CN112512539A - 包含细菌菌株的组合物 - Google Patents

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苏阿德·艾哈迈德
安娜·埃托尔
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特德·迪南
约翰·克赖恩
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Abstract

本发明提供一种包含巨球菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防自身免疫性或炎性病症或癌症。

Description

包含细菌菌株的组合物
技术领域
本发明涉及包含从哺乳动物消化道分离的细菌菌株的组合物以及此类组合物在治疗疾病中的用途的领域。
背景技术
人类肠道被认为在子宫中是无菌的，但是在出生之后它立即暴露于各种各样的母体和环境微生物。然后，发生动态时间段的微生物定殖和演替，受诸如分娩方式、环境、饮食和宿主基因型的因素影响，这些因素都影响肠道微生物群的组成，特别是在生命早期。随后，微生物群稳定化并且变得成人化(adult-like)[1]。人类肠道微生物群含有超过500-1000种不同的种系型(phylotype)，它们基本上属于两种主要的细菌分类：拟杆菌门和厚壁菌门[2]。由人类肠道的细菌定殖产生的成功的共生关系已产生各种各样的代谢、结构、保护和其他有益的功能。所定殖的肠道的代谢活动增强确保了原本难以消化的膳食组分被降解，同时释放出副产物，从而为宿主提供重要的营养物质来源。同样，肠道微生物群的免疫学重要性受到公认并且在无菌动物中被例证，所述无菌动物的受损免疫系统在引入共生细菌之后得到功能重建[3-5]。
微生物群组成的动态变化已在肠胃病症诸如炎性肠病(IBD)中有所记载。例如，梭菌(Clostridium)聚类XIVa细菌的水平在IBD患者中降低，而大肠杆菌(E.coli)的数量增加，从而表明肠道内共生生物和病原生物平衡的变化[6-9]。有趣的是，这种微生物生态失调还与T效应细胞群的失衡相关联。
在认识到某些细菌菌株对于动物肠道可能具有的潜在积极作用之后，已提出各种菌株供用于治疗各种疾病(参见，例如[10-13])。另外，已提出某些菌株，主要包括乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株，供用于治疗与肠不直接相关的各种炎性和自身免疫性疾病(关于综述参见[14]和[15])。然而，不同疾病与不同细菌菌株之间的关系以及特定细菌菌株对于肠道和在全身水平下以及对于任何特定类型的疾病的准确作用并未被良好地表征。
在本领域中需要治疗疾病的新方法。还需要表征肠道细菌的潜在作用，以便可以开发出使用肠道细菌的新疗法。
Ahmed等(已提交给Frontiers Cellular Neuroscience)考虑了源自肠道微生物群的细菌菌株的体外表征。
发明内容
本发明已开发了包含巨球菌(Megasphaera)属的细菌菌株的新组合物，其可用于治疗和预防自身免疫性和炎性疾病以及癌症，特别是由组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性介导的自身免疫性和炎性疾病以及癌症。本发明人已认识到来自巨球菌属的细菌菌株可以有效降低组蛋白脱乙酰酶活性。已显示组蛋白脱乙酰酶介导各种自身免疫性或炎性疾病和病状中的病理症状，包括但不限于移植物抗宿主病(GVHD)和炎性肠病(诸如溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn’s disease))。如实施例中所述，在疾病模型中，包含马氏巨球菌(Megasphaeramassiliensis)的组合物的施用降低组蛋白脱乙酰酶的活性。发明人还已确定，用马氏巨球菌进行的治疗可以减少促炎分子诸如NFκB和IL-6被LPS活化。发明人已经确定，在体外用马氏巨球菌进行的治疗可以减少脂质过氧化，这可以帮助减少细胞死亡和细胞凋亡。发明人还已确定，马氏巨球菌可以产生能够减轻炎症和氧化应激的吲哚。
HDAC活性还与多种癌症的病理机制相关联。因此，抑制HDAC活性在癌症治疗中可以是治疗上有益的。因此，本发明的组合物在癌症，特别是至少部分地由HDAC活性介导的癌症的治疗或预防中可以具有多效性益处。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防癌症，诸如前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或胃癌，具体地说其中癌症是由提高的HDAC活性介导的。
发明人已经确定，用来自巨球菌属的细菌菌株进行的治疗可以降低HDAC的活性，这可以在治疗由HDAC活性介导的疾病中提供临床益处。在一些实施方案中，已发现本发明的组合物对降低I类HDAC活性特别有益。在某些实施方案中，本发明的组合物可以降低HDAC1、HDAC2或HDAC3的活性。I类HDAC被普遍表达并且最常见位于细胞核中。I类HDAC使组蛋白赖氨酸残基脱乙酰化，以恢复组蛋白的正电荷，从而增加组蛋白与DNA之间的静电结合。因此，HDAC的活性增加了染色质紧实度，从而导致基础DNA序列的基因表达下调。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物可以用于调节靶基因表达。HDAC通过修饰非组蛋白的蛋白靶点还具有额外的调节作用。抑制非组蛋白的蛋白靶点的乙酰化可对治疗或预防与受染色质形态控制的基因表达不直接相关的其他方面的疾病有益。
发明人还证明，包含巨球菌属的细菌菌株的组合物上调了血清素转运体(SERT)基因SLC6A4的表达。SERT由肠壁的上皮细胞表达，并从间隙空间中去除血清素。在一些文献参考[16]中已报道血清素在某些情况下，例如在胃肠道中可具有促炎作用。因此，本发明的组合物可用于治疗炎性病症，特别是炎性肠病，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎。在某些实施方案中，本发明的组合物通过增加胃肠道中的血清素转运，例如通过上调血清素转运体(SERT)基因SLC6A4的表达来用于治疗炎性肠病。
在特定实施方案中，本发明提供一种包含巨球菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防疾病或病状的方法，所述疾病或病状选自由以下组成的组：炎性或自身免疫性疾病，诸如哮喘、关节炎、银屑病、糖尿病、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病，或炎性肠病，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎；或癌症，诸如前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或胃癌。来自巨球菌属的细菌菌株所显示的对HDAC活性的作用可为由HDAC活性介导的疾病和病状(诸如上文列出的那些)提供治疗益处。在某些实施方案中，本发明的组合物可在治疗具有HDAC表达增加的疾病或病状中提供治疗益处。在某些实施方案中，本发明的组合物可在治疗具有HDAC活性提高的疾病或病状中提供治疗益处。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含马氏巨球菌菌种的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防由HDAC活性介导的炎性或自身免疫性疾病的方法。在一些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防由HDAC活性介导的炎性或自身免疫性疾病的症状。发明人已经确定，本发明的菌株抑制HDAC活性。组蛋白乙酰化和脱乙酰化是基因表达的重要表观遗传调控因子。组蛋白乙酰化失衡涉及诸如以下的炎性或自身免疫性疾病的发病机理：哮喘、关节炎、银屑病、糖尿病、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病，或炎性肠病，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含巨球菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防由HDAC活性介导的炎性肠病的方法。已显示抑制HDAC活性抑制胃肠道中促炎细胞因子的产生。因此，本发明的组合物可用于治疗炎性疾病。具体地讲，本发明的组合物可用于治疗或预防与结肠促炎细胞因子发病机理增加相关联的病状。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防炎性肠病。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防克罗恩病。在某些实施方案中，本发明提供一种包含巨球菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防炎性疾病。在优选的实施方案中，本发明提供一种包含巨球菌属、优选地马氏巨球菌菌种的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防结肠炎。
在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防癌症。癌症中乙酰化途径的失调与癌细胞存活和肿瘤免疫逃逸有关。例如，HDAC介导的p53脱乙酰化降低了p53的稳定性和半衰期。乙酰化的p53以更强的功效结合并调节细胞周期调控基因和促凋亡基因的表达，从而减少癌细胞生长并促进细胞凋亡。因此，p53的脱乙酰化可抑制癌细胞的细胞凋亡，从而增加癌细胞存活。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防癌症。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗具有非突变的p53的癌症。在一些实施方案中，本发明的组合物用于增加癌细胞中的细胞凋亡的方法。在一些实施方案中，本发明的组合物用于减少肿瘤免疫逃逸的方法。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防具有HDAC活性提高的癌症。在一些实施方案中，所述组合物用作促凋亡药物，例如用于治疗或预防癌症。在某些实施方案中，本发明提供一种包含巨球菌属、优选地马氏巨球菌菌种的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防癌症。
在另外优选的实施方案中，本发明提供一种包含巨球菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防癌症诸如乳腺癌、肺癌或肝癌的方法。在某些实施方案中，所述组合物用于在治疗癌症中减小肿瘤大小或预防肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，本发明提供一种包含巨球菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗癌症。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于在治疗或预防由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病状中降低组蛋白脱乙酰酶活性的方法。
在某些实施方案中，所述组合物用于具有组蛋白脱乙酰酶活性升高的患者。在某些实施方案中，所述组合物用于具有I类HDAC活性升高的患者。马氏巨球菌菌株所显示的对组蛋白脱乙酰酶活性的作用可能对此类患者特别有益。
在本发明的某些实施方案中，组合物中的细菌菌株是马氏巨球菌。在本发明的某些实施方案中，组合物中的细菌菌株是马氏巨球菌。也可以使用密切相关的菌株，诸如具有16s rRNA基因序列的细菌菌株，所述16s rRNA基因序列与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由SEQID NO:1表示的16s rRNA基因序列。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于口服施用。口服施用本发明的菌株可有效治疗由HDAC活性介导的疾病和病状。在某些实施方案中，口服施用本发明的菌株可有效治疗由I类HDAC活性介导的疾病和病状。另外，口服施用对患者和医生是方便的，并允许递送到肠和/或部分或完全定殖于肠。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含已冻干的细菌菌株。冻干是用于制备允许递送细菌的稳定组合物的有效且方便的技术。
在某些实施方案中，本发明提供一种包含如上所述的组合物的食物产品。
另外，本发明提供一种治疗或预防由HDAC活性介导的疾病或病状的方法，其包括施用包含巨球菌属的细菌菌株的组合物。
在开发上述发明中，发明人已经鉴定并表征了对于治疗特别有用的细菌菌株。已显示本发明的马氏巨球菌菌株能有效地治疗本文所述的疾病，诸如炎性和自身免疫性疾病，诸如GVHD和结肠炎。因此，在另一方面，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞。本发明还提供了包含此类细胞或此类细胞的生物学纯培养物的组合物。本发明还提供了一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗，特别是用于本文所述疾病的治疗。
以下提供本发明的另外编号的实施方案：
1.一种包含巨球菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防选自由以下组成的列表的疾病或病状：炎性或自身免疫性疾病，诸如哮喘、关节炎、银屑病、糖尿病、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病，或炎性肠病，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎；或癌症，诸如前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或胃癌。
2.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防由组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性介导的疾病或病状。
3.如实施方案1所述的组合物，其用于治疗或预防由I类HDAC活性介导的疾病或病状。
4.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于在由I类HDAC活性介导的病状中抑制I类HDAC活性的方法。
5.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于在治疗由I类HDAC活性介导的病状中选择性抑制I类HDAC活性的方法。
6.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于在由HDAC1、HDAC2或HDAC3活性介导的疾病或病状中选择性抑制HDAC1、HDAC2或HDAC3。
7.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防在其中抑制HDAC活性是有益的疾病或病状。
8.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于具有HDAC活性升高的患者。
9.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防炎性或自身免疫性或疾病。
10.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防炎性肠病。
11.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防溃疡性结肠炎。
12.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防克罗恩病。
13.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防癌症。
14.根据实施方案13所述的所使用的组合物，其中所述癌症选自由前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或胃癌组成的列表。
15.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与巨球菌属的细菌菌株的16S rRNA序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。
16.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ IDNO:14、15、16、17或18中的任一者具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA基因序列，或者其中所述细菌菌株具有由SEQ ID NO:14、15、16、17或18中的任一者表示的16s rRNA基因序列。
17.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株是马氏巨球菌。
18.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ IDNO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA基因序列。
19.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有由SEQ IDNO:1表示的16s rRNA基因序列。
20.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于口服施用。
21.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
22.如前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株被冻干。
23.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用作抗炎药物。
24.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用作组蛋白脱乙酰酶抑制药物。
25.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其用作I类组蛋白脱乙酰酶抑制药物。
26.一种包含如前述实施方案中任一项所述的组合物的食物产品，其用于如前述实施方案中任一项所述的用途。
27.一种治疗或预防由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病状的方法，其包括向有需要的患者施用包含马氏巨球菌菌种的细菌菌株的组合物。
28.一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞。
29.一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗，优选地用于如实施方案1-14之一所定义的疾病或病状的治疗或预防。
30.一种用于治疗的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:14、15、16、17或18中的任一者具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。
31.一种具有由SEQ ID NO:14、15、16、17或18中的任一者表示的16S rRNA序列的细菌菌株，其用于治疗。
附图说明
图1全细胞组蛋白脱乙酰酶活性和细胞裂解液组蛋白脱乙酰酶活性(图1A)，酸诱导的组蛋白脱乙酰酶活性的变化，MRx0029中代谢物产生的水平
图2I类HDAC的抑制(图2A)；HDAC1的抑制(图2B)；HDAC2的抑制(图2C)；HDAC3的抑制(图2D)
图3：IL-6分泌水平
图4：LPS诱导的NFκB启动子活化的抑制
图5：抗氧化能力的变化
图6：脂质氧化的变化
图7：吲哚产生水平
图8示出了施用MRx0029后在脑中的神经递质代谢物的水平。
图9示出了SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的色氨酸羟化酶1和色氨酸羟化酶2的表达的倍数变化。将细胞与10％MRx0029上清液一起孵育24h。
图10示出了SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的色氨酸羟化酶1和色氨酸羟化酶2的表达的倍数变化。将细胞与5％MRx0029上清液一起孵育72h。
图11示出了SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的SLC6A4的表达的倍数变化。将细胞与10％MRx0029上清液一起孵育24h。
图12示出了SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的SLC6A4的表达的倍数变化。将细胞与5％MRx0029上清液一起孵育72h。
图13示出了分化的Caco2细胞中的色氨酸羟化酶1(TPH1)表达的倍数变化。将细胞与10％MRx0029细菌无细胞上清液一起孵育24h。
图14示出了分化的Caco2细胞中的SLC6A4的表达的倍数变化。将细胞与10％MRx0029细菌无细胞上清液一起孵育24h。
图15：马氏巨球菌菌株NCIMB 42787的代谢物分析。
图16：在MRx0029和参考马氏巨球菌菌株的上清液中的戊酸产生。
图17：MRx0029和参考马氏巨球菌菌株的有机酸产生和消耗。
图18：除MRx0029以外，(A)未经佛波醇肉豆蔻酸酯(phorbolmyristate)处理时，和(B)经佛波醇肉豆蔻酸酯处理时，在分化的Caco-2细胞中的GPR109a RNA表达。“YCFA”＝YCFA+
图19：MRx0029对NSE/烯醇酶2的抑制。“YCFA”＝YCFA+
图20：NCIMB 42787、NCIMB 43385、NCIMB 43388和NCIMB 43389的有机酸产生和消耗。
图21：NCIMB 42787和其他保藏菌株对LPS刺激的U373细胞中IL-6分泌的下调(n＝3)。
图22：NCIMB 42787和其他保藏菌株对受刺激的HEK-TLR4细胞中NFκB-AP1启动子活化的抑制(n＝3)。
图23：NCIMB 42787、NCIMB 43385、NCIMB 43388、NCIMB 43389、NCIMB 43386和NCIMB 43387对烯醇酶2的抑制。
图24：NCIMB 42787对细胞因子水平和NFκB-AP1启动子的调节。
图25：NCIMB 42787的抗氧化能力的综述。
图26：NCIMB 42787产生丁酸、戊酸和己酸。
图27：由NCIMB 42787产生的代谢物的抗炎活性。
图28：代谢物在NCIMB 42787的抗炎活性中的作用分析。
图29：NCIMB 42787调节从BALB/c小鼠分离的受刺激的脾细胞的TNFα产生。
图30：巨球菌参考菌株NCIMB 43385触发了糖皮质激素受体表达的增加。
具体实施方式
细菌菌株
本发明的组合物包含巨球菌属的细菌菌株。实施例表明此属的细菌可用于治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状。优选的细菌菌株是马氏巨球菌菌种。
用于本发明中的巨球菌菌种的实例包括埃氏巨球菌(Megasphaera elsdenii)、酿酒巨球菌(Megasphaera cerevisiae)、马氏巨球菌、印度巨球菌(Megasphaera indica)、少食巨球菌(Megasphaera paucivorans)、瑞典巨球菌(Megasphaera sueciensis)和小核桃形巨球菌(Megasphaera micronuciformis)。用于本发明的巨球菌菌种的另一个实例是Megasphaera hexanoica。巨球菌是反刍和非反刍哺乳动物(包括人)的专性厌氧的乳酸发酵的胃肠道微生物。
马氏巨球菌的典型菌株为NP3(＝CSUR P245＝DSM 26228)[17]。马氏巨球菌菌株NP3的16S rRNA基因序列的GenBank保藏号是JX424772.1。
在实施例中测试的马氏巨球菌细菌在本文中称为菌株MRx0029。在SEQ ID NO:1中提供了所测试的MRx0029菌株的16S rRNA序列。
菌株MRx0029在2017年7月13日以“马氏巨球菌MRx0029”由4D Pharma Research有限公司(Life Sciences Innovation Building,Cornhill Road,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)保藏于国际保藏机构NCIMB有限公司(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)并指定保藏号为NCIMB 42787。
还预期与实施例中测试的菌株紧密相关的细菌菌株能有效治疗或预防炎性或自身免疫性疾病。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与马氏巨球菌细菌菌株的16S rRNA序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。优选地，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由SEQID NO:1表示的16S rRNA序列。
还预期作为菌株MRx0029的生物型的细菌菌株能有效治疗或预防炎性或自身免疫性病症。生物型是具有相同或非常相似的生理和生物化学特征的紧密相关的菌株。
可以通过对菌株MRx0029的其他核苷酸序列进行测序来鉴定作为菌株MRx0029的生物型并且适用于本发明的菌株。例如，基本上可以对全基因组进行测序，并且用于本发明的生物型菌株可以具有跨其全基因组的至少80％(例如，跨至少85％、90％、95％或99％，或跨其全基因组)的至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。用于鉴定生物型菌株的其他合适的序列可以包括hsp60或重复序列，诸如BOX、ERIC、(GTG)5或REP或[18]。生物型菌株可以具有与菌株MRx0029的对应序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。
可替代地，可以通过使用菌株MRx0029和限制性片段分析和/或PCR分析，例如通过使用荧光扩增片段长度多态性(FAFLP)和重复DNA元件(rep)-PCR指纹分析或蛋白质分析或部分16S或23S rDNA测序，来鉴定作为菌株MRx0029的生物型并适用于本发明的菌株。在优选的实施方案中，此类技术可以用于鉴定其他马氏巨球菌菌株。
在某些实施方案中，作为菌株MRx0029的生物型并适用于本发明的菌株是当通过扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)，例如当使用Sau3AI限制性酶分析时(关于示例性方法和指南，参见例如[19])，提供与菌株MRx0029相同模式的菌株。可替代地，将生物型菌株鉴定为具有与菌株MRx0029相同的碳水化合物发酵模式的菌株。
可用于本发明的组合物和方法中的其他巨球菌菌株，诸如菌株MRx0029的生物型，可以使用任何适当的方法或策略来鉴定，包括实施例中所述的测定。例如，可通过添加至细胞裂解液或全细胞并检测总的或I类HDAC活性来鉴定用于本发明的菌株。具体地，具有与菌株MRx0029相似的生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株可以用于本发明。可用的菌株将具有与菌株MRx0029相当的免疫调节活性。具体地，生物型菌株将引起与如实施例中所示相当的对于HDAC活性的作用，这可通过使用在实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。
在一些实施方案中，可通过常规分析细菌菌株的代谢物产生和消耗来鉴定可用于本发明的细菌菌株。发明人已经发现，实施例中使用的细菌菌株产生丁酸酯、戊酸和己酸并消耗乙酸酯和丙酸酯(参见图15-图17)。还发现马氏巨球菌菌株Ref 1、Ref 2和Ref 3消耗并产生这些代谢物(参见图15-图17)。因此，在一些实施方案中，本发明的细菌菌株产生代谢物丁酸酯、戊酸和己酸中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明的细菌菌株消耗乙酸酯和丙酸酯中的一种或两种。在优选的实施方案中，本发明的细菌菌株产生丁酸酯、戊酸和己酸并消耗乙酸酯和丙酸酯。
本发明特别优选的菌株是马氏巨球菌MRx0029菌株。这是在实施例中测试的示例性菌株，并显示出有效地治疗疾病。因此，本发明提供了马氏巨球菌菌株MRx0029或其衍生物的细胞诸如分离的细胞。本发明还提供了一种组合物，其包含马氏巨球菌菌株MRx0029或其衍生物的细胞。本发明还提供了一种马氏巨球菌菌株MRx0029的生物学纯培养物。本发明还提供了一种马氏巨球菌菌株MRx0029或其衍生物的细胞，其用于治疗，特别是用于本文所述疾病的治疗。
本发明的特别优选的菌株是以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株。这是在实施例中测试的示例性MRx0029菌株，并显示出有效地治疗疾病。因此，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞诸如分离的细胞。本发明还提供了一种组合物，其包含以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞。本发明还提供了一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株的生物学纯培养物。本发明还提供了一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗，特别是用于本文所述疾病的治疗。
本发明菌株的衍生物可以是子代菌株(后代)或从原体培养的菌株(亚克隆)。本发明的菌株的衍生物可以在不损失生物活性的情况下例如在基因水平下进行修饰。具体地，本发明的衍生物菌株是治疗上有活性的。衍生物菌株将具有与MRx0029菌株相当的治疗活性。具体地，衍生物菌株将引起与在实施例中所示相当的对于HDAC活性的作用，这可通过使用在实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。MRx0029菌株的衍生物通常是MRx0029菌株的生物型。
对马氏巨球菌MRx0029菌株的细胞的提及涵盖具有与菌株MRx0029相同的安全性和治疗功效特征的任何细胞，并且此类细胞涵盖在本发明中。
在优选的实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是可存活的并且能够部分地或完全地定殖于肠。
发明人已经发现，马氏巨球菌菌株减少了炎性细胞因子诸如IL-6的活化。IL-6诱导的慢性炎症最终会导致细胞死亡。因此，本发明的细菌菌株在治疗或预防炎性或自身免疫性病症中是特别有用的。在一些实施方案中，细菌菌株可用于治疗以IL-6活化增强为特征的炎性或自身免疫性病症。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种包含以保藏号NCIMB 42787保藏于NCIMB的菌株或其衍生物或生物型的组合物，优选地用于治疗或预防炎性或自身免疫性疾病。
在优选的实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是可存活的并且能够部分地或完全地定殖于肠。
在某些实施方案中，本发明的组合物不包含马氏巨球菌菌株42787的细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是巨球菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB 42787保藏的菌株。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是马氏巨球菌菌种的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB 42787保藏的菌株。
实施例进一步表明了可用于治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状的其他细菌菌株。这些细菌菌株在2019年5月6日以马氏巨球菌(保藏号为NCIMB 43388和NCIMB 43389)和巨球菌菌种(Megasphaera spp.)(保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386和NCIMB 43387)由4D Pharma Research有限公司(Life SciencesInnovation Building,Cornhill Road,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)保藏于国际保藏机构NCIMB有限公司(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)。因此，在替代性实施方案中，本发明的组合物包含这些细菌菌株或其生物型或衍生物中的一种或多种。为避免疑惑，上述提及的Ref 1是以保藏号NCIMB 43385保藏的菌株，上述提及的Ref2是以保藏号NCIMB 43388保藏的菌株，并且上述提及的Ref3是以保藏号NCIMB 43389保藏的菌株。
还预期与实施例中测试的菌株紧密相关的细菌菌株有效治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株是以保藏号NCIMB 43388保藏的马氏巨球菌菌株。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43388保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43388保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43388保藏的菌株的细胞，其用于本文所述疾病中的任一种。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种包含以保藏号NCIMB 43388保藏于NCIMB的菌株或其衍生物或生物型的组合物，优选地用于治疗或预防炎性或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，本发明的组合物不包含以保藏号NCIMB 43388保藏的巨球菌菌株的细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是巨球菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB 43388保藏的菌株。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是马氏巨球菌菌种的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB43388保藏的菌株。
因此，在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株是以保藏号NCIMB 43389保藏的马氏巨球菌菌株。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43389保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB43389保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43389保藏的菌株的细胞，其用于本文所述疾病中的任一种。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种包含以保藏号NCIMB 43389保藏于NCIMB的菌株或其衍生物或生物型的组合物，优选地用于治疗或预防炎性或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，本发明的组合物不包含以保藏号NCIMB 43389保藏的马氏巨球菌菌株的细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是巨球菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB 43389保藏的菌株。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是马氏巨球菌菌种的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB 43389保藏的菌株。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:15具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:15表示的16S rRNA序列。在某些实施方案中，本发明提供了一种具有与SEQ ID NO:15具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列的细菌菌株，其用于治疗。在某些实施方案中，本发明提供了一种具有由SEQ ID NO:15表示的16S rRNA序列的细菌菌株，其用于治疗。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:16具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:16表示的16S rRNA序列。在某些实施方案中，本发明提供了一种具有与SEQ ID NO:16具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列的细菌菌株，其用于治疗。在某些实施方案中，本发明提供了一种具有由SEQ ID NO:16表示的16S rRNA序列的细菌菌株，其用于治疗。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与巨球菌属的细菌菌株的16SrRNA序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株是巨球菌属。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株是以保藏号NCIMB 43385保藏的巨球菌菌株。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43385保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43385保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43385保藏的菌株的细胞，其用于本文所述疾病中的任一种。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种包含以保藏号NCIMB 43385保藏于NCIMB的菌株或其衍生物或生物型的组合物，优选地用于治疗或预防炎性或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，本发明的组合物不包含以保藏号NCIMB 43385保藏的巨球菌菌株的细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是巨球菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB 43385保藏的菌株。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是马氏巨球菌菌种的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB43385保藏的菌株。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株是以保藏号NCIMB 43386保藏的巨球菌菌株。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43386保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43386保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43386保藏的菌株的细胞，其用于本文所述疾病中的任一种。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种包含以保藏号NCIMB 43386保藏于NCIMB的菌株或其衍生物或生物型的组合物，优选地用于治疗或预防炎性或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，本发明的组合物不包含以保藏号NCIMB 43386保藏的巨球菌菌株的细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是巨球菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB 43386保藏的菌株。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是马氏巨球菌菌种的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB43386保藏的菌株。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株是以保藏号NCIMB 43387保藏的巨球菌菌株。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43387保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43387保藏的菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状。在某些实施方案中，本发明提供了一种以保藏号NCIMB 43387保藏的菌株的细胞，其用于本文所述疾病中的任一种。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种包含以保藏号NCIMB 43387保藏于NCIMB的菌株或其衍生物或生物型的组合物，优选地用于治疗或预防炎性或自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，本发明的组合物不包含以保藏号NCIMB 43387保藏的巨球菌菌株的细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是巨球菌属的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB 43387保藏的菌株。在一些实施方案中，本发明的组合物中的细菌菌株是马氏巨球菌菌种的细菌菌株，其中所述细菌菌株不是以保藏号NCIMB43387保藏的菌株。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:14具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:17具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ IDNO:18具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:14、17或18具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。在某些实施方案中，本发明提供了一种具有与SEQ ID NO:14、17或18具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列的细菌菌株，其用于治疗。
在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:14表示的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:17表示的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:18表示的16S rRNA序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:14、17或18表示的16S rRNA序列。在某些实施方案中，本发明提供了一种具有由SEQ ID NO:14、17或18表示的16S rRNA序列的细菌菌株，其用于治疗。
还预期作为所述菌株中一种或多种的生物型的细菌菌株有效治疗或预防由HDAC活性介导的癌症以及炎性和自身免疫性疾病和病状。生物型是具有相同或非常相似的生理和生物化学特征的紧密相关的菌株。
在某些实施方案中，本发明提供以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的细菌菌株或其生物型，其用于治疗。
可以通过对以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种的其他核苷酸序列进行测序来鉴定作为以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种的生物型并且适用于本发明的菌株。例如，基本上可以对全基因组进行测序，并且用于本发明的生物型菌株可以具有跨其全基因组的至少80％(例如，跨至少85％、90％、95％或99％，或跨其全基因组)的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。用于鉴定生物型菌株的其他合适序列可以包括hsp60或重复序列，诸如BOX、ERIC、(GTG)5或REP。生物型菌株可具有与以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种的对应序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。
可替代地，可以通过使用以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种和限制性片段分析和/或PCR分析，例如通过使用荧光扩增片段长度多态性(FAFLP)和重复DNA元件(rep)-PCR指纹分析或蛋白质分析或部分16S或23S rDNA测序来鉴定作为以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种的生物型并且适用于本发明的菌株。在优选的实施方案中，此类技术可以用于鉴定其他马氏巨球菌菌株。
在某些实施方案中，作为以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种的生物型并且适用于本发明的菌株是当通过扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)，例如当使用Sau3AI限制性酶分析时，提供与以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种相同模式的菌株。可替代地，生物型菌株被鉴定为与以保藏号NCIMB43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种具有相同的碳水化合物发酵模式的菌株。
可用于本发明的组合物和方法中的其他菌株，诸如以保藏号NCIMB 43385、NCIMB43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种的生物型，可以使用任何适当的方法或策略来鉴定，包括实施例中所述的测定。例如，可通过添加至细胞裂解液或全细胞并检测总的或I类HDAC活性来鉴定用于本发明的菌株。具体地，与以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种具有相似的生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株可用于本发明。可用的菌株将具有与以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种相当的免疫调节活性。具体地，生物型菌株将引起与如实施例中所示相当的对于HDAC活性的作用，这可通过使用在实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。
在某些实施方案中，本发明的优选的菌株是以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株。这些是在实施例中测试的示例性菌株，并显示出有效地治疗疾病。因此，本发明提供一种以保藏号NCIMB 43385、NCIMB43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种或其衍生物的细胞，诸如分离的细胞。本发明还提供了一种组合物，其包含以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种或其衍生物的细胞。本发明还提供了一种以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种的生物学纯培养物。本发明还提供了一种以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB43389保藏的菌株中一种或多种或其衍生物的细胞，其用于治疗，特别是用于本文所述疾病的治疗。
本发明菌株的衍生物可以是子代菌株(后代)或从原体培养的菌株(亚克隆)。本发明的菌株的衍生物可以在不损失生物活性的情况下例如在基因水平下进行修饰。具体地，本发明的衍生物菌株是治疗上有活性的。衍生物菌株将具有与以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种相当的治疗活性。具体地，衍生物菌株将引起与在实施例中所示相当的对于HDAC活性的作用，这可通过使用在实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。以保藏号NCIMB 43385、NCIMB43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB 43389保藏的菌株中一种或多种的衍生物通常将分别是以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43386、NCIMB 43387、NCIMB 43388和/或NCIMB43389保藏的菌株中一种或多种的生物型。
发明人已经发现，实施例中使用的细菌菌株产生2-甲基丙酸和3-甲基丙酸并消耗甲酸(参见图20)。还发现以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43388和NCIMB 43389保藏的菌株产生2-甲基丙酸和3-甲基丙酸。此外，还发现以保藏号NCIMB 43385和NCIMB 43388保藏的菌株消耗甲酸。因此，在一些实施方案中，本发明的细菌菌株产生代谢物2-甲基丙酸和3-甲基丙酸中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明的细菌菌株消耗甲酸。在一些实施方案中，本发明的细菌菌株产生2-甲基丙酸和3-甲基丙酸并消耗甲酸。在优选的实施方案中，本发明的细菌菌株产生丁酸酯、戊酸、己酸、2-甲基丙酸和3-甲基丙酸，并消耗乙酸酯、丙酸酯和甲酸。
在某些实施方案中，丁酸酯的产生抑制IL-6分泌。因此，在某些实施方案中，鉴于产生丁酸酯后IL-6的减少，本发明的组合物可减轻炎症。
在某些实施方案中，本发明的细菌菌株产生戊酸。在某些实施方案中，本发明的细菌菌株是产生戊酸的巨球菌菌株。戊酸抑制HDAC活性并且因此可用于治疗自身免疫性和炎性病症。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物通过增加戊酸的产生来抑制HDAC活性。在某些实施方案中，鉴于戊酸产生的增加和戊酸对HDAC活性的抑制，本发明的组合物在本文所公开的炎性、自身免疫性和/或病症中是治疗上有益的。
在某些实施方案中，本发明的组合物不包含埃氏巨球菌。在某些实施方案中，可用于本发明的组合物和方法中的细菌菌株不是埃氏巨球菌。
治疗性用途
如实施例所表明，本发明的细菌组合物有效地降低HDAC活性。具体地，使用本发明的组合物的治疗实现了I类HDAC活性的降低。具体地，使用本发明的组合物的治疗实现了HDAC1、HDAC2和HDAC3活性的降低。具体地，使用本发明的组合物的治疗实现了HDAC1和HDAC2活性的降低。因此，本发明的组合物可以用于治疗或预防由HDAC活性介导的疾病或病状。病状可以是疾病的症状。具体地，本发明的组合物可以用于减少或预防由HDAC活性水平的升高介导的疾病或病状。具体地，本发明的组合物可以用于减少或预防由I类HDAC活性水平的升高介导的疾病或病状。具体地，本发明的组合物可以用于减少或预防由HDAC1、HDAC2或HDAC3活性水平的升高介导的疾病或病状。
组蛋白脱乙酰酶是一类从蛋白靶点上去除乙酰基的酶。最丰富的HDAC靶点是组蛋白，但已知HDAC可以使非组蛋白靶点的赖氨酸残基脱乙酰化以暂时调节蛋白活性。因此，HDAC有时被称为赖氨酸脱乙酰酶。目前有13种已知的HDAC，它们被分成四个主要类别：I类(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8)、IIa类(HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9)和IIb类(HDAC6和HDAC10)、III类(sirt1-sirt7)和IV类(HDAC11)[7]。每个类别通常具有不同的组织表达模式和亚细胞定位。
蛋白乙酰化/脱乙酰化通常用于蛋白活性的翻译后控制机制。组蛋白乙酰化/脱乙酰化是公认的转录调控机制。遗传调控是由组蛋白脱乙酰酶介导的从组蛋白尾部中的赖氨酸氨基酸的ε-N-乙酰基上裂解乙酰基而引起的。乙酰基的去除恢复了组蛋白尾部的正电荷，从而导致与负电荷的磷酸二酯DNA主链更有利的结合。改善的结合导致更紧密的染色体紧实度和组蛋白脱乙酰位点处的基因表达的总体减少。
组蛋白脱乙酰酶活性与多种疾病和病状相关。抑制组蛋白脱乙酰酶的活性可用于缓解或改善这些疾病或病状。组蛋白脱乙酰酶的泛抑制剂可用于治疗或预防HDAC介导的疾病。同种型特异性HDAC抑制剂可用于治疗或预防由特异性HDAC同种型活性介导的疾病。
抑制HDAC活性是一种确定的治疗方式，并且许多HDAC抑制剂是已获批准的药物，包括：伏立诺他(Vorinostat)(CTCL)、罗米地辛(Romidepsin)(CTCL)、西达本胺(Chidamide)(PTCL)、帕比司他(Panobinostat)(多发性骨髓瘤)、贝利司他(Belinostat)(T细胞淋巴瘤)，并且许多药物处于临床试验中，包括：帕比司他(CTCL)、丙戊酸(宫颈癌和卵巢癌、脊髓性肌肉萎缩症)、莫西替司他(Mocetinostat)(滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和急性髓系白血病)、艾贝司他(Abexinostat)(肉瘤)、恩替司他(Entinostat)(霍奇金淋巴瘤、肺癌和乳腺癌)、SB939(复发性或转移性前列腺癌)、雷米司他(Resminostat)(霍奇金淋巴瘤)、吉诺司他(Givinostat)(难治性白血病和骨髓瘤)、HBI-800(包括黑素瘤、肾细胞癌(RCC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的晚期实体瘤)、Kevetrin(卵巢癌)、CUDC-101、AR-42(复发或耐治疗的多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病或淋巴瘤)、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202(晚期血液学适应症)、CG200745(实体瘤)、ACY-1215(多发性骨髓瘤)、ME-344(实体难治性肿瘤)、萝卜硫素(sulforaphane)和曲古抑菌素(Trichostatin)(抗炎性)。
由HDAC活性介导的疾病或病状的实例包括炎性或自身免疫性疾病，诸如哮喘、关节炎、银屑病、糖尿病、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病，或炎性肠病，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎；以及癌症，诸如前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或胃癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防这些疾病或病状之一。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防这些由HDAC活性介导的疾病或病状之一。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防这些由I类HDAC活性介导的疾病或病状之一。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防这些由HDAC1、HDAC2或HDAC3活性介导的疾病或病状之一。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防由HDAC活性介导的疾病或病状。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在治疗或预防由HDAC活性介导的疾病或病状中降低HDAC活性的方法。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防由I类HDAC活性介导的疾病或病状。在某些实施方案中，本发明的组合物用于抑制I类HDAC活性的方法。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在治疗或预防由I类HDAC活性介导的疾病中选择性抑制I类HDAC活性的方法。发明人已经确定，本发明的某些组合物选择性抑制I类HDAC。如本文所用“选择性”是指对I类HDAC具有最大抑制作用的组合物，例如与其对来自其他类别的HDAC的抑制作用相比。选择性抑制HDAC对于需要长期施用治疗剂的疾病的治疗是有利的，例如需要在患者的整个一生中治疗疾病或病状的情况。在某些实施方案中，作为I类HDAC选择性抑制剂的本发明的组合物用于由I类HDAC活性介导的疾病或病状的姑息治疗或预防。选择性抑制剂相对于本领域已知的泛抑制剂而言是有利的，因为它减少了与其他类别的HDAC的不需要的抑制相关联的副作用。在某些实施方案中，本发明的组合物是HDAC2选择性抑制剂。在某些实施方案中，本发明的组合物用于选择性降低HDAC1、HDAC2或HDAC3活性的方法。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防由HDAC1、HDAC2或HDAC3活性介导的疾病。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于
GPR109a
在某些实施方案中，本发明的组合物不用于治疗癌症。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗不是癌症的疾病或病症。
炎性和自身免疫性病症
实施例表明，本发明的组合物具有HDAC抑制活性。HDAC活性是许多炎性和自身免疫性病症的病理的关键，并且HDAC抑制剂已显示出在治疗许多炎性和自身免疫性病症中的功效，如以下关于特定情况所讨论(还参见[20])。因此，本发明的组合物可用于治疗炎性和自身免疫性病症，特别是由组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性介导的炎性和自身免疫性病症。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防炎性或自身免疫性病症的方法。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防炎性或自身免疫性疾病，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有炎性或自身免疫性疾病的患者，其中所述患者具有升高的HDAC水平或活性。在某些实施方案中，患者可能已经被诊断出患有慢性炎性或自身免疫性疾病或病状，或者本发明的组合物可用于预防炎性或自身免疫性疾病或病状发展为慢性炎性或自身免疫性疾病或病状。在某些实施方案中，所述疾病或病状可能对使用TNF-α抑制剂的治疗无反应。
HDAC可能与慢性炎性和自身免疫性疾病相关联，因此本发明的组合物可特别用于治疗或预防如上列出的慢性疾病或病状。在某些实施方案中，所述组合物用于患有慢性疾病的患者。在某些实施方案中，所述组合物用于预防慢性疾病的发展。
本发明的组合物可用于治疗由HDAC介导的疾病和病状并用于解决HDAC活化，因此本发明的组合物可特别用于治疗或预防慢性疾病、治疗或预防对其他疗法(诸如使用TNF-α抑制剂的治疗)无反应的患者的疾病，和/或治疗或预防与HDAC相关联的组织损伤和症状。
在某些优选的实施方案中，本发明的组合物调节促炎细胞因子的产生和炎症。在某些实施方案中，本发明的组合物调节炎性状态。在某些实施方案中，本发明的组合物降低IL-6的产生和分泌。在某些实施方案中，本发明的组合物降低NFκB启动子的活化。在某些实施方案中，本发明的组合物能够调节有效的促炎性内毒素脂多糖(LPS)对IL-6产生的活化。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗不影响或不累及神经系统的炎性或自身免疫性病症。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗影响胃肠道、肌肉骨骼系统、呼吸系统或皮肤的炎性或自身免疫性病症。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗不是神经退行性病症的疾病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗不是以下的疾病：帕金森氏病(Parkinson’s disease)，包括进行性核上性麻痹、进行性核上性麻痹、斯蒂尔-理查德森-奥尔谢夫斯基氏(Steele-Richardson-Olszewski)综合征、正常压力脑积水、血管性或动脉硬化性帕金森病和药物诱发的帕金森病；阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)，包括本森氏综合症(Benson’s syndrome)；亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)；肌萎缩性侧索硬化症；葛雷克氏症(Lou Gehrig’s disease)；运动神经元疾病；朊病毒病；脊髓小脑共济失调；脊髓性肌萎缩；痴呆，包括路易体、血管和额颞痴呆；原发性进行性失语；轻度认知损害；HIV相关的认知损害或皮质基底节变性。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗具有健康神经系统的受试者。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗不是多发性硬化症的疾病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗不是脑损伤的疾病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗不是神经退行性病症和不是多发性硬化症以及不是脑损伤的疾病。
实施例还表明，本发明的组合物有效地上调已知可抑制炎症的GPR109a[62]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在治疗炎性或自身免疫性疾病中上调GPR109a。
实施例还表明，本发明的组合物有效地抑制已知具有促炎活性的烯醇酶[69]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在治疗炎性或自身免疫性疾病中抑制烯醇酶。
-炎性肠病
实施例表明，本发明的组合物具有HDAC抑制活性，并因此它们可用于治疗炎性肠病。不同的HDAC同种型的过表达与包括结肠炎在内的多种疾病病理有关。另外，丙戊酸已与DSS结肠炎小鼠模型中的I类HDAC抑制和结肠炎改善相关联[21]。此研究表明了HDAC I类抑制剂在IFN-γ、IL-10、IL-1β和TNF-α抑制中的作用，从而赋予了HDAC抑制的功能和在结肠炎中的功效。因此，实施例表明，本发明的组合物可用于治疗炎性肠病。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防炎性肠病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防炎性肠病，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有炎性肠病的患者，其中所述患者具有升高的HDAC水平或活性。
炎性肠病(IBD)是一种复杂的疾病，可能由多种环境和遗传因素引起。导致IBD发作的因素包括饮食、微生物群、肠道通透性以及对肠道感染的炎性反应增加的遗传易感性。炎性肠病的症状包括腹痛、呕吐、腹泻、直肠出血、骨盆区中严重的内部抽筋/肌肉痉挛、体重减轻和贫血。在某些实施方案中，所述组合物用于减少与IBD相关联的一种或多种症状。在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防IBD的一种或多种症状。
IBD可伴随其他疾病或病状，诸如关节炎、坏疽性脓皮病、原发性硬化性胆管炎、非甲状腺疾病综合征、深静脉血栓形成、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防IBD伴随的一种或多种疾病或病状。
炎性肠病通常通过活检或结肠镜检查来诊断。粪便钙卫蛋白的测量可用于IBD的初步诊断。用于诊断IBD的其他实验室检查包括全血细胞计数、红细胞沉降率、综合代谢检查、粪便隐血检查或C反应蛋白检查。通常，使用实验室检查和活检/结肠镜检查的组合来确认IBD的诊断。在某些实施方案中，本发明用于治疗或预防被诊断出患有IBD的受试者。
在某些实施方案中，炎性肠病为溃疡性结肠炎。溃疡性结肠炎是以浸润性T细胞为特征的自身免疫性炎性肠病。先前已显示HDAC抑制剂改善DSS结肠炎小鼠模型中的结肠炎[21]。此外，发明人已证实，本发明的组合物减少患有结肠炎的动物回肠中的白细胞浸润。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，本发明的组合物可通过减少患有溃疡性结肠炎的受试者回肠中的白细胞浸润来用于治疗溃疡性结肠炎。
UC通常受限于直肠和结肠，但有时会累及回肠。所述疾病根据胃肠道的累及程度进行分类。溃疡性结肠炎的分类包括远端结肠炎，诸如直肠炎、直肠乙状结肠炎和左侧结肠炎，或广泛性结肠炎，诸如全结肠炎。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗远端结肠炎。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗直肠炎。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗直肠乙状结肠炎。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗左侧结肠炎。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗广泛性结肠炎。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗全结肠炎。在某些实施方案中，所述组合物用于在处于发生溃疡性结肠炎风险的受试者中预防溃疡性结肠炎。
溃疡性结肠炎通过实验室检查和手术(诸如内窥镜检查/结肠镜检查和活检)的结合来诊断。有助于溃疡性结肠炎诊断的示例性实验室检查包括全血细胞计数、全套代谢功能检测组合、肝功能检查、尿液分析、粪便培养、红细胞沉降率和C反应蛋白测量。
溃疡性结肠炎症状的严重性可使用简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)来确定[]。SCCAI还可以用作评定旨在治疗或预防溃疡性结肠炎的疗法的功效的手段。SCCAI提出了以下一系列问题，旨在确定溃疡性结肠炎症状的严重性：大便频数(日间)；大便频数(夜间)；排便的紧迫性；便血；总体幸福感；结肠外特征(例如，关节炎、葡萄膜炎或UC伴随的其他病状)。每个答案在滑尺上提供，产生的分数在0与19之间。高于5的分数通常表示存在溃疡性结肠炎。
在一些实施方案中，所述组合物用于已经被诊断出患有溃疡性结肠炎的受试者。在一些实施方案中，所述组合物用于缓解或改善溃疡性结肠炎的一种或多种症状。例如，所述组合物可改善对SCCAI的一个或多个答案的分数。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于降低大便频数。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于减少排便的紧迫性。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于减少便血。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于减少结肠外特征。这些症状的缓解或改善可以通过在施用本发明的组合物之前和之后对应的SCCAI分数的改善来确定。
溃疡性结肠炎的额外症状包括腹泻、直肠出血、体重减轻和贫血、腹痛、排便时腹部绞痛。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防溃疡性结肠炎的一种或多种额外症状。
在一些情况下，溃疡性结肠炎伴随一种或多种结肠外特征。结肠外特征是伴随溃疡性结肠炎并在结肠外显现的病状或疾病。溃疡性结肠炎的结肠外特征的实例包括：口疮、虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎、血清阴性关节炎、强直性脊柱炎、骶髂关节炎、结节性红斑、坏疽性脓皮病、深静脉血栓形成和肺栓塞、自身免疫性溶血性贫血、杵状指、原发性硬化性胆管炎。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防溃疡性结肠炎的一种或多种结肠外特征。
溃疡性结肠炎可使用多种治疗剂，诸如5-氨基水杨酸(诸如柳氮磺胺吡啶和美沙拉嗪)、皮质类固醇(诸如强的松(prednisone))、免疫抑制剂(诸如硫唑嘌呤)、生物制剂(诸如英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗、维多珠单抗(vedolizumab)和依托珠单抗)、尼古丁或铁来治疗。在某些实施方案中，本发明的组合物与额外的治疗剂组合用于治疗或预防溃疡性结肠炎，其中所述额外的治疗剂用于治疗或预防溃疡性结肠炎。
在某些实施方案中，所述炎性肠病为克罗恩病。研究表明，患有克罗恩病的患者的炎性粘膜(muscosa)中有若干种HDAC上调。因此，抑制HDAC活性可用于治疗克罗恩病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防克罗恩病。
克罗恩病是一种复杂的疾病，具有各种可能的原因，包括遗传危险因素、饮食、其他生活方式因素，诸如吸烟和饮酒，以及微生物组组成。克罗恩病可沿胃肠道的任何地方显现。
克罗恩病的胃肠道症状从轻度到重度，并包括腹痛、腹泻、粪便血、回肠炎、肠蠕动增加、肠胃胀气增加、肠道狭窄、呕吐和肛周不适。本发明的组合物可用于治疗或预防克罗恩病的一种或多种胃肠道症状。
克罗恩病的全身症状包括生长缺陷，诸如青春期不能保持生长、食欲下降、发热和体重减轻。克罗恩病的肠道外特征包括葡萄膜炎、畏光症(photobia)、巩膜外层炎、胆结石、血清阴性脊柱关节病、关节炎、附着点炎(enthesitis)、结节性红斑、坏疽性脓皮病、深静脉血栓形成、肺栓塞、自身免疫性溶血性贫血、杵状指和骨质疏松症。肠道外特征是在GI道外显现出的与克罗恩病相关联的额外病状。患有克罗恩病的受试者还表现出对神经系统并发症(诸如癫痫发作、中风、肌病、周围神经病、头痛和抑郁症)的易感性增加。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防克罗恩病的一种或多种全身症状。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防克罗恩病的一种或多种肠道外特征。
克罗恩病的诊断通常包括进行多种检查和外科手术，诸如胃镜检查和/或结肠镜检查和活检(通常是回肠)、放射学检查、全血细胞计数、C反应蛋白检查和红细胞沉降率。在某些实施方案中，本发明的组合物用于被诊断出患有克罗恩病的受试者。在一些实施方案中，本发明的组合物用于治疗已经被诊断出患有克罗恩病的受试者。
克罗恩病根据GI道受影响的区域范围进行分类[23]。回肠和结肠两者的疾病都被分类为回结肠克罗恩病(Ileocolic Crohn’s)。在一些实施方案中，所述组合物用于治疗或预防回结肠克罗恩病。在一些实施方案中，所述组合物用于被诊断出患有回结肠克罗恩病的受试者。如果仅回肠受到影响，则分类为克罗恩回肠炎。如果仅结肠受到影响，则分类为克罗恩结肠炎。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗或预防克罗恩回肠炎。在一些实施方案中，所述组合物用于被诊断出患有克罗恩回肠炎的受试者。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗或预防克罗恩结肠炎。在一些实施方案中，所述组合物用于被诊断出患有克罗恩结肠炎的受试者。
克罗恩病可使用多种治疗剂，诸如皮质类固醇(诸如强的松)、免疫抑制剂(诸如硫唑嘌呤)或生物制剂(诸如英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗、维多珠单抗和依托珠单抗)来治疗。在某些实施方案中，本发明的组合物与额外的治疗剂组合用于治疗或预防克罗恩病。在某些实施方案中，所述额外的治疗剂用于治疗或预防克罗恩病。
实施例还表明，本发明的组合物有效地上调已知可抑制结肠炎症的GPR109a[62]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在治疗炎性肠病中上调GPR109a。
-关节炎
关节炎是以慢性关节炎症为特征的疾病。类风湿性关节炎是通常导致关节肿胀和疼痛的慢性自身免疫性病症。已经提出了抑制HDAC通过多种机制，包括影响细胞因子的产生、抑制T细胞分化、抑制滑膜成纤维细胞的增殖以及通过影响破骨细胞和成骨细胞来减少骨质流失来治疗类风湿性关节炎(Vojinov等,2011,Mol Med,17(5-6)397-403)。已显示HDAC抑制在若干种关节炎动物模型中具有强大的抗炎作用(Joosten等,2011,Mol Med,17(5-6),391-396)。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防受试者中的关节炎。
在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防类风湿性关节炎(RA)。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防类风湿性关节炎，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有类风湿性关节炎的患者，其中所述患者具有升高的HDAC水平或活性。
在某些实施方案中，用本发明的组合物进行的治疗引起关节肿胀的减少。在某些实施方案中，本发明的组合物用于患有关节肿胀的患者或被鉴定为处于关节肿胀风险中的患者。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减少RA中的关节肿胀的方法。
在某些实施方案中，用本发明的组合物进行的治疗引起软骨损伤或骨损伤的减少。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减少或预防软骨或骨损伤以治疗RA。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗处于软骨或骨损伤风险中的患有严重RA的患者。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防骨侵蚀或软骨损伤以治疗RA。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗表现出骨侵蚀或软骨损伤的患者或被鉴定为处于骨侵蚀或软骨损伤风险中的患者。
本发明的组合物可用于调节患者的免疫系统，因此在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防已被鉴定为处于RA风险中或已被诊断出患有早期RA的患者中的RA。本发明的组合物可以用于预防RA的发展。
本发明的组合物可以用于控制或缓解RA。本发明的组合物对于减少与关节肿胀或骨破坏相关联的症状可以是特别有用的。RA的治疗或预防可以是指例如症状严重性的缓解或对于患者是问题的触发物的加剧频率或范围的降低。
-哮喘
哮喘是慢性炎性呼吸系统疾病。已显示HDAC抑制剂在慢性哮喘小鼠模型中具有抗炎作用，可缓解气道炎症、气道重塑和气道超敏反应(Ren等,2016,Inflamm Res,65,995-1008)。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防受试者中的哮喘。
在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防哮喘。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防哮喘，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有哮喘的患者，其中所述患者具有升高的HDAC水平或活性。
在某些实施方案中，所述哮喘是嗜酸性或过敏性哮喘。嗜酸性和过敏性哮喘以外周血和气道分泌物中的嗜酸性粒细胞数量增加为特征，并在病理上与基底膜区增厚相关联，并且在药理上与皮质类固醇反应性相关联[24]。减少或抑制嗜酸性粒细胞募集或活化的组合物可用于治疗或预防嗜酸性和过敏性哮喘。嗜酸性和过敏性哮喘还以由T辅助2型淋巴细胞(Th2)过程介导的一系列炎症事件为特征。因此，减少或抑制T辅助2型淋巴细胞(Th2)过程的组合物可用于治疗或预防嗜酸性和过敏性哮喘。
在额外的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防嗜中性哮喘(或非嗜酸性哮喘)。中性粒细胞数量高与可能对皮质类固醇治疗不敏感的严重哮喘相关联。减少或抑制嗜中性粒细胞募集或活化的组合物可用于治疗或预防嗜中性哮喘。
嗜酸性哮喘(也称为Th2高哮喘)和嗜中性哮喘(也称为Th2低哮喘或非Th2哮喘)具有不同的基础病理生理机制，并表现出不同的临床特征。例如，Th2高哮喘通常表现为发病早，并表现出季节性的症状变化，而Th2低哮喘的发病要晚得多，通常在40岁或更晚。Th2高哮喘还以免疫球蛋白E(IgE)血液水平升高为特征，而Th2低哮喘则没有此特征。Th2高哮喘还以痰中的嗜酸性粒细胞水平高为特征。相比之下，Th2低哮喘可以痰中性粒细胞水平升高为特征。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防Th2低哮喘或非Th2哮喘。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗Th2高哮喘。
嗜酸性哮喘和嗜中性哮喘不是相互排斥的病症，并且有助于解决嗜酸性粒细胞反应和嗜中性粒细胞反应的治疗通常可用于治疗哮喘。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于减少嗜酸性炎性反应的方法以治疗或预防哮喘，或用于减少嗜中性炎性反应的方法以治疗或预防哮喘。如上所述，哮喘中的嗜酸性粒细胞的高水平在病理上与基底膜区增厚相关联，因此在治疗或预防哮喘中减少嗜酸性炎性反应可能够特异性地解决所述疾病的这种特征。另外，嗜中性粒细胞升高、或与嗜酸性粒细胞升高组合、或缺乏嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，均与严重的哮喘和慢性气道狭窄相关联。因此，减少嗜中性炎性反应可特别用于解决严重哮喘。
在某些实施方案中，所述组合物减少过敏性哮喘中的细支气管周围浸润，或用于减少细支气管周围浸润以治疗过敏性哮喘。在某些实施方案中，所述组合物减少嗜中性哮喘中的细支气管周围和/或血管周围浸润，或用于减少细支气管周围和/或血管周围浸润以治疗过敏性嗜中性哮喘。
在某些实施方案中，使用本发明的组合物治疗提供了减少或预防TNF-α水平的升高。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗导致嗜酸性和/或嗜中性炎性反应减少的哮喘的方法。在某些实施方案中，待治疗的患者具有或先前已被鉴定出具有嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞水平升高，例如通过血液采样或痰分析所鉴定。
当向新生儿或孕妇施用时，本发明的组合物可用于预防新生儿哮喘的发展。所述组合物可以用于预防儿童哮喘的发展。本发明的组合物可用于治疗或预防成人发作性哮喘。本发明的组合物可以用于控制或缓解哮喘。本发明的组合物可特别用于减少与由过敏原(诸如屋尘螨)加重的哮喘相关联的症状。
哮喘的治疗或预防可以是指例如症状严重性的缓解或对于患者是问题的触发物的加剧频率或范围的降低。
-银屑病
银屑病是慢性炎性皮肤病。已报道银屑病患者的皮肤活检中的HDAC1过表达(Tovar-Castillo等,2007,Int J Dermatol,46,239-46)以及已显示HDAC抑制剂阻止Foxp3+Treg转化为Foxp3-RORγt+IL-17/Treg(与银屑病疾病进展相关的转变)(Bovenschen等,2011,J Invest Dermatol,131,1853-60)。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防受试者中的银屑病。
在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防银屑病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防银屑病，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有银屑病的患者，其中所述患者具有升高的HDAC水平或活性。
-全身性红斑狼疮
全身性红斑狼疮(SLE)是自身免疫性疾病。基于对SLE的细胞培养和小鼠模型的研究，HDAC抑制被认为是治疗SLE的一种有前途的治疗方法(Reilly等,2011,Mol Med,17(5-6),417-425)。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防受试者中的全身性红斑狼疮。
在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防SLE。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防SLE，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有SLE的患者，其中所述患者具有升高的HDAC水平或活性。
-同种异体移植物排斥
当移植组织被接受者的免疫系统排斥时，就会发生同种异体移植物排斥。对小鼠心脏移植的研究表明，HDAC抑制会增加移植物内的组蛋白3的乙酰化，并与Foxp3蛋白(参与控制免疫反应的叉头转录家族成员)的移植物内水平增加、组织结构的维持和相对于对照缺乏慢性排斥的皮肤红斑相关联(Wang等,Immunol Cell Biol,1-8)。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防受试者中的同种异体移植物排斥。
在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防同种异体移植物排斥。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防同种异体移植物排斥，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有同种异体移植物排斥的患者，其中所述患者具有升高的HDAC水平或活性。
-糖尿病
糖尿病是其中低水平的胰岛素和/或外周胰岛素抵抗导致高血糖症的一组疾病。已提出抑制HDAC通过多种机制，包括脱抑制Pdx1(Park等,2008,J Clin Invest,118,2316-24)、增强转录因子Ngn3的表达以增加内分泌祖细胞的汇集(Haumaitre等,2008,Mol CellBiol,28,6373-83)和增强胰岛素的表达(Molsey等,2003,J Biol Chem,278,19660-6)等来治疗糖尿病。HDAC抑制也是用于糖尿病晚期并发症(诸如糖尿病肾病和视网膜缺血)的一种有前途的治疗(Christensen等,2011,Mol Med,17(5-6),370-390)。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防受试者中的糖尿病。
在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防糖尿病。在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防I型糖尿病。在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防II型糖尿病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防糖尿病，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有糖尿病的患者，其中所述患者具有升高的HDAC水平或活性。
-移植物抗宿主病(GVHD)
本发明的组合物可用于治疗或预防移植物抗宿主病(GVHD)。GVHD是同种异体组织移植到受试者体内后的一种医学并发症。GVHD通常发生在干细胞或骨髓移植或实体器官移植后，特别是在移植物(即供体)和宿主(即接受者)的遗传背景不同的情况下。
GVHD的病理生理学包括三个不同的阶段。首先，在将移植的组织识别为外来物质后，激活宿主抗原呈递细胞(APC)，诸如树突状细胞(DC)。APC活化先于效应免疫细胞(诸如常规的细胞毒性T细胞)的募集和活化，这会导致外来组织的破坏或排斥。
已显示HDAC抑制介导有效的多效抗炎作用，以用于治疗或预防GVHD。HDAC抑制可抑制GVHD病理生理级联的多个点。例如，HDAC抑制通过以STAT-3依赖性方式增强吲哚胺2,3-双加氧酶的表达来预防抗原呈递细胞和树突状细胞在体内针对同种异体组织的活化[25]。还显示STAT-1活性的HDAC抑制对治疗或预防GVHD有益[26]。在某些实施方案中，本发明的组合物可通过抑制APC活化来用于治疗或预防GVHD。
还显示HDAC抑制在体内扩大Treg细胞群体和活性[27]。已经显示HDAC抑制介导的Treg细胞活性的上调抑制了常规的细胞毒性T细胞活性，这可通过抑制GVHD病理生理级联的第二阶段来用于治疗或预防GVHD。在某些实施方案中，本发明的组合物通过降低常规的细胞毒性T细胞活性来用于治疗或预防GVHD。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于降低常规的细胞毒性T细胞活性。在某些实施方案中，本发明的组合物可通过上调Treg细胞活性来用于治疗或预防GVHD。
已显示供体NK细胞通过消除宿主APC来减少GVHD。已显示HDAC抑制提高NK细胞活性。因此，本发明的组合物可用于提高NK细胞活性，这可通过增加APC的消除来用于治疗或预防GVHD。在某些实施方案中，本发明的组合物可通过增强宿主APC的消除来用于治疗或预防GVHD。在某些实施方案中，本发明的组合物可通过增强NK细胞活性来用于治疗或预防GVHD。在某些实施方案中，本发明的组合物可通过增强NK细胞活性介导的宿主APC的消除来用于治疗或预防GVHD。
在某些实施方案中，本发明的组合物可在宿主接受移植后施用。在某些实施方案中，本发明的组合物可在受试者接受移植之前向宿主施用。在已经接受移植之前施用本发明的组合物可用于启动受试者的免疫系统以不引发针对移植组织的炎性或自身免疫性反应。在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防或防止GVHD的发作。在某些实施方案中，本发明的组合物可预防性地用于治疗或预防GVHD。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于预防GVHD。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于预防受试者中的移植组织排斥的方法。
在某些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗、延迟、预防或防止急性GVHD的发作。急性GVHD的症状通常在移植的前100天内显现出来。延迟、治疗或预防急性GVHD可特别有益于帮助受试者在移植手术后立即恢复。在某些实施方案中，所述组合物可通过抑制HDAC活性来治疗、延迟发作、预防或防止急性GVHD的发作。在某些实施方案中，所述组合物可通过上调Treg细胞活性来治疗、延迟发作、预防或防止急性GVHD的发作。所述组合物可通过抑制常规的细胞毒性T细胞活性来治疗、延迟发作、预防或防止急性GVHD的发作。本发明的组合物可通过增强NK细胞活性来治疗、延迟发作、预防或防止急性GVHD的发作。本发明的组合物可通过抑制APC活化来治疗、延迟发作、预防或防止急性GVHD的发作。
在某些实施方案中，当在移植后100天内向受试者施用时，本发明的组合物可治疗、延迟发作、预防或防止急性GVHD的发作。在某些实施方案中，当预防性地向受试者施用时，例如当在移植前将所述组合物向受试者施用时，本发明的组合物可治疗、延迟发作、预防或防止急性GVHD的发作。在某些实施方案中，本发明的组合物可治疗、延迟发作、预防或防止持续的、迟发性或复发性的急性GVHD的发作。诸如在移植后100天以上发生或复发的急性GVHD。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以治疗、延迟发作、预防或防止急性GVHD的一种或多种症状发作，所述急性GVHD症状选自由：大丘皮疹(macropaular skin rash)、恶心、厌食、腹泻、严重腹痛、肠梗阻和胆汁淤积性高胆红素血症组成的列表。
在某些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗、延迟发作、预防或防止慢性GVHD的发作。慢性GVHD是一种复杂的多系统病症，可累及任何器官，并且通常以纤维化为特征。慢性GVHD可能从急性GVHD演变而来，或者可能在急性GVHD之后的静止期后出现，或者可能重新出现。慢性GVHD的症状可在移植后的任何时间出现。在某些实施方案中，所述组合物可通过抑制HDAC活性来用于治疗、预防、防止发作或延迟慢性GVHD的发作。所述组合物可通过上调Treg细胞活性来治疗、延迟发作、预防或防止慢性GVHD的发作。所述组合物可通过抑制常规的细胞毒性T细胞活性来治疗、延迟发作、预防或防止慢性GVHD的发作。本发明的组合物可通过增强NK细胞活性来治疗、延迟发作、预防或防止慢性GVHD的发作。本发明的组合物可通过抑制APC DC活化来治疗、延迟发作、预防或防止慢性GVHD的发作。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于向最近经历干细胞、骨髓或实体器官移植的患者施用。在某些实施方案中，本发明的组合物用于向需要干细胞、骨髓或实体器官移植的患者施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以治疗、延迟发作、预防或防止慢性GVHD的一种或多种症状发作，所述慢性GVHD症状选自由：色素沉着、新发性脱发、皮肤异色病、扁平苔藓样爆发(lichen planuslike eruption)或硬化特征、甲营养不良或缺失、口干燥症、口腔溃疡(诸如口疮性口炎)、口腔中的苔藓型特征(诸如硬化性苔藓)、干燥性角膜结膜炎、干燥综合征、瘢痕性结膜炎、筋膜炎、肌炎、关节僵硬、阴道硬化、溃疡、厌食、体重减轻、食管蹼、黄疸、转氨性炎(transaminitis)、胸腔积液、闭塞性细支气管炎、肾病综合征、心包炎、血小板减少、贫血和中性粒细胞减少组成的列表。
在某些实施方案中，本发明的组合物可用于与一种或多种药理剂组合以治疗或预防GVHD。在某些实施方案中，所述一种或多种药理剂用于GVHD的药理预防或治疗。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在正在接受、已经接受或将要接受一种或多种所述药理剂的受试者中治疗或预防GVHD。在某些实施方案中，所述一种或多种药理剂选自由：suberoyanilide、伏立诺他、ITF2357环孢霉素、环孢素、西罗莫司、喷司他丁、利妥昔单抗、伊马替尼、霉酚酸酯、他克莫司、强的松、甲氨蝶呤、remestemcel-L和Prochymal组成的列表，其中所述药理剂以治疗有效量施用以治疗或预防GVHD。在一些实施方案中，本发明的组合物用于在已经接受、正在接受或将要接受体外光泳的受试者中治疗GVHD。
癌症
HDAC功能和表达会在多种癌症中受到扰乱，并经常导致不良预后。HDAC在癌症中的功能与促进细胞增殖和致瘤表型的基因的异常表达或功能相关联。在某些癌症中，HDAC主要调节癌症的发作，并被描述为癌基因。在其他癌症中，肿瘤融合蛋白募集了I类HDAC，以抑制调节细胞分化或细胞周期控制的基因的表达从而导致细胞转化。已显示HDAC表达的敲低或抑制具有多种抗癌作用，诸如细胞周期停滞和抑制增殖、细胞凋亡、分化和衰老以及破坏血管生成。因此，本发明的组合物可通过抑制HDAC活性来用于治疗由HDAC活性介导的癌症。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防癌症。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防由HDAC活性介导的癌症。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防结直肠癌。
在某些实施方案中，使用本发明的组合物进行的治疗导致肿瘤大小减小或肿瘤生长减少。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减小肿瘤大小或减少肿瘤生长。本发明的组合物可有效减小肿瘤大小或减少生长。在某些实施方案中，本发明的组合物用于患有实体瘤的患者。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减少或预防血管生成以治疗癌症。由HDAC调控的基因在血管生成中具有重要作用。在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防转移。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防胃癌。已显示HDAC2在胃癌的发展和结直肠肿瘤发生中起功能性作用[28,29]。在结直肠癌小鼠模型中，抑制HDAC2导致肿瘤发展的速率降低。在某些实施方案中，选择性抑制HDAC2的本发明组合物用于治疗或预防结直肠癌，特别是由HDAC2活性介导的结直肠癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防乳腺癌。本发明的组合物可有效治疗乳腺癌，并且已经显示HDAC在乳腺癌中被上调[30]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减小肿瘤大小、减少肿瘤生长或减少血管生成以治疗乳腺癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防前列腺癌。本发明的组合物可有效治疗前列腺癌，因为HDAC活性在前列腺癌的发展中起主要作用[31]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减小肿瘤大小、减少肿瘤生长或减少血管生成以治疗前列腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是激素难治性前列腺癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防肺癌。本发明的组合物可有效治疗肺癌，并且已经显示HDAC在肺癌中被上调[32]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减小肿瘤大小、减少肿瘤生长或减少血管生成以治疗肺癌。在优选的实施方案中，所述癌症是肺癌。在优选的实施方案中，所述组合物用于治疗具有高水平HDAC2表达的肺癌。已显示某些肺癌组织大量表达HDAC2。HDAC2的失活抑制了肺癌细胞的生长。已显示高水平的HDAC2活性抑制p53活性[33]。活跃的p53会阻止细胞分裂，并最终导致细胞凋亡的发生。在某些实施方案中，抑制HDAC2的本发明的组合物用于治疗具有高水平HDAC2活性的肺癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防肝癌。本发明的组合物可有效治疗肝癌，并且已经显示HDAC在肝癌中被上调[34]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减小肿瘤大小、减少肿瘤生长或减少血管生成以治疗肝癌。在优选的实施方案中，所述癌症是肝癌(肝细胞癌)。在某些实施方案中，癌症是低度肿瘤或早期肿瘤。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防癌。本发明的组合物可以特别有效地治疗癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防非免疫原性癌症。本发明的组合物可有效治疗非免疫原性癌症。
在另外的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、类癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓增生症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤、胶质瘤、儿童视觉通路和下丘脑、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾细胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌。甲状旁腺癌、咽癌、垂体腺瘤、浆细胞瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。
本发明的组合物与进一步的治疗剂组合使用时可能特别有效。本发明的组合物的HDAC抑制作用当与更直接的抗癌剂组合时可能是有效的。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种包含巨球菌属细菌菌株和抗癌剂的组合物。在优选的实施方案中，所述抗癌剂是免疫检查点抑制剂、靶向抗体免疫疗法、CAR-T细胞疗法、溶瘤病毒或抑制细胞生长药物。在优选的实施方案中，所述组合物包含选自由以下组成的组的抗癌剂：Yervoy(易普利姆玛(ipilimumab),BMS)；Keytruda(派姆单抗(pembrolizumab),Merck)；Opdivo(纳武单抗(nivolumab),BMS)；MEDI4736(AZ/MedImmune)；MPDL3280A(Roche/Genentech)；曲美单抗(Tremelimumab)(AZ/MedImmune)；CT-011(pidilizumab,CureTech)；BMS-986015(lirilumab,BMS)；MEDI0680(AZ/MedImmune)；MSB-0010718C(Merck)；PF-05082566(Pfizer)；MEDI6469(AZ/MedImmune)；BMS-986016(BMS)；BMS-663513(urelumab,BMS)；IMP321(Prima Biomed)；LAG525(Novartis)；ARGX-110(arGEN-X)；PF-05082466(Pfizer)；CDX-1127(varlilumab；CellDex Therapeutics)；TRX-518(GITR Inc.)；MK-4166(Merck)；JTX-2011(Jounce Therapeutics)；ARGX-115(arGEN-X)；NLG-9189(吲哚莫德(indoximod),NewLink Genetics)；INCB024360(Incyte)；IPH2201(Innate Immotherapeutics/AZ)；NLG-919(NewLink Genetics)；抗VISTA(JnJ)；依帕卡司他(Epacadostat)(INCB24360,Incyte)；F001287(Flexus/BMS)；CP 870893(University of Pennsylvania)；MGA271(Macrogenix)；艾马妥珠单抗(Emactuzumab)(Roche/Genentech)；加尼西替尼(Galunisertib)(EliLilly)；Ulocuplumab(BMS)；BKT140/BL8040(Biokine Therapeutics)；巴维妥昔单抗(Bavituximab)(Peregrine Pharmaceuticals)；CC 90002(Celgene)；852A(Pfizer)；VTX-2337(VentiRx Pharmaceuticals)；IMO-2055(Hybridon,Idera Pharmaceuticals)；LY2157299(Eli Lilly)；EW-7197(Ewha Women’s University,Korea)；维罗非尼(Vemurafenib)(Plexxikon)；达拉菲尼(Dabrafenib)(Genentech/GSK)；BMS-777607(BMS)；BLZ945(Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre)；Unituxin(地那昔单抗(dinutuximab),United Therapeutics Corporation)；Blincyto(博纳吐单抗(blinatumomab),Amgen)；Cyramza(雷莫昔单抗(ramucirumab),Eli Lilly)；Gazyva(奥比妥珠单抗(obinutuzumab),Roche/Biogen)；Kadcyla(阿杜曲妥珠单抗-DM1(ado-trastuzumab emtansine),Roche/Genentech)；Perjeta(帕妥珠单抗,Roche/Genentech)；Adcetris(贝伦妥单抗-维多汀(brentuximab vedotin),Takeda/Millennium)；Arzerra(奥法木单抗(ofatumumab),GSK)；Vectibix(帕尼单抗(panitumumab),Amgen)；Avastin(贝伐单抗(bevacizumab),Roche/Genentech)；Erbitux(西妥昔单抗(cetuximab),BMS/Merck)；Bexxar(托西莫单抗(tositumomab)-I131,GSK)；Zevalin(替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan),Biogen)；Campath(阿仑单抗(alemtuzumab),Bayer)；Mylotarg(吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin),Pfizer)；Herceptin(曲妥珠单抗,Roche/Genentech)；Rituxan(利妥昔单抗,Genentech/Biogen)；沃洛昔单抗(volociximab)(Abbvie)；依那妥单抗(Enavatuzumab)(Abbvie)；ABT-414(Abbvie)；埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)(Abbvie/BMS)；ALX-0141(Ablynx)；奥扎利珠单抗(Ozaralizumab)(Ablynx)；Actimab-C(Actinium)；Actimab-P(Actinium)；米拉妥珠单抗(Milatuzumab)-dox(Actinium)；Emab-SN-38(Actinium)；Naptumonmab estafenatox(Active Biotech)；AFM13(Affimed)；AFM11(Affimed)；AGS-16C3F(Agensys)；AGS-16M8F(Agensys)；AGS-22ME(Agensys)；AGS-15ME(Agensys)；GS-67E(Agensys)；ALXN6000(萨马珠单抗(samalizumab),Alexion)；ALT-836(Altor Bioscience)；ALT-801(Altor Bioscience)；ALT-803(Altor Bioscience)；AMG780(Amgen)；AMG 228(Amgen)；AMG820(Amgen)；AMG172(Amgen)；AMG595(Amgen)；AMG110(Amgen)；AMG232(adecatumumab,Amgen)；AMG211(Amgen/MedImmune)；BAY20-10112(Amgen/Bayer)；利洛单抗(Rilotumumab)(Amgen)；地诺单抗(Denosumab)(Amgen)；AMP-514(Amgen)；MEDI575(AZ/MedImmune)；MEDI3617(AZ/MedImmune)；MEDI6383(AZ/MedImmune)；MEDI551(AZ/MedImmune)；莫妥昔单抗假性毒素(Moxetumomab pasudotox)(AZ/MedImmune)；MEDI565(AZ/MedImmune)；MEDI0639(AZ/MedImmune)；MEDI0680(AZ/MedImmune)；MEDI562(AZ/MedImmune)；AV-380(AVEO)；AV203(AVEO)；AV299(AVEO)；BAY79-4620(Bayer)；阿尼妥单抗雷夫坦辛(Anetumab ravtansine)(Bayer)；万替曲单抗(vantictumab)(Bayer)；BAY94-9343(Bayer)；西罗妥珠单抗(Sibrotuzumab)(BoehringerIngleheim)；BI-836845(Boehringer Ingleheim)；B-701(BioClin)；BIIB015(Biogen)；奥比妥珠单抗(Biogen/Genentech)；BI-505(Bioinvent)；BI-1206(Bioinvent)；TB-403(Bioinvent)；BT-062(Biotest)BIL-010t(Biosceptre)；MDX-1203(BMS)；MDX-1204(BMS)；尼珠单抗(Necitumumab)(BMS)；CAN-4(Cantargia AB)；CDX-011(Celldex)；CDX1401(Celldex)；CDX301(Celldex)；U3-1565(Daiichi Sankyo)；帕曲妥单抗(patritumab)(Daiichi Sankyo)；替加妥珠单抗(tigatuzumab)(Daiichi Sankyo)；尼妥珠单抗(nimotuzumab)(Daiichi Sankyo)；DS-8895(Daiichi Sankyo)；DS-8873(DaiichiSankyo)；DS-5573(Daiichi Sankyo)；MORab-004(Eisai)；MORab-009(Eisai)；MORab-003(Eisai)；MORab-066(Eisai)；LY3012207(Eli Lilly)；LY2875358(Eli Lilly)；LY2812176(Eli Lilly)；LY3012217(Eli Lilly)；LY2495655(Eli Lilly)；LY3012212(Eli Lilly)；LY3012211(Eli Lilly)；LY3009806(Eli Lilly)；西昔单抗(cixutumumab)(Eli Lilly)；弗兰妥他单抗(Flanvotumab)(Eli Lilly)；IMC-TR1(Eli Lilly)；雷莫西单抗(Ramucirumab)(Eli Lilly)；塔巴单抗(Tabalumab)(Eli Lilly)；扎诺莫单抗(Zanolimumab)(EmergentBiosolution)；FG-3019(FibroGen)；FPA008(Five Prime Therapeutics)；FP-1039(FivePrime Therapeutics)；FPA144(Five Prime Therapeutics)；卡妥昔单抗(catumaxomab)(Fresenius Biotech)；IMAB362(Ganymed)；IMAB027(Ganymed)；HuMax-CD74(Genmab)；HuMax-TFADC(Genmab)；GS-5745(Gilead)；GS-6624(Gilead)；OMP-21M18(demcizumab,GSK)；马他妥单抗(mapatumumab)(GSK)；IMGN289(ImmunoGen)；IMGN901(ImmunoGen)；IMGN853(ImmunoGen)；IMGN529(ImmunoGen)；IMMU-130(Immunomedics)；米拉妥珠单抗(milatuzumab)-dox(Immunomedics)；IMMU-115(Immunomedics)；IMMU-132(Immunomedics)；IMMU-106(Immunomedics)；IMMU-102(Immunomedics)；依帕妥珠单抗(Epratuzumab)(Immunomedics)；克立妥单抗(Clivatuzumab)(Immunomedics)；IPH41(Innate Immunotherapeutics)；达拉妥单抗(Daratumumab)(Janssen/Genmab)；CNTO-95(Intetumumab,Janssen)；CNTO-328(siltuximab,Janssen)；KB004(KaloBios)；莫格莫利珠单抗(mogamulizumab)(Kyowa Hakko Kirrin)；KW-2871(依罗昔单抗(ecromeximab),LifeScience)；索奈普珠单抗(Sonepcizumab)(Lpath)；马格妥昔单抗(Margetuximab)(Macrogenics)；伊诺布利妥单抗(Enoblituzumab)(Macrogenics)；MGD006(Macrogenics)；MGF007(Macrogenics)；MK-0646(dalotuzumab,Merck)；MK-3475(Merck)；Sym004(Symphogen/Merck Serono)；DI17E6(Merck Serono)；MOR208(Morphosys)；MOR202(Morphosys)；Xmab5574(Morphosys)；BPC-1C(ensituximab,Precision Biologics)；TAS266(Novartis)；LFA102(Novartis)；BHQ880(Novartis/Morphosys)；QGE031(Novartis)；HCD122(lucatumumab,Novartis)；LJM716(Novartis)；AT355(Novartis)；OMP-21M18(Demcizumab,OncoMed)；OMP52M51(Oncomed/GSK)；OMP-59R5(Oncomed/GSK)；万替曲单抗(Oncomed/Bayer)；CMC-544(伊诺珠单抗(inotuzumab)奥佐米星,Pfizer)；PF-03446962(Pfizer)；PF-04856884(Pfizer)；PSMA-ADC(Progenics)；REGN1400(Regeneron)；REGN910(nesvacumab,Regeneron/Sanofi)；REGN421(enoticumab,Regeneron/Sanofi)；RG7221、RG7356、RG7155、RG7444、RG7116、RG7458、RG7598、RG7599、RG7600、RG7636、RG7450、RG7593、RG7596、DCDS3410A、RG7414(帕妥珠单抗)、RG7160(伊格单抗(imgatuzumab))、RG7159(奥比妥珠单抗)、RG7686、RG3638(恩妥珠单抗(onartuzumab))、RG7597(Roche/Genentech)；SAR307746(Sanofi)；SAR566658(Sanofi)；SAR650984(Sanofi)；SAR153192(Sanofi)；SAR3419(Sanofi)；SAR256212(Sanofi)、GN-LIV1A(林妥珠单抗(lintuzumab),Seattle Genetics)；SGN-CD33A(Seattle Genetics)；SGN-75(vorsetuzumab mafodotin,Seattle Genetics)；SGN-19A(Seattle Genetics)SGN-CD70A(Seattle Genetics)；SEA-CD40(Seattle Genetics)；替伊莫单抗(Spectrum)；MLN0264(Takeda)；加尼他单抗(ganitumab)(Takeda/Amgen)；CEP-37250(Teva)；TB-403(Thrombogenic)；VB4-845(Viventia)；Xmab2512(Xencor)；Xmab5574(Xencor)；尼妥珠单抗(YM Biosciences)；Carlumab(Janssen)；NY-ESO TCR(Adaptimmune)；MAGE-A-10TCR(Adaptimmune)；CTL019(Novartis)；JCAR015(Juno Therapeutics)；KTE-C19 CAR(Kite Pharma)；UCART19(Cellectis)；BPX-401(Bellicum Pharmaceuticals)；BPX-601(BellicumPharmaceuticals)；ATTCK20(Unum Therapeutics)；CAR-NKG2D(Celyad)；Onyx-015(OnyxPharmaceuticals)；H101(Shanghai Sunwaybio)；DNX-2401(DNAtrix)；VCN-01(VCNBiosciences)；Colo-Ad1(PsiOxus Therapeutics)；ProstAtak(Advantagene)；Oncos-102(Oncos Therapeutics)；CG0070(Cold Genesys)；Pexa-vac(JX-594,JennerexBiotherapeutics)；GL-ONC1(Genelux)；T-VEC(Amgen)；G207(Medigene)；HF10(TakaraBio)；SEPREHVIR(HSV1716,Virttu Biologics)；OrienX010(OrienGene Biotechnology)；Reolysin(Oncolytics Biotech)；SVV-001(Neotropix)；Cacatak(CVA21,Viralytics)；Alimta(Eli Lilly)、顺铂、奥沙利铂、伊立替康、亚叶酸、氨甲蝶呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、Zykadia(Novartis)、Tafinlar(GSK)、Xalkori(Pfizer)、Iressa(AZ)、Gilotrif(Boehringer Ingelheim)、Tarceva(Astellas Pharma)、Halaven(Eisai Pharma)、Veliparib(Abbvie)、AZD9291(AZ)、Alectinib(Chugai)、LDK378(Novartis)、Genetespib(Synta Pharma)、Tergenpumatucel-L(New Link Genetics)、GV1001(Kael-GemVax)、替万提尼(Tivantinib)(ArQule)；环磷酰胺(BMS)；长春新碱(Eli Lilly)；阿霉素(Pfizer)；吉西他滨(Eli Lilly)；Xeloda(Roche)；Ixempra(BMS)；Abraxane(Celgene)；Trelstar(Debiopharm)；无水多西他赛(Taxotere)(Sanofi)；索拉非尼(Nexavar)(Bayer)；IMMU-132(Immunomedics)；E7449(Eisai)；Thermodox(Celsion)；Cometriq(Exellxis)；Lonsurf(Taiho Pharmaceuticals)；Camptosar(Pfizer)；UFT(Taiho Pharmaceuticals)；和TS-1(Taiho Pharmaceuticals)。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于诱导GPR109a基因表达的方法以治疗或预防癌症。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗结直肠癌，诸如结直肠腺癌。实施例中使用的Caco-2细胞系是结直肠腺癌细胞系，并且显示本发明的组合物对此类细胞具有有用的作用。
在某些实施方案中，所述组合物用于治疗或预防转移性黑色素瘤、小细胞肺癌或腺鳞癌。实施例中显示的对NSE的作用表明，本发明的组合物可能针对这些癌症特别有效。
在某些实施方案中，本发明的组合物显示出固有的抗氧化能力。实际上，抗氧化能力用于治疗或预防癌症，特别是通过避免与癌症发展相关联的那些自由基损伤类型。在某些实施方案中，本发明的组合物通过所述抗氧化能力治疗或预防癌症。
施用方式
优选地，本发明的组合物施用到胃肠道以便允许本发明的细菌菌株递送到肠和/或本发明的细菌菌株部分或完全定殖于肠。通常，本发明的组合物口服施用，或者它们可以直肠、鼻内或通过口腔或舌下途径施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以作为泡沫、作为喷雾剂或凝胶施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以作为栓剂诸如直肠栓剂，例如呈可可油(可可脂)、合成硬脂(例如，suppocire、witepsol)、甘油-明胶、聚乙二醇或皂甘油组合物的形式施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物通过管(诸如鼻胃管、口胃管、胃管、空肠造瘘管(J管)、经皮内窥镜胃造口术(PEG))或端口(诸如提供到胃的路径的胸壁端口、空肠或其他合适的路径端口)来施用到胃肠道。
本发明的组合物可以施用一次，或者它们可以作为治疗方案的一部分顺序地施用。在某些实施方案中，本发明的组合物每天施用。
在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随对患者的肠道微生物群的评定。如果未实现本发明的菌株的递送和/或本发明的菌株的部分或完全定殖而使得未观察到功效，则可以重复治疗，或者如果递送和/或部分或完全定殖成功并且观察到功效，则可以停止治疗。
在某些实施方案中，可以将本发明的组合物施用于怀孕动物，例如哺乳动物，例如人，以防止子宫内和/或出生后的孩子体内发生炎性或自身免疫性疾病。
可以将本发明的组合物施用于已被诊断患有由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病状的患者，或已被鉴定为处于由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病状的风险中的患者。所述组合物也可以作为预防措施施用，以防止健康患者中发生由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病状。
本发明的组合物可以施用给已鉴定为具有异常的肠道微生物群的患者。例如，所述患者可以具有减少的或没有巨球菌属，特别是马氏巨球菌进行的定殖。
本发明的组合物可以作为食物产品诸如营养补充剂施用。
通常，本发明的组合物用于治疗人类，虽然它们可以用于治疗动物，包括单胃哺乳动物，诸如家禽、猪、猫、狗、马或兔。本发明的组合物可以用于增强动物的生长和性能。如果施用给动物，则可以使用口服管饲法。
组合物
通常，本发明的组合物包含细菌。在本发明的优选的实施方案中，所述组合物以冻干形式配制。例如，本发明的组合物可以包含颗粒或明胶胶囊，例如例如硬明胶胶囊，其包含本发明的细菌菌株。
优选地，本发明的组合物包含冻干的细菌。细菌的冻干是建立完善的程序，并且相关指导可见于例如参考文献[35,37]。
可替代地，本发明的组合物可以包含活的有效的细菌培养物。
在优选的实施方案中，本发明的组合物被封装以允许将细菌菌株递送到肠。封装保护组合物不被降解，直至通过例如用化学或物理刺激(诸如压力、酶活性或可以通过pH变化触发的物理崩解)破裂来递送在目标位置。可以使用任何适当的封装方法。示例性封装技术包括包埋在多孔基质内、附着或吸附在固体载体表面上、通过絮凝自聚集或与交联剂聚集、以及机械包含在微孔膜或微胶囊之后。关于可用于制备本发明的组合物的封装的指导可见于例如参考文献[38]和[39]。
所述组合物可以口服施用并且可以呈片剂、胶囊或粉末的形式。封装的产品是优选的，因为巨球菌属是厌氧菌。可以包括其他成分(例如像维生素C)作为氧清除剂和益生菌底物以改善体内递送和/或部分或完全定殖和存活。可替代地，本发明的益生菌组合物可以作为食物或营养产品(诸如基于奶或乳清的发酵乳制品)或作为药物产品口服施用。
所述组合物可以配制为益生菌。
本发明的组合物包含治疗有效量的本发明的细菌菌株。治疗有效量的细菌菌株足以对患者发挥有益作用。治疗有效量的细菌菌株可以足以产生对患者的肠的递送和/或受试者的肠的部分或完全定殖。
细菌的例如针对成人的合适的每日剂量可以是约1x103至约1x1011个菌落形成单位(CFU)；例如，约1x107至约1x1010个CFU；在另一个实例中，约1x106至约1x1010个CFU；在另一个实例中，约1x107至约1x1011个CFU；在另一个实例中，约1x108至约1x1010个CFU；在另一个实例中，约1x108至约1x1011个CFU。
在某些实施方案中，细菌的剂量是至少109个细胞/天，诸如至少1010、至少约1011或至少约1012个细胞/天。
在某些实施方案中，所述组合物包含相对于组合物的重量的约1x106至约1x1011个CFU/g的量的细菌菌株；例如约1x108至约1x1010个CFU/g。剂量可以例如为1g、3g、5g和10g。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其中细菌菌株的量是相对于组合物的重量的约1×103至约1×1011个菌落形成单位/克。
在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述组合物的施用剂量是500mg至1000mg、600mg至900mg、700mg至800mg、500mg至750mg或750mg至1000mg。在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述组合物中的冻干细菌的施用剂量是500mg至1000mg、600mg至900mg、700mg至800mg、500mg至750mg或750mg至1000mg。
通常，益生菌(诸如本发明的组合物)任选地与至少一种合适的益生菌化合物组合。益生菌化合物通常是不易消化的碳水化合物，诸如寡糖或多糖或者糖醇，其在上消化道中不被降解或吸收。已知的益生菌包括商业产品诸如菊粉和半乳糖-寡糖。
在某些实施方案中，本发明的益生菌组合物包含相对于总重量组成的约1至约30重量％(例如，约5至20重量％)的量的益生菌化合物。碳水化合物可选自由以下组成的组：果糖-寡糖(或FOS)、短链果糖-寡糖、菊粉、异麦芽糖醇-寡糖、果胶、木寡糖(或XOS)、壳聚糖-寡糖(或COS)、β-葡聚糖、改性的阿拉伯树胶和抗性淀粉、聚糊精、D-塔格糖、金合欢纤维、角豆树、燕麦、以及柑橘纤维。在一方面，益生菌是短链果糖-寡糖(为了简单起见，以下在本文中示为FOS-c.c)；所述FOS-c.c.是不易消化的碳水化合物，通常通过甜菜糖的转化获得并且包含三个葡萄糖分子所结合的蔗糖分子。
本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂或载体。此类合适的赋形剂的实例可见于参考文献[40]。用于治疗性用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是熟知的，并且例如在参考文献[41]中描述。合适的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以考虑预期的施用途径和标准药学实践来选择。所述药物组合物除载体、赋形剂或稀释剂之外可以包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉；明胶；天然糖，诸如葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖；玉米甜味剂；天然和合成胶，诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。在所述药物组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸以及对羟基苯甲酸的酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
本发明的组合物可以配制为食物产品。例如，食物产品可以提供除本发明的治疗性作用之外的营养益处，诸如呈营养补充剂的形式。相似地，可以配制食物产品以增强本发明的组合物的口味或通过与普通食品而非与药物组合物更相似来使得组合物对于消费者更具吸引力。在某些实施方案中，本发明的组合物被配制为基于奶的产品。术语“基于奶的产品”意指具有变化的脂肪含量的任何液体或半固体的基于奶或乳清的产品。基于奶的产品可以是例如牛奶、山羊奶、绵羊奶、脱脂奶、全脂奶、由奶粉和乳清重组而没有任何加工的奶、或加工产品，诸如酸乳酪、凝固奶、凝乳、酸奶、酸化全脂奶、黄油乳以及其他酸奶产品。另一个重要的组包括奶饮料诸如乳清饮料、发酵奶、炼乳、婴儿或幼儿奶；调味奶、冰淇淋；含奶食物诸如糖。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含单一细菌菌株或菌种并且不含任何其他细菌菌株或菌种。此类组合物可以仅包含微少的或生物非相关的量的其他细菌菌株或菌种。此类组合物可以是基本上不含其他种类的生物体的培养物。
用于根据本发明使用的组合物可能需要或可能不需要市场批准。
在一些情况下，冻干的细菌菌株在施用之前进行重构。在一些情况下，所述重构通过使用本文所述的稀释剂进行。
本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株以以下量存在：当施用给有需要的受试者时，足以治疗病症；并且其中所述病症选自由炎性肠病(诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎)、癌症(诸如前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或胃癌)组成的组。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量足以治疗或预防由HDAC介导的疾病或病状。在优选的实施方案中，所述疾病或病状选自由炎性或自身免疫性疾病，诸如哮喘、关节炎、银屑病、糖尿病、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病，或炎性肠病，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎；或癌症，诸如前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或胃癌组成的组。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其中细菌菌株的量是相对于组合物的重量的约1×103至约1×1011个菌落形成单位/克。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其中所述组合物在1g、3g、5g或10g的剂量下施用。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其中所述组合物通过选自由以下组成的组的方法施用：口服、直肠、皮下、鼻腔、口腔以及舌下。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其包含选自由以下组成的组的载体：乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇以及山梨醇。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其包含选自由以下组成的组的稀释剂：乙醇、甘油和水。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其包含选自由以下组成的组的赋形剂：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯树胶、黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠以及氯化钠。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其还包含防腐剂、抗氧化剂和稳定剂中的至少一种。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其包含选自由以下组成的组的防腐剂：苯甲酸钠、山梨酸以及对羟基苯甲酸的酯。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其中所述细菌菌株被冻干。
在某些实施方案中，本发明提供以上的药物组合物，其中当将所述组合物保存在约4℃或约25℃下的密封容器中并将所述容器置于具有50％相对湿度的气氛中时，如以菌落形成单位测量的细菌菌株的至少80％在至少约以下的时间段之后仍保留：1月、3月、6月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年。
培养方法
用于本发明的细菌菌株可使用如在例如参考文献[42,44]中详述的标准微生物技术来培养。
用于培养的固体或液体培养基可以是YCFA琼脂或YCFA培养基。YCFA培养基可包含(每100ml，大约值)：酪胨(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、NaHCO3(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、K2HPO4(0.045g)、KH2PO4(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH4)2SO4(0.09g)、MgSO4·7H2O(0.009g)、CaCl2(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯化血红素(1mg)、生物素(1μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(3μg)、叶酸(5μg)以及吡哆胺(15μg)。
用于疫苗组合物的细菌菌株
发明人已确定，本发明的细菌菌株可用于治疗或预防由HDAC介导的疾病或病状。这可能是本发明的细菌菌株对于宿主免疫系统所具有的作用产生的结果。因此，当作为疫苗组合物施用时，本发明的组合物还可用于预防由HDAC介导的疾病或病状。在某些此类实施方案中，本发明的细菌菌株可以被杀死、灭活或减毒。在某些此类实施方案中，所述组合物可以包含疫苗佐剂。在某些实施方案中，所述组合物用于通过注射诸如通过皮下注射进行施用。
概要
除非另外指示，否则本发明的实践将采用本领域的技术内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学以及药学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如参考文献[45]和[46,52]等。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成或者可以包括另外的事物，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是任选的并且是平均值，例如x±10％。
单词“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，单词“基本上”可以从本发明的定义中省略。
两个核苷酸序列之间的百分比序列同一性的引用意指当对齐时，比较两个序列的核苷酸的百分比是相同的。此比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序，例如参考文献[53]的7.7.18章节中描述的那些来确定。优选的比对通过Smith-Waterman同源性搜索算法使用仿射间隔搜索的具有间隔开放罚分(gap open penalty)为12，间隔延伸罚分(gap extension penalty)为2，BLOSUM矩阵为62来确定。Smith-Waterman同源性搜索算法在参考文献[54]中公开。
除非明确地声明，否则包括多个步骤的工艺或方法可以在方法开始或结束时包括另外的步骤或者可以包括另外的插入步骤。另外，在适当的情况下，步骤可以组合、省略或以可替代的顺序执行。
本发明的各种实施方案在本文中描述。应理解，在每个实施方案中指定的特征可以与其他指定的特征组合以提供另外的实施方案。具体地，在本文中突出显示为合适的、典型的或优选的实施方案可以彼此组合(当它们相互排斥时除外)。
用于实施本发明的方式
实施例1–细菌对组蛋白脱乙酰酶活性的功效
概要
研究了根据本发明的包含细菌菌株的组合物改变组蛋白脱乙酰酶活性的能力。组蛋白脱乙酰酶的失调涉及与炎性和自身免疫性病症和癌症相关联的发病机理。
材料和方法
细菌菌株
马氏巨球菌MRx0029
细胞系
使用细胞系HT-29，因为存在组蛋白脱乙酰酶。
方法
通过离心并在0.22uM过滤器中过滤来分离固定相细菌培养物的无细胞上清液。汇合后3天使用HT-29细胞，并在实验开始前24小时加入1mL DTS。用在DTS中稀释的10％无细胞上清液攻击HT-29细胞，并将其孵育48小时。然后使用Sigma Aldrich核酸酶提取试剂盒提取核酸酶蛋白，并在HDAC活性测量之前将样品速冻。使用Sigma Aldrich(UK)试剂盒对HDAC活性进行荧光评定。
结果
实验结果在图1A中示出。图1A表明MRX0029能够降低组蛋白脱乙酰酶活性水平。
实施例2–细菌对组蛋白脱乙酰酶活性的功效的进一步分析
引言
发明人试图研究MRX0029及其代谢物对HDAC抑制的有效性。
材料和方法
细菌培养和无细胞上清液收集
使纯MRX0029细菌培养物在YCFA肉汤中厌氧生长，直到达到稳定的生长阶段。将培养物以5,000x g离心5分钟，并且使用0.2μM过滤器(Millipore,UK)过滤无细胞上清液(CFS)。将CFS的1mL等分试样保存在-80℃下直至使用。丁酸钠、己酸和戊酸从SigmaAldrich(UK)获得，并在YCFA肉汤中制备悬浮液。
细菌上清液的SCFA和MCFA定量
细菌上清液中的短链脂肪酸(SCFA)和中链脂肪酸(MCFA)如下通过MS Omics APS分析和定量。使用盐酸将样品酸化，并添加氘标记的内标。所有样品均按随机顺序进行分析。使用安装在与四极杆检测器(59977B,Agilent)偶联的GC(7890B,Agilent)中的高极性色谱柱(ZebronTM ZB-FFAP,GC Cap.Column 30m x 0.25mm x 0.25μm)进行分析。所述系统由ChemStation(Agilent)控制。使用Chemstation(Agilent)将原始数据转换为netCDF格式，然后使用Johnsen,2017,J Chromatogr A,1503,57-64中所述的PARADISe软件在MatlabR2014b(Mathworks，Inc.)中将数据导入并处理。
特异性HDAC活性分析
使用用于每种类型的HDAC的荧光测定试剂盒(BPS Bioscience，CA)对HDAC1、2、3、4、5、6、9分析特异性HDAC抑制活性。根据制造商的说明书进行测定，每个样品均重复进行。将无细胞上清液以十分之一的比例稀释，并暴露于试剂盒中提供的特定HDAC蛋白，以保持方法之间的一致性。
结果
MRx0029产生HDAC抑制代谢物丁酸酯和戊酸
MRx0029上清液显示出强烈的HDAC抑制作用，并且发现产生的戊酸和己酸的平均浓度分别为5.08mM和1.60mM(图16A和图C)(图1C)。
为了研究哪些代谢物负责菌株诱导的HDAC抑制，测量了不同浓度的己酸、戊酸和丁酸钠在全HT-29细胞和HT-29细胞裂解液上的HDAC抑制作用。图1B中的结果显示，丁酸钠对全细胞以及细胞裂解液均具有显著的HDAC活性抑制作用(P<0.05)，而己酸确实显示显著的抑制活性。戊酸抑制总HDAC活性(*(p<0.05)，**(p<0.005)，***(P<0.001)，****(p<0.0001))。
研究的有效的总HDAC抑制剂靶向I类HDAC。
研究了测试细菌菌株的特异性HDAC抑制情况。对I类HDAC进行了特异性HDAC抑制测定(BPS Bioscience，CA)。分析了细菌菌株抑制HDAC酶的能力。结果(图2)表明MRX0029是I类HDAC酶(HDAC1、HDAC2和HDAC3)、特别是HDAC2的有效抑制剂。
论述
具有HDAC抑制活性的菌株产生了大量的戊酸和己酸，以及大量的丁酸钠(图1C)。当作为纯物质进行测试时，戊酸和丁酸钠会导致显著的HDAC抑制作用(图1B和图2)(p<0.0001)。
有趣的是，特异性HDAC活性的结果表明，所测试的菌株是I类HDAC、特别是HDAC2(图2)的有效抑制剂。I类HDAC(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8)位于细胞核中，并在若干种人类细胞类型中普遍表达。HDAC1–HDAC3共享超过50％的同源性，但具有不同的结构和细胞功能[55]。它们主要参与细胞存活、增殖和分化，因此其抑制对多种疾病可能是有用的[56,57,58,59,60]。这些数据表明，本发明的组合物可用于治疗由HDAC介导的疾病。
实施例3–细菌接种物减少IL-6分泌的功效。
概要
促炎细胞因子的活化与炎性疾病中的损伤相关联。脂多糖(LPS)是促炎细胞因子IL-6的已知刺激物。用根据本发明的包含细菌菌株的组合物与LPS结合处理人胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞，以观察其调节IL-6水平的能力。
材料和方法
细菌菌株
马氏巨球菌MRx0029
细胞系
MG U373是源自恶性肿瘤的人胶质母细胞瘤星形细胞瘤，并购自Sigma-Aldrich(目录号08061901-1VL)。将MG U373人胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞在补充有10％FBS、1％青霉素链霉素、4mM L-Glut、1X MEM非必需氨基酸溶液和1X丙酮酸钠的MEM(SigmaAldrich，目录号M-2279)中生长。
方法
一旦生长，就将MG U373细胞以100,000个细胞/孔接种在24孔板上。将细胞单独用LPS(1ug/mL)或用10％MRx0029细菌上清液处理24h。还进行了对照，其中将细胞在未处理的培养基中孵育。之后，收集不含细胞的上清液，在10,000g下于4℃离心3min。根据制造商说明书使用来自Peprotech的人IL-6 ELISA试剂盒(目录号#900-K16)测量IL-6。
结果
这些实验的结果在图3中示出。用LPS和细菌菌株处理细胞导致分泌的IL-6水平降低。
实施例4–细菌接种物减少NF-κB活化的功效
概要
NF-κB启动子的活化导致促炎细胞因子的产生，包括IL-1β、IL-1α、IL-18、TNFα和IL-6。NF-κB启动子可以通过刺激TLR4配体被α-突触核蛋白和LPS活化。研究了根据本发明的包含细菌菌株的组合物抑制NF-κB启动子活化的能力。
材料和方法
细菌菌株
马氏巨球菌MRx0029
细胞系
人HEK blue TLR4购自InvivoGen(目录号hkb-htlr4)。将人HEK blue TLR4在补充有10％FBS、1％青霉素链霉素、4mM L-Glut、Normocin和1X HEK Blue选择溶液的DMEM高葡萄糖(Sigma Aldrich，目录号D-6171)中生长。
方法
一旦生长，就将人HEK blue细胞以25,000个细胞/孔接种于96孔板中，重复4次。将细胞单独用LPS(10ng/mL，来自鼠伤寒肠沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型，SigmaAldrich，目录号L6143)或10％MRx0029细菌上清液处理22h。随后离心分离细胞，并将20ul上清液与200ul Quanti Blue试剂(InvivoGen，目录号rep-qb2)混合，孵育2h并在655nm下读取吸光度。
结果
这些实验的结果在图4中示出。图4显示，MRx0029抑制了LPS对NFκB启动子的活化。
实施例5–细菌接种物改变抗氧化能力的功效
概要
根据本发明的包含细菌菌株的组合物改变抗氧化能力的能力。使用众所周知的ABTS(2,2’-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))测定法确定细菌菌株的抗氧化能力。
细菌菌株
马氏巨球菌MRx0029
方法
收集细菌细胞(106个或更多)并离心。将它们重悬于测定缓冲液中(使用三倍沉淀体积)。将悬浮液在冰上超声处理5分钟，然后以12,000x g离心分离10分钟。根据制造商的说明，取出上清液，并使用Sigma Aldrich生产的ABTS测定试剂盒(代码CS0790)进行测量。
结果
这些实验的结果在图6中示出。图6表明，与Trolox相比，MRx0029的抗氧化能力为大约2mM。
实施例6–细菌接种物改变脂质过氧化水平的功效
概要
研究了根据本发明的包含细菌菌株的组合物改变脂质过氧化水平的能力。硫代巴比妥酸反应物测定法(TBAR)用于测量脂质过氧化的副产物。
材料和方法
细菌菌株
马氏巨球菌MRx0029
方法
收集细菌细胞(106个或更多)并离心，用等渗盐水进行洗涤步骤，然后将沉淀重悬浮于氯化钾测定缓冲液中。将悬浮液在冰上超声处理10分钟，然后以10,000x g离心分离10分钟。除去上清液，并使用硫代巴比妥酸反应物测定法评估脂质过氧化的水平。
结果
实验结果在图6中示出。图6显示，MRx029能够将脂质过氧化抑制大约20％，这比阳性对照丁基化羟基甲苯(1％w/v)具有更高的抗氧化能力。
实施例7–细菌中吲哚的产生水平
概要
研究了本发明的细菌产生吲哚的能力。吲哚与减轻炎症和氧化应激有关。
材料和方法
细菌菌株
马氏巨球菌MRx0029
ATCC 11775是已知产生吲哚的细菌参考菌株。
方法
将固定相中完整的细菌细胞与6mM色氨酸一起孵育48小时。具有色氨酸酶的细菌菌种利用色氨酸作为底物来产生吲哚。孵育48小时后，将上清液移出并添加到Kovac试剂中，以定量吲哚。使用内部验证的标准化方法制备标准品、储备溶液和试剂。
结果
实验结果在图7中示出。图7表明，MRx0029具有从色氨酸产生吲哚的能力，浓度为大约0.2mM。
实施例8–MRx0029减少回肠中的白细胞浸润的功效
1.研究目的
此研究的目的是确定反复口服施用后，MRX029在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中的预防功效。
2.材料和方法
2.1.测试物
-2.1.1测试物
YCFA容易制备。Hungate管含有预先还原的YCFA
MRx0029以冷冻甘油原液的形式制备。
-2.1.2参考物
他克莫司–(Sigma PHR-1809-批号LRAA8723)
丙戊酸(Arrow Generiques-200mg/mL-批次10.15-失效日期11/2020)
-2.1.3额外试剂
来自MP Biomedicals的DSS(36,000-50,000Da)，目录号：0216011090
来自Gibco的PBS(不含Ca/Mg)，目录号：14190-094
来自Sigma的Tween 80，目录号：P4780-100ML
ο来自Lavoisier的无菌0.9％NaCl，目录号：CIP 3400 963 340 763
ο来自Aguettant的无菌蒸馏水，目录号：600499
-2.1.4参考物制备
他克莫司每天在无菌的1％Tween 80、0.9％NaCl中制备，浓度为0.1mg/mL。
丙戊酸每天在无菌蒸馏水中制备，浓度为20mg/mL(稀释1/10)。
-2.1.5细菌预培养
使用利用无菌技术的以下方案制备细菌预培养物。将每个菌株保存在-80℃下的一份甘油原液完全解冻，并短暂地涡旋混合。仅使用培养基颜色为浅棕色/黄色的解冻原液。如果解冻培养基的颜色较深或偏蓝色，则将甘油原液丢弃。
使用带有0.8x40mm针的1mL注射器，通过Hungate管的隔膜注射400μL的甘油原液来制备预培养物。将管倒置混合，并一式两份制备第二个Hungate管。在t＝0时测量两个接种的Hungate管的OD600(未接种的Hungate管用作空白)。然后将Hungate管在37℃下孵育24h，并定期测量OD值。
-2.1.6用于小鼠施用的细菌主培养
使用1ml具有较高OD600的预培养物来接种新鲜的Hungate管。将管倒置混合。如上所述制备并培养双份接种物。如上所述测量OD600并在16小时的过程中定期进行测量。在终点时，使用具有较高OD600的Hungate管进行给药。
2.2.治疗剂量
他克莫司以1mg/kg/天给药
丙戊酸以200mg/kg/天给药
PBS、YCFA和细菌培养物以200μL/天给药
2.3.施用途径
每天以200μL/小鼠的固定量口服(PO)施用PBS、YCFA和活细菌
每天将以10mL/kg的量皮下(SC)施用他克莫司
每天将以10mL/kg的量口服(PO)施用丙戊酸
2.4.动物
从Charles River(France)获得六十三只、6周大的健康雄性C57BL/6J小鼠中的每一只，并分别进行鉴定并使用特定的代码标记。每个治疗组(9只动物/组)被饲养在三个不同的笼子中。
根据FELASA指南，使动物保持在SPF健康状态，并且根据法国和欧洲法规和NRC实验动物护理和使用指南实现了动物饲养和实验程序。·每天记录动物的生存能力和行为。
-2.4.1.饲养条件
在受控制的环境条件下将动物维持在饲养室中：温度：22±2℃；湿度55±10％；F9过滤空气；光周期(12h亮/12h暗)；每小时进行15次以上的空气交换，无再循环。
为动物围栏提供充足的空间，具有垫底材料、食物和水、环境和社交丰富化(群养)，如下所述：
·聚碳酸酯欧洲标准IIL型或Ill型滤盖饲养笼
·杨树垫(TOPLIT SELECT FINE,
Figure BDA0002769938050000701
Germany)，
·A04控制标准维持饮食(
Figure BDA0002769938050000702
France)，
·自来水，
·环境丰富化*
·来自BioServices-Netherlands的Sizzlenest和小木棍
·来自Plexx-Netherlands的小鼠冰屋。
3.实验设计和治疗
3.1.体内研究
在基于体重分配治疗组之前进行动物随机化。在整个研究过程中采取了具体措施以防止交叉污染。例如，在处理动物时，在每个治疗笼之间更换手套并喷涂70％的乙醇溶液，以使任何的污染风险最小化。还在无菌条件下进行组织收集。简而言之，在样品收集之前，所有工具、材料和收集区域均使用70％的乙醇喷涂。
为防止昼夜节律影响并优化组随机化，以及避免假阳性/阴性，还采取了以下特定措施：
·治疗是随机施用的，并且每天交替进行，以防止同一组每天在同一时间接受治疗
·随机地、每天交替地进行动物操作和处理，以防止在相同的时间点处理相同的动物
·获取样品时，在每个时间点将组随机化。
3.2.使用细菌主培养的动物给药
使用通过隔膜注射的注射器和0.8x40mm针从Hungate管中提取给药等分试样来进行动物给药。在提取出给药等分试样之前，将Hungate管倒置混合。前50-100μL通过管饲针注入，并且使用200μL培养物通过口服管饲对每只小鼠给药。
3.3.体内研究
下表指出了研究组。
Figure BDA0002769938050000721
治疗如下进行：
第-7天至第-1天：根据上述治疗表，使用细菌和参考物进行治疗
·每天口服施用PBS、YCF A或细菌一次-每小鼠200μL
·以10mL/kg的量，以200mg/kg/天的剂量每天口服施用丙戊酸一次
从第0天至第+7天：DSS施用
·施用在饮用水中的3％DSS
从第0天至第+6天：使用细菌和参考物进行治疗
·每天口服施用PBS、YCFA或细菌一次-每小鼠200μL
·每天口服施用丙戊酸一次-200mg/kg在无菌蒸馏水中-10mL/kg
·每天SC施用他克莫司一次-1mg/kg在无菌1％Tween80、0.9％NaCl中-10mL/kg
第+7天：所有组的处死和组织收集
·在气体麻醉(异氟醚)下进行动物安乐死，然后进行放血和颈椎脱位。所使用的安乐死方法是欧洲指令20I 0/63/CE推荐用于小鼠和大鼠的安乐死方法，并且描述安乐死方法的程序已由IACUC批准。
·正好在盲肠上游(从0.5cm起)进行剖腹手术和回肠收集-在所有小鼠之间，从完全相同的区域收集所有组织：
·收集1.5cm瑞士卷回肠(最接近盲肠)用于组织学检查
3.4.组织学检查
将回肠瑞士卷标本埋入石蜡中，切成5μm厚的切片，并安装在SuperFrost Ultraplus载玻片上。进行HP(苏木精-跟皮红(Phloxin))染色和AB-PAS(阿尔辛蓝-高碘酸希夫)染色以观察组织形态学变化。使用下表中的标准，在每只动物上建立了基于水肿、糜烂、隐窝/杯状细胞丢失和浸润的评分：
Figure BDA0002769938050000731
4.结果
七个治疗组中的每一组的每只动物的回肠组织学检查评分在下表中示出。
Figure BDA0002769938050000732
Figure BDA0002769938050000741
Figure BDA0002769938050000751
治疗组均未显示杯状细胞数量减少或水肿。未检测到明显的上皮细胞损伤/糜烂。
与未患病的第1组和第2组相比，仅媒介物的对照DSS组(第3组和第4组)中的大多数动物显示出白细胞浸润的轻微增加。用他克莫司(一种已知的免疫抑制剂)治疗的DSS动物与对照相比，白细胞浸润减少。在丙戊酸和细菌治疗第5组和第6组中观察到相似的减少。这表明，与已知的治疗剂他克莫司相比，所述细菌有效减少回肠中的白细胞浸润。
实施例9-稳定性测试
含有本文所述的至少一种细菌菌株的本文所述的组合物保存在25℃或4℃下的密封容器中，并且所述容器置于具有30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相对湿度的气氛中。在1个月、2个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年之后，至少50％、60％、70％、80％或90％的细菌菌株仍保留，如通过标准方案以菌落形成单位所测量的。
实施例10–神经化学产生–脑中的代谢物
背景
在离体筛查期间，在喂养MRx0029的小鼠的脑组织中，测量了在神经系统过程中起关键作用的神经化学因子、神经肽和神经递质的水平。
方法
动物
将BALBc(Envigo,UK)成年雄性小鼠在12h明暗周期下分组饲养；随意提供标准的啮齿动物食物和水。经过科克大学动物伦理实验委员会(University College CorkAnimal Ethics Experimentation Committee)的批准，所有实验均按照欧洲指南进行。在实验开始时，动物为8周龄。
研究设计
进入动物单位后，允许动物在其饲养室中适应一周。在15:00与17:00之间，它们以1X109个CFU的剂量接受活体生物治疗剂的口服管饲(200μL剂量)，连续6天。在第7天，将动物断头，并收集组织进行实验。
组织收集
关于治疗和测试条件，以随机方式处死动物；取样发生在上午9:00与下午1:00之间。将躯干血收集在EDTA(乙二胺四乙酸)钾管中，并以4000g离心15min。将血浆分离并保存在-80℃下以用于进一步分析。快速切除大脑，解剖，并且将每个大脑区域在干冰上快速冷冻并保存在-80℃下以用于进一步分析。
分析
通过HPLC对脑干样品上的神经化学因子、神经肽和神经递质的浓度进行分析。简而言之，将脑干组织在加标有4ng/40μl N-甲基5-HT(Sigma Chemical Co.,UK)作为内标的500μl冷冻流动相中进行超声处理。流动相含有0.1M柠檬酸、5.6mM辛烷-1-磺酸(Sigma)、0.1M磷酸二氢钠、0.01mM EDTA(Alkem/Reagecon,Cork)和9％(v/v)甲醇(Alkem/Reagecon)，并使用4N氢氧化钠(Alkem/Reagecon)将其调节至pH 2.8。然后将匀浆在4℃下以22,000×g离心15min，并将40μl上清液注入HPLC系统，所述系统由SCL 10-Avp系统控制器、LECD 6A电化学检测器(Shimadzu)、LC-10AS泵、CTO-10A烘箱、SIL-10A自动进样器(样品冷却器保持在40℃下)和在线Gastorr脱气器(ISS,UK)组成。使用保持在30℃下的反相柱(Kinetex 2.6u C18 100×4.6mm，Phenomenex)进行分离(流速0.9ml/min)。玻碳工作电极与Ag/AgCl参比电极(Shimdazu)组合使用，工作电压为+0.8V，并使用Class-VP 5软件(Shimadzu)分析所产生的色谱图。通过由标准进样确定的特征性保留时间来鉴定神经递质，这些标准进样在样品分析过程中以定期间隔进行。测量分析物与内标的峰高之比，并与标准进样进行比较。结果表示为ng神经递质/g鲜重组织。
结果–神经递质的产生
结果在图8中示出，所述图显示在喂养MRx0029的小鼠的大脑中，去甲肾上腺素(p＝0.0507)、血清素和5-HIAA的水平升高。
实施例11–色氨酸羟化酶表达
背景
色氨酸羟化酶是一种参与血清素产生的酶。因此，发明人试图研究马氏巨球菌菌株MRx0029是否可以在神经元样细胞中诱导色氨酸羟化酶基因TPH1和TPH2的上调表达。这可以解释MRx0029如何增加体内血清素的水平。
材料和方法
使神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞在补充有2mM L-谷氨酰胺、10％热灭活的FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的50％MEM和50％营养混合物F-12ham培养基中生长。将细胞接种在10cm培养皿中，密度为2x106个细胞。静置24h后，将细胞在含有10％MRx0029上清液或YCFA+的生长培养基(含1％FBS)中处理24h。接下来收集细胞，并根据RNeasy小试剂盒方案(RNeasy mini kit protocol)(Qiagen)分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)制备cDNA。引物序列在表1中示出。通过qPCR测量基因表达。B-肌动蛋白用作内部对照。根据2^(-ΔΔct)方法计算倍数变化。
进行第二组相似实验，除了以0.5×106细胞/孔的密度在六孔培养皿中接种细胞。静置24h后，将细胞在含有5％细菌上清液或YCFA+的生长培养基(含1％FBS)中处理72h。如上所述分析总RNA。
对照一起进行，其中细胞未经处理或在YCFA+培养基中孵育等效时间。YCFA+培养基具有以下组成：
Figure BDA0002769938050000781
Figure BDA0002769938050000791
矿物质溶液1：K2HPO4-3.0g；d.H2O补足至总体积1l
矿物质溶液2：KH2PO4-3.0g；(NH4)2SO4-6.0g；NaCl-6.0g；MgSO4-0.6g；CaCl2-0.6g；d.H2O补足至总体积1l
刃天青溶液：100ml蒸馏水中的0.1％粉末状刃天青
短链脂肪酸溶液：乙酸-17ml；丙酸-6ml；正戊酸-1ml；异戊酸-1ml；异丁酸-1ml
氯化血红素溶液：KOH-0.28g乙醇95％-25ml；氯化血红素-100mg；d.H2O补足至总体积100ml
维生素溶液1：生物素-1mg；钴胺素-1mg；对氨基苯甲酸-3mg；叶酸-5mg；吡哆胺-15mg；d.H2O补足至总体积100ml
维生素溶液2：硫胺素-5mg；核黄素-5mg；d.H2O补足至总体积100ml
结果
图9中显示的结果表明，当细胞与10％MRx0029细菌无细胞上清液一起孵育24h后，TPH1的表达水平相对于未处理或YCFA+处理的对照增加了5倍。TPH2的表达水平相对于未处理的对照也增加了30倍。
图10中显示的结果表明，当细胞与5％MRx0029细菌无细胞上清液一起孵育72h后，TPH1的表达水平相对于未处理或YCFA+处理的对照增加了5倍。TPH2的表达水平相对于未处理的对照也增加了30倍。
实施例12–血清素转运体表达
背景
SLC6A4基因编码血清素转运体。血清素转运体是分化的血清素能神经元的生物标志物。血清素转运体也由肠壁的上皮细胞表达，并从间隙空间中去除血清素。因此，发明人试图确定马氏巨球菌菌种的细菌菌株是否可以上调神经元样细胞中的血清素能标志物。
材料和方法
如实施例2所述进行相同的实验组。SLC6A4基因的引物序列在表2中示出。
表2-SLC6A4和β-肌动蛋白的引物序列
Figure BDA0002769938050000801
结果
图11中显示的结果表明，当细胞与10％MRx0029细菌无细胞上清液一起孵育24h后，SLC6A4的表达相对于未处理的对照上调了3倍，但与YCFA+处理的细胞没有差异。图12中显示的结果表明，当细胞与5％MRx0029细菌无细胞上清液一起孵育72h后，SLC6A4的表达相对于未处理的对照上调了3倍，并且相对于YCFA+处理的细胞上调了约2倍。这些数据表明，本发明的组合物可通过增加血清素转运体的表达并从胃肠道中去除血清素来有效治疗炎性肠病。
实施例13–Caco2细胞中的色氨酸羟化酶和血清素转运体的表达分析
引言
大部分血清素在肠道中产生。肠道血清素被认为在肠道与大脑之间起着重要的沟通作用。因此，发明人试图确定MRx0029是否可以增加肠样细胞中TPH1和SLC6A4的表达。
为此，发明人将分化的Caco2细胞与MRx0029细菌无细胞上清液一起孵育。分化的Caco2细胞形成极化的顶膜/粘膜和基底外侧膜/浆膜，这些膜不可渗透，并且在结构和功能上与小肠上皮细胞相似。
材料和方法
将Caco2细胞接种在12孔板上，并分化10天；然后将其血清饥饿12小时，并随后暴露于源自固定相MRx0029的10％上清液中24h。收集细胞，并根据RNeasy小试剂盒方案(Qiagen)分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)制备cDNA。通过qPCR测量基因表达。β-肌动蛋白用作内部对照。根据2^(-ΔΔct)方法计算倍数变化。引物序列如下所示。
结果
图13中显示的结果表明，当分化的Caco2细胞与10％MRx0029细菌无细胞上清液一起孵育24h后，TPH1的表达相对于未处理的对照和YCFA+处理的对照上调了几乎3倍。图14中显示的结果表明，孵育相对于未处理的对照使SLC6A4的表达增加了3倍以上。这些数据表明，本发明的组合物可通过增加血清素转运体的表达并从胃肠道中去除血清素来有效治疗炎性肠病。
实施例14–在分化的Caco-2细胞中的GPR109a RNA表达
GPR109a是在结肠和肠上皮细胞的面向内腔的顶膜中表达的G蛋白偶联受体。在结肠癌细胞系中发现了GPR109a表达沉默，并且据报道在细菌发酵产物(诸如丁酸酯)存在下诱导其表达可诱导肿瘤细胞凋亡[61]。GPR109a还能够抑制炎症，特别是结肠炎症[62]。
将HT29mtx细胞接种在12孔板上，并分化10天；然后将其血清饥饿12小时，并随后暴露于源自固定相细菌的10％上清液中24h。收集细胞，并根据RNeasy小试剂盒方案(Qiagen)分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)制备cDNA。通过qPCR测量基因表达。β-肌动蛋白用作内部对照。根据2^(-ΔΔct)方法计算倍数变化[63]。所用正向和反向引物的序列分别以SEQ ID NO:2和3提供。
分化的Caco-2形成极化的顶膜/粘膜和基底外侧膜/浆膜，这些膜不可渗透，并且在结构和功能上与小肠上皮细胞相似。用MRx0029处理Caco-2细胞引发GPR109a表达增加(图18A)。另外，用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)上清液处理的Caco-2，表现出比单独用PMA(或在YCFA培养基中的PMA)处理的更高的GPR109a RNA表达–参见图18B。因此，这些数据表明，本发明的组合物可用于治疗癌症，尤其是转移性癌症，特别是转移性结直肠癌或小肠癌，诸如小肠腺癌。这些数据还表明，作为GPR109a表达的结果，本发明的组合物可通过诱导凋亡的机制来实现此类治疗。这些数据还表明，MRx0029具有抗炎活性，并且可用于治疗炎性病症，特别是炎性肠病。
实施例15–代谢物分析
引言
肠道微生物群具有巨大的多样性和代谢能力，代表了巨大的代谢库，可用于产生多种分子。发明人试图确定由马氏巨球菌菌株NCIMB42787和本文中鉴定为Ref1、Ref2和Ref3的其他马氏巨球菌菌株产生和消耗了哪些短链脂肪酸和中链脂肪酸。
材料和方法
细菌培养和无细胞上清液收集
使纯细菌培养物在YCFA肉汤中厌氧生长，直到达到稳定的生长阶段。将培养物以5,000x g离心5分钟，并且使用0.2μM过滤器(Millipore,UK)过滤无细胞上清液(CFS)。将CFS的1mL等分试样保存在-80℃下直至使用。丁酸钠、己酸和戊酸从Sigma Aldrich(UK)获得，并在YCFA肉汤中制备悬浮液。
细菌上清液的SCFA和MCFA定量
细菌上清液中的短链脂肪酸(SCFA)和中链脂肪酸(MCFA)如下通过MS Omics APS分析和定量。使用盐酸将样品酸化，并添加氘标记的内标。所有样品均按随机顺序进行分析。使用安装在与四极杆检测器(59977B,Agilent)偶联的GC(7890B,Agilent)中的高极性色谱柱(ZebronTM ZB-FFAP,GC Cap.Column 30m x 0.25mm x 0.25μm)进行分析。所述系统由ChemStation(Agilent)控制。使用Chemstation(Agilent)将原始数据转换为netCDF格式，然后使用[肠和肠上皮细胞的面向内腔的顶膜中表达的G蛋白偶联受体。在结肠癌细胞系中发现了GPR109a表达沉默，并且据报道在细菌发酵64]中所述的PARADISe软件在MatlabR2014b(Mathworks，Inc.)中将数据导入并处理。
结果
如图15-图17所示，菌株42787产生戊酸、丁酸酯和己酸，并消耗丙酸酯和乙酸酯。发明人还发现了马氏巨球菌菌种的其他菌株，它们产生相当水平的戊酸、己酸和丁酸酯，并且消耗相似量的乙酸酯和丙酸酯。
实施例16–烯醇酶2的抑制
图19表明MRx0029具有抑制神经元特异性烯醇酶(NSE)/烯醇化酶2的统计学意义的作用。NSE被认为可以支持增加的肿瘤细胞代谢需求、保护肿瘤细胞免受压力条件的影响并促进其入侵和迁移[65]。它还与转移性黑色素瘤的进展[66]、小细胞肺癌的生存和进展[67]以及腺鳞癌的预后有关[68]。因此，预期本发明的组合物可有效治疗和预防癌症，特别是转移性黑色素瘤、小细胞肺癌和腺鳞癌。
此外，烯醇酶可具有促炎作用[69]，因此这些数据也表明本发明的组合物可用于治疗或预防自身免疫性和炎性病症。
实施例17–代谢物分析
除实施例17提供的数据外，图20表明马氏巨球菌菌株NCIMB 42787和其他以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43388和NCIMB 43389保藏的菌株产生和消耗了哪些其他短链脂肪酸。
马氏巨球菌菌株NCIMB 42787减少了甲酸，同时提高了2-甲基丙酸和3-甲基丙酸的水平(图20)。因此，NCIMB 42787菌株产生2-甲基丙酸和3-甲基丙酸并消耗甲酸。发明人还发现，其他保藏菌株产生相当水平的2-甲基丙酸和3-甲基丙酸并消耗相似量的甲酸。
实施例18–IL-6的下调
引言
研究了细菌菌株在免疫刺激剂LPS存在下减少星形细胞瘤细胞系U373分泌IL-6的能力。
材料和方法
将人胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞系(U373)维持在补充有10％热灭活FBS、4mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和5μg/ml plasmocin、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠的25ml MEME 4.5g/L D-葡萄糖(称为完全生长培养基)中。
将细胞在1ml完全生长培养基中以100,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并在37℃/5％CO2下静置72h。处理当天，从各孔中移出培养基，用0.5ml洗涤培养基(不含血清的MEME)冲洗细胞，将含1μg/ml LPS的0.9ml刺激培养基(含2％FBS的MEME培养基)加入到适当的孔中，并在37℃和5％CO2下孵育。预孵育1h后，将细胞从CO2培养箱中移出，并用100μl细菌上清液处理。将YCFA+培养基用作对照。然后将细胞在37℃/5％CO2下再孵育24h，之后收集无细胞上清液，并在4℃下以10,000g离心分离3min。将样品等分于1.5ml微管中，并在-80℃下保存用于hIL-6 ELISA。
结果和讨论
图21表明，与LPS和LPS培养基对照相比，马氏巨球菌菌株NCIMB 42787引起U373细胞中IL-6分泌的显著抑制。发明人还确定所有保藏的菌株都触发了IL-6分泌的显著减少。
实施例19–NFκB活化的抑制
引言
研究了细菌菌株降低HEK-TLR4细胞中NFκB-AP1启动子活化的能力。
材料和方法
根据制造商的说明，培养稳定表达人TLR4(HEK-TLR4)的HEK293-Blue报告细胞。简而言之，将HEK-TLR4细胞维持在补充有有10％(v/v)热灭活FBS、4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml normocin、1x HEK-Blue选择培养基的DMEM4.5g/L D-葡萄糖中。
对于实验，将细胞用PBS洗涤，在PBS中解离并收集在生长培养基中。对于HEK-TLR4，将细胞以25,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。为了评估反应性，在10％(V/V)细菌上清液存在或不存在下，用10ng/ml LPS处理细胞，并在CO2培养箱中培养。在37℃/5％CO2下处理22h，之后根据制造商的说明，使用QUANTI-blue溶液从细胞培养上清液中检测分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)活性。简而言之，收集20μl无细胞上清液，并通过与200μlQUANTI-Blue检测培养基混合来分析SEAP的存在。在37℃下孵育2h后，在酶标仪(iMarkmicroplate，Bio-Rad)上于655nm处测量光密度。
结果
图22表明，与LPS培养基对照相比，在LPS存在下，马氏巨球菌菌株NCIMB 42787减少了NFκB启动子的活化。此外，发明人已证明，其他保藏的菌株在NFκB启动子的活化中表现出相似的减少趋势。
实施例20–烯醇酶2的抑制
材料和方法
使神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y在补充有2mM L-谷氨酰胺、10％热灭活的FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的50％MEM和50％营养混合物F-12Ham培养基中生长。将SH-SY5Y接种在6孔板中，密度为0.5x106个细胞。24h后将细胞在含有10％细菌上清液或YCFA+的分化培养基(含1％FBS的生长培养基)中处理17h。收集细胞，并根据RNeasy小试剂盒方案(Qiagen)分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)制备cDNA。通过qPCR测量基因表达。将GAPDH用作内部对照。根据2(-ΔΔct)方法计算倍数变化。所使用的引物组如SEQ ID NO:19、20、21和22所列。
结果
图23表明马氏巨球菌菌株NCIMB 42787具有抑制神经元特异性烯醇酶(NSE)/烯醇化酶2的统计学意义的作用。此外，发明人还发现，与YCFA培养物对照相比，保藏菌株触发了烯醇酶2的统计学意义的降低。具体地，以保藏号NCIMB 43385、NCIMB 43388、NCIMB 43389、NCIMB 43386和NCIMB 43387保藏的菌株引起了烯醇酶2的显著抑制。
结论
因此，与以上实施例16中的评述一致，在某些实施方案中，预期包含示例性保藏菌株的本发明组合物可有效治疗和预防癌症，特别是转移性黑色素瘤、小细胞肺癌和腺鳞癌。
实施例21–U373胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞中IL-6产生的减少
引言
在用脂多糖(LPS)处理后，针对在U373胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞系中诱导抗炎反应的能力筛选了以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株的固定相细菌无细胞上清液。
材料和方法
U373是人胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞系。将细胞(第20-37次传代)维持在补充有10％热灭活FBS、4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和5μg/mlplasmocin、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠的25ml MEME(通篇称为完全生长培养基)中。将细胞在1ml完全生长培养基中以100,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并在37℃和5％CO2下静置72h。
BCFS的分离
通过将10ml培养物以5000xg离心5min并使用0.2μM过滤器(Millipore，UK)过滤，来从固定相培养物(由来自经划线的冷冻原液的替代(subbed)菌落的过夜培养物接种的)获得细菌无细胞上清液(BCFS)。将细菌无细胞上清液的1ml等分试样保存在-80℃下直至使用。
细胞的处理
处理当天，从各孔中取出培养基，用0.5ml洗涤培养基(不含血清的MEME)冲洗细胞，将含1μg/ml LPS的0.9ml刺激培养基(含2％FBS的MEME培养基)加入到适当的孔中，并在37℃和5％CO2下孵育。用LPS将细胞预处理1h。然后，从CO2培养箱中移出细胞，并用NCIMB42787的100μl(即10％)固定相细菌无细胞上清液处理。
每次处理后，将细胞在37℃和5％CO2下孵育24h。然后，收集无细胞上清液并在4℃下以10000xg离心3min。将样品等分于1.5ml微管中，并保存在-80℃下用于hIL-6 ELISA。
根据制造商的方案，使用hIL-6标准ELISA试剂盒在如上所述处理的U373细胞的无细胞上清液中分析了IL-6的分泌。在酶标仪(iMark，Bio-Rad)上将校正波长设置为655nm，在405nm处测量样品。使用GraphPad Prism 7软件绘制并分析原始数据。
结果
NCIMB 42787在用LPS处理后显示出U373细胞中IL-6分泌的强烈减少(相对于阳性对照减少约50％)(参见图24A)。图24B表明，与培养基对照相比，在LPS存在下，NCIMB 42787引起U373细胞中IL-6分泌的显著减少。与培养基对照相比，NCIMB 42787并未显著增加IL-6的基础水平。
实施例22–用马氏巨球菌菌株NCIMB 42787处理后，暴露于TNFα的HMC3细胞中细胞因子分泌的调节
引言
用TNFα处理HMC3细胞，并且在用NCIMB 42787固定相细菌无细胞上清液处理后，测量IL-6的分泌。
材料和方法
使人小胶质HMC3细胞在补充有谷氨酰胺的含有15％热灭活FBS和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的EMEM培养基中生长。将HMC3细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中。将细胞留在CO2培养箱中静置48h。然后将细胞在空白EMEM中洗涤，并在具有10ng/ml TNF-α的2％FBS生长培养基中预处理1h。此后，将NCIMB 42787固定生长培养物的10％无细胞细菌上清液(如上所述分离)加入到TNF-α处理的和未处理的孔中，并在37℃下的CO2培养箱中孵育24h。收集无细胞的上清液，并在4℃下以10,000xg离心3min。将样品等分于1.5ml微管中，并保存在-80℃下用于hIL-6 ELISA(如上所述进行)。
统计分析
正态分布数据表示为平均值±SEM；单向Anova(Sidak多重比较检验)用于分析本文中提供的数据。在所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。
结果
NCIMB 42787显著降低TNF-α处理的HMC3细胞中的IL-6分泌(图24C)。有趣的是，在没有刺激物的情况下，此菌株不会诱导这些细胞分泌IL-6(图24C)。
因此，在某些实施方案中，本发明的组合物减少人小胶质细胞中的IL-6分泌。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗神经元炎症和脑炎性病症。
实施例23–马氏巨球菌NCIMB 42787对HEK-TLR4细胞中NF-κB启动子活化的抑制
引言
为了验证用NCIMB 42787进行的处理是否能够干扰由TLR4的接合诱导的NF-κB-Ap1启动子活性，将HEK-TLR4细胞单独或与LPS结合用NCIMB 42787的无细胞细菌上清液处理。
材料和方法
根据制造商的说明，培养稳定表达人TLR4(HEK-TLR4)的HEK293-Blue报告细胞。简而言之，将HEK-TLR4细胞维持在补充有有10％(v/v)热灭活FBS、4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml normocin、1X HEK-Blue选择培养基的DMEM 4.5g/L D-葡萄糖中。
简而言之，将细胞用PBS洗涤，在PBS中解离并收集在生长培养基中。将细胞以25,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。为了评估细菌菌株对LPS诱导NF-κB启动子活化的影响，在10％上清液(如上所述分离)存在或不存在下，用10ng/ml LPS处理细胞，并在CO2培养箱中孵育。在37℃和5％CO下处理22h，之后根据制造商的说明，使用QUANTI-blue溶液从细胞培养上清液中检测分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)活性。简而言之，收集20μl无细胞上清液，并通过与200μl无菌过滤的QUANTI-Blue检测培养基混合来分析SEAP的存在。在37℃下孵育2h后，在酶标仪(iMark microplate，Bio-Rad)上于655nm处测量光密度。
统计分析
正态分布数据表示为平均值±SEM；单向Anova(Sidak多重比较检验)用于分析本文中提供的数据。在所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。
结果和讨论
NCIMB 42787显著抑制由LPS诱导的NF-κB-Ap1启动子活化(图24D)。此菌株确实能独自诱导NF-κB-Ap1启动子活化。
在佐剂存在下NF-κB启动子活化的减少将减少由NF-κB级联触发的炎性反应。
实施例24–马氏巨球菌菌株显示出固有的抗氧化能力
引言
为了捕获NCIMB 42787上清液中存在的不同分子之间的协同和氧化还原相互作用，使用了三种旨在表征此菌株抗氧化潜能的生化测定：吲哚产生测定、使用2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)的总自由基捕获抗氧化参数(TRAP)测定和Trolox等效抗氧化能力(TEAC)测定。
吲哚衍生物具有抗氧化和细胞保护活性。吲哚测试用于确定生物体将氨基酸色氨酸转化形成吲哚的能力。可以通过利用颜色变化评估抗氧化剂还原氧化剂的能力，从标准单电子势预测抗氧化剂的自由基清除能力。TEAC测定测量了化合物或化合物混合物的抗氧化能力。
材料和方法
细菌菌株NCIMB42787生长到固定相。BCFS如上所述制备。
定量L-色氨酸引起的细菌吲哚产生
使用先前所述的测定来定量细菌吲哚产生70。将细菌培养至生长的固定相。将YCFA+培养基中的0.5mM吲哚用作此测定的阳性化学对照。使用24孔(未处理的)测定板进行吲哚测定。将HCl中的100mM色氨酸溶液分配到每个孔中以得到6mM的最终浓度。将1ml固定相细菌培养物加入到每个孔中，并再孵育48h。将测定板在室温(RT)下以3,500xg离心10min。保留上清液并弃去沉淀。在96孔板中，一式三份分配140μl上清液。加入140μl Kovac试剂，并使用BioRad iMark微孔板吸光度读取器在540nm下读取吸光度。通过绘制吸光度作为最终吲哚浓度(mM)的函数来制备标准曲线。使用从标准曲线的线性回归推断出的方程式来计算测试样品的吲哚浓度。
2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基测定
使用前，将BCFS在4℃下解冻约2h。使用无菌的5mM PBS pH 7在1.5ml微量离心管中以1:2稀释所有样品，得到1ml的最终体积。制备在5mM PBS、pH 7中的500μM Trolox储备溶液，以制成标准曲线。包括Lazaroid抗氧化剂U83836E(200μM在100％甲醇中)作为阳性对照。如前所述71略加修改，在96孔板中进行DPPH测定。简而言之，一式三份将10μl样品/标准品/对照加入到96孔板的对应孔中。将200μl 200μmol/L DPPH溶液加入到三个空孔中作为对照。将190μl 200μmol/L DPPH加入到样品/标准品/对照的孔中，并将板在RT下在黑暗中孵育30min。使用BioRad iMark微孔板吸光度读取器在515nm下读取吸光度。DPPH自由基清除活性的计算如下：
DPPH自由基清除活性(％)＝[1-(A样品-A空白)/A对照)]*稀释系数*100
其中A样品是样品+200μmol/L DPPH的平均吸光度，A对照是没有样品的甲醇DPPH的平均吸光度，并且A空白是YCFA培养基空白的平均吸光度。
2,2’-联氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)测定
根据制造商的说明，使用抗氧化测定试剂盒进行总抗氧化能力测定。简而言之，将所有样品在1X测定缓冲液中以1:4稀释。在96孔板中，一式三份加入10μl标准品/对照/样品。将20μl肌红蛋白工作溶液加入到所有标准品/对照/样品的孔中。向每个孔中加入150μlABTS底物溶液，并使用BioRad iMark微孔板吸光度读取器在405nm下测量吸光度。
统计分析
正态分布数据表示为平均值±SEM；单向Anova(Sidak多重比较检验)用于分析本文中提供的数据。在所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。
结果
NCIMB 42787显示出明显的吲哚形成能力(图25A)。此外，NCIMB 42787在DPPH测定中用作自由基清除剂，与Trolox(维生素E的水溶性抗氧化衍生物)的标准溶液相比，具有较高的总抗氧化能力(图25B)。
实施例25–马氏巨球菌菌株显示出使SH-SY5Y细胞免受氧化应激的保护作用
引言
评估了NCIMB 42787的细菌无细胞上清液保护U373、HMC3和视黄酸(RA)分化的SH-SY5Y细胞使其免受通过叔丁基过氧化氢(TBHP)处理而产生的活性氧(ROS)影响的能力。
材料和方法
为了评估ROS的产生，将U373细胞和HMC3以10,000个细胞/孔的密度接种在黑色96孔板中。将U373细胞静置72h，同时将HMC3静置48h。用预热的PBS洗涤细胞，并在含2％FBS的生长培养基中用10μM DCFDA分子探针染色20min。然后，再次用预热的PBS洗涤细胞，并在10％BCFS存在或不存在下，用100μM TBHP处理2h。
使神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞在补充有2mM L-谷氨酰胺、10％热灭活的FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的50％MEM和50％营养混合物F-12Ham培养基中生长。将细胞在生长培养基中以5,000个细胞/孔接种在黑色96孔板上，并置于CO2培养箱中。24h后，将培养基替换为分化培养基(含有1％FBS的生长培养基)和10μM视黄酸(RA)。每隔一天更换一次分化培养基，并在分化10天后使用细胞。在第10天，用预热的PBS洗涤细胞，并在含1％FBS的生长培养基中用10μM DCFDA分子探针染色20min。然后，再次用预热的PBS洗涤细胞，并在存在或不存在10％BCFS的情况下，用100μM TBHP处理2h。
使用TECAN平板读数器在激发485nm/发射530nm下测量荧光强度。使用GraphPadPrism 7软件绘制并分析原始数据。
结果
在分化的SH-SY5Y细胞中，NCIMB 42787处理导致免受由TBHP诱导的ROS影响的显著保护(图25F)。
实施例26–马氏巨球菌菌株产生丁酸、戊酸和己酸
材料和方法
根据De Baere等72的方法，从YCFA+和加标有SCFA的标准混合物(40mM乙酸和20mM甲酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸)的YCFA+中进行SCFA提取。
SCFA的HPLC分析
根据De Baere等72的方法稍加修改进行SCFA的HPLC检测和定量。简而言之，使用配备有Waters光电二极管阵列(PDA)检测器2998的Waters e2695 HPLC系统(WatersLimited，Elstree，UK)进行HPLC分析。使用
Figure BDA0002769938050000941
HSS T3 3.5μm 4.6x150mm LC柱(Waters Limited,Elstree,UK)对SCFA标准品、从MRx0005和MRx0029 BCFS提取的SCFA以及MRx0005和MRx0029己烷、乙醚、乙酸乙酯、乙腈和甲醇提取物进行HPLC分析。使用被设置为200-800nm分析波长的光电二极管阵列检测器(PDA)进行LC分析。在210nm处进行SCFA检测和定量。流动相包括在HPLC水中的25mM磷酸钠缓冲液(使用磷酸(A)和乙腈(B)将pH调节至3.0)。使用具有以下梯度的溶剂系统来运行用于SCFA检测和定量的LC方法：t0′A＝95％，B＝5％；t10′A＝95％，B＝5％；t30′A＝30％，B＝70％；t31′A＝0％，B＝100％；t36′A＝0％，B＝100％；t38′A＝5％，B＝95％；t60′A＝5％，B＝95％；流量＝1ml/min。
通过注入20μl的SCFA的两倍连续稀释液(40mM乙酸和20mM甲酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸)，来为每个SCFA制备七点校准曲线。使用以下公式计算定量-提取效率：
[加标并提取的YCFA+中的SCFA]/[未加标提取的YCFA+中的SCFA]
提取效率用于确定每个样品中单个SCFA的浓度。通过减去未加标的培养基对照中存在的对应SCFA的量来计算特定SCFA的产生。
靶向代谢组学：细菌代谢物和脂肪酸分析
通过MS-Omics(Copenhagen,Denmark)进行样品分析。通过从每个样品中取等分试样来创建混合的汇集样品(QC样品)。在整个序列中以定期间隔分析此样品。通过对QC样品进行至少两个水平的加标来测试定量化合物的基质效应。
对于GC代谢物分析，使用Smart等73所述方案的稍加修改版本，将样品用氯甲酸甲酯衍生化。所有样品均按随机顺序进行分析。使用与四极检测器(59977B，Agilent)偶联的GC(7890B，Agilent)进行分析。使用Chemstation(Agilent)将原始数据转换为netCDF格式，然后使用Johnsen等74所述的PARADISe软件在Matlab R2014b(Mathworks，Inc.)中将数据导入并处理。
对于SCFA分析，使用盐酸将样品酸化，并添加氘标记的内标。使用安装在与四极杆检测器(59977B,Agilent)偶联的GC(7890B,Agilent)中的高极性色谱柱(ZebronTM ZB-FFAP,GC Cap.Column 30m X 0.25mm X 0.25μm)进行分析。使用Chemstation(Agilent)将原始数据转换为netCDF格式，然后使用Johnsen等74所述的PARADISe软件在Matlab R2014b(Mathworks，Inc.)中将数据导入并处理。
结果
使用靶向代谢组学进行的脂肪酸分析表明，NCIMB 42787产生均呈直链和支链形式(C4-C6)的丁酸(butanoic/butyric)、戊酸(pentanoic/valeric)和己酸(hexanoic/caproic)(图26A)。此外，在NCIMB42787无细胞上清液中，增加4-羟基-苯乙酸:培养基的比率。使用无细胞上清液的HPLC分析来监测由NCIMB 42787产生的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸(基于相关SCFA的保留时间和吸光度光谱)。在图26C中报告了重叠到为SCFA提取的NCIMB 42787无细胞上清液的SCFA标准样品的代表性色谱图。HPLC分析证实NCIMB 42787产生丁酸、戊酸和己酸。
实施例27–含有丁酸酯的马氏巨球菌甲醇级分在U373细胞中显示出抗炎活性
为了研究SCFA在减少IL-6分泌中的作用，用浓度递增的丁酸钠(SB)、戊酸钠(SV)和己酸(HA)处理U373细胞。
方法
如上所述制备U373细胞。将细胞用上述1μg/ml LPS预处理1h，并在37℃和5％CO2下孵育。预孵育1h后，将细胞从CO2培养箱中移出，并用浓度递增的新鲜制备的丁酸钠(SB)、戊酸钠(SV)和己酸(HA)处理。
统计分析
正态分布数据表示为平均值±SEM；单向Anova(Sidak多重比较检验)用于分析本文中提供的数据。在所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。
结果和讨论
所测试的浓度覆盖了在无细胞上清液中测量的不同脂肪酸的浓度范围，并考虑到在基于细胞的测定中仅使用了10％的上述上清液。仅SB以浓度依赖性方式抑制U373细胞中LPS诱导的IL-6分泌(图27A)。用LPS攻击后，HA不会抑制IL-6分泌。所测试的SFCA中没有一种自身诱导高于基础水平(未处理的细胞对照)的IL-6分泌。仅SB(在测试的最高浓度下)降低了IL-6的基础水平(图27A和图27B)。在存在和不存在LPS的情况下，三种SCFA的重构混合物均可以再现NCIMB 42787无细胞上清液的生物活性。
因此，在某些实施方案中，丁酸的产生驱动IL-6分泌的减少。以这种方式，在某些实施方案中，本发明的细菌菌株通过产生丁酸来驱动IL-6分泌的减少，可用于治疗炎性或自身免疫性病症。
实施例28–由NCIMB 42787产生的SCFA至少部分负责抗炎活性
引言
为了进一步确认NCIMB 42787的抗炎活性是否至少部分是由于SCFA，将无细胞的细菌上清液用极性递增的不同溶剂进行分馏。对此菌株上清液的脱蛋白化(de-proteinased)粗提物(己烷，F5；乙醚，F4；乙酸乙酯，F3；乙腈，F4；甲醇，F1)进行HPLC分析，以分析NCIMB 42787固定相无细胞上清液的生化复杂性，以及基于极性和溶解度来亚分馏化合物。
方法
顺序溶剂提取-粗提取物的制备
依次用HPLC级己烷(HEX)、乙醚(DE)、乙酸乙酯(EtOAc)、乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)来提取NCIMB 42787菌株BCFS和YCFA+(培养基对照)的三个生物学重复。简而言之，将20mlBCFS放入玻璃瓶中，并在室温(RT)下在旋转摇床(70rpm)上的20ml HEX中提取30min。对每个BCFS和YCFA+培养基对照总共进行三次提取。然后将剩余的水层在RT下在MX-RD-Pro旋转摇床(70rpm)上的20ml DE、EtOAc中提取30min，共提取三次。在不超过30℃的温度下，在装有V-300真空泵的R-300旋转蒸发仪(Büchi,Flawil,Switzerland)中减压干燥每种样品的合并提取物。将所得提取物重新溶解于2ml的对应溶剂中，并等分于四个1.5ml Eppendorf管中(每个500μl对应于5ml原始样品)。然后将剩余的水层在RT下在MX-RD-Pro旋转摇床(70rpm)上的20ml DE、EtOAc中提取30min，共提取三次。在不超过30℃的温度下，在装有V-300真空泵的R-300旋转蒸发仪(Büchi,Flawil,Switzerland)中减压干燥每种样品的合并提取物。将所得提取物重新溶解于2ml的对应溶剂中，并等分于四个1.5ml Eppendorf管中(各自500μl对应于5ml原始样品)。
使用R-300旋转蒸发仪将剩余的水层蒸发至干。将所得的干燥提取物在20ml ACN中提取30min，共提取3次。将ACN提取物合并，使用旋转蒸发仪蒸发至干，再溶解于2ml ACN中，并等分于四个1.5ml Eppendorf管中(各自500μl)。然后将剩余的干燥提取物(所述提取物的ACN不溶部分)在20ml MeOH中提取30min，共提取3次。将MeOH提取物合并，使用R-300旋转蒸发仪蒸发至干，再溶解于2ml MeOH中，并等分于四个1.5ml Eppendorf管中(各自500μl)。
将粗提取物的等分试样在-20℃下保存过夜，以诱导蛋白质组分的沉淀。过夜沉淀后，将每个等分试样以10,000xg离心6min，然后转移至新的2ml管中。重复过夜沉淀三次后，将提取物在RVC 2-18 CDPlus speedvac(Christ,Osterode am Harz,Germany)中干燥并称重。将每种提取物的所有干燥等分试样保存在-80℃下直至进一步使用。
处理
如上所述制备U373细胞。用上述1μg/ml LPS将细胞预处理1h。然后，将细胞从CO2培养箱中移出，并用100μl不同级分处理。来自培养基的级分用作对照。处理后24h收集无细胞上清液，并通过ELISA分析IL-6分泌(如上所述)。
统计分析
正态分布数据表示为平均值±SEM；单向Anova(Sidak多重比较检验)用于分析本文中提供的数据。在所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。
结果
HPLC分析证实了脱蛋白化上清液中存在的化合物的选择性提取和粗分馏。NCIMB42787的甲醇级分F1减少了IL-6的产生，并且似乎概括了未分馏的上清液的活性，进一步表明丁酸酯的存在与此菌株的抗炎活性相关联(参见图28A)。
在没有LPS的情况下，仅未分馏的NCIMB 42787保留其诱导IL-6的能力(图28B)。
实施例29–NCIMB 42787显著减少受刺激的脾细胞产生TNFα
针对在从BALB/c小鼠分离并用LPS或ConA刺激的脾细胞中产生免疫标志物的功效进行活体生物治疗菌株的离体筛选。
图29显示了本发明的组合物显著减少促炎细胞因子TNFα产生的能力。TNFα触发显著的炎性反应，因此减少产生这种细胞因子的能力将减少炎症。
因此，在某些实施方案中，本发明的组合物驱动TNFα水平的降低。在某些实施方案中，鉴于TNFα的减少，本发明的组合物是治疗上有益的。
实施例30–以保藏号NCIMB 43385保藏的巨球菌菌株显著增加了海马和杏仁核中糖皮质激素受体的表达
向BALB/c小鼠施用活体生物治疗剂，并使用qPCR分离组织以用于基因表达分析。
图30表明，NCIMB 43385触发了海马和杏仁核两者中的糖皮质激素受体(Nr3c1)的表达增加。
糖皮质激素在治疗慢性炎性病状中的用途是众所周知的，特别是鉴于它们在抑制促炎细胞因子中的作用。此外，糖皮质激素途径已经在癌症中得到治疗性使用，因为它可以触发抗增殖和抗血管生成反应。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物触发糖皮质激素受体的表达增加。在其他实施方案中，由于糖皮质激素受体的表达增加，本发明的组合物对治疗炎性病症是治疗上有益的。在其他实施方案中，由于促进了抗增殖和/或抗血管生成反应的糖皮质激素受体的表达增加，本发明的组合物对治疗癌症是治疗上有益的。
序列
SEQ ID NO:1(马氏巨球菌菌株MRx0029的共有16S rRNA序列)
Figure BDA0002769938050001011
qPCR所用的引物
Figure BDA0002769938050001012
TPH1和β-肌动蛋白的引物序列
Figure BDA0002769938050001013
SLC6A4和β-肌动蛋白的引物序列
Figure BDA0002769938050001014
SEQ ID NO:14(以保藏号NCIMB 43385保藏的巨球菌菌株的共有16S rRNA序列)
Figure BDA0002769938050001021
SEQ ID NO:15(以保藏号NCIMB 43388保藏的马氏巨球菌菌株的共有16S rRNA序列)
Figure BDA0002769938050001031
SEQ ID NO:16(以保藏号NCIMB 43389保藏的马氏巨球菌菌株的共有16S rRNA序列)
Figure BDA0002769938050001032
Figure BDA0002769938050001041
SEQ ID NO:17(以保藏号NCIMB 43386保藏的巨球菌菌株的共有16S rRNA序列)
Figure BDA0002769938050001042
Figure BDA0002769938050001051
SEQ ID NO:18(以保藏号NCIMB 43387保藏的巨球菌菌株的共有16S rRNA序列)
Figure BDA0002769938050001052
qPCR所用的引物
Figure BDA0002769938050001053
Figure BDA0002769938050001061
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PCT
(电子形式原件)
Figure BDA0002769938050001091
Figure BDA0002769938050001101
Figure BDA0002769938050001111
序列表
<110> 4D制药研究有限公司(4D PHARMA RESEARCH LIMITED)
<120> 包含细菌菌株的组合物
<130> P073037WO
<141> 2019-05-13
<150> 18171893.3
<151> 2018-05-11
<150> 18178136
<151> 2018-06-15
<150> 1810386.1
<151> 2018-06-25
<150> 1813460.1
<151> 2018-08-17
<150> 1817642.0
<151> 2018-10-29
<150> 1820264.8
<151> 2018-12-12
<150> 1820256.4
<151> 2018-12-12
<160> 22
<170> SeqWin2010, version 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 马氏巨球菌菌株MRx0029的共有16S rRNA序列(consensus 16S rRNA sequencefor Megasphaera massiliensis strain MRx0029)
<400> 1
tgagaagctt gcttcttatc gattctagtg gcaaacgggt gagtaacgcg taagcaacct 60
gcccttcaga tggggacaac agctggaaac ggctgctaat accgaatacg ttctttccgc 120
cgcatgacgg gaagaagaaa gggaggcctt cgggctttcg ctggaggagg ggcttgcgtc 180
tgattagcta gttggagggg taacggccca ccaaggcgac gatcagtagc cggtctgaga 240
ggatgaacgg ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300
ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgaacg atgacggcct 360
tcgggttgta aagttctgtt atatgggacg aacaggacat cggttaatac ccggtgtctt 420
tgacggtacc gtaagagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480
ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggcg cgcaggcggc atcgcaagtc 540
ggtcttaaaa gtgcggggct taaccccgtg aggggaccga aactgtgaag ctcgagtgtc 600
ggagaggaaa gcggaattcc tagtgtagcg gtgaaatgcg tagatattag gaggaacacc 660
agtggcgaaa gcggctttct ggacgacaac tgacgctgag gcgcgaaagc caggggagca 720
aacgggatta gataccccgg tagtcctggc cgtaaacgat ggatactagg tgtaggaggt 780
atcgactcct tctgtgccgg agttaacgca ataagtatcc cgcctgggga gtacggccgc 840
aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagta tgtggtttaa 900
ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagc cttgacattg attgctacgg aaagagattt 960
ccggttcttc ttcggaagac aagaaaacag gtggtgcacg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tcttctgttg ccagcacctc 1080
gggtggggac tcagaagaga ctgccgcaga caatgcggag gaaggcgggg atgacgtcaa 1140
gtcatcatgc cccttatggc ttgggctaca cacgtactac aatggctctt aatagaggga 1200
agcgaaggag cgatccggag caaaccccaa aaacagagtc ccagttcgga ttgcaggctg 1260
caactcgcct gcatgaagca ggaatcgcta gtaatcgcag gtcagcatac tgcggtgaat 1320
acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga aagtcattca cacccgaagc 1380
cggtgaggca accgcaag 1398
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> GPR109a qPCR正向引物(GPR109a qPCR forward primer)
<400> 2
atgttggcta tgaaccgcca g 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> GPR109a qPCR反向引物(GPR109a qPCR reverse primer)
<400> 3
gctgctgtcc gattggaga 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> TPH1正向引物(TPH1 forward primer)
<400> 4
aaagagcgta caggtttttc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> TPH1反向引物(TPH1 reverse primer)
<400> 5
gtctcacata ttgagtgcag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> TPH2正向引物(TPH2 forward primer)
<400> 6
cactattgtg acgctgaatc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> TPH2反向引物(TPH2 reverse primer)
<400> 7
agctcagaac catacatgag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> β-肌动蛋白正向引物(Beta-actin forward primer)
<400> 8
gatcaagatc attgctcctc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> β-肌动蛋白反向引物(Beta-actin reverse primer)
<400> 9
ttgtcaagaa agggtgtaac 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> SLC6A4正向引物(SLC6A4 forward primer)
<400> 10
aatctgccga ttttcaaag 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> SLC6A4反向引物(SLC6A4 reverse primer)
<400> 11
gtgttgtagt aggaagcaat g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> β-肌动蛋白正向引物(Beta-actin forward primer)
<400> 12
gatcaagatc attgctcctc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> β-肌动蛋白反向引物(Beta-actin reverse primer)
<400> 13
ttgtcaagaa agggtgtaac 20
<210> 14
<211> 1409
<212> DNA
<213> 以保藏号NCIMB 43385保藏的巨球菌菌株的共有16S rRNA序列(consensus 16SrRNA sequence for the Megasphaera strain deposited under accession numberNCIMB 43385)
<400> 14
ggctggttcc ttgcggttgc ctcaccggct tcgggtgtga atgactttcg tggtgtgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagta tgctgacctg cgattactag 120
cgattcctgc ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc gaactgggac tctgtttttg 180
gggtttgctc cggatcgctc cttcgcttcc ctctattaag agccattgta gtacgtgtgt 240
agcccaagcc ataaggggca tgatgacttg acgtcatccc cgccttcctc cgcattgtct 300
gcggcagtct cttctgagtc cccaccctta gtgctggcaa cagaagatag gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccgt gcaccacctg 420
ttttcttgtc ttccgaagaa gaaccggaaa tctctttccg tagcaatcaa tgtcaaggct 480
tggtaaggtt cttcgcgttg cgtcgaatta aaccacatac tccaccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggga tacttattgc 600
gttaactccg gcacagaagg agtcgatacc tcctacacct agtatccatc gtttacggcc 660
aggactaccg gggtatctaa tcccgtttgc tcccctggct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720
gtcgtccaga aagccgcttt cgccactggt gttcctccta atatctacgc atttcaccgc 780
tacactagga attccgcttt cctctccgac actcgagctt cacagtttcg gtcccctcac 840
ggggttaagc cccgcacttt taagaccgac ttgcgatgcc gcctgcgcgc cctttacgcc 900
caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960
ccgtggcttt ctcttacggt accgtcaggg ataacgggta ttgaccgcta tcctgttcgt 1020
cccatataac agaactttac aacccgaagg ccgtcatcgt tcacgcggcg ttgctccgtc 1080
agactttcgt ccattgcgga agattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140
tctcagtccc aatgtggccg ttcatcctct cagaccggct actgatcgtc gccttggtgg 1200
gccgttaccc ctccaactag ctaatcagac gcaagcccct cctccagcga aagcccgaag 1260
gcctcccttt cttcatcccg tcatgcggcg gaaagaacgt attcggtatt agcagccgtt 1320
tccagctgtt gtccccatct gaagggcagg ttgcttacgc gttactcacc cgtttgccac 1380
tcgaattgat aagaagcaag cttctcatc 1409
<210> 15
<211> 1415
<212> DNA
<213> 以保藏号NCIMB 43388保藏的马氏巨球菌菌株的共有16S rRNA序列(consensus16S rRNA sequence for the Megasphaera massiliensis strain deposited underaccession number NCIMB 43388)
<400> 15
ggctggttcc ttgcggttgc ctcaccggct tcgggtgtga atgactttcg tggtgtgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagta tgctgacctg cgattactag 120
cgattcctgc ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc gaactgggac tctgtttttg 180
gggtttgctc cggatcgctc cttcgcttcc ctctattaag agccattgta gtacgtgtgt 240
agcccaagcc ataaggggca tgatgacttg acgtcatccc cgccttcctc cgcattgtct 300
gcggcagtct cttctgagtc cccacccgag gtgctggcaa cagaagatag gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccgt gcaccacctg 420
ttttcttgtc ttccgaagaa gaaccggaaa tctctttccg tagcaatcaa tgtcaaggct 480
tggtaaggtt cttcgcgttg cgtcgaatta aaccacatac tccaccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggga tacttattgc 600
gttaactccg gcacagaagg agtcgatacc tcctacacct agtatccatc gtttacggcc 660
aggactaccg gggtatctaa tcccgtttgc tcccctggct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720
gtcgtccaga aagccgcttt cgccactggt gttcctccta atatctacgc atttcaccgc 780
tacactagga attccgcttt cctctccgac actcgagctt cacagtttcg gtcccctcac 840
ggggttaagc cccgcacttt taagaccgac ttgcgatgcc gcctgcgcgc cctttacgcc 900
caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960
ccgtggcttt ctcttacggt accgtcaaag acaccgggta ttaaccgatg tcctgttcgt 1020
cccatataac agaactttac aacccgaagg ccgtcatcgt tcacgcggcg ttgctccgtc 1080
agactttcgt ccattgcgga agattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140
tctcagtccc aatgtggccg ttcatcctct cagaccggct actgatcgtc gccttggtgg 1200
gccgttaccc ctccaactag ctaatcagac gcaagcccct cctccagcga aagcccgaag 1260
gcctcccttt cttcttcccg tcatgcggcg gaaagaacgt attcggtatt agcagccgtt 1320
tccagctgtt gtccccatct gaagggcagg ttgcttacgc gttactcacc cgtttgccac 1380
tagaatcgat aagaagcaag cttctcatgt cttct 1415
<210> 16
<211> 1433
<212> DNA
<213> 以保藏号NCIMB 43389保藏的马氏巨球菌菌株的共有16S rRNA序列(consensus16S rRNA sequence for the Megasphaera massilliensis strain deposited underaccession number NCIMB 43389)
<400> 16
cgacggctgg ttccttgcgg ttgcctcacc ggcttcgggt gtgaatgact ttcgtggtgt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agtatgctga cctgcgatta 120
ctagcgattc ctgcttcatg caggcgagtt gcagcctgca atccgaactg ggactctgtt 180
tttggggttt gctccggatc gctccttcgc ttccctctat taagagccat tgtagtacgt 240
gtgtagccca agccataagg ggcatgatga cttgacgtca tccccgcctt cctccgcatt 300
gtctgcggca gtctcttctg agtccccacc cgaggtgctg gcaacagaag ataggggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccgtgcacca 420
cctgttttct tgtcttccga agaagaaccg gaaatctctt tccgtagcaa tcaatgtcaa 480
ggcttggtaa ggttcttcgc gttgcgtcga attaaaccac atactccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc gggatactta 600
ttgcgttaac tccggcacag aaggagtcga tacctcctac acctagtatc catcgtttac 660
ggccaggact accggggtat ctaatcccgt ttgctcccct ggctttcgcg cctcagcgtc 720
agttgtcgtc cagaaagccg ctttcgccac tggtgttcct cctaatatct acgcatttca 780
ccgctacact aggaattccg ctttcctctc cgacactcga gcttcacagt ttcggtcccc 840
tcacggggtt aagccccgca cttttaagac cgacttgcga tgccgcctgc gcgcccttta 900
cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctctta cggtaccgtc aaagacaccg ggtattaacc gatgccctgt 1020
tcgtcccata taacagaact ttacaacccg aaggccgtca tcgttcacgc ggcgttgctc 1080
cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140
cgtgtctcag tcccaatgtg gccgttcatc ctctcagacc ggctactgat cgtcgccttg 1200
gtgggccgtt acccctccaa ccagctaatc agacgcaagc ccctcctcca gcgaaagccc 1260
gaaggcctcc ctttcttctt cccgtcatgc ggcggaaaga acgtattcgg tattagcagc 1320
cgtttccagc tgttgtcccc atctgaaggg caggttgctt acgcgttact cacccgtttg 1380
ccactagaat cgataagaag caagcttctc atgtcttctc gttcgacttg cat 1433
<210> 17
<211> 1431
<212> DNA
<213> 以保藏号NCIMB 43386保藏的巨球菌菌株的共有16S rRNA序列(consensus 16SrRNA sequence for the Megasphaera strain deposited under accession numberNCIMB 43386)
<400> 17
cgacggctgg ttccttgcgg ttgcctcacc ggcttcgggt gtgaatgact ttcgtggtgt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agtatgctga cctgcgatta 120
ctagcgattc ctgcttcatg caggcgagtt gcagcctgca atccgaactg ggactctgtt 180
tttggggttt gctccggatc gctccttcgc ttccctctat taagagccat tgtagtacgt 240
gtgtagccca agccataagg ggcatgatga cttgacgtca tccccgcctt cctccgcatt 300
gtctgcggca gtctcttctg agtccccacc cttagtgctg gcaacagaag ataggggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccgtgcacca 420
cctgttttct tgtcttccga agaagaaccg gaaatctctt tccgtagcaa tcaatgtcaa 480
ggcttggtaa ggttcttcgc gttgcgtcga attaaaccac atactccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc gggatactta 600
ttgcgttaac tccggcacag aaggagtcga tacctcctac acctagtatc catcgtttac 660
ggccaggact accggggtat ctaatcccgt ttgctcccct ggctttcgcg cctcagcgtc 720
agttgtcgtc cagaaagccg ctttcgccac tggtgttcct cctaatatct acgcatttca 780
ccgctacact aggaattccg ctttcctctc cgacactcga gcttcacagt ttcggtcccc 840
tcacggggtt aagccccgca cttttaagac cgacttgcga tgccgcctgc gcgcccttta 900
cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctctta cggtaccgtc agggataacg ggtattgacc gctatcctgt 1020
tcgtcccata taacagaact ttacaacccg aaggccgtca tcgttcacgc ggcgttgctc 1080
cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140
cgtgtctcag tcccaatgtg gccgttcatc ctctcagacc ggctactgat cgtcgccttg 1200
gtgggccgtt acccctccaa ctagctaatc agacgcaagc ccctcctcca gcgaaagccc 1260
gaaggcctcc ctttcttcat cccgtcatgc ggcggaaaga acgtattcgg tattagcagc 1320
cgtttccagc tgttgtcccc atctgaaggg caggttgctt acgcgttact cacccgtttg 1380
ccactcgaat tgataagaag caagcttctc atctcttctc gttcgactgc a 1431
<210> 18
<211> 1434
<212> DNA
<213> 以保藏号NCIMB 43387保藏的巨球菌菌株的共有16S rRNA序列(consensus 16SrRNA sequence for the Megasphaera strain deposited under accession numberNCIMB 43387)
<400> 18
tcgaacggct ggttccttgc ggttgcctca ccggcttcgg gtgtgaatga ctttcgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcagtatgct gacctgcgat 120
tactagcgat tcctgcttca tgcaggcgag ttgcagcctg caatccgaac tgggactctg 180
tttttggggt ttgctccgga tcgctccttc gcttccctct attaagagcc attgtagtac 240
gtgtgtagcc caagccataa ggggcatgat gacttgacgt catccccgcc ttcctccgca 300
ttgtctgcgg cagtctcttc tgagtcccca cccttagtgc tggcaacaga agataggggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccgtgcac 420
cacctgtttt cttgtcttcc gaagaagaac cggaaatctc tttccgtagc aatcaatgtc 480
aaggcttggt aaggttcttc gcgttgcgtc gaattaaacc acatactcca ccgcttgtgc 540
gggcccccgt caattccttt gagtttcagc cttgcggccg tactccccag gcgggatact 600
tattgcgtta actccggcac agaaggagtc gatacctcct acacctagta tccatcgttt 660
acggccagga ctaccggggt atctaatccc gtttgctccc ctggctttcg cgcctcagcg 720
tcagttgtcg tccagaaagc cgctttcgcc actggtgttc ctcctaatat ctacgcattt 780
caccgctaca ctaggaattc cgctttcctc tccgacactc gagcttcaca gtttcggtcc 840
cctcacgggg ttaagccccg cacttttaag accgacttgc gatgccgcct gcgcgccctt 900
tacgcccaat aattccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960
agttagccgt ggctttctct tacggtaccg tcagggataa cgggtattga ccgctatcct 1020
gttcgtccca tataacagaa ctttacaacc cgaaggccgt catcgttcac gcggcgttgc 1080
tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg 1140
gccgtgtctc agtcccaatg tggccgttca tcctctcaga ccggctactg atcgtcgcct 1200
tggtgggccg ttacccctcc aactagctaa tcagacgcaa gcccctcctc cagcgaaagc 1260
ccgaaggcct ccctttcttc atcccgtcat gcggcggaaa gaacgtattc ggtattagca 1320
gccgtttcca gctgttgtcc ccatctgaag ggcaggttgc ttacgcgtta ctcacccgtt 1380
tgccactcga attgataaga agcaagcttc tcatctcttc tcgttcgact tgca 1434
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> NSE正向引物(NSE forward primer)
<400> 19
ccctgtatcg taagaacggt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> NSE反向引物(NSE reverse primer)
<400> 20
gccaccattg atcacgttga 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> GAPDH正向引物(GAPDH forward primer)
<400> 21
ggtatcgtgg aaggactcat g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> GAPDH反向引物(GAPDH reverse primer)
<400> 22
atgccagtga gcttcccgtt c 21

Claims (19)

1.一种包含巨球菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防自身免疫性或炎性病症或癌症。
2.如权利要求1所述的组合物，其用于治疗哮喘、关节炎、银屑病、糖尿病、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病，炎性肠病，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎；或前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或胃癌。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防由I类HDAC活性介导的疾病或病状。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于在治疗由I类HDAC活性介导的病状中选择性抑制I类HDAC活性的方法。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于在由HDAC1、HDAC2或HDAC3活性介导的疾病或病状中选择性抑制HDAC1、HDAC2或HDAC3。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于具有HDAC活性升高的患者。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与巨球菌属的细菌菌株的16S rRNA序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16SrRNA序列。
8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:14、15、16、17或18中的任一者具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA基因序列，或者其中所述细菌菌株具有由SEQ ID NO:14、15、16、17或18中的任一者表示的16s rRNA基因序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株是马氏巨球菌。
10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA基因序列，或者其中所述细菌菌株具有由SEQ ID NO:1表示的16s rRNA基因序列。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于口服施用。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述细菌菌株被冻干。
14.一种包含如前述权利要求中任一项所述的组合物的食物产品，其用于如前述权利要求中任一项所述的使用。
15.一种治疗或预防由组蛋白脱乙酰酶活性介导的疾病或病状的方法，其包括向有需要的患者施用包含巨球菌属的细菌菌株的组合物。
16.一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞。
17.一种以保藏号NCIMB 42787保藏的马氏巨球菌菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗，优选地用于如权利要求1-4之一所定义的疾病或病状的治疗或预防。
18.一种用于治疗的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:14、15、16、17或18中的任一者具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA序列。
19.一种具有由SEQ ID NO:14、15、16、17或18中的任一者表示的16S rRNA序列的细菌菌株，其用于治疗。
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