TW202014513A - 包含細菌菌株之組合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種包含巨型球菌屬(Megasphaera)之細菌菌株之組合物，其用於刺激個體之免疫系統。

Description

包含細菌菌株之組合物

本發明屬於包含自哺乳動物消化道分離之細菌菌株的組合物及此類組合物用於治療疾病、尤其癌症，且尤其在疾病治療中刺激免疫系統之用途的領域。

雖然認為人類腸道在子宮內係無菌的，但在出生後其立刻暴露於大量母體及環境微生物。此後，出現微生物定殖及演替之動態期，其受諸如分娩模式、環境、飲食及宿主基因型之因素影響，所有因素均影響腸微生物叢之組成，特別是在童年期間。隨後，微生物叢穩定化且變成成人樣[1]。人類腸微生物叢含有超過500-1000個基本上屬於兩大細菌分類脆弱擬桿菌(Bacteroidete)及厚壁門菌(Firmicute)之不同種系型[2]。由人類腸之細菌定殖產生的成功共生關係產生多種代謝、結構、保護及其他有益功能。定殖腸部之增強之代謝活性確保降解以其他方式無法攝取之飲食組分，同時釋放副產物，為宿主提供重要營養物來源。類似地，充分認識到腸微生物叢之免疫重要性，且在免疫系統減弱之無菌動物中予以例示，其免疫系統在引入共生細菌後在功能上復原[3-5]。

微生物叢組成之顯著變化已在例如炎性腸病(IBD)之腸胃病症中予以證明。舉例而言，在IBD患者中梭菌屬(Clostridium)XIVa簇細菌之水準降低，而大腸桿菌數目增加，此表明腸內共生體與病原性共生體之平衡的變化[6-9]。有趣地，此微生物生態失調亦與效應T細胞群體之不平衡相關。

認識到某些細菌菌株對動物腸可能具有潛在之積極作用，已提議各種菌株用於治療各種疾病(參見例如[10-13])。亦已提議某些菌株，包括大部分乳 桿菌屬(Lactobacillus)及雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)菌株，用於治療不直接與腸相關之各種炎性及自體免疫性疾病(綜述參見[14]及[15])。然而，不同疾病與不同細菌菌株之間的關係及在全身層面上特定細菌菌株對腸及對任何特定類型疾病之準確作用尚未很好地表徵。

WO2015038731論述一種治療結腸癌之方法，其係藉由投與抗微生物劑或益生菌劑破環結腸生物薄膜進行。該申請案列出大量可用於益生菌中之細菌，但未證明任何細菌治療結腸癌之功效。而該申請案則集中於生物薄膜在結腸直腸癌中之診斷潛能。

EMBL資料庫登錄號XP002787383提供所提出之巨型球菌屬(Megasphaera)之16S rRNA基因序列，而EMBL資料庫登錄號XP002787384提供馬賽巨型球菌(Megasphaera massiliensis)菌株之16S rRNA基因。此等文獻詳述經分離之菌株之基因組分析且未提供有關巨型球菌之治療益處的指導。

Ahmed等人(提交至Frontiers Cellular Neuroscience)考慮源自腸道微生物叢之細菌菌株的活體外表徵。

本領域中需要治療疾病之新方法。亦需要表徵腸細菌之潛在作用，以便研發使用腸細菌之新療法。

本發明者已研發包含巨型球菌屬之細菌菌株之新組合物，其可用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。

因此，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於刺激個體之免疫系統。較佳地，該細菌菌株屬於馬賽巨型球菌物種。

在其他態樣中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於治療及預防癌症，諸如轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、神經母細胞瘤、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、 淋巴瘤及/或胃癌。在其他態樣中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於治療及預防癌症，諸如結腸直腸癌及/或血液惡性病。

在其他態樣中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於治療、預防或延遲免疫衰老。

在其他態樣中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用作疫苗佐劑。

在其他態樣中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於增強細胞療法，諸如CAR-T。

較佳地，用於本發明中之細菌係以登錄號42787寄存在NCIMB之菌株。

以下提供本發明之其他編號實施例：

1.一種包含巨型球菌屬之細菌菌株的組合物，其用於刺激個體之免疫系統。

2.實施例1之組合物，其用於治療或預防癌症，諸如轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、神經母細胞瘤、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結腸直腸癌及/或血液惡性病。

3.根據實施例2之供使用之組合物，其中該組合物具有組蛋白去乙醯酶抑制活性。

4.根據實施例2或實施例3之供使用之組合物，其中該組合物上調促炎性細胞介素。

5.根據實施例2至4中任一項之供使用之組合物，其用於降低腸障壁通透性。

6.實施例1之組合物，其用於治療、預防或延遲免疫衰老。

7.實施例1之組合物，其用作疫苗佐劑。

8.實施例1之組合物，其用於增強細胞療法，諸如CAR-T。

9.任一前述實施例之組合物，其用於增加凋亡蛋白酶3、MAP2、IL-1β、IL-23 及/或TNF-α之表現水準及/或活性。

10.任一前述實施例之組合物，其用於選擇性地降低細胞群體中Treg之數目及/或百分比的方法中。

11.任一前述實施例之組合物，其中該細菌菌株具有與巨型球菌屬之細菌菌株之16S rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA序列。

12.任一前述實施例之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：8、9、10、11或12中之任一者至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16s rRNA基因序列，或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO：8、9、10、11或12中之任一者表示的16s rRNA基因序列。

13.任一前述實施例之組合物，其中該細菌菌株屬於馬賽巨型球菌。

14.任一前述實施例之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：1至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA基因序列，或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO：1表示之16s rRNA基因序列。

15.任一前述實施例之組合物，其中該細菌菌株係以登錄號42787寄存在NCIMB之菌株。

16.任一前述實施例之組合物，其中該組合物係用於經口投與。

17.任一前述實施例之組合物，其中該組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。

18.任一前述實施例之組合物，其中該細菌菌株經凍乾。

19.一種包含任一前述實施例之組合物的食品，其供任一前述申請專利範圍使 用。

20.一種治療或預防與免疫刺激減少相關之疾病或病狀的方法，其包括向有需要之患者投與包含巨型球菌屬之細菌菌株的組合物。

21.一種組合物，其包含在實施例1至16中之任一項中所定義之細菌菌株的細胞，其中該細胞表現一或多種異源抗原。

22.根據實施例21之組合物，其中該細胞呈遞該一或多種異源抗原。

23.根據實施例21或實施例22之組合物，其用作疫苗。

24.一種在實施例1至18中之任一項中所定義之細菌菌株的細胞，其中該細胞表現一或多種異源抗原。

25.根據實施例24之細胞，其中該細胞呈遞該一或多種異源抗原。

26.根據實施例24或實施例25之細胞，其用作疫苗。

27.一種細菌菌株，其用於治療中，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：8、9、10、11或12中之任一者至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA序列。

28.一種細菌菌株，其具有由SEQ ID NO：8、9、10、11或12中之任一者表示之16S rRNA序列，其用於治療中。

圖1 β3微管蛋白表現之水準：免疫染色及細胞成像(圖1A)；免疫墨點(圖1B)。

圖2 MAP2表現之水準：免疫染色及細胞成像(圖2A)；免疫墨點(圖2B)；表現變化倍數(圖2C)。

圖3：DRD2表現之變化。

圖4：Casp3表現之變化。

圖5：細胞活力之變化。

圖6：CD4 T輔助細胞(圖6A)、CD4+活化細胞(圖6B)、Treg細胞(圖6C)、CD8細胞毒性T細胞(圖6D)、CD8+活化細胞(圖6E)、B細胞(圖6F)、CD8/Treg比率(圖6G)、活化CD8/Treg比率(圖6H)之細胞分型。

圖7：IL-1β(圖7A)、TNF-α(圖7B)、IL-23(圖7C)、IL-6(圖7D)、MIP-3α(圖7E)、CXCL9(圖7F)、MCP-1(圖7G)、IL-10(圖7H)、GM-CSF(圖7I)之細胞介素分析。

圖8：藉由流式細胞術，針對圖6中呈現之數據，用於分析免疫細胞之不同群體(CD4、CD8及CD19+細胞)之閘控策略。

圖9 介白素-8(IL-8)之分泌。

圖10：組蛋白去乙醯酶(HDAC)活性之變化。

圖11A：菌株誘發之全細胞組蛋白去乙醯酶活性及細胞溶解產物組蛋白去乙醯酶活性之變化；圖11B：菌株誘導之代謝物產生；圖11C：酸誘導之組蛋白去乙醯酶活性變化。

圖12A：HDAC1抑制；圖12B：HDAC2抑制；圖12C：HDAC3抑制。

圖13A：I類HDAC之抑制；圖13B：HDAC1之抑制；；圖13C：HDAC2之抑制；圖13D：HDAC3之抑制。

圖14：對腸障壁功能之作用。

圖15：海馬區Toll樣受體4(TLR-4)表現之變化。

圖16：海馬區TNF-α表現之變化。

圖17：海馬區介白素-1β(IL-1β)表現之變化。

圖18：海馬區介白素-6(IL-6)表現之變化。

圖19：海馬區CD11b表現之變化。

圖20：杏仁核TLR-4表現之變化。

圖21：杏仁核CD11b表現之變化。

圖22：杏仁核IL-6表現之變化。

圖23：前額葉皮質TLR-4表現之變化。

圖24：前額葉皮質CD11b表現之變化。

圖25：前額葉皮質IL-6表現之變化。

圖26：對干擾素-γ自來自投與MRx0029之小鼠之小鼠脾細胞的產生的作用。

圖27：對IL-1β自來自投與MRx0029之小鼠之小鼠脾細胞的產生的作用。

圖28：對IL-6自來自投與MRx0029之小鼠之小鼠脾細胞的產生的作用。

圖29：對TNF-α自來自投與MRx0029之小鼠之脾細胞的產生的作用。

圖30：對CXCL1自來自投與MRx0029之小鼠之脾細胞的產生的作用。

圖31：相對於GAPDH，在各種處理之後SKMEL2細胞株中MAP2之基因表現。「YCFA」=YCFA+

圖32：在各種處理之後SKMEL2細胞株中之純系存活。「YCFA」=YCFA+

圖33：在各種處理之後SKMEL2細胞株中之軟瓊脂生長。「YCFA」=YCFA+

圖34：在各種處理之後SKMEL2細胞株中之ERK信號傳導(磷酸化ERK1及ERK2(p44及p42)/總ERK)。「YCFA」=YCFA+

圖35：相對於GAPDH，在各種處理之後SKMEL28細胞株中MAP2之基因表現。「YCFA」=YCFA+

圖36：在各種處理之後SKMEL28細胞株中之純系存活。「YCFA」=YCFA+

圖37：在各種處理之後SKMEL28細胞株中之軟瓊脂生長。「YCFA」=YCFA+

圖38：在各種處理之後SKMEL28細胞株中之ERK信號傳導(磷酸化ERK1及ERK2(p44及p42)/總ERK)。「YCFA」=YCFA+

圖39：相對於GAPDH，在各種處理之後SKMEL31細胞株中MAP2之基因表現。「YCFA」=YCFA+

圖40：在各種處理之後SKMEL31細胞株中之純系存活。「YCFA」=YCFA+

圖41：在各種處理之後SKMEL31細胞株中之軟瓊脂生長。「YCFA」=YCFA+

圖42：在各種處理之後SKMEL31細胞株中之ERK信號傳導(磷酸化ERK1及ERK2(p44及p42)/總ERK)。「YCFA」=YCFA+

圖43：相對於GAPDH，在各種處理之後451Lu細胞株中MAP2之基因表現。「YCFA」=YCFA+

圖44：在各種處理之後451Lu細胞株之純系存活。「YCFA」=YCFA+

圖45：在各種處理之後451Lu細胞株之軟瓊脂生長。「YCFA」=YCFA+

圖46：在各種處理之後451Lu細胞株中之ERK信號傳導(磷酸化ERK1及ERK2(p44及p42)/總ERK)。「YCFA」=YCFA+

圖47：相對於GAPDH，在各種處理之後HT-29細胞株中MAP2之基因表現。「YCFA」=YCFA+

圖48：在各種處理之後HT-29細胞株之純系存活。「YCFA」=YCFA+

圖49A：在各種處理之後HT-29細胞株之軟瓊脂生長。「YCFA」=YCFA+

圖49B：在各種處理之後HT-29細胞株之軟瓊脂生長(瓊脂盤照片)。「YCFA」=YCFA+

圖50：在各種處理之後HT29細胞株中之ERK信號傳導(磷酸化ERK1及ERK2(p44及p42)/總ERK)。「YCFA」=YCFA+

圖51：MAP激酶路徑之概述(來自[72])。

圖52：除MRx0029外(A)無佛波醇肉豆蔻酯處理及(B)進行佛波醇肉豆蔻酯處理之分化Caco-2細胞中的GPR109a RNA表現。「YCFA」=YCFA+

圖53：(A)具有條件培養基之MRx0029及(B)單獨MRx0029誘導IL-8自HT29細胞之分泌。

圖54：馬賽巨型球菌菌株NCIMB 42787之代謝物分析。

圖55：MRx0029及參考馬賽巨型球菌菌株之上清液中的戊酸產生。

圖56：MRx0029及參考馬賽巨型球菌菌株之有機酸產生及消耗。

圖57：MRX0029對NSE/烯醇酶2之抑制。「YCFA」=YCFA+

圖58：NCIMB 42787、NCIMB 43385、NCIMB 43388及NCIMB 43389之有機酸產生及消耗。

圖59：NCIMB 42787及其他寄存菌株(n=3)對U373細胞中之IL-6分泌的上調。

圖60：NCIMB 42787、NCIMB 43385、NCIMB 43388、NCIMB 43389、NCIMB 43386及NCIMB 43387對烯醇酶2之抑制。

圖61A：NCIMB 42787及其他寄存之菌株增加MAP2表現；圖61B及61C：NCIMB 42787對細胞介素水準及NFκB-AP1啟動子之調節。

圖62：NCIMB 42787產生丁酸、戊酸及己酸。

圖63：藉由NCIMB 42787產生之代謝物的免疫刺激活性。

圖64：代謝物在NCIMB 42787之免疫刺激活性中之作用的分析。

圖65：巨型球菌菌株NCIMB 43387影響BALB/c小鼠中之結腸IDO-1 mRNA表現。

圖66：巨型球菌菌株NCIMB 43385及NCIMB 43387影響BALB/c小鼠中之結腸Tph1 mRNA表現。

圖67：巨型球菌菌株NCIMB 43385在來自BALB/c小鼠之脾細胞的ConA刺激後調節IFNγ及IL-6之產生。

圖68：巨型球菌菌株NCIMB 43385調節BALB/c小鼠之腦中IL-6及CD11b之表現。

圖69：NCIMB 42787調節BALB/c小鼠之杏仁核中TLR4之表現。

細菌菌株

本發明之組合物包含巨型球菌屬之細菌菌株。實例證明此種細菌可用於刺激免疫系統且治療疾病、尤其癌症。較佳細菌菌株屬於馬賽巨型球菌物種。

用於本發明之巨型球菌物種之實例包括埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、釀酒巨型球菌(Megasphaera cerevisiae)、馬賽巨型球菌(Megasphaera massiliensis)、印度巨型球菌(Megasphaera indica)、少食巨型球菌(Megasphaera paucivorans)、瑞典巨型球菌(Megasphaera sueciensis)及微核巨球巨型球菌(Megasphaera micronuciformis)。用於本發明之巨型球菌物種之另一實例為己酸巨型球菌(Megasphaera hexanoica)。巨型球菌為反芻及非反芻哺乳動物(包括人類)的專性厭氧之乳酸醱酵之胃腸微生物。

馬賽巨型球菌之模式菌株為NP3(=CSUR P245=DSM 26228)[16]。馬賽巨型球菌菌株NP3之16S rRNA基因序列之GenBank登錄號為JX424772.1。

在實例中進行測試之馬賽巨型球菌細菌在本文中稱為菌株 MRx0029。測試之MRx0029菌株的16S rRNA序列在SEQ ID NO：1中提供。

菌株MRx0029由4D製藥研究有限公司(4D Pharma Research Ltd.)(Life Sciences Innovation Building,Cornhill Road,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)以「馬賽巨型球菌MRx0029」在2017年7月13日寄存在國際寄存局NCIMB有限公司(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)且分配登錄號NCIMB 42787。

亦預期與實例中測試之菌株密切相關之細菌菌株有效刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有與SEQ ID NO：1至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA序列。較佳地，用於本發明之細菌菌株具有由SEQ ID NO：1表示之16S rRNA序列。

亦預期作為菌株MRx0029之生物型的細菌菌株有效刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。生物型為具有相同或極類似之生理及生物化學特性的密切相關菌株。

作為菌株MRx0029之生物型且適合用於本發明中的菌株可藉由對菌株MRx0029之其他核苷酸序列進行測序來鑑別。舉例而言，基本上全基因組可進行測序，且用於本發明之生物型菌株可在其全基因組之至少80%上(例如在至少85%、90%、95%或99%上或在其全基因組上)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性。用於鑑別生物型菌株之其他合適序列可包括hsp60或重複序列，例如BOX、ERIC、(GTG)₅或REP或[17]。生物型菌株可具有與菌株MRx0029之對應序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致的序列。

可替代地，作為菌株MRx0029之生物型且適用於本發明中的菌株可藉由使用菌株MRx0029以及限制片段分析及/或PCR分析，例如藉由使用螢光 增強之片段長度多態現象(fluorescent amplified fragment length polymorphism，FAFLP)及重複DNA組件(rep)-PCR指紋或蛋白質剖析或部分16S或23S rDNA測序來鑑別。在較佳實施例中，此類技術可用於鑑別其他馬賽巨型球菌菌株。

在某些實施例中，作為菌株MRx0029之生物型且適用於本發明中的菌株為當藉由增強之核蛋白體DNA限制分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)分析時，例如當使用Sau3AI限制酶(關於示例性方法及指導參見例如[18])時提供與菌株MRx0029相同模式之菌株。可替代地，生物型菌株確定為具有與菌株MRx0029相同之碳水化合物醱酵模式的菌株。

適用於本發明之組合物及方法的其他巨型球菌菌株，諸如菌株MRx0029之生物型，可使用任何適當方法或策略，包括實例中描述之分析鑑別。舉例而言，用於本發明之菌株可藉由添加至細胞溶解產物或全細胞且測試MAP2表現、DRD2表現、細胞介素水準或細胞存活來鑑別。詳言之，具有與菌株MRx0029類似之生長模式、代謝類型及/或表面抗原的細菌菌株可用於本發明。適用菌株之免疫調節活性將與菌株MRx0029相當。詳言之，如實例中所示，生物型菌株將對MAP2表現、DRD2表現、細胞介素水準或細胞存活引起相當之作用，其可藉由使用實例中描述之培養及投與方案來鑑別。如實例中所示，生物型菌株可對組蛋白去乙醯酶抑制活性引起相當之作用，其可藉由使用實例中描述之培養及投與方案來鑑別。

在一些實施例中，適用於本發明之細菌菌株可藉由通常對細菌菌株產生及消耗代謝物之概況進行分析來鑑別。本發明者已發現用於實例中之細菌菌株產生丁酸鹽、戊酸及己酸且消耗乙酸鹽及丙酸鹽(參見圖54-56)。亦發現馬賽巨型球菌菌株Ref 1、Ref 2及Ref 3消耗及產生此等代謝物(參見圖54-56)。因此，在一些實施例中，本發明之細菌菌株產生代謝物丁酸鹽、戊酸及己酸中之一或多種。在一些實施例中，本發明之細菌菌株消耗乙酸鹽及丙酸鹽中之一種或兩 種。在較佳實施例中，本發明之細菌菌株產生丁酸鹽、戊酸及己酸且消耗乙酸鹽及丙酸鹽。

本發明之一種尤其較佳菌株為馬賽巨型球菌MRx0029菌株。其為實例中測試之示例性菌株且展示有效治療疾病。因此，本發明提供馬賽巨型球菌菌株MRx0029或其衍生物的細胞，諸如分離細胞。本發明亦提供一種組合物，其包含馬賽巨型球菌菌株MRx0029或其衍生物的細胞。本發明亦提供一種馬賽巨型球菌菌株MRx0029之生物純培養物。本發明亦提供馬賽巨型球菌菌株MRx0029或其衍生物之細胞，其用於治療中，尤其用於治療本文中描述之疾病。

本發明之一種尤其較佳菌株為以登錄號NCIMB 42787寄存之馬賽巨型球菌菌株。其為實例中測試之示例性MRx0029菌株且展示有效刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。因此，本發明提供以登錄號NCIMB 42787寄存之馬賽巨型球菌菌株或其衍生物的細胞，諸如分離細胞。本發明亦提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 42787寄存之馬賽巨型球菌菌株或其衍生物的細胞。本發明亦提供一種以登錄號NCIMB 42787寄存之馬賽巨型球菌菌株之生物純培養物。本發明亦提供以登錄號NCIMB 42787寄存之馬賽巨型球菌菌株或其衍生物之細胞，其用於治療中，尤其用於治療本文中描述之疾病。

本發明之菌株的衍生物可為子代菌株(子代)或自原始培養(次選殖)之菌株。本發明菌株之衍生物可例如在基因層面下修飾，而不消除生物活性。詳言之，本發明之衍生菌株為治療活性的。衍生菌株將具有與MRx0029菌株相當之治療活性。詳言之，如實例中所示，衍生物菌株將對MAP2表現、DRD2表現、細胞介素水準或細胞存活引起相當之作用，其可藉由使用實例中描述之培養及投與方案來鑑別。如實例中所示，衍生物菌株可對組蛋白去乙醯酶抑制活性引起相當之作用，其可藉由使用實例中描述之培養及投與方案來鑑別。MRx0029菌株之衍生物一般將為MRx0029菌株之生物型。

對馬賽巨型球菌MRx0029菌株之細胞的提及涵蓋具有與菌株MRx0029相同之安全性及治療功效特性的任何細胞，且本發明涵蓋此類細胞。

在較佳實施例中，本發明組合物中之細菌菌株能存活且能夠部分或全部定殖腸部。

本發明者已發現馬賽巨型球菌菌株增加諸如IL-1β、TNF-α、MIP-3α、IL-23、IL-8及/或IL-6之炎性細菌介素之活化。

本發明者已發現馬賽巨型球菌菌株增加免疫細胞之活化且增強諸如IL-1β、TNF-α、MIP-3α、IL-23、IL-8及/或IL-6之細菌介素之分泌。

在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 42787寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症，最佳腦癌，諸如神經母細胞瘤。在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 42787寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於治療或預防轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結腸直腸癌及/或血液惡性病。

在較佳實施例中，本發明組合物中之細菌菌株能存活且能夠部分或全部定殖腸部。

在某些實施例中，本發明之組合物不包含馬賽巨型球菌菌株42787之細胞。

在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係巨型球菌屬之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 42787寄存之菌株。

在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係馬賽巨型球菌物種之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 42787寄存之菌株。

此等細菌菌株由4D製藥研究有限公司(Life Sciences Innovation Building,Cornhill Road,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)以馬賽巨型球菌(以登錄號NCIMB 43388及NCIMB 43389)及巨型球菌屬(Megasphaera spp.)(登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386及NCIMB 43387)在2019年5月6日寄存在國際寄存局NCIMB有限公司(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)。因此，在一替代實施例中，本發明之組合物包含此等細菌菌株中之一或多種，或其生物型或衍生物。為避免疑義，上文提及之Ref 1係以登錄號NCIMB 43385寄存之菌株，上文提及之Ref 2係以登錄號NCIMB 43388寄存之菌株，且上文提及之Ref 3係以登錄號NCIMB 43389寄存之菌株。

亦預期與實例中測試之菌株密切相關之細菌菌株有效刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株為以登錄號NCIMB 43388寄存之馬賽巨型球菌菌株。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43388寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於治療中。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43388寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43388寄存之菌株的細胞，用於治療本文中描述之任一種疾病。

在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43388寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症，最佳腦癌，諸如神經母細胞瘤。在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43388寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於治療或預防轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結腸直腸癌及/或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明之組合物不包含以登錄號NCIMB 43388寄 存之馬賽巨型球菌菌株之細胞。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係巨型球菌屬之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43388寄存之菌株。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係馬賽巨型球菌物種之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43388寄存之菌株。

相應地，在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株為以登錄號NCIMB 43389寄存之馬賽巨型球菌。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43389寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於治療中。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43389寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43389寄存之菌株的細胞，用於治療本文中描述之任一種疾病。

在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43389寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症，最佳腦癌，諸如神經母細胞瘤。在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43389寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於治療或預防轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結腸直腸癌及/或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明之組合物不包含以登錄號NCIMB 43389寄存之馬賽巨型球菌菌株之細胞。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係巨型球菌屬之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43389寄存之菌株。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係馬賽巨型球菌物種之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43389寄存之菌株。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有與SEQ ID NO：9至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16S rRNA序列。在某些 實施例中，用於本發明之細菌菌株具有由SEQ ID NO：9表示之16S rRNA序列。在某些實施例中，本發明提供一種具有與SEQ ID NO：9至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA序列的細菌菌株，用於治療中。在某些實施例中，本發明提供一種具有由SEQ ID NO：9表示之16S rRNA序列的細菌菌株，用於治療中。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有與SEQ ID NO：10至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16S rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有由SEQ ID NO：10表示之16S rRNA序列。在某些實施例中，本發明提供一種具有與SEQ ID NO：10至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA序列的細菌菌株，用於治療中。在某些實施例中，本發明提供一種具有由SEQ ID NO：10表示之16S rRNA序列的細菌菌株，用於治療中。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有與巨型球菌屬之細菌菌株之16S rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16S rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株屬於巨型球菌屬。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株為以登錄號NCIMB 43385寄存之巨型球菌屬菌株。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43385寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於治療中。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43385寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43385寄存之菌株的細胞，用於治療本文中描述之任一種疾病。

在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43385寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症，最佳腦癌，諸如神經母細胞瘤。在較佳實施例中，本 發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43385寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於治療或預防轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結腸直腸癌及/或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明之組合物不包含以登錄號NCIMB 43385寄存之馬賽巨型球菌菌株之細胞。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係巨型球菌屬之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43385寄存之菌株。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係馬賽巨型球菌物種之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43385寄存之菌株。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株為以登錄號NCIMB 43386寄存之巨型球菌屬菌株。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43386寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於治療中。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43386寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43386寄存之菌株的細胞，用於治療本文中描述之任一種疾病。

在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43386寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症，最佳腦癌，諸如神經母細胞瘤。在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43386寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於治療或預防轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結腸直腸癌及/或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明之組合物不包含以登錄號NCIMB 43386寄存之馬賽巨型球菌菌株之細胞。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株 係巨型球菌屬之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43386寄存之菌株。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係馬賽巨型球菌物種之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43386寄存之菌株。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株為以登錄號NCIMB 43387寄存之巨型球菌屬菌株。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43387寄存之菌株或其衍生物的細胞，用於治療中。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43387寄存之菌株的細胞，用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43387寄存之菌株的細胞，用於治療本文中描述之任一種疾病。

在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43387寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症，最佳腦癌，諸如神經母細胞瘤。在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43387寄存在NCIMB之菌株或其衍生物或生物型，較佳用於治療或預防轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結腸直腸癌及/或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明之組合物不包含以登錄號NCIMB 43387寄存之馬賽巨型球菌菌株之細胞。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係巨型球菌屬之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43387寄存之菌株。在一些實施例中，本發明之組合物中之細菌菌株係馬賽巨型球菌物種之細菌菌株，其中該細菌菌株並非以登錄號NCIMB 43387寄存之菌株。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有與SEQ ID NO：8至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16S rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有與SEQ ID NO：11至少95%、96%、97%、 98%、99%、99.5%或99.9%一致的16S rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有與SEQ ID NO：12至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16S rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有與SEQ ID NO：8、11或12至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16S rRNA序列。在某些實施例中，本發明提供具有與SEQ ID NO：8、11或12至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA序列的細菌菌株，用於治療中。

在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有由SEQ ID NO：8表示之16S rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有由SEQ ID NO：11表示之16S rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有由SEQ ID NO：12表示之16S rRNA序列。在某些實施例中，用於本發明之細菌菌株具有由SEQ ID NO：8、11或12表示之16S rRNA序列。在某些實施例中，本發明提供具有由SEQ ID NO：8、11或12表示之16S rRNA序列的細菌菌株，用於治療中。

亦預期作為以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的生物型的細菌菌株有效刺激免疫系統且治療及預防疾病、尤其癌症。生物型為具有相同或極類似之生理及生物化學特性的密切相關菌株。

在某些實施例中，本發明提供以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之細菌菌株或其生物型，用於治療中。

作為以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的生物型且適合用於本發明中的菌株可藉由對以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、 NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的其他核苷酸序列進行測序來鑑別。舉例而言，基本上全基因組可進行測序，且用於本發明之生物型菌株可在其全基因組之至少80%上(例如在至少85%、90%、95%或99%上或在其全基因組上)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性。用於鑑別生物型菌株之其他合適序列可包括hsp60或重複序列，例如BOX、ERIC、(GTG)₅或REP。生物型菌株可具有與以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的對應序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致的序列。

可替代地，作為以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的生物型且適用於本發明中的菌株可藉由使用以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株以及限制片段分析及/或PCR分析，例如藉由使用螢光增強之片段長度多態現象(FAFLP)及重複DNA組件(rep)-PCR指紋或蛋白質剖析或部分16S或23S rDNA測序來鑑別。在較佳實施例中，此類技術可用於鑑別其他馬賽巨型球菌菌株。

在某些實施例中，作為以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的生物型且適用於本發明中的菌株為當藉由增強之核蛋白體DNA限制分析(ARDRA)分析時，例如當使用Sau3AI限制酶時提供與以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株相同模式的菌株。可替代地，生物型菌株確定為具有與以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株相同之碳水化合物醱酵模式的菌株。

適用於本發明之組合物及方法的其他菌株，例如以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的生物型，可使用任何適當方法或策略，包括實例中描述之分析鑑別。舉例而言，用於本發明之菌株可藉由添加至細胞溶解產物或全細胞且測試MAP2表現、DRD2表現、細胞介素水準或細胞存活來鑑別。詳言之，具有與以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株類似的生長模式、代謝類型及/或表面抗原的細菌菌株可用於本發明。適用菌株之免疫調節活性將與以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株相當。詳言之，如實例中所示，生物型菌株將對MAP2表現、DRD2表現、細胞介素水準或細胞存活引起相當之作用，其可藉由使用實例中描述之培養及投與方案來鑑別。如實例中所示，生物型菌株可對組蛋白去乙醯酶抑制活性引起相當之作用，其可藉由使用實例中描述之培養及投與方案來鑑別。

在某些實施例中，本發明之較佳菌株為以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株。此等菌株為實例中測試之示例性菌株且展示有效治療疾病。因此，本發明提供以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株或其衍生物的細胞，諸如分離細胞。本發明亦提供一種組合物，其包含以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株或其衍生物的細胞。本發明亦提供一種以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的生物 純培養物。本發明亦提供以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株或其衍生物的細胞，其用於治療中，尤其用於治療本文中描述之疾病。

本發明之菌株的衍生物可為子代菌株(子代)或自原始培養(次選殖)之菌株。本發明菌株之衍生物可例如在基因層面下修飾，而不消除生物活性。詳言之，本發明之衍生菌株為治療活性的。衍生菌株將具有與以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株相當的治療活性。詳言之，如實例中所示，衍生物菌株將對MAP2表現、DRD2表現、細胞介素水準或細胞存活引起相當之作用，其可藉由使用實例中描述之培養及投與方案來鑑別。如實例中所示，生物型菌株可對組蛋白去乙醯酶抑制活性引起相當之作用，其可藉由使用實例中描述之培養及投與方案來鑑別。以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的衍生物一般將分別為以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388及/或NCIMB 43389寄存之菌株中之一或多種菌株的生物型。

本發明者已發現用於實例中之細菌菌株產生2-甲基-丙酸及3-甲基-丙酸且消耗甲酸(參見圖58)。亦發現以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43388及NCIMB 43389寄存之菌株產生2-甲基-丙酸及3-甲基-丙酸。此外，亦發現以登錄號NCIMB 43385及NCIMB 43388寄存之菌株消耗甲酸。因此，在一些實施例中，本發明之細菌菌株產生代謝物2-甲基-丙酸及3-甲基-丙酸中之一或多種。在一些實施例中，本發明之細菌菌株消耗甲酸。在一些實施例中，本發明之細菌菌株產生2-甲基-丙酸及3-甲基-丙酸且消耗甲酸。在較佳實施例中，本發明之細菌菌株產生丁酸鹽、戊酸、己酸、2-甲基-丙酸及3-甲基-丙酸，且消耗乙酸鹽、丙酸鹽及甲酸。

在某些實施例中，丁酸鹽及/或戊酸之產生抑制IL-8分泌。因此，在某些實施例中，本發明之組合物可經由產生丁酸鹽及/或戊酸刺激免疫系統。

在某些實施例中，本發明之組合物不包含埃氏巨型球菌。在某些實施例中，適用於本發明之組合物及方法中之細菌菌株不為埃氏巨型球菌。

治療用途

刺激免疫系統

實例顯示本發明之組合物之投與可在人類外周血單核細胞(PBMC)中引起免疫刺激。因為本發明之組合物之投與顯示對PBMC具有免疫刺激作用，所以本發明之組合物可用於治療疾病、尤其特徵在於免疫活化降低之疾病及可藉由增加免疫反應進行治療之疾病。在某些實施例中，本發明之組合物用於刺激免疫系統。在某些實施例中，本發明之組合物用於藉由刺激免疫系統來治療疾病。在某些實施例中，本發明之組合物用於促進免疫反應。

實例顯示本發明之組合物之投與可引起PBMC中Treg之百分比下降(圖6C)。Treg亦稱抑制T細胞，係用以抑制免疫反應之T細胞群體。Treg之特徵在於細胞表面標記物CD25之高表現及CD127之低表現[19]。因為本發明之組合物之投與顯示選擇性地減少Treg群體(圖6C)，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於細胞群體中Treg之百分比增加的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物可用於治療或預防特徵在於細胞群體中Treg之百分比增加的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物可用於治療或預防特徵在於細胞群體中CD4+CD25+CD127-細胞之百分比增加的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞群體中Treg之百分比用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於減少Treg對免疫反應之抑制。在一個實施例中，本發明之組合物藉由選擇性減少Treg用於刺激免疫反應。在一個實施例中，本發明之組合物用於免疫刺激，其中本發明之組合物降低Treg之數目或百分比。

實例證明本發明之組合物能夠選擇性地靶向Treg，且不顯著地影響諸如B細胞、CD4 T細胞或CD8 T細胞之細胞。因此，本發明之組合物可選擇性地減少PBMC中之Treg，且不顯著地影響其他測試細胞類型之百分比。在一個實施例中，本發明之組合物用於選擇性地降低Treg之數目或百分比，其中CD4 T細胞之數目或百分比未顯著地變化。在一個實施例中，本發明之組合物用於選擇性地降低Treg之數目或百分比，其中CD8 T細胞之數目或百分比未顯著地變化。在一個實施例中，本發明之組合物用於選擇性地降低Treg之數目或百分比，其中B細胞之數目或百分比未顯著地變化。在另一實施例中，本發明之組合物用於選擇性地降低Treg之數目或百分比，其中B細胞、CD4 T細胞及/或CD8 T細胞之數目或百分比未顯著地變化。

Treg之百分比的降低尤其令人意外，因為馬賽巨型球菌MRx0029菌株產生丁酸鹽，且丁酸鹽與血液中增加之Treg細胞水準及增加之Treg活性相關[20]。因此，意外地，本發明之組合物將引起PBMC中Treg之百分比下降。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起CD8細胞與Treg細胞之比率增加。CD8+ T細胞(CD8細胞)係細胞毒性T細胞，且在對細胞內病原體之免疫防禦中起關鍵作用。因為本發明之組合物之投與顯示增加CD8/Treg細胞與活化CD8/Treg細胞兩者之比率(圖6G及圖6H)，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於CD8/Treg細胞與活化CD8/Treg細胞之比率下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於CD8/Treg細胞之比率下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於活化CD8/Treg細胞之比率下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞群體中Treg之百分比，由此增加CD8/Treg細胞之比率，用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞群體中Treg之百分比，由此增加CD8/Treg細胞之比率，用於治療或預防疾病，其中CD8/Treg細胞之比率增加引 起免疫刺激。在另一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞群體中Treg之百分比，由此增加活化CD8/Treg細胞之比率，用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞群體中Treg之百分比，由此增加CD8/Treg細胞之比率，用於治療或預防疾病，其中活化CD8/Treg細胞之比率增加引起免疫刺激。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD8/Treg細胞之比率用於刺激免疫反應。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加活化CD8/Treg細胞之比率用於刺激免疫反應。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起PBMC中CD19+CD3-細胞之百分比增加(圖6F)。因此，本發明之組合物之投與可引起細胞群體中B細胞之百分比增加。因為本發明之組合物之投與顯示增加B細胞之百分比，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於B細胞之數目或百分比下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於B細胞之數目或百分比下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於CD19+CD3-細胞之數目或百分比下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加細胞群體中B細胞之數目或百分比用於治療或預防疾病，其中B細胞之數目或百分比增加引起免疫刺激。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加B細胞之數目或百分比用於刺激免疫反應。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起PBMC中CD8 T細胞毒細胞之百分比增加(圖6D)。因此，本發明之組合物之投與可引起細胞群體中CD8 T細胞之百分比增加。因為本發明之組合物之投與顯示增加CD8 T細胞毒細胞之百分比，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於CD8 T細胞毒細胞之數目或百分比下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於CD8 T細胞毒細胞之數目或百分比下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加細胞群體中CD8 T細胞毒細胞之數目或百分比用於治療或預防 疾病，其中CD8 T細胞毒細胞之數目或百分比增加引起免疫刺激。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD8 T細胞毒細胞之數目或百分比用於刺激免疫反應。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起PBMC中CD8+活化細胞之百分比增加(圖6E)。因此，本發明之組合物之投與可引起細胞群體中CD8+活化細胞之百分比增加。因為本發明之組合物之投與顯示增加CD8+活化細胞之百分比，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於CD8+活化細胞之數目或百分比下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於CD8+活化細胞之數目或百分比下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加細胞群體中CD8+活化細胞之數目或百分比用於治療或預防疾病，其中CD8+活化細胞之數目或百分比增加引起免疫刺激。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD8+活化細胞之數目或百分比用於刺激免疫反應。

實例顯示本發明之組合物之投與可引起PBMC中諸如促炎性細胞介素之促炎性分子之表現增加(圖7及圖9)。在投與本發明之組合物後顯示表現水準增加之免疫刺激(例如促炎性)分子的實例包括IL-23、TNF-α、IL-1β、MIP-3α、IL-8及IL-6。因為本發明之組合物之投與顯示增加免疫刺激(例如促炎性)分子之表現，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於諸如促炎性細胞介素之促炎性分子之表現下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於促炎性分子之表現及/或活性下降的疾病、尤其特徵在於促炎性細胞介素之表現及/或活性下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-23、TNF-α、IL-1β、MIP-3α及/或IL-6之表現及/或活性下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-8之表現及/或活性下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於CD11b之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，本發明之 組合物藉由增加IL-23、TNF-α、IL-1β、MIP-3α及/或IL-6之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-8之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD11b之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-23、TNF-α、IL-1β、MIP-3α及/或IL-6之表現及/或活性用於促進免疫反應。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-8之表現及/或活性用於促進免疫反應。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD11b之表現及/或活性用於促進免疫反應。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起PBMC中IL-1β之表現增加。IL-1β係一種促炎性細胞介素[21]。IL-1β之產生及分泌由炎性體調控，炎性體係與炎性反應之活化有關的蛋白質複合物[22]。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-1β之表現，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於IL-1β之表現下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-1β之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-1β之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本本發明之組合物藉由增加IL-1β之表現及/或活性用於促進免疫反應。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療特徵在於IL-1β之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-1β之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-1β之表現及/或活性用於促進免疫反應。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-23之表現增加。IL-23與炎症有關[23,24]。所提出之IL-23在免疫反應中之功能包括促進CD4+記憶T細胞增殖及促進樹突狀細胞(DC)分泌IFN-γ[25]。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-23之表現，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於IL-23之表現下 降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-23之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-23之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-23之表現及/或活性用於促進免疫反應。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療特徵在於IL-23之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-23之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-23之表現及/或活性用於促進免疫反應。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起PBMC中巨噬細胞炎性蛋白-3(MIP3-α)或CCL20之表現增加。MIP3-α係一種炎性趨化介素，其結合於CCR6受體，且充當DC及記憶T細胞之化學引誘物。MIP3-α藉由將不成熟DC募集至炎症部位而引起適應性免疫反應[26]。MIP3-α之表現失調與諸如炎性腸病之疾病相關[27]。因為本發明之組合物之投與顯示增加MIP3-α之表現，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於MIP3-α之表現下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於MIP3-α之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加MIP3-α之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加MIP3-α之表現及/或活性用於促進免疫反應。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療特徵在於MIP3-α之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加MIP3-α之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加MIP3-α之表現及/或活性用於促進免疫反應。

實例顯示本發明之組合物之投與可引起腫瘤壞死因子α(TNF-α)之表現增加。TNF-α係一種促炎性細胞介素，已知其與促進細胞死亡之各種信號傳導 路徑有關。TNF-α藉由結合於其同源受體TNFR-1開啟細胞凋亡，此引起細胞凋亡路徑中裂解事件之級聯[28]。TNF-α亦可經由RIP激酶依賴性機制引起壞死[29]。因為本發明之組合物之投與顯示增加TNF-α之表現，所以本發明之組合物可用於治療疾病、尤其用於治療或預防特徵在於TNF-α之表現下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療特徵在於TNF-α之表現下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於TNF-α之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加TNF-α之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加TNF-α之表現及/或活性用於促進免疫反應。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療特徵在於TNF-α之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加TNF-α之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加TNF-α之表現及/或活性用於促進免疫反應。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起PBMC中IL-6之表現增加。IL-6係一種促炎性細胞介素，其在炎症期間產生，且促進不成熟CD4+ T細胞及CD8+ T細胞分化成細胞毒性T細胞[30]。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-6之表現，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於IL-6之表現下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-6之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-6之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-6之表現及/或活性用於促進免疫反應。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療特徵在於IL-6之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-6之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-6之表 現及/或活性用於促進免疫反應。

Bettelli等人[31]報導IL-6抑制Treg之產生。因為實例顯示本發明之組合物增加IL-6之表現，所以本發明之組合物藉由增加IL-6之表現可選擇性地降低Treg之數目或百分比。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-6之表現用於免疫刺激。在另一個實施例中，本發明之組合物藉由降低Treg之數目或百分比用於免疫刺激。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-6之表現用於免疫刺激。在另一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由降低Treg之數目或百分比用於免疫刺激。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-8之表現增加(參見實例8)。IL-8係一種促炎性細胞介素，主要由巨噬細胞分泌，具有刺激免疫之作用。其在標靶細胞、主要嗜中性粒細胞以及其他顆粒細胞中誘發趨化性，引起其遷移至感染部位。IL-8亦刺激吞噬作用。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-8之表現，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於IL-8之表現下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-8之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-8之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-8之表現及/或活性用於促進免疫反應。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療特徵在於IL-8之表現及/或IL-8之活性下降的疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-8之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加IL-8之表現及/或活性用於促進免疫反應。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起CD11b之表現增加(參見實例12)。CD11b係一種具有免疫刺激作用之促炎性細胞介素。CD11b在與先天免疫系統相關之許多白細胞表面上表現，且藉由調控白細胞黏附及遷移而介導 炎症。CD11b與例如吞噬作用、細胞介導之細胞毒作用、趨化性及細胞活化之若干免疫過程有關聯。因為本發明之組合物之投與顯示增加CD11b之表現，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於CD11b之表現下降的疾病。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於CD11b之表現及/或活性下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD11b之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD11b之表現及/或活性用於促進免疫反應。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療特徵在於CD11b之表現及/或CD11b之活性下降的疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加CD11b之表現及/或活性用於治療或預防疾病。在一個實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加CD11b之表現及/或活性用於促進免疫反應。

實例顯示本發明之組合物可誘導NF-κB-Ap1啟動子活化(參見圖61)。NF-κB尤其藉由刺激與免疫反應相關之炎症介體及細胞介素，例如IL-6之表現而與免疫反應之活化有關。如上所概述，IL-6之表現增加有助於刺激免疫系統，因此活化NF-κB路徑具有免疫刺激活性。因此，在某些實施例中，本發明之組合物活化NF-κB信號傳導，因此刺激免疫系統。在某些實施例中，本發明之組合物藉由增加NF-κB啟動子之活化，刺激炎症介體及免疫刺激性細胞介素之表現。

癌症

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防癌症。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防腦癌、尤其神經母細胞瘤。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防黑色素瘤、尤其轉移性黑色素瘤。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防腦癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防神經母細胞瘤。在某些實施例中，本發明之組合 物用於治療或預防黑色素瘤。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防轉移性黑色素瘤。在一最佳實施例中，本發明之組合物包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株且用於治療或預防腦癌、尤其神經母細胞瘤。在另一最佳實施例中，本發明之組合物包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株且用於治療或預防黑色素瘤、尤其轉移性黑色素瘤。

實例(實例1)證明本發明之組合物之投與可引起未分化神經母細胞瘤細胞中III類β微管蛋白(β3微管蛋白)之表現增加。β3微管蛋白廣泛稱為神經元標記物[32]。實例亦證明本發明之組合物之投與可引起未分化神經母細胞瘤細胞中微管相關蛋白2(MAP2)之表現增加。MAP2主要在神經元中表現且用以穩定微管，促進樹突形成及軸突長出[33]。MAP2稱為分化神經元之標記物。

引起細胞分化之劑與癌症治療劑相關，因為細胞分化劑之投與引起腫瘤生長之抑制[34]。因此，本發明之組合物可用於治療癌症。在一個特定實施例中，本發明之組合物藉由誘導細胞分化、尤其神經元分化用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由誘導神經元分化用於治療腦癌、尤其治療神經母細胞瘤。

此外，已發現MAP2在原發性皮膚黑色素瘤中高度表現，但在轉移性黑色素瘤中表現減少[35]。已提出增加微管穩定蛋白之表現或用諸如MAP2之微管穩定蛋白治療可干擾在細胞分裂期間需要之微管動態不穩定性。因此，認為MAP2上調阻礙細胞分裂且延遲癌症中之腫瘤生長[35]。因此，本發明之組合物可用於治療癌症、尤其轉移性癌症。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療癌症之方法中。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防由MAP2表現下降介導之癌症。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於MAP2表現下降或缺乏之癌症。在某些實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療中增加MAP2表現。在一較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防 黑色素瘤。在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防轉移性黑色素瘤。

在某些實施例中，本發明之治療劑組合用於治療或預防黑色素瘤。根據一些實施例，本發明之治療劑組合對黑色素細胞有影響且可有效治療黑色素瘤。在某些實施例中，本發明之治療劑組合用於在黑色素瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。

詳言之，實例顯示本發明之組合物之投與可引起未分化神經母細胞瘤細胞中MAP2之表現增加。因為MAP2廣泛稱為分化神經元之標記物且其表現顯示與癌症相關，所以本發明之組合物尤其可用於治療腦癌、諸如神經母細胞瘤。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療腦癌之方法中。在一較佳實施例中，本發明之組合物用於治療神經母細胞瘤之方法中。

此外，實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起多巴胺受體D2(DRD2)表現顯著下降(參見實例2及圖3)。DRD2為G蛋白偶合受體(GPCR)且其屬於多巴胺受體家族。DRD2與促進細胞存活之信號傳導路徑有關，因此與癌症相關。DRD2之過度表現或上調與若干類型之癌症相關聯，因為與正常細胞相比，惡性細胞顯示DRD2表現增加[36]。已顯示經由DRD2特異性拮抗劑抑制DRD2具有抗腫瘤作用。DRD2拮抗劑已顯示在許多癌症中具有抗腫瘤功效，該等癌症包括乳癌[37][38]、膠質母細胞瘤[39][40][41]、神經母細胞瘤[42]、肝細胞癌[43]、肺癌、前列腺癌[44]、子宮頸癌[45]、卵巢癌[46]、淋巴瘤[47]及胃癌[48]。因此，降低DRD2表現水準之組合物可用於治療癌症。因為本發明之組合物之投與顯示降低DRD2表現，所以本發明之組合物可用於治療癌症、尤其用於治療或預防特徵在於DRD2表現增加之癌症。在一個實施例中，本發明之組合物可用於治療或預防特徵在於DRD2之表現及/或活性增加的癌症。在某些實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療中減少DRD2表現及/或活性。在一個實 施例中，本發明之組合物可用於治療癌症，尤其乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、腦癌，尤其膠質母細胞瘤及神經母細胞瘤、癌瘤，尤其肝細胞癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤及/或胃癌。在一個實施例中，本發明之組合物可藉由降低DRD2之水準及/或活性用於治療或預防癌症。

Prabhu等人報導ONC201(一種DRD2拮抗劑)已在膠質母細胞瘤模型中顯示縮小腫瘤之功效。DRD2表現在膠質母細胞瘤腫瘤中上調，因此DRD2為癌症治療劑之有吸引力之標靶[49]。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防膠質母細胞瘤。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起SH-SY5Y細胞中凋亡蛋白酶3(Casp3)之表現增加。凋亡蛋白酶屬於半胱胺酸蛋白酶家族且已知促進細胞凋亡。Casp3稱為「執行凋亡蛋白酶」，其在細胞凋亡路徑中之細胞蛋白質之裂解級聯中起重要作用。先前已在來自乳房、卵巢及子宮頸腫瘤組織之癌症中顯示Casp3表現之下調，且認為Casp3之表現下降促進癌組織中之細胞存活[50]。因此，增加執行凋亡蛋白酶、尤其Casp3之表現水準之組合物可用於治療癌症。因為本發明之組合物之投與顯示增加Casp3表現，所以本發明之組合物可用於治療癌症、尤其用於治療或預防由Casp3表現介導之癌症。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於Casp3表現下降或缺乏之癌症。在一個實施例中，本發明之組合物可用於治療特徵在於執行凋亡蛋白酶表現下降或缺乏之癌症。在一個特定實施例中，本發明之組合物可用於治療或預防特徵在於Casp3表現下降或缺乏之癌症。在某些實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療中增加Casp3表現。在一個實施例中，本發明之組合物可用於治療癌症、尤其乳癌、卵巢癌及/或子宮頸癌。在一個實施例中，本發明之組合物可藉由增加Casp3之水準及/或活性用於治療或預防癌症。

此外，已報導凋亡蛋白酶與除細胞凋亡以外之過程，諸如細胞分化 有關[51]。實例(實例1及實例3)證明本發明之組合物之投與可引起神經元標記物β3微管蛋白及MAP2之表現增加以及未分化神經母細胞瘤細胞中Casp3之表現增加。因為本發明之組合物可引起神經元標記物及已知在細胞分化中起作用之蛋白質之表現增加，所以本發明之組合物可用於神經元自未分化細胞之分化。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可在未分化神經母細胞瘤細胞中引起細胞活力下降(圖5)。詳言之，實例顯示濃度為5%或10%之MRx0029之投與引起細胞活力顯著的劑量依賴性下降(圖5)。

已知細胞活力之下降或增加癌細胞之細胞死亡係癌症治療之一個目標[52]。因此，降低諸如神經母細胞瘤細胞株之癌細胞株之細胞活力的組合物可用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞活力用於治療癌症。在另一實施例中，本發明之組合物藉由增加細胞死亡用於治療癌症。

此外，因為實例顯示本發明之組合物增加Casp3表現且降低細胞活力(圖4及圖5)，所以提出本發明之組合物藉由上調細胞凋亡來降低細胞活力。在一個實施例中，本發明之組合物用於上調細胞凋亡。在另一實施例中，本發明之組合物藉由增加細胞死亡，尤其藉由增加細胞凋亡，用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞活力用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞活力用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由上調細胞凋亡用於治療癌症。在一個特定實施例中，本發明之組合物藉由上調細胞凋亡用於治療癌症。在一個特定實施例中，本發明之組合物藉由上調細胞凋亡用於治療特徵在於Casp3表現下降或缺乏之癌症。在某些實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療中增加細胞凋亡。在某些實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療中降低細胞活力。

實例顯示本發明之組合物增加Casp3與MAP2兩者之表現。因此，Casp3上調與MAP2上調可能相關。

組蛋白乙醯化及去乙醯化係基因表現之重要表觀遺傳調控因子。表觀遺傳調控係一種調控細胞功能之所有態樣之有效工具。組蛋白去乙醯酶(HDAC)藉由自組蛋白上之ε-N-乙醯基離胺酸胺基酸移除乙醯基，允許組蛋白更緊密地包裹DNA且經由無法接近核小體引起轉錄抑制而抑制基因表現。HDAC具有18種同功型，其組織成四類：I類、II類、III類及IV類。已在包括例如癌症、感染性疾病、炎性疾病及神經退化性疾病之許多疾病類型中觀察到HDAC水準之改變[53,54,55]。

HDAC抑制劑(HDACi)係一類有前途之新興抗癌藥物，已顯示其在多種癌細胞株中引起生長抑制、分化、細胞凋亡、減少血管生成及調節免疫反應[56,57,58,59]。雖然介導此等藥劑之臨床活性的精確機制尚不清楚，但當前正研究大量HDACi作為潛在抗癌劑。此外，由於在活體外與活體內研究中可證明抗癌活性，故許多HDACi經由臨床研發已迅速地發展，作為單一療法或與其他抗癌劑組合[60]。當中，伏瑞斯特(vorinostat)(Zolinza^TM)、羅米地辛(romidepsin)(Istodax^TM)及貝利司他(belinostat)(Beleodaq^TM)已經US FDA批准用於治療淋巴瘤。淋巴瘤及其他血液癌症(亦稱為血液科癌症或血液惡性病)尤其對HDACi敏感。腸微生物叢具有巨大多樣性及代謝能力，其代表用於產生各種對HDAC活性具有潛在作用之分子的巨大代謝貯存器。少數研究已評定除丁酸鹽以外的源自微生物之代謝物的HDAC抑制活性，已顯示丁酸鹽抑制HDAC且與亨廷頓氏病(Huntington’s disease)之運動功能改善有關[61]。

實例顯示本發明之組合物抑制HDAC活性、尤其I類HDAC、例如HDAC2(實例9及10)。因此，在某些實施例中，本發明之組合物調節HDAC活性。在某些實施例中，本發明之組合物降低HDAC活性。在某些實施例中，本發明之組合物抑制HDAC。在某些實施例中，本發明之組合物為HDACi。在較佳實施例中，本發明之組合物降低I類HDAC活性。在某些實施例中，本發明 之組合物降低II類HDAC活性。在某些實施例中，本發明之組合物降低III類HDAC活性。在某些實施例中，本發明之組合物降低IV類HDAC活性。在某些實施例中，本發明之組合物降低HDAC1活性。在較佳實施例中，本發明之組合物降低HDAC2活性。在某些實施例中，本發明之組合物降低HDAC3活性。在某些實施例中，本發明之組合物經由產生戊酸降低HDAC活性。在某些實施例中，本發明之組合物經由產生丁酸鈉降低HDAC活性。在較佳實施例中，本發明之組合物藉由降低HDAC活性用於治療或預防癌症。在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防HDAC相關癌症。在某些實施例中，本發明之組合物藉由降低HDAC活性用於治療或預防轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、神經母細胞瘤、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、結腸直腸癌、血液惡性病及/或胃癌。在較佳實施例中，本發明之組合物藉由降低HDAC活性用於治療或預防血液惡性病。

在某些實施例中，本發明之組合物之HDAC抑制活性引起生長抑制。在某些實施例中，本發明之組合物之HDAC抑制活性引起細胞週期抑制。在某些實施例中，本發明之組合物之HDAC抑制活性引起細胞分化。在某些實施例中，本發明之組合物之HDAC抑制活性引起細胞凋亡。在某些實施例中，本發明之組合物之HDAC抑制活性減少血管生成。在某些實施例中，本發明之組合物之HDAC抑制活性調節免疫反應。在某些實施例中，本發明之組合物用於作為單一療法降低HDAC活性。在某些實施例中，本發明之組合物用於作為組合療法降低HDAC活性。在某些實施例中，本發明之組合物與另一抗癌劑組合使用。在某些實施例中，本發明之組合物與超過一種其他抗癌劑組合使用。在某些實施例中，本發明之組合物與化學治療劑組合使用。在某些實施例中，本發明之組合物與蛋白酶體抑制劑組合使用。在其他態樣中，本發明之組合物為表觀遺傳調控劑。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於表觀遺傳異 常之疾病。

在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株調節HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株抑制HDAC。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株為HDACi。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低I類HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低II類HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低III類HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低IV類HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低HDAC1活性。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低HDAC2活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低HDAC3活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株經由產生戊酸降低HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株經由產生丁酸鈉降低HDAC活性。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由降低HDAC活性用於治療或預防癌症。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防HDAC相關癌症。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由降低HDAC活性用於治療或預防轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、神經母細胞瘤、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、結腸直腸癌、血液惡性病及/或胃癌。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由降低HDAC活性用於治療或預防血液惡性病。

在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之HDAC抑制活性引起生長抑制。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之HDAC抑制活性引起細胞週期抑制。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之HDAC抑制活性引起細胞分化。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株 之HDAC抑制活性引起細胞凋亡。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株減少血管生成。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之HDAC抑制活性調節免疫反應。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株作為單一療法用於降低HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株作為組合療法用於降低HDAC活性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株與另一抗癌劑組合使用。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株與超過一種其他抗癌劑組合使用。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株與化學治療劑組合使用。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株與蛋白酶體抑制劑組合使用。在其他態樣中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株為表觀遺傳調控劑。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防特徵在於表觀遺傳異常之疾病。

本發明之組合物能夠藉由改變與涉及腸障壁功能之蛋白質之表現及定位相關的細胞內信號轉導來調控上皮通透性。詳言之，本發明之組合物增強閉合蛋白、Villin、緊密連接蛋白1(TJP1)及緊密連接蛋白2(TJP2)mRNA表現。因此，本發明之組合物用以增加腸障壁功能且降低腸通透性(實例11)。在某些實施例中，本發明之組合物用於增加腸障壁功能。在某些實施例中，本發明之組合物用於降低腸通透性。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防腸障壁功能減少。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防腸通透性增加。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於腸障壁功能減少之疾病或病狀。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於腸通透性增加之疾病或病狀。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防由放射線療法或化學療法引起之腸障壁功能減少。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防由放射線療法或化學療法引起之腸通透性增加。在某些實施例中，本發明之組合物藉由增加腸障壁功能用於治療或預防惡病質。在某些實施例中，本 發明之組合物藉由降低腸通透性用於治療或預防惡病質。在某些實施例中，惡病質為癌症惡病質。

在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於增加腸障壁功能。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於降低腸通透性。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防腸障壁功能減少。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防腸通透性增加。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防特徵在於腸障壁功能減少之疾病或病狀。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防特徵在於腸通透性增加之疾病或病狀。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防由放射線療法或化學療法引起之腸障壁功能減少。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防由放射線療法或化學療法引起之腸通透性增加。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由增加腸障壁功能用於治療或預防惡病質。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由降低腸通透性用於治療或預防惡病質。在某些實施例中，惡病質為癌症惡病質。

在較佳實施例中，組合物用於治療進行放射線療法或化學療法之患者中的癌症。在此類實施例中，組合物可在放射線療法或化學療法之前、期間或之後投與。進行放射線療法或化學療法之患者不應投與任何誘發腸滲漏之劑，但馬賽巨型球菌促進腸障壁功能[62]，因此本發明之組合物尤其適合於治療進行放射線療法或化學療法之患者。TLR-5之活化已顯示改善體內輻射誘發之上皮損傷[63]。本發明之組合物亦活化免疫系統。在一些實施例中，本發明之組合物用於治療放射線療法誘發之損傷。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療放射線療法誘發之損傷。

在一些實施例中，本發明之組合物可減少腫瘤生長。

在某些實施例中，用本發明之組合物治療減小腫瘤尺寸或減少腫瘤生長。在某些實施例中，本發明之組合物係用於減小腫瘤尺寸或減少腫瘤生長。本發明之組合物可有效減小腫瘤尺寸或生長。在某些實施例中，本發明之組合物係用於具有實體腫瘤之患者中。在某些實施例中，本發明之組合物係用於在癌症治療中減少或預防血管生成。本發明之組合物可對在血管生成中具有重要作用之免疫或炎性系統具有作用。本發明之組合物可具有抗轉移性活性。馬賽巨型球菌物種之細菌菌株可具有抗轉移性活性。在某些實施例中，本發明之組合物係用於預防轉移。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於預防轉移。

實例展示本發明之組合物之投與可引起PBMC中Treg百分比下降(圖6C)。Treg與癌症相關聯，且腫瘤組織中Treg之浸潤引起不良預後[64]。因為本發明之組合物之投與顯示選擇性地減少Treg群體(圖6C)，所以本發明之組合物可用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於細胞群體中Treg之百分比增加的癌症。在一個實施例中，本發明之組合物可用於治療或預防特徵在於細胞群體中CD4+CD25+CD127-細胞之百分比增加的癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低尤其癌組織中Treg之數目或百分比用於治療或預防癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由選擇性減少Treg用於治療癌症。

已提出選擇性地降低Treg及活化效應T細胞、諸如CD8+ T細胞之數目將為一種有效癌症療法[64]。實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起CD8細胞與Treg細胞之比率增加。因為本發明之組合物之投與顯示增加CD8/Treg細胞與活化CD8/Treg細胞兩者之比率(圖6G及圖6H)，所以本發明之組合物可用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於CD8/Treg及/或活化CD8/Treg細胞之比率降低的癌症。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於CD8/Treg細胞之比率降低的癌症。在一個 實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於活化CD8/Treg細胞之比率降低的癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞群體中Treg之百分比，由此增加CD8/Treg細胞之比率，用於治療或預防癌症。在另一個實施例中，本發明之組合物藉由降低細胞群體中Treg之百分比，由此增加活化CD8/Treg細胞之比率，用於治療或預防癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD8/Treg細胞之比率用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加活化CD8/Treg細胞之比率用於治療癌症。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-1β之表現增加。在結腸炎相關癌症中，IL-1β在腫瘤部位之表現減少與諸如增加之疾病後果及發病的症狀相關[65]。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-1β表現，所以本發明之組合物可用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-1β之表現下降或缺乏的癌症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-1β之表現用於治療或預防癌症。

實例顯示本發明之組合物之投與可引起腫瘤壞死因子α(TNF-α)之表現增加。TNF-α係一種促炎性細胞介素，已知其與促進細胞死亡之各種信號傳導路徑有關。TNF-α藉由結合於其同源受體TNFR-1開啟細胞凋亡，此引起細胞凋亡路徑中裂解事件之級聯。TNF-α亦可經由RIP激酶依賴性機制引起壞死。因為許多類型癌症具有缺陷性細胞凋亡及壞死路徑，且已知TNF-α介導此等細胞死亡路徑，所以TNF-α為癌症療法之潛在標靶。因為本發明之組合物之投與顯示增加TNF-α之表現，所以本發明之組合物可用於治療特徵在於TNF-α之表現下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療癌症，尤其用於治療或預防由TNF-α表現介導之癌症。在一個實施例中，本發明之組合物可用於治療由TNF-α表現介導之癌症，尤其TNF-α之表現及/或活性下降的癌症。在一個實施例中，本發明之組合物可用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物可藉 由增加TNF-α之水準及/或活性用於治療癌症。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防乳癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於在乳癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防乳癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在乳癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，癌症為乳腺癌。在較佳實施例中，癌症為IV期乳癌。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防肺癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於在肺癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防肺癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在肺癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，癌症為肺癌。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防肝癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於在肝癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防肝癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在肝癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，癌症為肝癌(肝細胞癌)。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防黑色素瘤。在某些實施例中，本發明之組合物用於在黑色素瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防黑色素瘤。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在黑色素瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，黑色素瘤為轉移性黑色素瘤。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防卵巢癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於在卵巢癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防卵巢癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在卵巢癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防子宮頸癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於在子宮頸癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防子宮頸癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在子宮頸癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防神經母細胞瘤。在某些實施例中，本發明之組合物用於在神經母細胞瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防神經母細胞瘤。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在神經母細胞瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防膠質母細胞瘤。在某些實施例中，本發明之組合物用於在膠質母細胞瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防膠質母細胞瘤。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在膠質母細胞瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防前列腺癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於在前列腺癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防前列腺癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在前列腺 癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防血液惡性病。在某些實施例中，本發明之組合物用於在血液惡性病之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防血液惡性病。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在血液惡性病之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在某些實施例中，血液惡性病為急性白血病。在某些實施例中，血液惡性病為慢性白血病。在某些實施例中，血液惡性病為急性骨髓性白血病。在某些實施例中，血液惡性病為慢性骨髓性白血病。在某些實施例中，血液惡性病為急性淋巴球性白血病。在某些實施例中，血液惡性病為慢性淋巴球性白血病。在某些實施例中，血液惡性病為淋巴瘤。在某些實施例中，血液惡性病為多發性骨髓瘤。在某些實施例中，血液惡性病為骨髓增生異常症候群。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防慢性淋巴球性白血病。在某些實施例中，本發明之組合物用於在慢性淋巴球性白血病之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防慢性淋巴球性白血病。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在慢性淋巴球性白血病之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防淋巴瘤。在某些實施例中，本發明之組合物用於在淋巴瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防淋巴瘤。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在淋巴瘤之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在某些實施例中，淋巴瘤為霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)。在某些實施例中，淋巴瘤為非霍奇金氏淋 巴瘤。

在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防胃癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於在胃癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防胃癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在胃癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防結腸癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防結腸直腸癌。本發明之組合物可對結腸癌細胞有影響且可有效治療結腸癌。本發明之組合物可對結腸癌細胞有影響且可有效治療結腸直腸癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於在結腸癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在某些實施例中，本發明之組合物用於在結腸直腸癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防結腸癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防結腸直腸癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在結腸癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在結腸直腸癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施例中，癌症為結腸直腸腺癌。

在某些實施例中，本發明之治療劑組合用於治療或預防腎癌(本文中亦稱為腎癌)。在某些實施例中，本發明之治療劑組合用於在腎癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防腎癌(本文中亦稱為腎癌)。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於在腎癌之治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。實例證明本發明之治療劑組合對腎癌細胞有影響且可有效治療腎 癌。在較佳實施例中，癌症為腎細胞癌或移行細胞癌。在一些實施例中，癌症在腸部。在一些實施例中，癌症處於非腸部之身體部分。在一些實施例中，癌症非腸部癌症。在一些實施例中，癌症非結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症非小腸癌。在一些實施例中，治療或預防除腸以外之部位。在一些實施例中，治療或預防腸以及除腸以外之部位。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防癌瘤。本發明之組合物可有效治療許多類型癌瘤。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防非免疫原性癌。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防癌瘤。馬賽巨型球菌物種之細菌菌株可有效治療許多類型癌瘤。在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株用於治療或預防非免疫原性癌。實例證明本發明之組合物可有效治療非免疫原性癌。

本發明之組合物對癌症的治療作用可能由促炎性機制介導。許多促炎性細胞介素之表現可能在投與MRx0029之後增加。炎症可具有癌症抑制作用[66]且正研究諸如TNF-α之促炎性細胞介素作為癌症療法[67]。實例中所示的諸如TNF-α之基因的上調可指示本發明之組合物可經由類似機制用於治療癌症。諸如CXCL9之CXCR3配位體之上調可指示本發明之組合物引起IFNγ類型反應。IFNγ係一種有效活化巨噬細胞之因子，其可刺激殺腫瘤活性[68]，且例如CXCL9亦具有抗癌作用[69-71]。實例證明許多促炎性細胞介素之表現可能在投與MRx0029之後增加。因此，在某些實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療中促進發炎。在較佳實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療中促進Th1發炎。Th1細胞產生IFNγ且具有有效抗癌作用[66]。在某些實施方案中，本發明的組合物用於治療早期癌症，例如尚未轉移之癌症或0期或1期癌症。促進發炎可能對早期癌症更有效[66]。在某些實施例中，本發明之組合物用於增強第二抗癌劑之作用。在某些實施例中，本發明之組合物用於促進發炎以增強第二抗 癌劑之作用。在某些實施例中，癌症之治療或預防包括增加一或多種細胞介素之表現水準。在某些實施例中，癌症之治療或預防包括增加一或多種促炎性細胞介素之表現水準。舉例而言，在某些實施例中，癌症之治療或預防包括增加IL-1β、IL-6、MIP-3α、CXCL9、IL-23、MCP-1、GMCSF及TNF-α中之一或多種的表現水準。在某些實施例中，癌症之治療或預防包括增加IL-1β及MIP-3α之表現水準。已知IL-1β、IL-6及TNF-α中之任一者的表現水準之增加均指示治療癌症之功效。

當如本文所述之細菌菌株與脂多醣(LPS)組合使用時，IL-1β可能協同增加。已知LPS引起促炎性作用。因此，在某些實施例中，治療或預防包括使用如本文所述之細菌菌株與上調IL-1β之劑組合。在某些實施例中，治療或預防包括使用如本文所述之細菌菌株與LPS組合。因此，本發明之組合物可另外包含上調IL-1β之劑。因此，本發明之組合物可另外包含LPS。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療先前已接受化學療法之患者。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療對化學療法治療已不耐受之患者。本發明之組合物可尤其適合於此類患者。

在某些實施例中，本發明之組合物用於預防復發。本發明之組合物可適合於長期投與。在某些實施例中，本發明之組合物用於預防癌症進展。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療非小細胞肺癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療小細胞肺癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療鱗狀細胞癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療腺癌。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療腺體腫瘤、類癌腫瘤或未分化癌。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療肝母細胞瘤、肝膽管型肝癌、膽管細胞囊腺癌或由病毒感染引起之肝癌。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療浸潤性導管癌、導管原 位癌或浸潤性小葉癌。

在其他實施例中，本發明之組合物係用於治療或預防急性淋巴母細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質癌、基細胞癌瘤、膽管癌、膀胱癌、骨腫瘤、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、腦腫瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、乳癌、支氣管腺瘤/類癌瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、類癌瘤腫瘤、子宮頸癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性脊髓增生病、結腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、眼內黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)、生殖細胞腫瘤、兒童期視覺通路及下丘腦神經膠質瘤、霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、胰島細胞癌瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎細胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、間皮瘤、神經母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、甲狀旁腺癌、咽癌、垂體腺瘤、漿細胞瘤形成、前列腺癌、腎細胞癌瘤、視網膜母細胞瘤、肉瘤、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。在其他實施例中，本發明之組合物用於治療或預防血液惡性病、多發性骨髓瘤或骨髓增生異常症候群。

本發明之組合物在與其他治療劑組合使用時可特別有效。本發明組合物之免疫調節作用在與更直接抗癌劑組合時可為有效的。因此，在某些實施例中，本發明提供一種組合物，其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株及抗癌劑。在某些實施例中，包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株的本發明之組合物用於刺激癌症以增強癌症對用第二抗癌劑治療之敏感性。在某些實施例中，包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株的本發明之組合物藉由增強對用第二抗癌劑治療之敏感性用於治療諸如腦癌之癌症。第二抗癌劑可同時投與，或可在包含馬賽巨型球菌物 種之細菌菌株的組合物之後，諸如之後至少一天、一週或一個月投與。

在較佳實施例中，抗癌劑為免疫檢查點抑制劑、靶向抗體免疫療法、CAR-T細胞療法、溶瘤病毒或抑制細胞生長藥物。在較佳實施例中，組合物包含選自由以下組成之群的抗癌劑：Yervoy(易普利單抗(ipilimumab)，BMS)；Keytruda(派姆單抗(pembrolizumab)，Merck)；Opdivo(納武單抗(nivolumab)，BMS)；MEDI4736(AZ/MedImmune)；MPDL3280A(Roche/Genentech)；曲美目單抗(Tremelimumab)(AZ/MedImmune)；CT-011(皮利珠單抗(pidilizumab)，CureTech)；BMS-986015(利魯單抗(lirilumab)，BMS)；MEDI0680(AZ/MedImmune)；MSB-0010718C(Merck)；PF-05082566(Pfizer)；MEDI6469(AZ/MedImmune)；BMS-986016(BMS)；BMS-663513(優瑞路單抗(urelumab)，BMS)；IMP321(Prima Biomed)；LAG525(Novartis)；ARGX-110(arGEN-X)；PF-05082466(Pfizer)；CDX-1127(瓦利路單抗(varlilumab)；CellDex Therapeutics)；TRX-518(GITR Inc.)；MK-4166(Merck)；JTX-2011(Jounce Therapeutics)；ARGX-115(arGEN-X)；NLG-9189(英多莫德(indoximod)，NewLink Genetics)；INCB024360(Incyte)；IPH2201(Innate Immotherapeutics/AZ)；NLG-919(NewLink Genetics)；抗VISTA(JnJ)；依帕斯塔特(Epacadostat)(INCB24360，Incyte)；F001287(Flexus/BMS)；CP 870893(University of Pennsylvania)；MGA271(Macrogenix)；依瑪珠單抗(Emactuzumab)(Roche/Genentech)；加尼斯替(Galunisertib)(Eli Lilly)；優庫路單抗(Ulocuplumab)(BMS)；BKT140/BL8040(Biokine Therapeutics)；巴維昔單抗(Bavituximab)(Peregrine Pharmaceuticals)；CC 90002(Celgene)；852A(Pfizer)；VTX-2337(VentiRx Pharmaceuticals)；IMO-2055(Hybridon，Idera Pharmaceuticals)；LY2157299(Eli Lilly)；EW-7197(Ewha Women's University，Korea)；威羅菲尼(Vemurafenib)(Plexxikon)；達拉菲尼(Dabrafenib)(Genentech/GSK)；BMS-777607(BMS)；BLZ945(Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre)；Unituxin(地土昔單抗(dinutuximab)，United Therapeutics Corporation)；Blincyto(布爾莫單抗(blinatumomab)，Amgen)；Cyramza(雷莫蘆單抗(ramucirumab)，Eli Lilly)；Gazyva(歐努珠單抗(obinutuzumab)，Roche/Biogen)；Kadcyla(阿多曲妥珠單抗恩他新(ado-trastuzumab emtansine)，Roche/Genentech)；Perjeta(帕妥珠單抗(pertuzumab)，Roche/Genentech)；Adcetris(布瑞西單抗維多新(brentuximab vedotin)，Takeda/Millennium)；Arzerra(奧法木單抗(ofatumumab)，GSK)；Vectibix(帕尼單抗(panitumumab)，Amgen)；Avastin(貝伐單抗(bevacizumab)，Roche/Genentech)；Erbitux(西妥昔單抗(cetuximab)，BMS/Merck)；Bexxar(托西莫單抗(tositumomab)-I131，GSK)；Zevalin(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen)；Campath(阿侖單抗(alemtuzumab)，Bayer)；Mylotarg(吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，Pfizer)；Herceptin(曲妥珠單抗(trastuzumab)，Roche/Genentech)；Rituxan(利妥昔單抗，Genentech/Biogen)；伏洛昔單抗(volociximab)(Abbvie)；艾那維單抗(Enavatuzumab)(Abbvie)；ABT-414(Abbvie)；埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)(Abbvie/BMS)；ALX-0141(Ablynx)；奧紮利單抗(Ozaralizumab)(Ablynx)；埃替單抗(Actimab)-C(Actinium)；埃替單抗-P(Actinium)；米拉珠單抗-多柔比星(Milatuzumab-dox)(Actinium)；Emab-SN-38(Actinium)；伊土莫單抗(Naptumonmab estafenatox)(Active Biotech)；AFM13(Affimed)；AFM11(Affimed)；AGS-16C3F(Agensys)；AGS-16M8F(Agensys)；AGS-22ME(Agensys)；AGS-15ME(Agensys)；GS-67E(Agensys)；ALXN6000(薩瑪利單抗(samalizumab)，Alexion)；ALT-836(Altor Bioscience)；ALT-801(Altor Bioscience)；ALT-803(Altor Bioscience)；AMG780(Amgen)；AMG 228(Amgen)；AMG820(Amgen)；AMG172(Amgen)；AMG595(Amgen)；AMG110(Amgen)；AMG232(阿達木單抗(adecatumumab)，Amgen)；AMG211(Amgen/MedImmune)；BAY20-10112(Amgen/Bayer)；瑞洛土單抗(Rilotumumab)(Amgen)；戴諾素單抗 (Denosumab)(Amgen)；AMP-514(Amgen)；MEDI575(AZ/MedImmune)；MEDI3617(AZ/MedImmune)；MEDI6383(AZ/MedImmune)；MEDI551(AZ/MedImmune)；帕莫西單抗(Moxetumomab pasudotox)(AZ/MedImmune)；MEDI565(AZ/MedImmune)；MEDI0639(AZ/MedImmune)；MEDI0680(AZ/MedImmune)；MEDI562(AZ/MedImmune)；AV-380(AVEO)；AV203(AVEO)；AV299(AVEO)；BAY79-4620(Bayer)；拉安土單抗(Anetumab ravtansine)(Bayer)；萬替珠單抗(vantictumab)(Bayer)；BAY94-9343(Bayer)；西羅珠單抗(Sibrotuzumab)(Boehringer Ingleheim)；BI-836845(Boehringer Ingleheim)；B-701(BioClin)；BIIB015(Biogen)；歐努珠單抗(Biogen/Genentech)；BI-505(Bioinvent)；BI-1206(Bioinvent)；TB-403(Bioinvent)；BT-062(Biotest)BIL-010t(Biosceptre)；MDX-1203(BMS)；MDX-1204(BMS)；奈西莫單抗(Necitumumab)(BMS)；CAN-4(Cantargia AB)；CDX-011(Celldex)；CDX1401(Celldex)；CDX301(Celldex)；U3-1565(Daiichi Sankyo)；帕曲土單抗(patritumab)(Daiichi Sankyo)；替加土單抗(tigatuzumab)(Daiichi Sankyo)；尼妥珠單抗(nimotuzumab)(Daiichi Sankyo)；DS-8895(Daiichi Sankyo)；DS-8873(Daiichi Sankyo)；DS-5573(Daiichi Sankyo)；MORab-004(Eisai)；MORab-009(Eisai)；MORab-003(Eisai)；MORab-066(Eisai)；LY3012207(Eli Lilly)；LY2875358(Eli Lilly)；LY2812176(Eli Lilly)；LY3012217(Eli Lilly)；LY2495655(Eli Lilly)；LY3012212(Eli Lilly)；LY3012211(Eli Lilly)；LY3009806(Eli Lilly)；西妥木單抗(cixutumumab)(Eli Lilly)；法拉維單抗(Flanvotumab)(Eli Lilly)；IMC-TR1(Eli Lilly)；雷莫蘆單抗(Eli Lilly)；塔巴木單抗(Tabalumab)(Eli Lilly)；紮諾利單抗(Zanolimumab)(Emergent Biosolution)；FG-3019(FibroGen)；FPA008(Five Prime Therapeutics)；FP-1039(Five Prime Therapeutics)；FPA144(Five Prime Therapeutics)；卡妥索單抗(catumaxomab)(Fresenius Biotech)；IMAB362(Ganymed)；IMAB027(Ganymed)；HuMax-CD74 (Genmab)；HuMax-TFADC(Genmab)；GS-5745(Gilead)；GS-6624(Gilead)；OMP-21M18(登西珠單抗(demcizumab)，GSK)；馬帕木單抗(mapatumumab)(GSK)；IMGN289(ImmunoGen)；IMGN901(ImmunoGen)；IMGN853(ImmunoGen)；IMGN529(ImmunoGen)；IMMU-130(Immunomedics)；米拉珠單抗-多柔比星(Immunomedics)；IMMU-115(Immunomedics)；IMMU-132(Immunomedics)；IMMU-106(Immunomedics)；IMMU-102(Immunomedics)；依帕珠單抗(Epratuzumab)(Immunomedics)；克利瓦單抗(Clivatuzumab)(Immunomedics)；IPH41(Innate Immunotherapeutics)；達拉土單抗(Daratumumab)(Janssen/Genmab)；CNTO-95(Intetumumab，Janssen)；CNTO-328(西妥昔單抗(siltuximab)，Janssen)；KB004(KaloBios)；莫加利單抗(mogamulizumab)(Kyowa Hakko Kirrin)；KW-2871(依美昔單抗(ecromeximab)，Life Science)；索奈珠單抗(Sonepcizumab)(Lpath)；馬土西單抗(Margetuximab)(Macrogenics)；恩利珠單抗(Enoblituzumab)(Macrogenics)；MGD006(Macrogenics)；MGF007(Macrogenics)；MK-0646(達洛珠單抗(dalotuzumab)，Merck)；MK-3475(Merck)；Sym004(Symphogen/Merck Serono)；DI17E6(Merck Serono)；MOR208(Morphosys)；MOR202(Morphosys)；Xmab5574(Morphosys)；BPC-1C(恩斯土單抗(ensituximab)，Precision Biologics)；TAS266(Novartis)；LFA102(Novartis)；BHQ880(Novartis/Morphosys)；QGE031(Novartis)；HCD122(盧卡木單抗(lucatumumab)，Novartis)；LJM716(Novartis)；AT355(Novartis)；OMP-21M18(登西珠單抗，OncoMed)；OMP52M51(Oncomed/GSK)；OMP-59R5(Oncomed/GSK)；萬替珠單抗(Oncomed/Bayer)；CMC-544(奧英妥珠單抗(inotuzumab ozogamicin)，Pfizer)；PF-03446962(Pfizer)；PF-04856884(Pfizer)；PSMA-ADC(Progenics)；REGN1400(Regeneron)；REGN910(奈瓦庫單抗(nesvacumab)，Regeneron/Sanofi)；REGN421(恩替庫單抗(enoticumab)，Regeneron/Sanofi)；RG7221、RG7356、RG7155、RG7444、RG7116、 RG7458、RG7598、RG7599、RG7600、RG7636、RG7450、RG7593、RG7596、DCDS3410A、RG7414(帕薩珠單抗(parsatuzumab))、RG7160(伊佳珠單抗(imgatuzumab))、RG7159(歐賓珠單抗(obintuzumab))、RG7686、RG3638(歐奈珠單抗(onartuzumab))、RG7597(Roche/Genentech)；SAR307746(Sanofi)；SAR566658(Sanofi)；SAR650984(Sanofi)；SAR153192(Sanofi)；SAR3419(Sanofi)；SAR256212(Sanofi)，SGN-LIVIA(林妥珠單抗(lintuzumab)，Seattle Genetics)；SGN-CD33A(Seattle Genetics)；SGN-75(馬維珠單抗(vorsetuzumab mafodotin)，Seattle Genetics)；SGN-19A(Seattle Genetics)；SGN-CD70A(Seattle Genetics)；SEA-CD40(Seattle Genetics)；替伊莫單抗(Spectrum)；MLN0264(Takeda)；加尼妥單抗(ganitumab)(Takeda/Amgen)；CEP-37250(Teva)；TB-403(Thrombogenic)；VB4-845(Viventia)；Xmab2512(Xencor)；Xmab5574(Xencor)；尼妥珠單抗(YM Biosciences)；卡路單抗(Carlumab)(Janssen)；NY-ESO TCR(Adaptimmune)；MAGE-A-10 TCR(Adaptimmune)；CTL019(Novartis)；JCAR015(Juno Therapeutics)；KTE-C19 CAR(Kite Pharma)；UCART19(Cellectis)；BPX-401(Bellicum Pharmaceuticals)；BPX-601(Bellicum Pharmaceuticals)；ATTCK20(Unum Therapeutics)；CAR-NKG2D(Celyad)；Onyx-015(Onyx Pharmaceuticals)；H101(Shanghai Sunwaybio)；DNX-2401(DNAtrix)；VCN-01(VCN Biosciences)；Colo-Ad1(PsiOxus Therapeutics)；ProstAtak(Advantagene)；Oncos-102(Oncos Therapeutics)；CG0070(Cold Genesys)；Pexa-vac(JX-594，Jennerex Biotherapeutics)；GL-ONC1(Genelux)；T-VEC(Amgen)；G207(Medigene)；HF10(Takara Bio)；SEPREHVIR(HSV1716，Virttu Biologics)；OrienX010(OrienGene Biotechnology)；Reolysin(Oncolytics Biotech)；SVV-001(Neotropix)；Cacatak(CVA21，Viralytics)；Alimta(Eli Lilly)、順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、伊立替康(irinotecan)、亞葉酸(folinic acid)、甲胺喋呤、環磷醯胺 (cyclophosphamide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、Zykadia(Novartis)、Tafinlar(GSK)、Xalkori(Pfizer)、Iressa(AZ)、Gilotrif(Boehringer Ingelheim)、Tarceva(Astellas Pharma)、Halaven(Eisai Pharma)、Veliparib(Abbvie)、AZD9291(AZ)、阿雷替尼(Alectinib)(Chugai)、LDK378(Novartis)、蓋納特皮(Genetespib)(Synta Pharma)、Tergenpumatucel-L(NewLink Genetics)、GV1001(Kael-GemVax)、替瓦替尼(Tivantinib)(ArQule)；Cytoxan(BMS)；Oncovin(Eli Lilly)；阿黴素(Adriamycin)(Pfizer)；Gemzar(Eli Lilly)；Xeloda(Roche)；Ixempra(BMS)；Abraxane(Celgene)；Trelstar(Debiopharm)；Taxotere(Sanofi)；Nexavar(Bayer)；IMMU-132(Immunomedics)；E7449(Eisai)；Thermodox(Celsion)；Cometriq(Exellxis)；Lonsurf(Taiho Pharmaceuticals)；Camptosar(Pfizer)；UFT(Taiho Pharmaceuticals)；及TS-1(Taiho Pharmaceuticals)。

在一些實施例中，以登錄號NCIMB 42761寄存之馬賽巨型球菌之細菌菌株係本發明之組合物中的唯一治療活化劑。

本發明者已確定來自巨型球菌屬之細菌菌株可尤其有效治療或預防包含致癌細胞外信號相關激酶(ERK)信號傳導之癌症。細胞外信號相關激酶(ERK)係有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶路徑中之下游效應子，MAP激酶路徑為在所有真核生物中發現之高度保守之信號轉導路徑[72]。MAP激酶路徑調控諸如細胞增殖、分化、存活及細胞凋亡之過程，且路徑之異常活化與癌症發病機理緊密相關。如實例中所述，包含巨型球菌菌株之組合物之投與可抑制癌細胞株中之ERK信號傳導；亦即，相對於總ERK蛋白質，降低磷酸化ERK之細胞水準。本發明者亦已確定用巨型球菌菌株治療可降低包含致癌ERK信號傳導之癌細胞株、尤其黑色素瘤及結腸直腸癌細胞株之純系存活。本發明者亦已確定用巨型球菌菌株治療可誘導微管相關蛋白2(MAP2)之基因表現，此表明尤其適用於治療轉移性癌症。

因此，在某些實施例中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於治療或預防癌症之方法中，其中該癌症包含致癌ERK信號傳導。

如本文所用，「致癌ERK信號傳導」係指包含失調之經由MAP激酶路徑之細胞信號傳導，諸如非刺激物依賴性信號傳導，結果引起ERK(ERK1或ERK2同功型或者兩者)信號傳導過度活化，使得癌細胞增殖及/或存活增加的癌症。當在位置Thr202及Tyr204發生磷酸化時ERK1為活性的(亦即信號傳導)。當在位置Thr173及Tyr185發生磷酸化時ERK 2為活性的(亦即信號傳導)。因此，「致癌ERK信號傳導」可由MAP激酶路徑之正調節蛋白之(功能獲得突變)中存在致癌突變或其過度表現或MAP激酶路徑之負調節蛋白之(功能喪失突變)中存在致癌突變或其表現下調所引起。

可替代地，包含致癌ERK信號傳導之癌症可定義為「展現」或「特徵在於」致癌ERK信號傳導之癌症。可替代地，包含致癌ERK信號傳導之癌症可定義為其中惡性細胞之增殖及/或存活藉由ERK信號傳導「刺激」、「誘發」或「上調」之癌症。可替代地，包含致癌ERK之癌症可定義為包含、展現或特徵在於「非刺激物依賴性ERK信號傳導」之癌症。

「致癌突變」涵蓋蛋白質中相對於野生型蛋白質之促進癌細胞增殖及/或存活的任何胺基酸變異，包括(但不限於)取代(包括單胺基酸取代)、插入及/或缺失。如上所述，致癌突變可為功能喪失或功能獲得突變，視蛋白質及其在MAP激酶路徑內之功能而定。「過度表現」或「表現下調」分別係指癌細胞中相對於非癌細胞，蛋白質之表現增加或減少。

因此，包含致癌ERK信號傳導之癌症包括BRAF、NRAS、ARAF、CRAF、EGFR、GRB2、SOS、HRAS、KRAS4A、KRAS4B、MEK1、MEK2、ERK1或ERK2，諸如BRAF、ARAF、CRAF、EGFR、GRB2、SOS、HRAS、 MEK1、MEK2、ERK1或ERK2中包含致癌突變或過度表現的癌症。此等蛋白質為MAP激酶路徑之正調節蛋白(亦即致癌蛋白)[72]。舉例而言，癌症可包含BRAF、NRAS、ARAF、CRAF、EGFR、GRB2、SOS、HRAS、MEK1、MEK2、ERK1或ERK2中之致癌突變。

包含致癌ERK信號傳導之癌症亦包括包含(或者可替代地以上致癌突變/過度表現，或除此之外)RSK、DUSP1、DUSP5、DUSP6或SPRY中之致癌突變或表現下調的癌症。此等蛋白質為MAP激酶路徑之負調節蛋白(亦即腫瘤抑制蛋白)[72]。

可使用本發明之組合物治療或預防包含致癌ERK信號傳導之任何癌症，諸如實體腫瘤或血液惡性病。此類癌症包括(但不限於)結腸直腸癌、黑色素瘤、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質癌、基細胞癌瘤、膽管癌、膀胱癌、骨腫瘤、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、腦腫瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、乳癌、支氣管腺瘤/類癌瘤、伯基特氏淋巴瘤、類癌瘤腫瘤、子宮頸癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性脊髓增生病、皮膚T細胞淋巴瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因肉瘤、眼內黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、生殖細胞腫瘤、兒童期視覺通路及下丘腦神經膠質瘤、霍奇金氏淋巴瘤、胰島細胞癌瘤、卡波西氏肉瘤、腎細胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、間皮瘤、神經母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、甲狀旁腺癌、咽癌、垂體腺瘤、漿細胞瘤形成、前列腺癌、腎細胞癌瘤、視網膜母細胞瘤、肉瘤、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。

包含致癌ERK信號傳導之任何癌症可藉由包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物治療或預防，且較佳為結腸直腸癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺腺癌(諸 如非小細胞肺腺癌)、胰臟癌、膀胱癌、白血病(諸如毛細胞白血病或急性骨髓性白血病)、神經膠質瘤、毛細胞型星形細胞瘤、卵巢癌、乳頭狀或濾泡性甲狀腺癌、精原細胞瘤、肝癌、骨髓增生異常症候群、腎癌或霍奇金氏病。

在較佳實施例中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於治療或預防包含BRAF中之致癌突變之癌症的方法中，視情況其中該癌症還包含BRAF之過度表現。本發明者已確定用巨型球菌菌株治療可在包含致癌BRAF突變之癌細胞株中、尤其包含致癌BRAF V600E突變之結腸直腸癌及黑色素瘤細胞株中，抑制純系存活，抑制ERK信號傳導且上調MAP2基因表現。因此，在較佳實施例中，本發明亦提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於治療或預防在BRAF之位置600處包含致癌突變、較佳BRAF V600E之癌症的方法中。在特別較佳實施例中，癌症為結腸直腸癌或黑色素瘤。

除BRAF之位置600處之致癌突變(諸如V600E)外或代替其，癌症可包含選自BRAF K601E、G469A、G469V、L597R、K601N、G464V、N581S、L597Q、A598V、G464R、G466A或G469E之致癌突變；視情況其中該癌症為結腸直腸癌。在另一實施例中，除V600E突變外或代替其，癌症可包含選自BRAF V600K、V600R或V600D之致癌突變；視情況其中該癌症為黑色素瘤。

在另一態樣中，本發明亦提供一種包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物，其用於治療結腸直腸癌、諸如轉移性結腸直腸癌之方法中。如實例中所示，本發明者已發現馬賽巨型球菌菌株可抑制結腸直腸癌細胞株中之純系存活及ERK信號傳導。

在另一態樣中，本發明亦提供一種包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物，其用於治療黑色素瘤、諸如轉移性黑色素瘤之方法中。如實例中所示，本發明者已發現馬賽巨型球菌菌株可抑制黑色素瘤細胞株中之純系存活及ERK信號傳導。此外，馬賽巨型球菌菌株在黑色素瘤細胞株中誘導MAP2基因 表現之能力指示尤其針對轉移性黑色素瘤之功效。

在較佳實施例中，相對於包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物的投與，BRAF抑制劑同時、分開或相繼投與。較佳地，BRAF抑制劑為BRAF^V600E之選擇性抑制劑，較佳選自威羅菲尼、達帕菲尼(Dabrafinib)或恩考芬尼(Encorafenib)。更佳地，BRAF抑制劑為威羅菲尼。

在另一態樣中，本發明亦提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株及BRAF抑制劑、較佳以上定義之BRAF抑制劑的組合物，兩者同時、分開或相繼用於治療或預防癌症。

在其他較佳實施例中，相對於包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物的投與，胞苷類似物同時、分開或相繼投與。較佳地，胞苷類似物係選自氮胞苷-c(Azacytidine-c)、地西他濱(Decitabine)或澤布拉林(Zebularine)。更佳地，胞苷類似物為氮胞苷-c。

在另一態樣中，本發明亦提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株及胞苷類似物、較佳以上定義之胞苷類似物的組合物，兩者同時、分開或相繼用於治療或預防癌症。

在其他較佳實施例中，相對於包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物的投與，微管蛋白聚合抑制劑或微管蛋白解聚抑制劑同時、分開或相繼投與。較佳地，微管蛋白聚合抑制劑或微管蛋白解聚抑制劑係選自太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、Abraxane、多西紫杉醇(Docetaxel)、埃坡黴素(Epothilone)、(+)-圓皮海綿內酯、秋水仙鹼、考布他汀(Combretastatin)、2-甲氧雌甾二醇、E7010、長春新鹼(Vincristine)、長春花鹼(Vinblastine)、長春瑞濱(Vinorelbine)或長春氟寧(Vinflunine)；更佳太平洋紫杉醇。

在另一態樣中，本發明亦提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株及微管蛋白聚合抑制劑或微管蛋白解聚抑制劑、較佳以上定義之彼等抑制劑的組合 物，兩者同時、分開或相繼用於治療或預防癌症。在另一態樣中，本發明亦提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其藉由增加癌症對微管蛋白聚合或解聚抑制劑、較佳以上定義之彼等抑制劑的敏感性用於癌症療法中。

在其他此類實施例中，本發明提供：

1.一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，其用於治療或預防癌症之方法中，尤其其中該癌症包含致癌ERK信號傳導。

2.根據實施例1之供使用之組合物，其中該癌症包含BRAF、NRAS、ARAF、CRAF、EGFR、GRB2、SOS、HRAS、KRAS4A、KRAS4B、MEK1、MEK2、ERK1或ERK2中之致癌突變或其過度表現。

3.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其中該癌症包含RSK、DUSP1、DUSP5、DUSP6或SPRY中之致癌突變或其表現下調。

4.根據實施例2之供使用之組合物，其中該癌症包含BRAF、ARAF、CRAF、EGFR、GRB2、SOS、HRAS、MEK1、MEK2、ERK1或ERK2中之致癌突變或其過度表現。

5.根據實施例2之供使用之組合物，其中該癌症包含BRAF、NRAS、ARAF、CRAF、EGFR、GRB2、SOS、HRAS、MEK1、MEK2、ERK1或ERK2中之致癌突變。

6.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其中該癌症包含BRAF或NRAS中之致癌突變，視情況其中該癌症還包含BRAF或NRAS之過度表現。

7.根據實施例6之供使用之組合物，其中該癌症包含BRAF中之致癌突變，視情況其中該癌症還包含BRAF之過度表現。

8.根據實施例7之供使用之組合物，其中該癌症在BRAF之位置600處包含致癌突變。

9.根據實施例6至8中任一項之供使用之組合物，其中該癌症包含選自BRAF V600E、K601E、G469A、G469V、L597R、K601N、G464V、N581S、L597Q、A598V、G464R、G466A或G469E之致癌突變；視情況其中該癌症為結腸直腸癌。

10.根據實施例6至8中任一項之供使用之組合物，其中該癌症包含選自BRAF V600E、V600K、V600R或V600D之致癌突變；視情況其中該癌症為黑色素瘤。

11.根據實施例6至10中任一項之供使用之組合物，其中該癌症包含致癌突變BRAF V600E。

12.根據實施例6至11中任一項之供使用之組合物，其中該癌症包含致癌突變NRAS Q61R，視情況其中該癌症為黑色素瘤。

13.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其中該癌症係選自結腸直腸癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺腺癌(諸如非小細胞肺腺癌)、胰臟癌、膀胱癌、白血病(諸如毛細胞白血病或急性骨髓性白血病)、神經膠質瘤、毛細胞型星形細胞瘤、卵巢癌、乳頭狀或濾泡性甲狀腺癌、精原細胞瘤、肝癌、骨髓增生異常症候群、腎癌或霍奇金氏病。

14.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其中該癌症為結腸直腸癌。

15.根據實施例1至13中任一項之供使用之組合物，其中該癌症為黑色素瘤。

16.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其中該細菌菌株屬於馬賽巨型球菌物種。

17.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其在該癌症之治療或預防中用於抑制ERK1及/或ERK2信號傳導之方法中。

18.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其在該癌症之治療或預防中用於抑制ERK1及/或ERK2磷酸化之方法中。

19.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其在該癌症之治療或預防中用於誘導MAP2基因表現之方法中。

20.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其在該癌症之治療或預防中用於減小腫瘤尺寸、腫瘤生長、預防或抑制轉移或預防血管生成之方法中。

21.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其在該癌症之治療中用於抑制轉移之方法中。

22.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其中該方法包括相對於該組合物之投與，同時、分開或相繼投與BRAF抑制劑。

23.根據實施例22之供使用之組合物，其中該BRAF選擇性地抑制BRAF^V600E，較佳地其中該BRAF抑制劑係選自威羅菲尼、達帕菲尼或恩考芬尼。

24.根據實施例23之供使用之組合物，其中該BRAF抑制劑為威羅菲尼。

25.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其中該方法包括相對於該組合物之投與，同時、分開或相繼投與胞苷類似物。

26.根據實施例25之供使用之組合物，其中該胞苷類似物係選自氮胞苷-c、地西他濱或澤布拉林。

27.根據實施例26之供使用之組合物，其中該胞苷類似物為氮胞苷-c。

28.根據任一前述實施例之供使用之組合物，其中該方法包括相對於該組合物之投與，同時、分開或相繼投與微管蛋白聚合抑制劑或微管蛋白解聚抑制劑。

29.根據實施例28之供使用之組合物，其中該微管蛋白聚合抑制劑或微管蛋白解聚抑制劑係選自太平洋紫杉醇、Abraxane、多西紫杉醇、埃坡黴素、(+)-圓皮海綿內酯、秋水仙鹼、考布他汀、2-甲氧雌甾二醇、E7010、長春新鹼、長春花鹼、長春瑞濱或長春氟寧。

較佳地，可使用本發明之組合物(尤其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物)治療或預防的包含致癌ERK信號傳導之癌症包括(但不限於)結腸直腸癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺腺癌(諸如非小細胞肺腺癌)、胰臟癌、膀胱癌、白血病(諸如毛細胞白血病或急性骨髓性白血病)、神經膠質瘤、毛細胞型星形細 胞瘤、卵巢癌、乳頭狀或濾泡性甲狀腺癌、精原細胞瘤、肝癌、骨髓增生異常症候群、腎癌或霍奇金氏病。已報導此類癌症包含過度活化之MAP激酶路徑(亦即致癌ERK信號傳導)[72]。

在一個特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防包含BRAF或NRAS中之致癌突變的癌症，視情況其中該癌症還包含BRAF或NRAS之過度表現。較佳地，本發明之組合物(尤其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物)用於治療或預防包含BRAF中之致癌突變及視情況BRAF過度表現之癌症。

BRAF中之致癌突變包括V600E、K601E、G469A、G469V、L597R、K601N、G464V、N581S、L597Q、A598V、G464R、G466A或G469E，此已在結腸直腸癌中確定[73]，且本發明之組合物(尤其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物)可用於治療或預防此類癌症。BRAF中之其他致癌突變包括V600E、V600K、V600R或V600D，此已在黑色素瘤中確定[74]，且本發明之組合物(尤其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物)可用於治療或預防此類癌症。BRAF中之胺基酸根據UniProt登錄號P15056[75](野生型BRAF)編號。

在一特別較佳實施例中，本發明之組合物(尤其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物)用於治療或預防包含突變BRAF V600E之癌症。癌細胞株SKMEL28、451Lu及HT29包含BRAF中之此突變，且在實例中發現巨型球菌菌株在此類細胞株中抑制純系存活，抑制ERK信號傳導且誘導MAP2基因表現。癌症還可包含致癌突變NRAS Q61R。癌細胞株SKMEL2包含NRAS中之此突變，且在實例中發現巨型球菌之菌株在此細胞株中誘導MAP2基因表現。

實例中所用之HT29細胞株為結腸直腸癌細胞株，且發現巨型球菌之菌株在此細胞株中抑制純系存活及抑制ERK信號傳導。因此，在特別較佳實施例中，本發明之組合物(尤其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物)用於 治療或預防結腸直腸癌，諸如包含突變BRAF V600E之結腸直腸癌。

實例中使用之SKMEL2及SKMEL28及451Lu細胞株為黑色素瘤細胞株，且發現巨型球菌菌株在此類細胞株中抑制純系存活，抑制ERK信號傳導且誘導MAP2基因表現。因此，在特別較佳實施例中，本發明之組合物(尤其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物)用於治療或預防黑色素瘤，諸如包含突變BRAF V600E之黑色素瘤。

在另一個態樣中，本發明之組合物包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株，其用於治療結腸直腸癌之方法中。在另一個態樣中，本發明之組合物包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株，其用於治療黑色素瘤之方法中。

在以上詳述之任一態樣及實施例中，本發明之組合物(尤其包含馬賽巨型球菌物種之細菌菌株之組合物)較佳用於治療轉移性癌症。如實例中所報導，發現巨型球菌菌株上調MAP2基因表現。已發現MAP2在原發性皮膚黑色素瘤中高度表現，但在轉移性黑色素瘤中表現減少[76]。已提出增加微管穩定蛋白之表現或用諸如MAP2之微管穩定蛋白治療可干擾在細胞分裂期間需要之微管動態不穩定性。因此，認為MAP2上調在癌症中阻礙細胞分裂且延遲腫瘤生長[76]，此表明本發明之組合物尤其可用於治療轉移性癌症。

如實例中所證明，包含巨型球菌菌株之本發明之組合物具有在黑色素瘤及結腸直腸癌細胞株中誘導MAP2基因表現及抑制ERK信號傳導之作用。因此，本發明之組合物可在如上定義之包含致癌ERK信號傳導之癌症的治療或預防中用於抑制ERK信號傳導，諸如ERK1及/或ERK2信號傳導之方法中。本發明之組合物亦可在此類癌症之治療或預防中用於抑制ERK磷酸化，諸如ERK1及/或ERK2磷酸化之方法中。本發明之組合物亦可在此類癌症之治療或預防中用於誘導MAP2基因表現之方法中。MAP2基因表現與增加之癌症對靶向微管化合物(諸如太平洋紫杉醇)之敏感性相關[77]。因此，本發明之組合物可用於增 加此類癌症對微管蛋白聚合或解聚抑制劑、尤其太平洋紫杉醇之敏感性。本發明之組合物亦可在包含致癌ERK信號傳導之癌症之治療或預防中用於減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長、預防或抑制轉移或預防血管生成之方法中。歸因於實例中證明之對MAP2基因表現之作用，本發明之組合物較佳在此類癌症之治療中用於抑制轉移之方法中。

在另一態樣中，包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物在癌症之治療或預防中用於抑制ERK1及/或ERK2信號傳導之方法中。在另一態樣中，包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物在癌症之治療或預防中用於抑制ERK1及/或ERK2磷酸化之方法中。在另一態樣中，包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物在癌症之治療或預防中用於誘導MAP2基因表現之方法中。在該等其他態樣中，較佳地，癌症之特徵如上所詳述(「癌症及其特徵」)。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療小腸癌，諸如小腸腺癌。用於實例中之經甲胺喋呤處理之HT29細胞株具有與小腸上皮細胞類似之表型且本發明之組合物顯示對此類細胞具有有效作用。在某些實施例中，本發明之組合物在癌症、尤其小腸癌之治療或預防中用於促進細胞凋亡。

在某些實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療或預防中誘導GPR109a基因表現之方法中。

在某些實施例中，本發明之組合物用於在癌症之治療或預防中增加IL-8水準之方法中。

在某些實施例中，本發明之組合物用於治療結腸直腸癌，諸如結腸直腸腺癌。用於實例中之Caco-2細胞株為結腸直腸腺癌細胞株且本發明之組合物顯示對此類細胞具有有效作用。

在某些實施例中，組合物用於治療或預防轉移性黑色素瘤、小細胞肺癌或肺腺鱗癌。實例中所示之對NSE之作用表明本發明之組合物可尤其有效 針對此等癌症。

在某些實施例中，本發明之組合物不用於治療癌症。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療非癌症之疾病或病症。

用作疫苗佐劑

實例顯示本發明之組合物之投與可引起腫瘤壞死因子α(TNF-α)之表現增加。已知TNF-α對疫苗反應而言係重要的。舉例而言，已證明TNF-α係老年群體之流感疫苗接種中之有效疫苗反應所需的[78]。因為本發明之組合物之投與顯示增加TNF-α表現，所以本發明之組合物可用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加TNF-α之水準及/或活性用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物在流感療法中用作疫苗佐劑。在某些實施例中，本發明之組合物用於增強針對抗原之免疫反應。在某些實施例中，本發明提供一種組合物，其與抗原組合投與。在某些實施例中，本發明之組合物在即將接種疫苗時或在接種疫苗之後立即投與患者。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-6之表現增加。IL-6表現增加與許多疾病之疫苗反應相關。舉例而言，在向成人投與流感疫苗之後CD14+CD16-炎性單核球產生IL-6[79]，且較高水準之IL-6與實現對流感疫苗之疫苗反應有關[80]。此外，在注射AS03佐劑系統之後產生IL-6[81]，且小鼠中IL-6之下調顯示減少投與肺結核疫苗之後的輔助性T細胞反應[82]。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-6表現，所以本發明之組合物可用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-6之水準及/或活性用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物在肺結核療法中用作疫苗佐劑。

此外，IL-6及TNF-α表現顯示與治療性HIV疫苗[Huang等人]、肺 結核疫苗及衣原體屬疫苗[83]之功效相關。Su等人[84]顯示IL-6或TNF-α與FMDV DNA疫苗共同接種引起CD4+及CD8+ T細胞對IFN-γ之表現增加、CD4+ T細胞中IL-4之表現較高及較高抗原特異性細胞毒性反應。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-6及TNF-α表現，所以本發明之組合物可用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加TNF-α之水準及/或活性可用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-6之水準及/或活性可用作疫苗佐劑。在一個特定實施例中，本發明之組合物藉由增加TNF-α及IL-6之水準及/或活性可用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物在HIV療法中用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物在衣原體屬療法中用作疫苗佐劑。

實例顯示本發明之組合物之投與可引起MIP-3α之表現增加。MIP-3α已顯示增加對HIV疫苗之反應[85]。因為本發明之組合物之投與顯示增加MIP-3α表現，所以本發明之組合物可用作疫苗佐劑。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-1β之表現。Li等人[86]顯示佐劑氫氧化鋁活化IL-1β之分泌，且表明IL-1β可充當佐劑。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-1β表現，所以本發明之組合物可用作疫苗佐劑。實例顯示本發明之組合物之投與可增加CD8+ T細胞與Treg之比率。佐劑已顯示刺激CD8+ T細胞[87]，且因為本發明之組合物之投與顯示增加CD8+ T細胞與Treg之比率，所以本發明之組合物可用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加CD8+ T細胞與Treg之比率用作疫苗佐劑。

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-8之表現增加。IL-8表現增加與許多疾病之疫苗反應相關。舉例而言，較高水準之IL-8與實現對禽流感疫苗之疫苗反應有關[88]。此外，IL-8在DNA疫苗接種模型中用作分子佐劑 [89]。因此，IL-8可用作免疫刺激劑以提高例如禽流感疫苗之免疫效率。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-8表現，所以本發明之組合物可用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加IL-8之水準及/或活性用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物在流感療法中用作疫苗佐劑。在一些實施例中，當用作疫苗佐劑時，本發明之組合物獨自投與以對分開投與患者之抗原提供輔助作用。在某些實施例中，本發明之組合物經口投與，而抗原非經腸注射。

本發明之組合物可用於增強對任何有用抗原之免疫反應。用於本發明之例示性抗原包括：病毒抗原，諸如病毒表面蛋白；細菌抗原，諸如蛋白質及/或醣抗原；真菌抗原；寄生蟲抗原；及腫瘤抗原。本發明尤其可用於針對流感病毒、HIV、鉤蟲、B型肝炎病毒、單純疱疹病毒、狂犬病、呼吸道合胞病毒、巨細胞病毒、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、衣原體屬、SARS冠狀病毒、水痘帶狀疱疹病毒、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、艾伯斯坦巴爾病毒(Epstein Barr virus)、人類乳頭狀瘤病毒等之疫苗。用於本發明之其他抗原包括糖蛋白及脂聚糖抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸基-Tn(STn)、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、威爾姆氏腫瘤基因(Wilms tumour gene)(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾伯斯坦巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、β-澱粉狀蛋白、τ蛋白、PCSK9及成癮物質，例如菸鹼、灑精或鴉片劑。

用於本發明之較佳抗原包括病原體抗原及腫瘤抗原。抗原將引起對抗原具有特異性之免疫反應，有效防止病原體感染或攻擊腫瘤。抗原可為例如肽或多醣。

本發明亦提供以下各者之用途：(i)抗原之水性製劑；及(ii)包含巨型 球菌屬之細菌菌株、較佳馬賽巨型球菌物種之組合物，用於製造供提高患者中之免疫反應的藥劑。

藉由此等方法及用途提高之免疫反應一般包括抗體反應，較佳保護性抗體反應。

在一些實施例中，巨型球菌屬之細菌菌株經工程改造以呈遞抗原。在本發明之細菌菌株上呈遞抗原可最大化免疫刺激活性且進一步增強針對該抗原產生之保護性免疫反應。此外，以此方式製造及遞送包含抗原及本發明之細菌之治療劑可比抗原及包含細菌菌株之組合物每一者分開製造及投與時更高效及有效。因此，在一些實施例中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之組合物，該細菌菌株在例如其細胞表面上呈遞抗原。在一些實施例中，包含呈遞抗原之細菌菌株的組合物用作疫苗抗原。在一些實施例中，抗原來源於HIV、鉤蟲、B型肝炎病毒、單純疱疹病毒、狂犬病、呼吸道合胞病毒、巨細胞病毒、金黃色葡萄球菌、衣原體屬、SARS冠狀病毒、水痘帶狀疱疹病毒、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、結核分枝桿菌、炭疽桿菌、艾伯斯坦巴爾病毒或人類乳頭狀瘤病毒。在一些實施例中，抗原為糖蛋白抗原、脂聚糖抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸基-Tn(STn)、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、威爾姆氏腫瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾伯斯坦巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、β-澱粉狀蛋白、τ蛋白、PCSK9或成癮物質，諸如灑精或鴉片劑及其類似物。

在一些實施例中，本發明之細菌表現一或多種抗原。一般地，抗原將重組表現且對於本發明之細菌而言係異源的。因此，本發明提供表現異源抗原之巨型球菌屬之細菌菌株。抗原可為與細菌同源之一或多種多肽一起表現的融合多肽之一部分。在一些實施例中，細菌將抗原表現為非融合多肽。在一些實施例中，本發明提供一種包含巨型球菌屬之細菌菌株之細胞的組合物，其中該細胞表 現異源抗原。在一些實施例中，組合物用作疫苗。在一些實施例中，本發明提供巨型球菌屬之細菌菌株之細胞，其中該細胞表現異源抗原。在一些實施例中，細胞用作疫苗。

用於本發明之例示性抗原包括：病毒抗原，諸如病毒表面蛋白；細菌抗原，諸如蛋白質及/或醣抗原；真菌抗原；寄生蟲抗原；及腫瘤抗原。用於在巨型球菌屬之細菌菌株中表現之其他抗原包括糖蛋白及脂聚糖抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸基-Tn(STn)、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、威爾姆氏腫瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾伯斯坦巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、β-澱粉狀蛋白、τ蛋白、PCSK9及成癮物質，例如菸鹼、灑精、鴉片劑或其類似物。

本發明亦可用於增強對針對諸如阿茲海默氏病(Alzheimer’s Disease)及其他神經退化性病症之非傳染病之疫苗的反應，在此情況下用於本發明之抗原可為β-澱粉狀蛋白或τ蛋白。非傳染病之其他此類抗原包括PCSK9(用於治療升高膽固醇)。

本發明亦可用於增強對針對例如菸鹼、灑精或鴉片劑之成癮物質之疫苗的反應。

細胞療法

嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法

實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-6之表現增加。IL-6表現增加與對慢性淋巴球性白血病之CD19 CAR-T療法之反應相關。血清IL-6之增加與CAR-T細胞擴增有關，而IL-6之抑制與CAR-T細胞增殖之抑制有關[90]。因為本發明之組合物之投與顯示增加IL-6表現，所以本發明之組合物可用於細胞療法、尤其CAR-T細胞療法中。在一個實施例中，本發明之組合物用於細胞療法中。在一個實施例中，本發明之組合物用於CAR-T細胞療法中。在一 個實施例中，本發明之組合物用於治療慢性淋巴球性白血病。

意外地，實例亦顯示本發明之組合物之投與選擇性地減少PBMC群體中Treg之百分比(圖6C)。Treg之選擇性耗盡已顯示增強細胞毒性淋巴細胞之功效[91]。CAR-T細胞為細胞毒性淋巴細胞之子集，因此認為Treg之選擇性耗盡在CAR-T細胞療法中係有效的。因為本發明之組合物之投與顯示耗盡Treg，所以本發明之組合物可用於細胞療法、尤其CAR-T細胞療法中。

因此，本發明之組合物可用於細胞療法、尤其增強對細胞療法之反應。

間質幹細胞(MSC)療法

已報導間質幹細胞(MSC)療法具有免疫刺激性。當MSC用LPS處理時，其上調促炎性細胞介素IL-6及IL-8，引起B細胞增殖增加[92]。因此，因為本發明之組合物顯示增加IL-6之表現，所以其可與MSC細胞療法組合使用。

幹細胞移植療法

已報導，代替在幹細胞移植療法中使用未分化幹細胞，在某種程度上在移植前使幹細胞分化可為有益的。舉例而言，Heng等人[93]報導藉由具有較高移植效率、增強肌細胞再生及增加心臟功能恢復，幹細胞之心肌源性分化可為有益的。因為本發明之組合物之投與開始未分化神經母細胞瘤細胞中之神經元分化，所以本發明之組合物可用於幹細胞移植療法中之幹細胞分化。

免疫衰老

實例亦顯示本發明之組合物之投與可選擇性地耗盡Treg且增加B細胞數目(圖6C及圖6F)。Fulop等人[94]確定Treg細胞數目增加及B細胞數目下降與適應性免疫系統之衰老有關。因此，本發明之組合物可用於預防或延遲免疫衰老。在一個實施例中，本發明之組合物用於預防免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物用於延遲特徵在於Treg細胞數目增加之免疫衰老。在另一實施 例中，本發明之組合物用於延遲特徵在於B細胞數目降低之免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物用於延遲特徵在於Treg細胞數目增加及B細胞數目降低之免疫衰老。在一個實施例中，本發明之組合物用於延遲特徵在於Treg細胞數目降低之免疫衰老。在一個實施例中，本發明之組合物藉由增加B細胞數目用於延遲免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物藉由降低Treg細胞數目及增加B細胞數目用於延遲免疫衰老。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療由免疫衰老引起之疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由延遲及/或預防免疫衰老用於治療衰老相關之疾病。

此外，已建議疫苗助劑可戰勝免疫衰老[95]。因為本發明之組合物適合用作疫苗助劑，所以本發明之組合物可用於預防或延遲免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物作為疫苗助劑用於延遲及/或預防免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物用作疫苗助劑，其中該組合物延遲及/或預防免疫衰老。

與免疫衰老相關之疾病包括心血管疾病、神經退化性疾病(諸如阿茲海默氏病及帕金森氏病(Parkinson’s disease))、癌症、2型糖尿病[96]及自體免疫性病症[97]。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療心血管疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由延遲及/或預防免疫衰老用於治療心血管疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療神經退化性疾病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由延遲及/或預防免疫衰老用於治療神經退化性疾病，尤其阿茲海默氏病及帕金森氏病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由延遲及/或預防免疫衰老用於治療癌症。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療2型糖尿病。在一個實施例中，本發明之組合物藉由延遲及/或預防免疫衰老用於治療2型糖尿病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療自體免疫性病症。在一個實施例中，本發明之組合物藉由延遲及/或預防免疫衰老用於治療自體免疫性病症。

投與模式

較佳地，本發明之組合物待投與胃腸道，以能夠傳遞至腸及/或使本發明之細菌菌株部分或全部定殖腸部。一般地，雖然本發明之組合物經口投與，但其可經直腸、鼻內或藉由頰或舌下途徑投與。

在某些實施例中，本發明之組合物可呈泡沫、噴霧或凝膠形式投與。

在某些實施例中，本發明之組合物可呈栓劑，例如直腸栓劑，例如呈可可豆油(可可脂)、合成硬脂(例如suppocire、witepsol)、甘油基-明膠、聚乙二醇或肥皂甘油組合物之形式投與。

在某些實施例中，本發明之組合物藉由管，諸如鼻飼管、口胃管、胃管、空腸造口管(J型管)、經皮內視鏡胃造口術(percutaneous endoscopic gastrostomy，PEG)或端口，諸如通向胃、空腸及其他適合進入埠之胸壁端口投與胃腸道。

本發明之組合物可投與一次，或其可作為治療方案一部分連續投與。在某些實施例中，本發明之組合物將每日投與。

在本發明之某些實施例中，根據本發明之治療伴隨有患者腸微生物叢之評定。若本發明之菌株傳遞及/或部分或全部定殖未實現，使得功效未觀測到，則可重複治療，若傳遞及/或部分或全部定殖成功且觀測到功效，則可停止治療。

在某些實施例中，本發明之組合物可投與懷孕動物，例如哺乳動物，諸如人類，以降低癌症在其子女中在子宮內及/或其出生後顯現之可能性。

本發明之組合物可投與經診斷患有由免疫活性降低之疾病或病狀或已確定為處於由免疫活性降低介導之疾病或病狀風險中的患者。組合物亦可作為預防措施投與以預防健康患者中由免疫活性降低介導之疾病或病狀顯現。

本發明之組合物可投與經診斷患有癌症或已確定為處於癌症風險下 之患者。舉例而言，患者可具有減少或缺乏之巨型球菌，及尤其馬賽巨型球菌定殖。

本發明之組合物可作為食品，例如營養增補劑投與。

一般地，本發明之組合物用於治療人類，不過其可用於治療動物，包括單胃哺乳動物，諸如家禽、豬、貓、犬、馬或兔。本發明之組合物可用於增強動物之生長及效能。若投與動物，則可使用經口管飼法。

組合物

一般地，本發明之組合物包含細菌。在本發明之較佳實施例中，組合物呈凍幹形式調配。舉例而言，本發明之組合物可包含含有本發明之細菌菌株的顆粒或明膠膠囊，例如硬明膠膠囊。

較佳地，本發明之組合物包含凍乾細菌。細菌凍乾為公知之程序且相關指導可於例如參考文獻[98,99,100]中獲得。

可替代地，本發明之組合物可包含活的活性細菌培養物。

在較佳實施例中，本發明之組合物經囊封以能夠傳遞細菌菌株至腸。囊封保護組合物免於降解，直至藉由例如用化學或物理刺激，諸如壓力、酶活性或物理性崩解(其可藉由pH值改變而觸發)進行破裂，在目標位置傳遞。可使用任何適當囊封法。示例性囊封技術包括截留在多孔基質內、附著或吸附在固體載體表面上、藉由絮凝或利用交聯劑而自我凝聚以及機械容納在微孔膜或微膠囊後。關於可用於製備本發明之組合物之囊封的指導可於例如參考文獻[101]及[102]中獲得。

組合物可經口投與且可呈錠劑、膠囊或散劑形式。囊封產品為較佳，因為巨型球菌為厭氧菌。其他成分(諸如維生素C)可作為除氧劑及益生基質包括以改善活體內傳遞及/或部分或全部定殖及存活。或者，本發明之益生組合物可作為食品或營養產品，諸如基於牛奶或乳清之醱酵乳製品，或作為藥品經口投 與。

組合物可調配為益生菌。

本發明之組合物包括治療有效量之本發明之細菌菌株。治療有效量之細菌菌株足以對患者發揮有益作用。治療有效量之細菌菌株可足夠傳遞至患者腸及/或部分或全部定殖患者腸部。

例如適合於成年人之細菌日劑量可為約1×10³至約1×10¹¹菌落形成單位(colony forming unit，CFU)；例如約1×10⁷至約1×10¹⁰CFU；在另一實例中，約1×10⁶至約1×10¹⁰CFU；在另一個實例中，約1×10⁷至約1×10¹¹CFU；在另一個實例中，約1×10⁸至約1×10¹⁰CFU；在另一個實例中，約1×10⁸至約1×10¹¹CFU。

在某些實施例中，細菌之劑量為每日至少10⁹個細胞，諸如每日至少10¹⁰、至少10¹¹或至少10¹²個細胞。

在某些實施例中，組合物含有相對於組合物之重量，約1×10⁶至約1×10¹¹CFU/g，例如約1×10⁸至約1×10¹⁰CFU/g之量的細菌菌株。劑量可為例如1g、3g、5g及10g。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株之量為相對於組合物之重量每公克約1×10³至約1×10¹¹菌落形成單位。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該組合物以500mg與1000mg之間、600mg與900mg之間、700mg與800mg之間、500mg與750mg之間或750mg與1000mg之間的劑量投與。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該醫藥組合物中之凍乾細菌以500mg與1000mg之間、600mg與900mg之間、700mg與800mg之間、500mg與750mg之間或750mg與1000mg之間的劑量投與。

通常，益生菌，諸如本發明之組合物，視情況與至少一種合適益生化 合物組合。益生化合物通常為不易消化之碳水化合物，諸如寡醣或多醣，或糖醇，其在上部消化道中不降解或吸收。已知之益生菌包括商業產品，例如菊糖及反式半乳寡醣。

在某些實施例中，本發明之益生菌組合物包括相對於組合物總重量，約1至約30重量%(例如5至20重量%)之量的益生菌化合物。碳水化合物可選自由以下組成之群：果寡糖(或FOS)、短鏈果寡糖、菊糖、異麥芽寡糖、果膠、木寡糖(或XOS)、幾丁寡糖(或COS)、β-葡聚糖、阿拉伯膠改質及抗性澱粉、聚葡萄糖、D-塔格糖、阿拉伯膠纖維、角豆樹、燕麥及柑桔纖維。在一個態樣中，益生菌為短鏈果糖-寡糖(下文中為簡單起見展示為FOSs-c.c)；該FOSs-c.c為不可消化之碳水化合物，一般由甜菜糖轉變獲得且包括三個葡萄糖分子鍵結之蔗糖分子。

本發明之組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。此類合適賦形劑之實例可見於參考文獻[103]中。用於治療用途之可接受之載劑或稀釋劑為醫藥技術中所熟知且描述於例如參考文獻[104]中。合適載劑之實例包括乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇、山梨糖醇及其類似物。合適稀釋劑之實例包括乙醇、甘油及水。醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑之選擇可針對預期投與途徑及標準醫藥實踐來選擇。醫藥組合物可包含任何合適黏合劑、潤滑劑、懸浮劑、包被劑、增溶劑作為載劑、賦形劑或稀釋劑或除載劑、賦形劑或稀釋劑之外可包含所述物質。合適黏合劑之實例包括澱粉、明膠、天然糖(例如葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑)、天然及合成樹膠(例如阿拉伯膠、黃蓍膠)或海藻酸鈉、羧甲基纖維素及聚乙二醇。合適潤滑劑之實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉及其類似物。防腐劑、穩定劑、染料及甚至調味劑可提供於醫藥組合物中。防腐劑之實例包括苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸酯。亦可使用抗氧化劑及懸浮劑。

本發明之組合物可調配為食品。舉例而言，除本發明之治療作用之外，食品可提供營養益處，諸如營養增補劑中。類似地，食品可調配成增強本發明組合物之口味，或藉由使其更類似於常見食品而非醫藥組合物，使得組合物食用起來更具吸引力。在某些實施例中，本發明之組合物調配為基於牛奶之產品。術語「基於牛奶之產品」意謂具有變化脂肪含量之任何基於牛奶或乳清之液體或半固體產品。基於牛奶之產品可為例如奶牛奶、山羊奶、綿羊奶、脫脂乳、全乳、無任何加工下奶粉與乳清重組之牛奶或加工產品，諸如酸奶酪、凝乳、凝塊、酸牛奶、酸全乳、酪乳及其他酸牛奶產品。另一重要組包括乳製飲料，諸如乳清飲料、醱酵牛奶、煉乳、嬰兒或嬰孩牛奶；增香乳、冰淇淋；含牛奶之食品，例如甜食。

在某些實施例中，本發明之組合物含有單一細菌菌株或物種且不含有任何其他細菌菌株或物種。此類組合物可僅僅包含最低限度量或生物學上不相干量的其他細菌菌株或物種。此類組合物可為基本上不含其他生物體物種之培養物。

根據本發明使用之組合物可能需要或可能不需要銷售批准。

在一些情況下，凍乾細菌菌株在投與之前復原。在一些情況下，復原係藉由使用本文中描述之稀釋劑。

本發明之組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

在某些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中細菌菌株在投與有於需要之個體時量足夠治療病症；且其中病症為癌症，諸如神經母細胞瘤、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌或胃癌。在另一實施例中，癌症為卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、慢性淋巴球性白血病、淋巴瘤或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足夠治療或預防由MAP2介導之疾病或病狀。在較佳實施例中，該疾病或病狀為癌症，諸如神經母細胞瘤、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌或胃癌。在另一實施例中，癌症為卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、慢性淋巴球性白血病、淋巴瘤或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中細菌菌株之量足夠治療或預防由B3微管蛋白介導之疾病或病狀。在較佳實施例中，該疾病或病狀為癌症，諸如神經母細胞瘤、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌或胃癌。在另一實施例中，癌症為卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、慢性淋巴球性白血病、淋巴瘤或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足夠治療或預防由DRD2介導之疾病或病狀。在較佳實施例中，該疾病或病狀為癌症，諸如神經母細胞瘤、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌或胃癌。在另一實施例中，癌症為卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、慢性淋巴球性白血病、淋巴瘤或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足夠治療或預防由HDAC介導之疾病或病狀。在較佳實施例中，該疾病或病狀為癌症，諸如神經母細胞瘤、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌或胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、慢性淋巴球性白血病、淋巴瘤或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足夠治療或預防由促炎性細胞介素，諸如IL-1β、TNF-α、MIP-3α、IL-23或IL-6介導之疾病或病狀。在一較佳實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足夠治療或預防由TNF-α介導之疾病或病狀。在一較佳實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足夠治療或預防由IL-8介導之疾病或病狀。在一較佳實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足夠治療或預防由CD11b介導之疾病或病狀。在較佳實施例中，該疾病或病狀為癌症，諸如神經母細胞瘤、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌或胃癌。在另一實施例中，該癌症為卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、慢性淋巴球性白血病、淋巴瘤或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足夠治療或預防由Casp3介導之疾病或病狀。在較佳實施例中，該疾病或病狀為癌症，諸如神經母細胞瘤、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、肝癌或胃癌。在另一實施例中，該癌症為卵巢癌、子宮頸癌、膠質母細胞瘤、癌瘤、慢性淋巴球性白血病、淋巴瘤或血液惡性病。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株之量為相對於組合物之重量每公克約1×10³至約1×10¹¹菌落形成單位。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中組合物以1g、3g、5g或10g之劑量投與。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中組合物藉由選自由口腔、直腸、皮下、鼻、頰及舌下組成之群的方法投與。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇及山梨糖醇組成之群的載劑。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由乙醇、甘油及水組成之群的稀釋劑。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由以下組成之群的賦形劑：澱粉、明膠、葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑、阿拉伯膠、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其進一步包含防腐劑、抗氧化劑及穩定劑中之至少一種。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸酯組成之群的防腐劑。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經凍乾。

在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中當組合物儲存在密封容器中約4℃或約25℃下且容器置於具有50%相對濕度之氛圍中時，在至少約1個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年時期後，如以菌落形成單位量測，至少80%細菌菌株殘留。

培養方法

用於本發明之細菌菌株可使用如例如參考文獻[105,107]中詳述之標準微生物學技術培養。

用於培養之固體或液體培養基可為YCFA瓊脂或YCFA培養基。 YCFA培養基可包括(每100ml，近似值)：酪腖(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、NaHCO₃(0.4g)、半胱胺酸(0.1g)、K₂HPO₄(0.045g)、KH₂PO₄(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH₄)₂SO₄(0.09g)、MgSO₄．7H₂O(0.009g)、CaCl₂(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯化血紅素(1mg)、生物素(1μg)、鈷胺素(1μg)、對胺基苯甲酸(3μg)、葉酸(5μg)及吡哆胺(15μg)。

用於疫苗組合物中之細菌菌株

本發明人已確定本發明之細菌菌株可用於治療或預防與免疫活性降低相關之疾病或病狀。此可能為以下各者之結果：本發明之細菌菌株作用於宿主免疫系統。因此，當作為疫苗組合物投與時，本發明之組合物亦可用於預防諸如癌症之疾病或病狀。在某些此類實施例中，本發明之細菌菌株可為殺死的、滅活的或減毒的。在某些此類實施例中，組合物可包含疫苗佐劑。在某些實施例中，組合物用於經由注射，例如經由皮下注射投與。

在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株降低甲酸水準。甲酸為甲酸鹽之共軛鹼，其藉由抑制細胞色素氧化酶活性(電子傳遞鏈之末端電子受體)破壞粒線體電子傳遞及能量產生。因此，甲酸及因此甲酸鹽之減少將經由細胞色素氧化酶抑制活性氧累積而降低細胞死亡發生率。因此，在某些實施例中，馬賽巨型球菌物種之細菌菌株藉由降低甲酸水準，在疾病之治療中刺激免疫系統。

通則

除非另外指明，否則本發明之實施將採用在所屬領域技能內之習知化學、生物化學、分子生物學、免疫學及藥理學方法。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如參考文獻[108]及[109,115]等。

術語「包含」涵蓋「包括」以及「由......組成」，例如「包含」X之組合物可僅僅由X組成，或可包括其他某物，例如X+Y。

關於數值x之術語「約」為視情況選用的且意謂例如x±10%。

詞語「基本上」不排除「完全」，例如「基本上不含」Y之組合物可完全不含Y。必要時，本發明之定義中可省略詞語「基本上」。

提及兩種核苷酸序列之間的序列一致性百分比意謂在比對時，比較兩種序列中相同之核苷酸百分比。此比對及同源性或序列一致性百分比可使用所屬領域中已知之軟體程式，例如參考文獻[116]之部分7.7.18中描述之軟體程式確定。較佳比對藉由Smith-Waterman同源性搜索算法使用仿射空位搜索(其中開放空位罰分為12且空位延伸罰分為2、BLOSUM 62矩陣)來確定。Smith-Waterman同源性搜索算法在參考文獻[117]中揭示。

除非特別陳述，否則包括多個步驟之製程或方法可在方法開始或結束包括其他步驟，或可包括其他插入步驟。此外，適當時步驟可組合，省去或以替代次序進行。

本文中描述本發明之多個實施例。應瞭解每個實施例中說明之特徵均可與其他所說明之特徵組合以提供其他實施例。詳言之，本文中強調為適合、典型或較佳的實施例可彼此組合(除非其互斥時)。

用於進行本發明之模式 實例1-MRx0029在SH-SY5Y細胞中誘導成熟表型

引言

本發明者設法確定MRx0029對神經母細胞瘤細胞中神經分化標記物β3微管蛋白及MAP2之表現的作用。β3微管蛋白為神經元中預分化之標記物，且MAP2為成熟(分化)神經元之標記物。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

細胞株

SH-SY5Y細胞

方法

qPCR

SH-SY5Y以2×10⁶個細胞之密度塗鋪於10cm皮氏培養皿(petri dish)中。在24小時之後，細胞在具有10%細菌上清液之分化培養基(含有1% FBS且無RA之生長培養基)或YCFA+、10uM RA、200uM己酸或200uM丙戊酸中處理17小時。此後使用相差EVOS XL核心顯微鏡在40X/0.65放大率下拍攝代表性影像。收集細胞，且根據RNeasy微型套組方案(Qiagen)分離總RNA。使用大容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems)製造cDNA。使用qPCR量測基因表現。GAPDH用作內部對照物。根據2^(-△△ct)法計算變化倍數。

免疫標記及細胞成像

將細胞以5×10⁴個細胞/孔接種至8孔室載片(Marienfeld Laboratory Glassware)上隔夜，且用10%細菌上清液處理24小時。為進行分化，將細胞用10nM RA處理5天，接著用無細胞之細菌上清液處理24小時。

然後，在室溫(RT)下將細胞用含4%多聚甲醛之PBS固定20分鐘。將固定細胞用PBS洗滌，且用含1% Triton X-100之PBS滲透10分鐘。在用PBS洗滌之後，將載片與阻斷緩衝液(4% BSA/PBS)一起在室溫下培育1小時，接著在4℃下添加在1% BSA/PBS中稀釋之抗MAP2抗體或β3-微管蛋白(分別sc-74421及sc-80005，Santa Cruz Biotechnology公司)，歷時12小時。接著將其用PBS洗滌兩次，接著在室溫下與Alexa Flour 488結合之抗小鼠(Molecular Probes公司)及Alexa Flour 594結合之毒傘素(ab176757，Abcam)一起培育1小時。在用PBS洗滌3次之後，將載片用DAPI染色且安裝Vectashield®(Vector Laboratories)。使用裝備有63x/1.2W Korr物鏡之Axioskop 50顯微鏡(Zeiss)及適合於偵測所使用之螢光染料的濾波器組觀察載片。經MAP-2免疫標記之影像之 數位採集的手工暴露時間保持恆定，允許不同孔及處理之間進行比較。毒傘素(F-肌動蛋白)及DAPI暴露時間進行變化以適合視場。使用由Image Pro Plus軟體控制之QImaging相機，採集隨機化視場。影像作為TIFF文件保存，且在Adobe Photoshop CC 2015.1.2中打開。接著MAP-2、DAPI及毒傘素影像之影像覆蓋及合併。選擇代表性影像來說明檢查蛋白質之豐度及位置的差異。

免疫墨點

SH-SY5Y細胞在上述指示條件下培養，用MRx0029處理24小時，接著溶解在含有蛋白酶抑制劑(Roche Diagnostics,UK)之混合物的RIPA緩衝液中。蛋白質濃度使用BCA蛋白質分析套組(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)估計，藉由SDS-PAGE分離，且轉移至PVDF膜。接著膜用5%脫脂乳粉或5% BSA阻斷，且在4℃下與初級抗體(分別MAP2及β3-微管蛋白)一起培育隔夜。接著墨點與適當辣根過氧化酶(HRP)結合之二級抗體一起培育，且藉由化學發光偵測套組(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)偵測蛋白質。對於MAP2與β3-微管蛋白，β-肌動蛋白用作對照物以監測樣品中之蛋白質負載變化性。

結果

MRx0029誘導未分化神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中β3-微管蛋白之表現。圖1展示與未經處理之SH-SY5Y細胞相比，用MRx0029處理增加β3-微管蛋白之表現。

MRx0029誘導未分化神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中MAP2之表現。圖2展示與未經處理之SH-SY5Y細胞相比，用MRx0029處理增加MAP2之表現。

討論

結果展示MRx0029可為有效促進分化、尤其神經元分化之組合物。此外，結果表明MRx0029可為有效治療腦癌、尤其神經母細胞瘤及黑色素瘤、 尤其轉移性黑色素瘤之組合物。

實例2-MRx0029降低SH-SY5Y細胞中DRD2之表現

引言

本發明者設法確定MRx0029對神經母細胞瘤細胞中DRD2之表現的作用。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

細胞株

SH-SY5Y細胞

方法

本發明者使用與實例1中所述相同之方法量測神經母細胞瘤細胞中DRD2表現之變化。

結果

MRx0029降低神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中DRD2之表現。圖3顯示與未經處理之SH-SY5Y細胞相比，用MRx0029處理顯著地降低DRD2之表現。

討論

此表明MRx0029可為有效治療癌症之組合物。

實例3-MRx0029誘導SH-SY5Y細胞中凋亡蛋白酶3之上調

引言

本發明者設法確定MRx0029對神經母細胞瘤細胞中凋亡蛋白酶3(Casp3)之表現的作用。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

細胞株

SH-SY5Y細胞

方法

本發明者量測神經母細胞瘤細胞中Casp3表現之變化。

結果

MRx0029誘導未分化神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中Casp3之上調。圖4顯示與未經處理之SH-SY5Y細胞相比，用MRx0029處理增加Casp3之表現。詳言之，圖4顯示MRx0029之投與使Casp3之表現與對照物相比增加三倍。

討論

在未分化SH-SY5Y細胞中，MRx0029使Casp3基因表現增加可引起細胞分化且誘發程式化細胞死亡，諸如細胞凋亡。

凋亡蛋白酶3係一種執行凋亡蛋白酶，因此與細胞凋亡有關。細胞凋亡失調與癌症相關聯，因此，結果顯示MRx0029可為有效治療癌症之組合物。

已顯示凋亡蛋白酶在細胞分化中具有作用。因此，在用MRx0029處理後Casp3表現增加表明MRx0029可為有效增加細胞分化之組合物。

實例4-SH-SY5Y細胞中之MTT分析：

引言

本發明者使用MTT分析設法確定MRx0029對神經母細胞瘤細胞活力之作用，MTT分析係一種廣泛用於評定細胞代謝活性之方法，細胞代謝活性反映在活細胞之數目上。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

細胞株

SH-SY5Y細胞

方法

MTT分析

SH-SY5Y細胞以10,000個細胞/孔之接種密度塗鋪，24小時後細胞在100ul具有不同濃度(表示成v/v%)的來自穩定期培養之無細胞之細菌上清液的1% FBS生長培養基中進行處理22小時。此後添加10μl MTT溶液且細胞在CO2培育箱中培育4小時，在結束時，將100μl含0.04 HCL之異丙醇添加至各孔。在560nm波長及655nm參考波長下量測吸光度。MTT分析套組購自Merck Millipore(目錄號CT01)。

結果

MRx0029顯示對神經母細胞瘤細胞活力之劑量依賴性作用，其中與對照物相比，10% MRx0029使活力降低大約70%。用10% MRx0029無細胞之細菌上清液處理顯示降低細胞活力。實驗結果示於圖5中。

討論

此表明MRx0029可為有效增加細胞死亡之組合物，因此，MRx0029可為有效用於治療癌症之組合物。

實例5-來自健康供體之PBMC上基礎細胞之分型

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

方法

PBMC處理

冷凍之健康人類PBMC係購自Stem Cells Technologies(Cambridge UK)。簡言之，將細胞解凍且在CO2培育箱中在完全生長培養基(具有10% FBS、2mM L-麩醯胺酸、55μM 2-巰基乙醇及100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素之RPMI 1640)中在37℃下靜置隔夜。對於該實驗，細胞以750,000個細胞/孔之密 度塗鋪在48孔盤中，且在具有10%細菌上清液之完全生長培養基中在存在或不存在1ng/ml LPS下處理。細胞培養基添加至未經處理之孔。細胞靜置72小時，此後收集無細胞上清液，且在4℃下在10,000g下短暫離心3分鐘。樣品儲存在-80℃下用於細胞介素分析。

免疫分型

在室溫下將每個樣品1.5×10⁶個細胞用活力固定染料(Miltenyi)染色10分鐘以區別活細胞與死細胞。然後將細胞用下列抗體(Miltenyi)之混合物染色，用於基礎免疫分型(CD3/CD4/CD8/CD25/CD127及CD19)且在室溫下培育10分鐘。

進行實驗以量測以下細胞群體之百分比：

●CD4+ CD3+細胞(CD4 T輔助細胞之標記物)

●CD4+ CD25+細胞(CD4+活化細胞之標記物)

●CD4+細胞群體中之CD25++ CD17-細胞(Treg細胞之標記物)

●CD8+ CD3+細胞(細胞毒性T細胞之標記物)

●CD25+ CD8+細胞(CD8+活化細胞之標記物)

●CD19+ CD3-細胞(B細胞之標記物)。

測定CD8+/Treg之比率及活化CD8/Treg細胞之比率。

抗體

結果

實驗結果示於圖6中。

最驚人之結果為MRx0029處理對代表Treg細胞之CD25++ CD17-細胞之百分比的作用(參見圖6C)。MRx0029選擇性地降低PBMC群體中Treg之百分比。MRx0029處理未顯著改變CD4 T輔助細胞、CD4+活化細胞、細胞毒性T細胞、CD8+活化細胞或B細胞之百分比。

與未經處理之細胞相比，用MRx0029處理增加CD8+/Treg之比率及活化CD8/Treg細胞之比率(參見圖6G及圖6H)。

討論

用MRx0029處理選擇性地降低Treg之百分比，藉此增加CD8/Treg及活化CD8/Treg之比率的觀測結果係意外的，因為MRx0029產生丁酸鹽，且丁酸鹽產生與Treg群體增加相關。

MRx0029在來自健康供體之PBMC中之基礎免疫分型表明用MRx0029處理降低淋巴細胞群體中Treg之相對百分比，此反映在CD8/Treg細胞之間的比率增加上。

此表明MRx0029可為有效刺激免疫反應及降低Treg對免疫之抑制的組合物。結果亦表明MRx0029可為有效用於治療癌症之組合物。

實例6-來自健康供體之PBMC之細胞介素分析

引言

本發明者設法在與MRx0029一起培育後進一步分析PBMC。本發明者分析在用MRx0029處理之後，來自PBMC之特定細胞介素，包括促炎性細胞介素TNF-α、IL-1β及IL-23之表現。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

方法

PBMC處理

PBMC如實例5中所述進行處理。

細胞介素定量

使用ProcartaPlex多工免疫分析法，按照製造商建議(Thermo Fischer Scientific)，進行細胞介素定量。簡言之，使用MAGPIX® MILLIPLEX®系統(Merck)，利用xPONENT軟體(Luminex,Austin,TX,USA)，50μl無細胞之共培養上清液用於細胞介素定量。使用MILLIPLEX®分析軟體(Merck)，使用5參數邏輯曲線及背景去除將平均螢光強度轉換成pg/ml值來分析數據。

結果

來自健康供體之PBMC培養物中MRx0029之細胞介素分析的結果顯示MRx0029之免疫刺激特徵。詳言之，MRx0029處理增加TNF-α、IL-1β及IL-23之表現。

結果亦顯示用MRx0029處理增加MIP-3α、IL-6及IL-10之表現。MCP-1、CXCL9及GMCSF之表現水準類似於對照。

討論

此表明MRx0029具有免疫刺激性，且可為有效用於免疫刺激之組合物。結果亦表明MRx0029可為有效治療癌症之組合物。

實例7-不同細胞群體之流式細胞術分析

引言

本發明者設法在與MRx0029一起培育後進一步分析PBMC。流式細胞術分析用於確定CD4細胞(CD4+ CD3+)、Treg(CD25++ CD127-)、CD8細胞(CD8+ CD3+)及B細胞(CD19+ CD3-)之百分比。

方法

PBMC處理

PBMC如實例5中所述進行處理。

不同細胞群體之流式細胞術分析

在室溫下將每個樣品1.5×10⁶個細胞用活力固定染料(Miltenyi)染色10分鐘以區別活細胞與死細胞。然後將細胞用下列抗體(Miltenyi)之混合物染色，用於基礎免疫分型(CD3/CD4/CD8/CD25/CD127及CD19)且在室溫下培育10分鐘。接著洗滌細胞且再懸浮於PBS中且立即使用裝備有藍色(488nm)、紅色(633nm)及紫色(405nm)雷射器之FACS Aria II進行分析。所有實驗中包括FMO。對於分析，使用Flowjo 10.4.2版軟體(FlowJo,LLC)。

結果

流式細胞術實驗之結果示於圖8中。

圖8A顯示0.73% PBMC為Treg(CD25++ CD127-)。

討論

結果表明MRx0029可用於下調Treg。此外，結果表明MRx0029可為有效刺激免疫反應及降低Treg對免疫之抑制的組合物。結果亦表明MRx0029可為有效用於治療癌症之組合物。

實例8-MRx0029增加MG U373細胞中之IL-8分泌

引言

本發明者設法確定MRx0029對神經母細胞瘤細胞中IL-8之分泌的作用。將人類膠質母細胞瘤星形細胞瘤細胞用包含MRx0029以及LPS之組合物處理以觀察其調節IL-8水準之能力。IL-8係一種促炎性細胞介素，主要由巨噬細胞分泌，具有刺激免疫之作用。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

細胞株

MG U373係一種源自於惡性腫瘤之人類膠質母細胞瘤星形細胞瘤且 購自Sigma-Aldrich(目錄號08061901-1VL)。MG U373人類膠質母細胞瘤星形細胞瘤細胞在補充有10% FBS、1% Pen Strep、4mM L-Glut、1X MEM非必需胺基酸溶液及1X丙酮酸鈉之MEM(Sigma Aldrich，目錄號M-2279)中生長。

方法

一旦生長，即將MG U373細胞以100,000個細胞/孔塗鋪於24孔盤上。細胞用單獨或具有來自MRx0029之10%細菌上清液之LPS(1ug/mL)處理24小時。LPS係促炎性細胞介素如IL-8之已知刺激物。然後，收集無細胞上清液，在4℃下以10,000g離心3分鐘。使用來自Peprotech之人類IL-8 ELISA套組(目錄號# 900-K18)，根據製造商說明書量測IL-8。

結果

此等實驗之結果示於圖9中。用細菌菌株處理細胞引起IL-8之分泌增加，與LPS之存在無關。

討論

結果顯示MRx0029可用於增加IL-8分泌。因此，本發明之組合物可用於治療疾病、尤其特徵在於免疫活化減少之疾病及可藉由免疫反應增加而治療之疾病。

實例9-MRx0029降低HT-29細胞中組蛋白去乙醯酶活性之水準

引言

研究包含MRx0029之組合物改變組蛋白去乙醯酶活性的能力。HDACi已顯示在多種癌細胞株中引起生長抑制、分化、細胞凋亡、減少血管生成及調節免疫反應。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

細胞株

使用細胞株HT-29，因為其存在組蛋白去乙醯酶。

方法

穩定期細菌培養物之無細胞上清液藉由離心及在0.22uM過濾器中過濾來分離。匯合後3天，使用HT-29細胞，且在實驗開始前24小時在1mL DTS中沈積下來。用在DTS中稀釋之10%無細胞上清液激發HT-29細胞，且使其培育48小時。接著使用Sigma Aldrich核酸酶提取套組提取核酸酶蛋白質且在量測HDAC活性前將樣品速凍。使用Sigma Aldrich(UK)套組，以螢光測定法評定HDAC活性。

結果

實驗結果展示於圖10中。圖109顯示MRx0029能夠降低組蛋白去乙醯酶活性之水準。

討論

結果表明MRx0029係一種有望用於經由抑制HDAC活性治療或預防特徵在於表觀遺傳異常之疾病的候選物。癌症係一種特徵在於表觀遺傳異常之疾病。此外，HDAC抑制劑(HDACi)係一類有前途之新興抗癌藥物，已顯示其在多種癌細胞株中引起生長抑制、分化、細胞凋亡、減少血管生成及調節免疫反應。因此，結果表明本發明之組合物可有效用於治療或預防癌症。

實例10-對組蛋白去乙醯化抑制機制之進一步分析

引言

腸微生物叢具有巨大多樣性及代謝能力，其代表用於產生各種能夠影響HDAC活性之分子的巨大代謝貯存器。因此，本發明者設法確定哪些代謝物負責HDAC抑制且進一步說明實現抑制之機制。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

方法

細菌培養及無細胞上清液收集

細菌之純培養物在YCFA肉湯中無氧生長，直至其達到其穩定生長期。將培養物在5,000×g下離心5分鐘，且使用0.2μM過濾器(Millipore,UK)過濾無細胞上清液(CFS)。將CFS之1mL等分試樣儲存在-80℃下，直至使用。丁酸鈉、己酸及戊酸自Sigma Aldrich(UK)獲得且在YCFA+肉湯中製備懸浮液。

細菌上清液之SCFA及MCFA定量

藉由MS Omics APS如下分析及定量來自細菌上清液之短鏈脂肪酸(SCFA)及中鏈脂肪酸(MCFA)。使用鹽酸將樣品酸化，且添加氘標記之內標。所有樣品以隨機化順序分析。使用安裝在GC(7890B，Agilent)中之高極性管柱(Zebron^TM ZB-FFAP，GC Cap.管柱30m×0.25mm×0.25μm)聯合四極偵測器(59977B，Agilent)進行分析。藉由ChemStation(Agilent)控制系統。使用Chemstation(Agilent)將原始數據轉變成netCDF格式，接著輸入數據且在Matlab R2014b(Mathworks公司)中使用[118]中描述之PARADISe軟體處理。

特定HDAC活性分析

使用針對各種HDAC之螢光分析套組(BPS Bioscience,CA)，針對HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC9，分析特定HDAC抑制活性。根據製造商說明書進行分析，且每個樣品重複進行。無細胞上清液以1：10稀釋且暴露於套組中提供之特定HDAC蛋白，以維持方法之間的一致性。

結果

抑制組蛋白去乙醯酶之腸共生微生物代謝物為丁酸鹽及戊酸

上清液展示在HT29全細胞與HT29細胞溶解產物中強HDAC抑制(參見圖11A)的MRx0029產生平均濃度分別為5.08mM及1.60mM之戊酸及己 酸(圖11B)。

為研究哪些代謝物引起菌株誘導之HDAC抑制，量測不同濃度之己酸、戊酸及丁酸鈉對全HT-29細胞及HT-29細胞溶解產物之HDAC抑制。圖11C中之結果展示在全細胞上以及在細胞溶解產物上丁酸鈉顯著(P<0.05)抑制HDAC活性，而己酸展示顯著抑制活性。戊酸亦抑制全細胞上以及細胞溶解產物上之HDAC活性(*(p<0.05)，**(p<0.005)，***(P<0.001)，****(p<0.0001))。

所研究之有效總HDAC抑制劑靶向I類HDAC。

研究測試細菌菌株之特定HDAC抑制概況。對I類HDAC及II類進行特定HDAC抑制分析(BPS Bioscience,CA)。細菌菌株抑制HDAC酶之能力與丁酸鹽、己酸及戊酸比較。結果證明MRx0029係1類HDAC酶(HDAC1、HDAC2及HDAC3)之非常有效抑制劑。II類HDAC之抑制不顯著(資料未示)。

論述

具有HDAC抑制活性之菌株產生大量戊酸及己酸以及大量丁酸鈉(圖11B)。當呈純物質進行測試時，戊酸及丁酸鈉引起顯著HDAC抑制(p<0.0001)。

有趣地，特定HDAC活性之結果展示測試菌株為I類HDAC及尤其HDAC2之有效抑制劑(圖12及圖13)。I類HDAC(HDAC1、HDAC2、HDAC3及HDAC8)存在於細胞核中且在若干人類細胞類型中處處表現。HDAC1-3共享超過50%同源性，但具有不同結構及細胞功能[119]。其主要與細胞存活、增殖及分化相關，因此，抑制可用於大量疾病[120]；[121]；[122]；[123]；[124]。因此，本發明之組合物尤其可用於治療其中I類HDAC活性上調之疾病。詳言之，本發明之組合物尤其可用於治療其中I類HDAC活性上調之癌症。舉例而言，本發明之組合物尤其可用於治療其中HDAC2活性上調之癌症。

實例11-MRx0029調節腸障壁功能及腸通透性

引言

研究MRx0029引起任何腸障壁功能障礙之能力。HT29-mtx上皮之產生黏蛋白之細胞單層[125]用作活體外模型以評估用MRx0029處理後之腸障壁破環及免疫刺激。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

方法

RNA提取及qPCR分析

使用RNeasy微型套組(Qiagen,Manchester,JUK)，根據製造商之說明書提取總RNA，且使用分光光度計(nano-Drop ND-1000；Thermo Scientific,Wilmington,DE)，藉由260/280nm下吸光度確定RNA濃度。為分析mRNA表現，使用大容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems,UK)，根據製造商之說明書，自總RNA製備cDNA。在熱循環儀(Biometra,Germany)中在25℃下進行逆轉錄反應10分鐘，在37℃下進行120分鐘，且在85℃下進行5分鐘，在4℃下繼續。所得cDNA藉由SYBR-Green PCR分析一式兩份擴增，且在QuantStudio 6 flex即時PCR機(Applied Biosystems,UK)上，使用標準化概況(95℃下10分鐘初始變性，接著95℃下15秒變性及視引子而定60/65℃下退火/延伸60秒之循環40次)偵測產物。在40次循環之後添加解離階段以產生熔融曲線。使用Applied Biosystems QuantStudio即時PCR軟體1.2版進行分析。

結果

暴露於佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)之分化HT29-mtx細胞分泌大量IL-8；相比之下，用MRx0029細菌上清液處理24小時誘導IL-8分泌比未經處理及經YCFA+-處理之細胞低(圖14A)。

接著研究MRx0029藉由改變與涉及腸障壁形成之蛋白質之表現及 定位相關的細胞內信號轉導來調控上皮通透性的能力。

分離RNA且進行定量RT-PCR(qRT-PCR)分析以表徵在與MRx0029一起培育期間緊密連接蛋白質之基因表現的變化。MRx0029之投與在培育2小時之後增強閉合蛋白、Villin、緊密連接蛋白1及緊密連接蛋白2(分別TJP1及TJP2)mRNA表現(圖14B)。

活體外結果與來自對餵食MRx0029之小鼠之腸之離體平行分析的數據比較。在結腸及回腸中定量TJP1及閉合蛋白之基因表現。離體數據完全反映活體外數據，因為MRx0029能夠顯著上調鼠科腸之結腸區域中的TJP1及閉合蛋白(p=0.073)(圖14C+14D)。MRx0029亦能夠降低相同小鼠之結腸中的通透性功能(圖14F)。

討論

結果表明MRx0029能夠藉由改變與涉及腸障壁形成之蛋白質(例如閉合蛋白、Villin、TJP1及TJP2)之表現及定位相關的細胞內信號轉導來調控上皮通透性。因此，結果表明MRx0029用以增加腸障壁功能且降低腸通透性。因此，本發明之組合物有效治療或預防特徵在於腸障壁功能減少或腸通透性增加之疾病或病狀。

實例12

引言

本發明者設法分析來自餵食MRx0029之小鼠之海馬區、杏仁核及前額葉皮質的腦組織中炎性標記物之基因表現。本發明者亦探索在投與MRx0029之相同小鼠中對細胞介素自脾之產生的作用。

細菌菌株

馬賽巨型球菌MRx0029

方法

動物

BALBc(Envigo,UK)成年雄性小鼠成組圈養在12小時光-暗週期下；標準囓齒類動物食物及水隨意取用。所有實驗均根據歐洲準則在經科克大學動物實驗倫理委員會(University College Cork Animal Ethics Experimentation Committee)批准後進行。開始實驗時動物為8週齡。

研究設計

在到達動物單元後使動物適應其保藏室一週。其接受活生物治療劑以1×10⁹CFU之劑量之經口管飼法(200μL劑量)，在15：00與17：00之間，連續6日。在第7天，將動物斷頭，且收穫組織以供實驗。

收集組織

以在處理及測試條件方面隨機之方式處死動物；在上午9.00與下午2：30之間進行取樣。將軀幹血收集在EDTA(乙二胺四乙酸)鉀管中且在4000g下旋轉15分鐘。分離血漿且儲存在-80℃下以供進一步分析。迅速切除腦，解剖，且各腦區域在乾冰上速凍，且儲存在-80℃下以供進一步分析。移除脾，收集於5mL RPMI培養基(具有L-麩醯胺酸及碳酸氫鈉、R8758 Sigma+10% FBS(F7524，Sigma)+1% Pen/Strep(P4333，Sigma))中且在挑選之後立即加工以進行離體免疫刺激。將腸組織(切除與盲腸最靠近之2-3cm迴腸及結腸區段，且使用離盲腸最遠1-2cm之組織)安裝至尤斯室(Ussing chamber)中以進行腸道通透性分析。移除盲腸，稱重，且儲存在-80℃下以供SCFA分析。

脾細胞介素分析

在處死後將脾立即收集在5mL RPMI培養基中且立即培養。脾細胞首先在此RPMI培養基中均質化，接著與1ml RBC溶解緩衝液(11814389001 ROCHE，Sigma)一起培育5分鐘。添加又10ml RPMI培養基，接著進行200G離心5分鐘。接著上清液經40um過濾器過濾。將細胞計數且接種(每毫升培養 基4,000,000個)。適應2.5小時之後，將細胞用脂多醣(LPS-2μg/ml)或伴刀豆凝集素A(ConA-2.5μg/ml)刺激24小時。在刺激之後，收穫上清液以使用促炎性小組1(小鼠)V-PLEX套組(Meso Scale Discovery,Maryland,USA)針對TNFα、IL-10、IL-1β、干擾素γ、CXCL2及IL6評定細胞介素釋放。使用MESO QuickPlex SQ 120、SECTOR Imager 2400、SECTOR Imager 6000、SECTOR S 600進行分析。

基因表現分析

根據製造商之建議，使用mirVana^TM miRNA分離套組(Ambion/Llife technologies,Paisley,UK)提取總RNA且進行DNase處理(Turbo DNA-free,Ambion/life technologies)。使用NanoDrop^TM分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc.,Wilmington,Delaware,USA)，根據製造商之說明書，定量RNA。使用Agilent 生物分析儀(Agilent,Stockport,UK)，根據製造商之程式評定RNA品質，且計算RNA完整性數值(RIN)。RIN值>7之RNA用於後續實驗。使用Applied Biosystems大容量cDNA套組(Applied Biosystems,Warrington,UK)，根據製造商之說明書，將RNA逆轉錄成cDNA。簡言之，添加Multiscribe逆轉錄酶(50U/μL)(1)(2)(1)(10)作為RT主混合物之一部分，在25℃下培育10分鐘，在37℃下培育2小時，在85℃下培育5分鐘且儲存在4℃下。使用Applied Biosystems設計之針對小鼠特異性靶向基因之探針(6羧基螢光素-FAM)進行定量PCR，同時使用β-肌動蛋白作為內源對照物。擴增反應含有1μl cDNA、5μl 2X PCR主混合物(Roche)、900nM各引子，且藉由添加無RNase之水達至總共10μl。使用96孔盤，在LightCycler®480系統上一式三份進行所有反應。熱循環條件如製造商(Roche)所推薦，循環55次。為檢查擴增子污染，針對所用之各探針，一式三份，每次操作不含模板對照。記錄循環閾值(Ct)。使用β-肌動蛋白將數據標準化，且使用2-△△CT法變換，且呈對比對照組之變化倍數呈現。

統計分析

正態分佈數據呈平均值±SEM呈現；非參數數據集呈中位數與四分間距呈現。未配對雙尾t檢驗用於分析參數數據且曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)用於非參數。採用斯皮曼秩相關係數(Spearman's rank correlation coefficient)在彙集之數據集中進行相關分析。在所有情況下p值<0.05視為顯著。

結果-基因表現

分析來自海馬區、杏仁核及前額葉皮質之腦組織中炎性標記物[IL-1β、IL6、CD11b、TNF-α及TLR-4]之基因表現。圖15-25展示在MRx0029處理之後海馬區、杏仁核及前額葉皮質中基因表現之變化。用MRx0029處理顯著地增加杏仁核中TLR-4之表現(圖20)。用MRx0029處理亦增加杏仁核中CD11b之表現(圖21)。

結果-對細胞介素自脾細胞之表現的作用

離體脾細胞分析涉及用細菌模擬物或病毒模擬物激發來激發脾細胞(自脾分離之細胞，脾為與免疫防禦有關之主要器官)。

在用LPS激發之後用MRx0029處理引起干擾素-γ、介白素-1β及介白素-6減少(分別圖26、27及28)。

用MRx0029處理引起化學引誘物CXCL1之水準增加(圖30)。

討論

用MRx0029處理顯著地增加杏仁核中促炎性細胞介素TLR-4及CD11b之表現。因此，本發明之組合物可用於治療疾病、尤其特徵在於免疫活化減少之疾病及可藉由免疫反應增加而治療之疾病。

實例13-穩定性測試

含有至少一種本文中描述之細菌菌株的本文中描述之組合物儲存在密封容器中25℃或4℃下且容器置於具有30%、40%、50%、60%、70%、75%、 80%、90%或95%相對濕度之氛圍中。1個月、2個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年後，至少50%、60%、70%、80%或90%之細菌菌株應殘留，如以藉由標準規方案測定之菌落形成單位量測。

實例14-馬賽巨型球菌對ERK信號傳導路徑之作用的分析

材料與方法

RNA提取及MAP2 qPCR分析

將細胞以2×10⁵個細胞/孔之密度塗鋪在12孔盤。在24小時之後，將細胞用DMSO或威羅菲尼(662005；EMD Millipore；VEMU；SKMEL28、SKMEL31、451Lu、HT29(1μM)SKMEL2(10μM))或氮胞苷-C(A3656；Sigma Aldrich；AzaC；5μg/ml)或兩種藥物(VEMU+Aza)一起在10%細菌上清液存在或不存在(YCFA+)下處理。使用RNeasy微型套組(Qiagen,Manchester,UK)，根據製造商之說明書，提取總RNA，且藉由分光光度計(NanoDrop ND-1000；Thermo Fisher Scientific,Loughborough)在260/280nm下確定RNA濃度。為分析mRNA表現，使用大容量cDNA逆轉錄套組(Thermo Fisher,Loughborough)，根據製造商之說明書，自2000ng總RNA製備cDNA。在熱循環儀(Biometra,Germany)中在25℃下進行逆轉錄反應10分鐘，在37℃下進行120分鐘，且在85℃下進行5分鐘。所得cDNA藉由SYBR-Green PCR分析一式兩份擴增，且在QuantStudio 6 flex即時PCR機(Applied Biosystems,UK)上，使用標準化概況(95℃下10分鐘初始變性，接著95℃下10秒變性及65℃下退火/延伸30秒之循環40次)偵測產物。在40次循環之後添加解離階段以產生熔融曲線。使用Applied Biosystems QuantStudio即時PCR軟體1.2版進行分析。下文展示GAPDH及MAP2之引子序列。

西方墨點分析

在10%細菌上清液存在或不存在(YCFA+)下用適當藥物處理24小時 之後，藉由將細胞溶解於補充有蛋白酶抑制劑(cOmplete蛋白酶抑制劑混合物片；Roche,Switzerland)及1mM/L原釩酸鈉、0.5mM/L PMSF之RIPA緩衝液(R0278；Sigma Aldrich)中來獲得蛋白質提取物。藉由BCA蛋白質分析定量蛋白質。藉由SDS-PAGE，在4-15%梯度凝膠(BioRad)上分離等量總蛋白(20μg/泳道)且轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Thermo Fisher Scientific,Loughborough)。在用含5% BSA或脫脂乳粉之TBST(10mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.5% Tween 20)阻斷60分鐘之後，用針對磷酸化-ERK(9101S，1：1000，Cell Signalling；New England Biolabs(UK))或總ERK(4696S，1：1000，Cell signalling；New England Biolabs(UK))之初級抗體探測膜。

用適當HRP結合之二級抗體(1：10,000；Thermo Fisher Scientific,Loughborough)偵測所關注之蛋白質，用ECL Western blotting Super Signal PicoPlus受質(34577；Thermo Fisher Scientific,Loughborough)顯影，且在Chemidoc XRS成像器(BioRad)中目測。

96孔盤中非錨定依賴性生長(軟瓊脂生長分析)

將25μL含有20% FBS、4mM L-Glu、2×NEAA、0.6%碳酸氫鈉、200U/mL青黴素/鏈黴素(Invitrogen)之預先溫熱之(37℃)2×適當生長培養基(EMEM，用於黑色素瘤細胞株；DMEM高葡萄糖，用於HT29)與25μL預先溫熱之(47℃)1.2% Noble瓊脂(A5431；Sigma Aldrich)的混合物塗鋪至96孔微量培養盤中之每個孔上，以用作分析之預備層。將十微升含有0-2×10³個細胞之細胞懸浮液與25μL 2×生長培養基及35μL 0.8% Noble瓊脂混合於96孔圓形底聚丙烯微量培養盤，且轉移至含有固化預備層之96孔微量培養盤。使細胞生長2天，接著每隔兩天饋入在10%細菌上清液或YCFA+存在下含有藥物之培養基。使其在濕潤37℃培育箱中在5% CO₂下生長1-2週，接著使用CytoSelect 96孔細胞轉型分析(CBA-130；Cell Biolabs)，根據製造商之方案，對軟瓊脂生長進行評分。 使用Tecan Infinite F200 Pro系列多孔盤式讀數器(Tecan Biosystems)量測細胞生長，其中在485nm下激發且在530nm下發射。

32mm盤中非錨定依賴性生長(軟瓊脂生長分析)

將每盤1mL預先溫熱之(37℃)2×適當生長培養基(EMEM，用於黑色素瘤細胞株；DMEM高葡萄糖，用於HT29)與1mL預先溫熱之(47℃)0.8% Noble瓊脂(0.4%最終瓊脂)的混合物與1mL細胞懸浮液混合，且接種在6孔盤中之0.6%瓊脂/細胞生長預備層(2mL)上。使細胞在濕潤37℃培育箱中在5% CO₂下生長21-28天。每隔兩天在10%細菌上清液不存在(YCFA+)或存在下向其饋入藥物。使用Evos XL Core顯微鏡(Thermo Fisher Scientific,Loughborough)對菌落照像。

純系分析

將細胞進行胰蛋白酶化且以200個細胞/孔接種於12孔盤中。在48小時之後，在10%細菌上清液不存在(YCFA+)或存在下細胞用適當藥物處理且每隔兩天再饋入。在接種之後第21天，將細胞固定在冰冷甲醇中，且用Crystal Violet藍染色。對菌落(.50個細胞)進行計數且存活分數計算為治療情況下菌落數目除以塗鋪細胞數目(塗鋪效率)除以對照物之塗鋪效率。

實例14A-SKMEL2黑色素瘤細胞株

評定以下處理對SKMEL2黑色素瘤細胞株(WT BRAF；Nras中N61R致癌突變)之作用：(1)MRX0029；(2)YFCA+培養基中威羅菲尼(VEMU)；(3)VEMU及MRX029；(4)YFCA+培養基中氮胞苷-C(Aza-c)；(5)Aza-c及MRX029；(6)VEMU、Aza-c及MRX0029。

使用材料與方法中之方案，評定SKMEL2細胞株中之MAP2基因表現，且結果示於圖31中。所有利用MRX029(單獨或與VEMU及/或Aza-c組合)之處理相對於兩種陰性對照物(僅細胞株及YCFA+)增加MAP2基因表現。使用 材料與方法中之方案，評定SKMEL2細胞株之純系存活，且結果示於圖32中。使用材料與方法中之方案，評定SKMEL2細胞株之軟瓊脂生長，且結果示於圖33中。VEMU+Aza-c改善MRX029對軟瓊脂生長之抑制。使用材料與方法中之方案評定SKMEL2細胞株中之ERK信號傳導，且結果示於圖34中(不評定VEMU、Aza-c及MRX029)。

此等結果表明單獨或與威羅菲尼及/或氮胞苷-C組合之MRX0029在黑色素瘤細胞株(SKMEL2)中可具有誘導MAP2基因表現之作用。此外，威羅菲尼+氮胞苷-C增強MRX0029對軟瓊脂生長之抑制。基於此，預期本發明之組合物可用於治療或預防各種癌症、尤其轉移性癌症、尤其轉移性黑色素瘤。

實例14B-SKMEL28黑色素瘤細胞株

評定以下處理對SKMEL28黑色素瘤細胞株(BRAF中V600E致癌突變)之作用：(1)MRx0029；(2)YCFA+培養基中威羅菲尼(VEMU)；(3)VEMU及MRx0029；(4)YCFA+培養基中氮胞苷-C(Aza-c)；(5)Aza-c及MRX0029；(6)VEMU、Aza-c及MRx0029。

使用材料與方法中之方案，評定SKMEL28細胞株中之MAP2基因表現，且結果示於圖35中。使用材料與方法中之方案，評定SKMEL28細胞株之純系存活，且結果示於圖36中。MRX029與VEMU及/或Aza-c組合相對於兩種陰性對照物(YCFA+及僅細胞株)減少純系存活。使用材料與方法中之方案，評定SKMEL28細胞株之軟瓊脂生長，且結果示於圖37中。使用材料與方法中之方案評定SKMEL28細胞株中之ERK信號傳導，且結果示於圖38中(不評定VEMU、Aza-c及MRx0029)。所有利用MRx0029(單獨或與VEMU或Aza-c組合)之處理相對於陰性對照物(YFCA+)減少ERK信號傳導。

此等結果表明單獨或與威羅菲尼及/或氮胞苷-C組合之MRx0029對包含BRAF V600E突變之黑色素瘤細胞株(SKMEL28)可具有抑制ERK信號傳導 及降低純系存活之作用。基於此，預期本發明之組合物可用於治療或預防癌症、尤其包含致癌ERK信號傳導之癌症、特別是黑色素瘤。詳言之，預期本發明之組合物可用於治療或預防在BRAF中、尤其在位置600處包含致癌突變且特別是突變BRAF V600E之此類癌症。

實例14C-SKMEL31黑色素瘤細胞株

評定以下處理對SKMEL31黑色素瘤細胞株(BRAF V600E雜合的)之作用：(1)MRx0029；(2)YFCA+培養基中威羅菲尼(VEMU)；(3)VEMU及MRx0029；(4)YFCA+培養基中氮胞苷-C(Aza-c)；(5)Aza-c及MRx0029；(6)VEMU、Aza-c及MRx0029。

使用材料與方法中之方案，評定SKMEL31細胞株中之MAP2基因表現，且結果示於圖39中。使用材料與方法中之方案，評定SKMEL31細胞株之純系存活，且結果示於圖40中。使用材料與方法中之方案，評定SKMEL31細胞株之軟瓊脂生長，且結果示於圖41中。VEMU、Aza-c及VEMU+Aza-c改善MRx0029對軟瓊脂生長及純系存活之抑制。使用材料與方法中之方案評定SKMEL31細胞株中之ERK信號傳導，且結果示於圖42中(不評定組合之VEMU、Aza-c及MRx0029)。所有利用MRx0029(單獨或與VEMU或Aza-c組合)之處理相對於陰性對照物(YFCA+)減少ERK信號傳導。

實例14D-451Lu黑色素瘤細胞株

評定以下處理對451Lu黑色素瘤細胞株(BRAF中V600E致癌突變)之作用：(1)MRx0029；(2)YFCA+培養基中威羅菲尼(VEMU)；(3)VEMU及MRx0029；(4)YFCA+培養基中氮胞苷-C(Aza-c)；(5)Aza-c及MRx0029；(6)VEMU、Aza-c及MRx0029。

使用材料與方法中之方案，評定451Lu細胞株中之MAP2基因表現，且結果示於圖43中。所有利用MRx0029(單獨或與VEMU及/或Aza-c組合)之 處理相對於僅細胞株之陰性對照物增加MAP2基因表現。使用材料與方法中之方案，評定451Lu細胞株之純系存活，且結果示於圖44中。所有利用MRx0029(單獨或與VEMU及/或Aza-c組合)之處理相對於兩種陰性對照物(僅細胞株及YCFA+ +DMSO)降低純系存活。使用材料與方法中之方案，評定451Lu細胞株之軟瓊脂生長，且結果示於圖45中。氮胞苷C增強MRx0029對軟瓊脂生長之抑制。使用材料與方法中之方案評定451Lu細胞株中之ERK信號傳導，且結果示於圖46中(不評定組合之VEMU、Aza-c及MRx0029)。MRx0029與VEMU或Aza-c組合相對於陰性對照物(YFCA+ +DMSO)減少ERK信號傳導。

此等結果表明單獨或與威羅菲尼及/或氮胞苷-C組合之MRx0029對載有BRAF V600E致癌突變之黑色素瘤細胞株(451Lu)可具有誘導MAP2基因表現及降低純系存活及生長之作用。基於此，預期本發明之組合物可用於治療或預防癌症、尤其包含致癌ERK信號傳導之癌症、特別是黑色素瘤，諸如轉移性黑色素瘤。詳言之，預期本發明之組合物可用於治療或預防在BRAF中、尤其在位置600處包含致癌突變且特別是突變BRAF V600E之此類癌症。

實例14E-HT29結腸直腸癌細胞株

評定以下處理對HT29結腸直腸癌細胞株(BRAF中V600E致癌突變)之作用：(1)MRx0029；(2)YFCA+培養基中威羅菲尼(VEMU)；(3)VEMU及MRx0029；(4)YCFA+培養基中氮胞苷-C(Aza-c)；(5)Aza-c及MRx0029；(6)VEMU、Aza-c及MRx0029。

使用材料與方法中之方案，評定HT29細胞株中之MAP2基因表現，且結果示於圖47中。MRx0029與VEMU及/或Aza-c組合相對於兩種陰性對照物(僅細胞株及YCFA+)增加MAP2基因表現。使用材料與方法中之方案，評定HT29細胞株之純系存活，且結果示於圖48中。所有利用MRx0029(單獨或與VEMU及/或Aza-c組合)之處理相對於兩種陰性對照物(僅細胞株及YCFA+ +DMSO)降低純系存活。Aza-c改善MRx0029抑制純系存活之作用。使用材料與方法中之方案，評定HT29細胞株之軟瓊脂生長，且結果示於圖49a及49b中。使用材料與方法中之方案評定HT29細胞株中之ERK信號傳導，且結果示於圖50中(不評定組合之VEMU、Aza-c及MRx0029)。單獨MRx0029相對於陰性對照(YFCA+ +DMSO)ERK信號傳導。

此等結果表明單獨或與威羅菲尼及/或氮胞苷-C組合之MRx0029對載有V600E致癌突變之細胞株(HT29)可具有誘導MAP2基因表現、降低純系存活及抑制ERK信號傳導之作用。基於此，預期本發明之組合物可用於治療或預防癌症、尤其包含致癌ERK信號傳導之癌症、特別是結腸直腸癌，諸如轉移性結腸直腸癌。詳言之，預期本發明之組合物可用於治療或預防在BRAF中、尤其在位置600處包含致癌突變且特別是突變BRAF V600E之此類癌症。

實例15-分化Caco-2細胞中之GPR109a RNA表現

GPR109a係一種在結腸及腸上皮細胞之面向內腔之頂膜中表現的G蛋白偶合受體。在結腸癌細胞株中發現GPR109a表現沉默，且已報導誘導其表現可在諸如丁酸鹽之細菌醱酵產物存在下誘導腫瘤細胞之細胞凋亡[126]。

將HT29mtx細胞接種在12孔盤上且分化10天；接著血清饑餓12小時，隨後暴露於源自於穩定期細菌之10%上清液24小時。收集細胞，且根據RNeasy微型套組方案(Qiagen)分離總RNA。使用大容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems)製造cDNA。藉由qPCR量測基因表現。β-肌動蛋白用作內部對照物。根據2^(-△△ct)法計算變化倍數[127]。所用正向及反向引子之序列分別提供為SEQ ID NO：6及7。

分化Caco-2形成不能滲透且在結構上及功能上類似於小腸上皮細胞之極化頂膜/黏膜及基底膜/漿膜。用MRx0029處理Caco-2引起GPR109a之表現增加(圖52A)。此外，用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)上清液處理Caco- 2展現比用單獨PMA(或YCFA+培養基中PMA)處理更大的GPR109a RNA表現，參見圖52B。因此，此等資料表明本發明之組合物可用於治療癌症、特別是轉移性癌症、尤其轉移性結腸直腸癌或小腸癌，諸如小腸腺癌，且尤其包含致癌ERK信號傳導之癌症。此等資料亦表明本發明之組合物可經由作為GPR109a表現之結果，誘導細胞凋亡之機制實現此類治療。

實例16-MRx0029對HT29細胞株分泌IL-8之作用

分化HT29細胞形成不能滲透且在結構上及功能上類似於小腸上皮細胞之極化頂膜/黏膜及基底膜/漿膜。

將HT29細胞以200,000個細胞/孔之密度塗鋪在12孔盤中。細胞分化10天(每2天改變培養基)。實驗當日置於厭氧罩中且用厭氧之平衡漢氏溶液(HANK solution)洗滌。接著將900ul生長培養基(無FBS及抗生素)添加至細胞。使細菌細胞再懸浮於生長培養基(無FBS及抗生素)中且接著在100ul中以總計10⁷CFU添加。將細胞與細菌在厭氧罩中共同培育2小時。然後將細胞在無FBS但含有抗生素之生長培養基中洗滌。細胞置於1ml THP1條件培養基中24小時。培育24小時之後，收集上清液且在4℃下以10,000g短暫離心3分鐘。樣品冷凍在-80℃下直至進一步使用。

THP1條件培養基：將THp1以4×10⁶/燒瓶之密度接種在T25燒瓶上。將細胞在具有1ug/ml LPS或LPS+5mM ATP(在LPS之後3小時添加ATP)之RPMI培養基(含有2mM L-麩醯胺酸，無FBS)中處理。使細胞靜置24小時。此後藉由在室溫下以250g短暫離心細胞5分鐘來收集條件培養基(CM)。不同CM用於處理HT29細胞。小等分試樣冷凍在-80℃下，用於ELISA。

自不同樣品收集上清液且根據製造商之說明書，使用來自Peprotech之人類IL-8 ELISA套組進行細胞介素分析。GraphPad Prism7用於繪製及分析資料。

MRx0029增加IL-8分泌，IL-8係一種有效刺激免疫之細胞介素(圖53)。此等資料證明MRx0029之免疫刺激活性。

如上所述，IL-8之分泌增加B細胞增殖。B細胞與調節對腫瘤之免疫反應相關聯。實際上，B細胞分泌抗腫瘤抗體係一種有效控制腫瘤之機制。熟知腫瘤特異性抗體之產生可引起自然殺手細胞結合於抗體恆定域，從而經由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)溶解腫瘤細胞。因此，本發明之組合物可經由適當調節B細胞反應，確保抗腫瘤免疫反應增加來實現癌症之治療。

基於大部分癌症之病變機制涉及宿主免疫系統對監督之逃避的實事，所以任何與刺激免疫反應相關之機制將具有治療有益之影響。因此，預期本發明之組合物可用於治療或預防各種癌症。

實例17-代謝物分析

引言

腸微生物叢具有巨大多樣性及代謝能力，其代表用於產生各種分子之巨大代謝貯存器。本發明者設法確定馬賽巨型球菌菌株NCIMB 42787及本文中確定為Ref 1、Ref 2及Ref 3之其他馬賽巨型球菌菌株產生及消耗哪些短鏈脂肪酸及中鏈脂肪酸。

材料與方法

細菌培養及收集無細胞上清液

細菌之純培養物在YCFA+肉湯中無氧生長，直至其達到其穩定生長期。將培養物以5,000×g離心5分鐘且使用0.2μM過濾器(Millipore,UK)過濾無細胞上清液(CFS)。將CFS之1mL等分試樣儲存在-80℃下，直至使用。丁酸鈉、己酸及戊酸自Sigma Aldrich(UK)獲得且在YCFA+肉湯中製備懸浮液。

細菌上清液之SCFA及MCFA定量

藉由MS Omics APS如下分析及定量來自細菌上清液之短鏈脂肪酸 (SCFA)及中鏈脂肪酸(MCFA)。使用鹽酸酸化樣品，且添加氘標記之內標。所有樣品以隨機化順序分析。使用安裝在GC(7890B，Agilent)中之高極性管柱(Zebron^TM ZB-FFAP，GC Cap.管柱30m×0.25mm×0.25μm)聯合四極偵測器(59977B，Agilent)進行分析。藉由ChemStation(Agilent)控制系統。使用Chemstation(Agilent)將原始數據轉變成netCDF格式，接著輸入數據且在Matlab R2014b(Mathworks公司)中使用[128]描述之PARADISe軟體處理。

結果

如圖54-56所示，菌株42787產生戊酸、丁酸鹽及己酸且消耗丙酸鹽及乙酸鹽。本發明者亦發現馬賽巨型球菌物種之其他菌株產生可比較水準之戊酸、己酸及丁酸鹽且消耗類似量之乙酸鹽及丙酸鹽。

實例18-烯醇酶2之抑制

圖57顯示MRx0029具有抑制神經元特異性烯醇酶(NSE)/烯醇酶2之統計顯著作用。認為NSE支持增加之腫瘤細胞代謝需求，保護腫瘤細胞抵禦應力條件且促進其侵襲及遷移[129]。其亦與轉移性黑色素瘤之進展[130]、小細胞肺癌之存活及進展[131]及肺腺鱗癌之預後[132]相關聯。因此，預期本發明之組合物有效治療及預防癌症、尤其轉移性黑色素瘤、小細胞肺癌及肺腺鱗癌。

實例19-代謝物分析

考慮到實例17中提供之資料，圖58顯示馬賽巨型球菌菌株NCIMB 42787及以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43388及NCIMB 43389寄存之其他菌株產生及消耗哪些其他短鏈脂肪酸。

馬賽巨型球菌菌株NCIMB 42787減少甲酸，同時增加2-甲基-丙酸及3-甲基-丙酸之水準(圖58)。因此，菌株NCIMB 42787產生2-甲基-丙酸及3-甲基-丙酸且消耗甲酸。本發明者亦發現其他寄存菌株產生可比較水準之2-甲基-丙酸及3-甲基-丙酸且消耗類似量之甲酸。

實例20-IL-6之上調

引言

研究細菌菌株引起星形細胞瘤細胞株U373之IL-6分泌增加的能力。

材料與方法

將人類膠質母細胞瘤星形細胞瘤細胞株(U373)維持於補充有10%熱失活FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素及5μg/ml血漿素(plasmocin)、1%非必需胺基酸、1%丙酮酸鈉之25ml MEME 4.5g/L D-葡萄糖(稱為完全生長培養基)中。

細胞於1ml完全生長培養基中以100,000個細胞/孔之密度塗鋪於24孔盤中，且靜置於37℃/5% CO₂下72小時。在處理當日，自各孔移除培養基，將細胞用0.5ml洗滌培養基(無血清MEME)、0.9ml刺激培養基(含有2% FBS之MEME培養基)清洗。預培育1小時之後，自CO₂培育箱移除細胞且用100μl細菌上清液處理。YCFA+培養基用作對照物。接著將細胞在37℃/5% CO₂下進一步培育24小時，此後收集無細胞上清液，且在4℃下以10,000g短暫離心3分鐘。樣品等分在1.5ml微管中，且儲存在-80℃下進行hIL-6 ELISA。

結果及結論

圖59顯示與未經處理及YCFA+對照物相比，馬賽巨型球菌菌株NCIMB 42787上調U373細胞中之IL-6分泌。其他寄存菌株、尤其NCIMB 43389亦增加IL-6之分泌。其他寄存菌株為NCIMB 43385、NCIMB 43388、NCIMB 43386及NCIMB 43387。

IL-6之分泌增加B細胞增殖。如上所概述，B細胞增殖增加可充當改善針對癌症之免疫反應的有效機制(例如經由產生抗體及引起ADCC)。

實際上，不僅寄存菌株顯示免疫刺激活性，相關寄存菌株亦顯示免疫刺激活性。因此，預期包含巨型球菌屬之菌株或其生物型的本發明之組合物可 用於治療或預防各種癌症。

實例21-烯醇酶2之抑制

材料與方法

神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y在補充有2mM L-麩醯胺酸、10%熱失活FBS、100U/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素之50% MEM及50% Nutrient Mixture F-12 Ham培養基中生長。SH-SY5Y以0.5×10⁶個細胞之密度塗鋪於6孔盤中。在24小時之後，細胞在具有10%細菌上清液之分化培養基(含有1% FBS之生長培養基)或YCFA+中處理17小時。收集細胞，且根據RNeasy微型套組方案(Qiagen)分離總RNA。使用大容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems)製造cDNA。藉由qPCR量測基因表現。GAPDH用作內部對照物。根據2^(-△△ct)法計算變化倍數。所用引子組以SEQ ID NO：2、3、13及14列出。

結果

圖60顯示馬賽巨型球菌菌株NCIMB 42787具有抑制神經元特異性烯醇酶(NSE)/烯醇酶2之統計顯著作用。此外，與YCFA+培養對照物相比，本發明者亦發現寄存之參考菌株引起烯醇酶2之統計顯著減少。詳言之，以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43388、NCIMB 43389、NCIMB 43386及NCIMB 43387寄存之菌株顯著抑制烯醇酶2。

結論

因此，與以上實例18中之評論一致，在某些實施例中，預期包含例示性參考菌株之本發明之組合物有效治療及預防癌症、尤其轉移性黑色素瘤、小細胞肺癌及肺腺鱗癌。

實例22-MAP2之上調

材料與方法

神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y在補充有2mM L-麩醯胺酸、10%熱 失活FBS、100U/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素之50% MEM及50% Nutrient Mixture F-12 Ham培養基中生長。SH-SY5Y以0.5×10⁶個細胞之密度塗鋪於6孔盤中。在24小時之後，細胞在具有10%細菌上清液之分化培養基(含有1% FBS之生長培養基)或YCFA+中處理17小時。收集細胞，且根據RNeasy微型套組方案(Qiagen)分離總RNA。使用大容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems)製造cDNA。藉由qPCR量測基因表現。GAPDH用作內部對照物。根據2^(-△△ct)法計算變化倍數。所用引子組以SEQ ID NO：2、3、4及5列出。

結果

圖61A顯示與對照物(亦即陰性對照物及培養基對照物)相比，馬賽巨型球菌菌株NCIMB 42787及其他寄存菌株引起MAP2表現之統計上顯著增加。詳言之，以登錄號NCIMB 43385、NCIMB 43388、NCIMB 43389、NCIMB 43386及NCIMB 43387寄存之菌株引起MAP2表現顯著增加。基於此，預期本發明之組合物可用於治療或預防各種癌症，尤其轉移性癌症、尤其轉移性黑色素瘤。

實例23-在用馬賽巨型球菌菌株NCIMB 42787處理後暴露於TNFα之HMC3細胞中細胞介素分泌之調節

引言

HMC3細胞用TNFα處理，且在用來自NCIMB 42787之穩定期培養之無細胞上清液處理後量測IL-8之分泌。

材料與方法

人類小神經膠質細胞HMC3細胞在補充麩醯胺酸之含有15%熱失活FBS及100U/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素之EMEM培養基中生長。將HMC3細胞以50,000個細胞/孔之密度塗鋪在24孔盤中。細胞置於CO₂培育箱中靜置48小時。接著細胞在空白EMEM中洗滌，且在具有10ng/ml TNF-α之2% FBS 生長培養基中預先處理1小時。此後，將NCIMB 42787穩定期生長培養物(如上所述分離)之10%無細胞細菌上清液添加至經TNF-α處理及未經處理之孔且在CO₂培育箱中在37℃下培育24小時。收集無細胞上清液且在4℃下以10,000×g離心3分鐘。樣品等分在1.5ml微管中，且儲存在-80℃下進行hIL-8 ELISA。

使用hIL-8標準ELISA套組，根據製造商之方案，在來自如上所述處理之HMC3細胞的無細胞上清液中分析IL-8分泌。在微量培養盤式讀數器(iMark,Bio-Rad)上，在405nm下量測樣品，其中校正波長設定在655nm下。使用GraphPad Prism 7軟體將原始數據繪圖且分析。

統計分析

正態分佈之數據呈現為平均值±SEM；單因子(斯達克多次對比檢驗(Sidak’s multiple comparison test))用於分析此文件中呈現之數據。在所有情況下p值<0.05視為顯著。

結果

NCIMB 42787在缺乏刺激下誘導IL-8分泌(圖61B)。如上所概述，IL-8尤其藉由刺激B細胞增殖引起活化免疫系統。

實例24-HEK-TLR4細胞中馬賽巨型球菌NCIMB 42787對NF-κB啟動子之活化

引言

為證實用NCIMB 42787處理是否將誘導由TLR4接合所誘導之NF-κB-Ap1啟動子活性，將HEK-TLR4細胞用單獨或與LPS組合的NCIMB 42787之無細胞細菌上清液處理。

材料與方法

根據製造商之說明書培養穩定表現人類TLR4之HEK293-Blue報導細胞(HEK-TLR4)。簡言之，將HEK-TLR4細胞維持於補充有10%(v/v)熱失活 FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、100μg/ml諾黴素(normocin)、1X HEK-Blue選擇培養基之DMEM 4.5g/L D-葡萄糖中。

簡言之，將細胞用PBS洗滌，在PBS中解離，且收集在生長培養基中。將細胞以25,000個細胞/孔之密度塗鋪在96孔盤中。為評估細菌菌株對LPS誘發之NF-κB啟動子活化的作用，在10%上清液(如上所述分離)存在或不存在下將細胞用10ng/ml LPS處理且在CO₂培育箱中培育。處理在37℃及5% CO下進行22小時，接著使用QUANTI-blue溶液，根據製造商之說明書，偵測來自細胞培養上清液之分泌性胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)活性。簡言之，收集20μl無細胞上清液，且藉由與200μl無菌過濾之QUANTI-Blue偵測培養基混合來分析SEAP之存在。在37℃下培育2小時之後，在微量培養盤式讀數器(iMark,Bio-Rad)上，在655nm下量測光密度。

統計分析

正態分佈之數據呈現為平均值±SEM；單因子(斯達克多次對比檢驗)用於分析此論文中呈現之數據。在所有情況下p值<0.05視為顯著。

結果

NCIMB 42787自身誘導NF-κB-Ap1啟動子之活化(圖61C)。

NF-κB尤其藉由刺激與免疫反應相關之炎症介體及細胞介素，例如IL-6之表現而與免疫反應之活化有關。如上所概述，IL-6之表現增加有助於刺激免疫系統，因此活化NF-κB路徑具有免疫刺激活性。因此，在某些實施例中，本發明之組合物活化NF-κB信號傳導，因此刺激免疫系統。

實例25-馬賽巨型球菌菌株產生丁酸、戊酸及己酸

材料與方法

根據De Baere等人之方法¹³³，自YCFA+、外加SCFA之標準混合物(40mM乙酸及20mM甲酸、丙酸、丁酸、戊酸及己酸)之YCFA+提取SCFA。

SCFA之HPLC分析

根據De Baere等人之方法¹³³進行SCFA之HPLC偵測及定量，略作修改。簡言之，使用裝備有Waters光電二極體陣列(PDA)偵測器2998(Waters Limited,Elstree,UK)之Waters e2695 HPLC系統進行HPLC分析。使用Xselect® HSS T3 3.5μm 4.6×150mm LC管柱(Waters Limited,Elstree,UK)進行SCFA標準品、自MRx0005及MRx0029 BCFS提取之SCFA及MRx0005及MRx0029己烷、二乙醚、乙酸乙酯、乙腈及甲醇提取物的HPLC分析。使用光電二極體陣列偵測器(PDA)進行LC分析，該偵測器設定為分析200-800nm之波長。在210nm下進行SCFA偵測及定量。流動相由HPLC水中25mM磷酸鈉緩衝液(pH值使用磷酸調至3.0)(A)及乙腈(B)組成。用於SCFA偵測及定量之LC方法使用具有以下梯度之溶劑系統操作：t0′A=95%，B=5%；t10′A=95%，B=5%；t30′A=30%，B=70%；t31′A=0%，B=100%；t36′A=0%，B=100%；t38′A=5%，B=95%；t60′A=5%，B=95%；流速=1ml/min。

藉由注射20μl SCFA(40mM乙酸及20mM甲酸、丙酸、丁酸、戊酸及己酸)之兩倍連續稀釋液，針對各SCFA製備七點校準曲線。定量-提取效率使用下式計算：[外加且提取之YCFA+中的SCFA]/[外加未提取之YCFA+中的SCFA]

提取效率用於確定各樣品中個別SCFA之濃度。藉由減去未外加之培養基對照物中存在之對應SCFA之量，計算特定SCFA之產生。

靶向代謝組學：細菌代謝物及脂肪酸分析

藉由MS-Omics(Copenhagen,Denmark)進行樣品分析。藉由自各樣品取等分試樣，建立混合之彙集樣品(QC樣品)。在整個順序中此樣品以規則間隔分析。藉由以最少兩個水準外加QC樣品，測試定量化合物之基質效應。

對於GC-代謝物分析，使用Smart等人描述之方案¹³⁴的略微修改版 本，用氯甲酸甲酯衍生樣品。所有樣品以隨機化順序分析。使用GC(7890B，Agilent)聯合四極偵測器(59977B，Agilent)進行分析。使用Chemstation(Agilent)將原始數據轉變成netCDF格式，接著輸入數據且在Matlab R2014b(Mathworks公司)中使用Johnsen等人¹³⁵描述之PARADISe軟體處理。

對於SCFA分析，使用鹽酸將樣品酸化，且添加經氘標記之內標。使用安裝在GC(7890B，Agilent)中之高極性管柱(Zebron^TM ZB-FFAP，GC Cap.管柱30m×0.25mm×0.25μm)聯合四極偵測器(59977B，Agilent)進行分析。使用Chemstation(Agilent)將原始數據轉變成netCDF格式，接著輸入數據且在Matlab R2014b(Mathworks公司)中使用Johnsen等人¹³⁵描述之PARADISe軟體處理。

結果

使用靶向代謝組學進行之脂肪酸分析顯示，NCIMB 42787產生呈直鏈及支鏈形式之丁酸(丁酸)、戊酸(戊酸)及己酸(己酸)(C4-C6)(圖62A)。此外，在NCIMB 42787無細胞上清液中4-羥基-苯基乙酸：培養基之比率增加。無細胞上清液之HPLC分析用於監測NCIMB 42787之甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及己酸之產生(基於相關SCFA之滯留時間及吸光度範圍)。與針對SCFA提取之NCIMB 42787無細胞上清液疊加的SCFA標準品之代表性層析圖報導於圖62C中。HPLC分析證實NCIMB 42787產生丁酸、戊酸及己酸。

實例26-含有丁酸鹽及戊酸鹽之馬賽巨型球菌甲醇溶離份在U373細胞中顯示免疫刺激活性

為研究SCFA在減少IL-8分泌中之作用，將U373細胞用增加濃度之丁酸鈉(SB)、戊酸鈉(SV)及己酸(HA)處理。

方法

U373如上所述製備。如上所指示將細胞用1μg/ml LPS預先處理1小時，且在37℃及5% CO₂下培育。預培育1小時之後，自CO₂培育箱移除細 胞，且用增加濃度之新鮮製備之丁酸鈉(SB)、戊酸鈉(SV)及己酸(HA)處理。

統計分析

正態分佈之數據呈現為平均值±SEM；單因子(斯達克多次對比檢驗)用於分析此論文中呈現之數據。在所有情況下p值<0.05視為顯著。

結果及結論

測試之濃度覆蓋不同脂肪酸在無細胞上清液中量測之濃度範圍且考慮僅10%上述上清液用於基於細胞之分析的事實。SB與SV均增加相同細胞中LPS誘發之IL-8分泌(圖63)，此表明當添加NCIMB 42787至培養物時兩種SCFA之存在可能促進IL-8誘發。在用LPS激發之後HA不抑制IL-8分泌。測試之SFCA中無一者本身誘發IL-8之分泌超過基礎水準(未經處理之細胞對照物)。在LPS存在與不存在下，三種SCFA之重組混合物均再現NCIMB 42787無細胞上清液之生物活性。

因此，在某些實施例中，丁酸及/或戊酸與IL-8之產生有關，因此，對於例如經由B細胞增殖刺激免疫系統而言係重要的。因此，在某些實施例中，本發明之細菌菌株經由產生丁酸及/或戊酸而刺激免疫系統。

實例27-由NCIMB 42787產生之SCFA至少部分負責免疫刺激活性

引言

為進一步確認NCIMB 42787之活性是否至少部分歸因於SCFA，將無細胞細菌上清液用極性遞增之不同溶劑分級分離。對此菌株上清液之去蛋白酶化粗提取物(己烷，F5；二乙醚，F4；乙酸乙酯，F3；乙腈，F4；甲醇，F1)進行HPLC分析以分析NCIMB 42787之穩定期無細胞上清液之生物化學複雜性，以及基於極性及溶解性將化合物細分級分離。

方法

依序溶劑提取-製備粗提取物

將NCIMB 42787菌株BCFS之三個生物學複製品及YCFA+(培養基對照物)依序用HPLC級己烷(HEX)、二乙醚(DE)、乙酸乙酯(EtOAc)、乙腈(ACN)及甲醇(MeOH)提取。簡言之，20ml BCFS置於玻璃小管，且在室溫(RT)下在20ml HEX中在旋轉震盪器(70rpm)上提取30分鐘。在各BCFS及YCFA+培養基對照物上總共提取三次。接著在室溫下，在20ml DE、EtOAc中在MX-RD-Pro旋轉震盪器(70rpm)上將剩餘水層提取30分鐘，總共三次。將各樣品之合併提取物在裝備有V-300真空泵(Büchi,Flawil,Switzerland)之R-300旋轉蒸發器中在減壓下在不超過30℃之溫度下乾燥。使所得提取物再溶於2ml對應溶劑中且等分在四個1.5ml艾氏管(Eppendorftube)(各500μl，與5ml原樣相對應)。接著在室溫下，在20ml DE、EtOAc中在MX-RD-Pro旋轉震盪器(70rpm)上將剩餘水層提取30分鐘，總共三次。將各樣品之合併提取物在裝備有V-300真空泵(Büchi,Flawil,Switzerland)之R-300旋轉蒸發器中在減壓下在不超過30℃之溫度下乾燥。使所得提取物再溶於2ml對應溶劑中且等分在四個1.5ml艾氏管(各500μl，與5ml原樣相對應)。

使用R-300旋轉蒸發器將剩餘水層蒸乾。將所得乾提取物在20ml ACN中提取30分鐘，總共三次。將ACN提取物合併，使用旋轉蒸發器蒸乾，再溶於2ml ACN且等分在四個1.5ml艾氏管(各500μl)。接著剩餘乾提取物(提取物之ACN不溶部分)在20ml MeOH中提取30分鐘，總共三次。將MeOH提取物合併，使用R-300旋轉蒸發器蒸乾，再溶於2ml MeOH且等分在四個1.5ml艾氏管(各500μl)。

粗提取物之等分試樣保持在-20℃下隔夜，誘發蛋白質組分沈澱。在沈澱隔夜之後，各等分試樣以10,000×g離心6分鐘且轉移至新2ml管。隔夜沈澱重複三次，接著在RVC 2-18 CDPlus speedvac(Christ,Osterode am Harz,Germany)中乾燥提取物，且稱重。各提取物之所有乾燥等分試樣儲存在-80℃下 直至進一步使用。

處理

U373如上所述製備。如上所指示，將細胞用1μg/ml LPS預先處理1小時。然後，自CO₂培育箱移除細胞且用100μl不同溶離份處理。來自培養基之溶離份用作對照物。在處理後24小時收集無細胞上清液，且藉由ELISA分析IL-8之分泌(如上所概述)。

統計分析

正態分佈之數據呈現為平均值±SEM；單因子(斯達克多次對比檢驗)用於分析此論文中呈現之數據。在所有情況下p值<0.05視為顯著。

結果

HPLC分析證實去蛋白酶化之上清液中存在之化合物的選擇性提取及粗分級分離。在LPS存在及不存在下，未分級分離之NCIMB 42787誘發U373細胞中IL-8分泌，且甲醇溶離份F1產生相同活性，因此重複丁酸及戊酸在此等細胞類型之IL-8產生中之重要作用(圖64A及64B)。

因此，如上所概述，在某些實施例中，丁酸及/或戊酸之產生刺激免疫系統。因此，在某些實施例中，本發明之細菌菌株經由產生丁酸及/或戊酸而刺激免疫系統。

實例28-巨型球菌參考菌株NCIMB 43387顯著減少BALB/c小鼠中結腸IDO-1 mRNA表現

圖65顯示NCIMB 43387與媒劑對照物相比，顯著減少(藉由qPCR定量，相對於β-肌動蛋白標準化)BALB/c小鼠之結腸中IDO-1 mRNA表現。

回應於發炎或感染，IDO-1參與促進免疫抑制。因此，驅動IDO-1表現下降引起免疫刺激。此外，IDO-1之減少使癌細胞之增殖及遷移能力降低，且改善對腫瘤之免疫監督。因此，在某些實施例中，本發明之細菌菌株用來減少 IDO-1表現。在某些實施例中，免疫刺激引起IDO-1表現減少。此外，在某些實施例中，本發明之組合物預防轉移性癌症生長。在某些實施例中，根據針對轉移之活性，本發明之組合物有效治療及預防癌症、尤其轉移性黑色素瘤、小細胞肺癌及肺腺鱗癌。

實例29-以登錄號NCIMB 43385及NCIMB 43387寄存之巨型球菌菌株減少BALB/c小鼠中結腸Tph-1 mRNA表現

向BALB/c小鼠投與活的生物治療劑且分離組織以使用qPCR分析基因表現。

圖66顯示本發明之組合物與媒劑對照物相比能夠減少Tph-1 mRNA之表現(藉由qPCR定量，相對於β-肌動蛋白標準化)。

已知Tph-1減少與抗癌性增加及癌細胞生長減少有關。此外，Tph-1活性下降藉由為肥大細胞提供充足水準之必需胺基酸色胺酸來驅動抗腫瘤免疫性而刺激免疫系統。因此，在某些實施例中，本發明之組合物降低Tph-1之表現水準。在某些實施例中，本發明之組合物藉由降低Tph-1之水準，引起免疫刺激且治療及/或預防本文揭示之疾病。

實例30-以登錄號NCIMB 43385寄存之巨型球菌菌株在來自BALB/c小鼠之脾細胞的ConA刺激後增加IFNγ及IL-6產生

針對自BALB/c小鼠分離且經ConA刺激之脾細胞中免疫標記物產生之功效，離體篩選活的生物治療性菌株。

圖67顯示本發明之組合物顯著增加促炎性細胞介素IFNγ及IL-6之產生。如上所概述，此兩種細胞介素與刺激免疫反應有關。此外，IFNγ具有顯著的殺腫瘤活性。

因此，如上所概述，在某些實施例中，本發明之組合物增加IFNγ及/或IL-6之產生，因此驅動免疫反應之刺激。因此，在某些實施例中，本發明之 組合物之治療益處引起IFNγ及/或IL-6產生增加。

實例30-以登錄號NCIMB 43385寄存之巨型球菌參考菌株顯著增加IL-6及CD11b表現

向BALB/c小鼠投與活的生物治療劑且分離組織以使用qPCR分析基因表現。

圖68顯示NCIMB 43385與媒劑對照物相比，能夠顯著增加BALB/c小鼠之海馬區中IL-6及CD11b表現。

因此，如上所概述，在某些實施例中，本發明之組合物增加與刺激免疫反應有關之促炎性細胞介素、尤其IL-6及CD11b之表現。在某些實施例中，根據IL-6及CD11b表現之增加，本發明之組合物係治療有效的。

實例31-NCIMB 42787增加TLR4表現

向BALB/c小鼠投與活的生物治療劑且分離組織以使用qPCR分析基因表現。

圖69顯示NCIMB 42787與媒劑對照物相比，能夠顯著增加BALB/c小鼠之杏仁核中之TLR4表現。

TLR4與活化免疫反應有關。因此，增加TLR4表現將提高免疫刺激。在某些實施例中，本發明之組合物增加TLR4之表現。在某些實施例中，TLR4表現之增加使免疫反應增加。在某些實施例中，本發明之組合物增加免疫反應且經由增加TLR4表現具有治療本文揭示之疾病的治療作用。

序列

SEQ ID NO：1(馬賽巨型球菌菌株MRx0029之一致16S rRNA序列)

用於qPCR之引子

SEQ ID NO：8(以登錄號NCIMB 43385寄存之巨型球菌菌株之一致16S rRNA序列)

SEQ ID NO：9(以登錄號NCIMB 43388寄存之馬賽巨型球菌菌株之一致16S rRNA序列)

SEQ ID NO：10(以登錄號NCIMB 43389寄存之馬賽巨型球菌菌株之一致16S rRNA序列)

SEQ ID NO：11(以登錄號NCIMB 43386寄存之巨型球菌菌株之一致16S rRNA序列)

SEQ ID NO：12(以登錄號NCIMB 43387寄存之巨型球菌菌株之一致16S rRNA序列)

用於烯醇酶之qPCR的引子

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<110> 英商4D製藥研究有限公司(4D PHARMA RESEARCH LIMITED)

<120> 包含細菌菌株之組合物

<140> 108116449

<141> 2019-05-13

<150> 18178136

<151> 2018-06-15

<150> 1813460.1

<151> 2018-08-17

<150> 1817642.0

<151> 2018-10-29

<150> 1820264.8

<151> 2018-12-12

<160> 14

<170> SeqWin2010，版本1.0

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 馬賽巨型球菌(Megasphaera massiliensis)菌株MRx0029之一致16S rRNA序列

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<913> GAPDH正向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH反向引子

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> MAP2正向引子

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> MAP2反向引子

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> GPR109a正向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> GPR109a反向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 1409

<212> DNA

<213> 以編號NCIMB 43385寄存之巨型球菌屬(Megasphaera)菌株之一致16S rRNA序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1415

<212> DNA

<213> 以編號NCIMB 43388寄存之馬賽巨型球菌(Megasphaera massilliensis)菌株之一致16S rRNA序列

<400> 9

<210> 10

<211> 1433

<212> DNA

<213> 以編號NCIMB 43389寄存之馬賽巨型球菌(Megasphaera massilliensis)菌株之一致16S rRNA序列

<400> 10

<210> 11

<211> 1431

<212> DNA

<213> 以編號NCIMB 43386寄存之巨型球菌屬(Megasphaera)菌株之一致16S rRNA序列

<400> 11

<210> 12

<211> 1434

<212> DNA

<213> 以編號NCIMB 43387寄存之巨型球菌屬(Megasphaera)菌株之一致16S rRNA序列

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 烯醇酶qPCR正向引子

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 烯醇酶qPCR反向引子

<400> 14

Claims (28)

1. 一種包含巨型球菌屬(Megasphaera)之細菌菌株的組合物，其用於刺激個體之免疫系統。
2. 如申請專利範圍第1項之組合物，其用於治療或預防癌症，諸如轉移性黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、神經母細胞瘤、膠質母細胞瘤、癌瘤、肺癌、慢性淋巴球性白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結腸直腸癌及/或血液惡性病。
3. 如申請專利範圍第2項之供使用之組合物，其中該組合物具有組蛋白去乙醯酶抑制活性。
4. 如申請專利範圍第2項或第3項之供使用之組合物，其中該組合物上調促炎性細胞介素。
5. 如申請專利範圍第2項至第4項中任一項之供使用之組合物，其用於降低腸障壁通透性。
6. 如申請專利範圍第1項之組合物，其用於治療、預防或延遲免疫衰老。
7. 如申請專利範圍第1項之組合物，其用作疫苗佐劑。
8. 如申請專利範圍第1項之組合物，其用於增強細胞療法，諸如CAR-T。
9. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其用於增加凋亡蛋白酶3、MAP2、IL-1β、IL-23及/或TNF-α之表現水準及/或活性。
10. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其用於選擇性地降低細胞群體中Treg之數目及/或百分比的方法中。
11. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其中該細菌菌株具有與巨型球菌屬之細菌菌株之16S rRNA序列至少95%、96%、97%、98%、99%、 99.5%或99.9%一致之16S rRNA序列。
12. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：8、9、10、11或12中之任一者至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16s rRNA基因序列，或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO：8、9、10、11或12中之任一者表示的16s rRNA基因序列。
13. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其中該細菌菌株屬於馬賽巨型球菌(Megasphaera massiliensis)。
14. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：1至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA基因序列，或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO：1表示之16s rRNA基因序列。
15. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其中該細菌菌株係以登錄號42787寄存在NCIMB之菌株。
16. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其中該組合物係用於經口投與。
17. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其中該組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
18. 如任一前述申請專利範圍之組合物，其中該細菌菌株經凍乾。
19. 一種包含如任一前述申請專利範圍之組合物的食品，其供任一前述申請專利範圍使用。
20. 一種治療或預防與免疫刺激減少相關之疾病或病狀的方法，其包括向有需要之患者投與包含巨型球菌屬之細菌菌株的組合物。
21. 一種組合物，其包含在申請專利範圍第1項至第16項中之任一項中所定義之細菌菌株的細胞，其中該細胞表現一或多種異源抗原。
22. 如申請專利範圍第21項之組合物，其中該細胞呈遞該一或多種異源抗原。
23. 如申請專利範圍第21項或第22項之組合物，其用作疫苗。
24. 一種在申請專利範圍第1項至第18項中之任一項中所定義之細菌菌株的細胞，其中該細胞表現一或多種異源抗原。
25. 如申請專利範圍第24項之細胞，其中該細胞呈遞該一或多種異源抗原。
26. 如申請專利範圍第24項或第25項之細胞，其用作疫苗。
27. 一種細菌菌株，其用於治療中，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO：8、9、10、11或12中之任一者至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16S rRNA序列。
28. 一種細菌菌株，其具有由SEQ ID NO：8、9、10、11或12中之任一者表示之16S rRNA序列，其用於治療中。

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