KR20210008391A - 세균 균주를 포함하는 조성물 - Google Patents

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파르테나 포티아두
에이미 베스 홀트
수아드 아메드
안나 에토레
사만다 율리
테드 디난
존 크라이안
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Abstract

본 발명은 개체에서 면역계를 자극하는 데 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

세균 균주를 포함하는 조성물
기술 분야
본 발명은 포유류 소화관으로부터 단리된 세균 균주를 포함하는 조성물, 그리고 질환, 특히 암의 치료에서 및 특히, 질환의 치료에서 면역계를 자극하기 위한 이런 조성물의 용도의 분야이다.
발명의 배경
인간 장은 자궁내에서 무균인 것으로 생각되지만, 이것은 출생 직후 매우 다양한 모계 미생물 및 환경 미생물에 노출된다. 그 후, 미생물 집락형성과 천이의 동적 기간이 발생하는데, 이것은 인자, 예컨대 전달 방식, 환경, 식이 및 숙주 유전자형에 의해 영향을 받고, 이들 모두 특히, 어린 시절 동안 소화관 미생물총의 조성에 영향을 준다. 차후에, 미생물총은 안정되고 성인과 유사해진다 [1]. 인간 소화관 미생물총은 2가지 주요 세균 부문, 박테로이데테스 (Bacteroidetes) 및 피르미쿠테스 (Firmicutes)에 본질적으로 속하는 500-1000개 이상의 상이한 계통형을 내포한다 [2]. 인간 소화관의 세균 집락형성으로부터 발생하는 성공적인 공생 관계는 매우 다양한 물질대사 기능, 구조 기능, 보호 기능 및 다른 유익한 기능을 산출하였다. 집락형성된 소화관의 증강된 대사 활동은 만약 그렇지 않으면 비소화성인 식이 성분이 분해되어, 숙주에 대한 중요한 영양소 공급원을 제공하는 부산물이 방출되도록 담보한다. 유사하게, 소화관 미생물총의 면역학적 중요성은 충분히 인식되고, 그리고 공생균의 도입 이후에 기능적으로 재구성되는 손상된 면역계를 갖는 무균 동물에서 예증된다 [3-5].
미생물총 조성에서 극적인 변화가 위장관 장애, 예컨대 염증성 장 질환 (IBD)에서 문서화되었다. 예를 들면, 클로스트리듐 (Clostridium) 클러스터 XIVa 세균의 수준은 IBD 환자에서 감소되는 반면, 대장균 (E. coli)의 숫자는 증가되는데, 이것은 소화관 내에서 공생체 및 유해균의 균형에서 변동을 암시한다 [6-9]. 흥미롭게도, 이러한 미생물 장내세균불균형은 또한, T 작동체 세포 개체군에서 불균형과 연관된다.
일정한 세균 균주가 동물 소화관에 대해 가질 수 있는 잠재적인 긍정적인 효과에 비추어, 다양한 질환의 치료에서 이용을 위한 다양한 균주가 제안되었다 (참조: 예를 들면, [10-13]). 또한, 대부분의 락토바실루스 (Lactobacillus) 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 균주를 포함하는 일정한 균주가 장에 직접적으로 연계되지 않는 다양한 염증 질환과 자가면역 질환을 치료하는 데 이용을 위해 제안되었다 (리뷰를 위해 [14] 및 [15]를 참조한다). 하지만, 상이한 질환 및 상이한 세균 균주 사이에 관계, 그리고 소화관에서 및 전신 수준에서 및 질환의 임의의 특정 유형에서 특정 세균 균주의 정확한 효과는 불량하게 특징화된다.
WO2015038731은 항균제 또는 프로바이오틱 작용제의 투여에 의해, 결장 생물막의 파괴에 의한 결장암을 치료하는 방법을 논의한다. 상기 출원에서는 프로바이오틱에서 이용될 수 있는 다수의 세균을 열거하지만, 결장암의 치료에서 임의의 세균의 효능에 관한 어떤 증명도 제공하지 못한다. 그 대신에, 상기 출원은 결장직장암에서 생물막의 진단 잠재력에 집중한다.
EMBL 데이터베이스 수탁 번호 XP002787383은 제안된 메가스파에라 (Megasphaera) 종의 16S rRNA 유전자 서열을 제공하고, 반면 EMBL 데이터베이스 수탁 번호 XP002787384는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 16S rRNA 유전자를 제공한다. 이들 문서는 단리된 균주의 유전체 분석을 상술하지만, 메가스파에라 (Megasphaera)의 치료적 유익성을 향한 어떤 보도도 제공하지 못한다.
Ahmed et al (Frontiers Cellular Neuroscience에 제출됨)은 장내 미생물총-유래된 세균 균주의 시험관내 특징화를 고려한다.
질환을 치료하는 새로운 방법이 당해 분야에서 요구된다. 장내 세균을 이용하는 새로운 요법이 개발될 수 있도록, 장내 세균의 잠재적 효과가 특징화되는 것이 또한 요구된다.
발명의 요약
본 발명자들은 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 이용될 수 있는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 새로운 조성물을 개발하였다.
본 발명은 이런 이유로, 개체에서 면역계를 자극하는 데 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 암, 예컨대 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신경모세포종, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종 및/또는 위암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 암, 예컨대 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 면역노화를 치료하거나, 예방하거나 또는 지연시키는 데 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 백신 어쥬번트로서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 세포 요법, 예컨대 CAR-T를 증강하는 데 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에서 이용된 세균은 수탁 번호 42787 하에 NCIMB에 기탁된 균주이다.
본 발명의 추가 넘버링된 구체예가 아래에 제공된다:
1. 개체에서 면역계를 자극하는 데 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물.
2. 암, 예컨대 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신경모세포종, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 위암, 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 구체예 1의 조성물.
3. 구체예 2에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 저해 활성을 갖는다.
4. 구체예 2 또는 구체예 3에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 조성물은 친염증성 사이토킨을 상향조절한다.
5. 소화관 장벽 투과성을 감소시키는 데 이용을 위한, 구체예 2-4 중에서 한 가지에 따른 이용을 위한 조성물.
6. 면역노화를 치료하거나, 예방하거나 또는 지연시키는 데 이용을 위한, 구체예 1의 조성물.
7. 백신 어쥬번트로서 이용을 위한, 구체예 1의 조성물.
8. 세포 요법, 예컨대 CAR-T를 증강하는 데 이용을 위한, 구체예 1의 조성물.
9. 카스파제 3, MAP2, IL-1β, IL-23 및/또는 TNF-α의 발현 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예의 조성물.
10. 세포 개체군에서 Tregs의 숫자 및/또는 백분율을 선별적으로 감소시키는 방법에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예의 조성물.
11. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다.
12. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 서열 번호:8, 9, 10, 11 또는 12 중에서 한 가지와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나, 또는 여기서 세균 균주는 서열 번호:8, 9, 10, 11 또는 12 중에서 한 가지에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다.
13. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주이다.
14. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 서열 번호:1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나, 또는 세균 균주는 서열 번호:1에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다.
15. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 수탁 번호 42787 하에 NCIMB에 기탁된 균주이다.
16. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 조성물은 경구 투여용이다.
17. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 조성물은 한 가지 또는 그 이상의 제약학적으로 허용가능한 부형제 또는 운반체를 포함한다.
18. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 동결 건조된다.
19. 임의의 선행하는 청구항의 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예의 조성물을 포함하는 식품 산물.
20. 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감소된 면역자극과 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 방법.
21. 구체예 1 내지 16 중 어느 것에서 규정된 세균 균주의 세포를 포함하는 조성물, 여기서 세포는 하나 또는 그 이상의 이종성 항원을 발현한다.
22. 구체예 21에 따른 조성물, 여기서 세포는 하나 또는 그 이상의 이종성 항원을 제시한다.
23. 백신으로서 이용을 위한, 구체예 21 또는 구체예 22에 따른 조성물.
24. 구체예 1 내지 18 중 어느 것에서 규정된 세균 균주의 세포, 여기서 세포는 하나 또는 그 이상의 이종성 항원을 발현한다.
25. 구체예 24에 따른 세포, 여기서 세포는 하나 또는 그 이상의 이종성 항원을 제시한다.
26. 백신으로서 이용을 위한, 구체예 24 또는 구체예 25에 따른 세포.
27. 요법에서 이용을 위한 세균 균주, 여기서 세균 균주는 서열 번호:8, 9, 10, 11 또는 12 중에서 한 가지와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다.
28. 요법에서 이용을 위한, 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12 중에서 한 가지에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주.
도면의 간단한 설명
도 1: β3 튜불린 발현의 수준: 면역염색 및 세포 영상화 (도 1a); 면역블롯팅 (도 1b)
도 2: MAP2 발현의 수준: 면역염색 및 세포 영상화 (도 2a); 면역블롯팅 (도 2b); 발현에서 배수 변화 (도 2c)
도 3: DRD2 발현에서 변화
도 4: Casp3 발현에서 변화
도 5: 세포 생존력에서 변화
도 6: CD4 T 보조 세포 (도 6a); CD4+ 활성화된 세포 (도 6b); Tregs 세포 (도 6c); CD8 세포독성 T 세포 (도 6d); CD8+ 활성화된 세포 (도 6e); B 세포 (도 6f); CD8/Treg 비율 (도 6g); 활성화된 CD8/Treg 비율 (도 6h)의 세포 표현형분석.
도 7: IL-1β (도 7a); TNF-α (도 7b); IL-23 (도 7c); IL-6 (도 7d); MIP-3α (도 7e); CXCL9 (도 7f); MCP-1 (도 7g); IL-10 (도 7h); GM-CSF (도 7i)의 사이토킨 분석.
도 8: 도 6에서 제시된 데이터에 대해 유세포분석법에 의해 면역 세포의 상이한 개체군 (CD4, CD8 및 CD19+ 세포)을 분석하는 데 이용된 게이팅 전략.
도 9: 인터류킨-8 (IL-8))의 분비.
도 10: 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 활성에서 변화
도 11a: 전체 세포 및 세포 용해물 히스톤 탈아세틸화효소 활성에서 균주-유도된 변화; 도 11b: 균주에 의한 대사산물 생산; 도 11c: 히스톤 탈아세틸화효소 활성에서 산-유도된 변화.
도 12a: HDAC1 저해; 도 12b: HDAC2 저해; 도 12c: HDAC3 저해.
도 13a: 부류 I HDACs의 저해; 도 13b: HDAC1의 저해; 도 13c: HDAC2의 저해; 도 13d: HDAC3의 저해.
도 14: 장관 장벽 기능에 대한 효과.
도 15: 톨 유사 수용체 4 (TLR-4)의 해마 발현에서 변화.
도 16: TNF-α의 해마 발현에서 변화.
도 17: 인터류킨-1β (IL-1β)의 해마 발현에서 변화.
도 18: 인터류킨-6 (IL-6)의 해마 발현에서 변화.
도 19: CD11b의 해마 발현에서 변화.
도 20: TLR-4의 편도 발현에서 변화.
도 21: CD11b의 편도 발현에서 변화.
도 22: IL-6의 편도 발현에서 변화.
도 23: TLR-4의 전전두엽 피질 발현에서 변화.
도 24: CD11b의 전전두엽 피질 발현에서 변화.
도 25: IL-6의 전전두엽 피질 발현에서 변화.
도 26: MRx0029가 투여된 생쥐로부터 생쥐 비장세포로부터 인터페론-γ 생산에 대한 효과
도 27: MRx0029가 투여된 생쥐로부터 생쥐 비장세포로부터 IL-1β 생산에 대한 효과
도 28: MRx0029가 투여된 생쥐로부터 생쥐 비장세포로부터 IL-6 생산에 대한 효과
도 29: MRx0029가 투여된 생쥐로부터 비장세포로부터 TNF-α 생산에 대한 효과
도 30: MRx0029가 투여된 생쥐로부터 비장세포로부터 CXCL1 생산에 대한 효과
도 31: GAPDH에 비하여, 다양한 처리 이후에 SKMEL2 세포주에서 MAP2의 유전자 발현. "YCFA" = YCFA+
도 32: 다양한 처리 이후에 SKMEL2 세포주의 클론원성 생존. "YCFA" = YCFA+
도 33: 다양한 처리 이후에 SKMEL2 세포주의 연한천 성장. "YCFA" = YCFA+
도 34: 다양한 처리 이후에 SKMEL2 세포주에서 ERK 신호전달 (인산화된 ERK1 및 2 (p44 및 p42)/ 총 ERK). "YCFA" = YCFA+
도 35: GAPDH에 비하여, 다양한 처리 이후에 SKMEL28 세포주에서 MAP2의 유전자 발현. "YCFA" = YCFA+
도 36: 다양한 처리 이후에 SKMEL28 세포주의 클론원성 생존. "YCFA" = YCFA+
도 37: 다양한 처리 이후에 SKMEL28 세포주의 연한천 성장. "YCFA" = YCFA+
도 38: 다양한 처리 이후에 SKMEL28 세포주에서 ERK 신호전달 (인산화된 ERK1 및 2 (p44 및 p42)/ 총 ERK). "YCFA" = YCFA+
도 39: GAPDH에 비하여, 다양한 처리 이후에 SKMEL31 세포주에서 MAP2의 유전자 발현. "YCFA" = YCFA+
도 40: 다양한 처리 이후에 SKMEL31 세포주의 클론원성 생존. "YCFA" = YCFA+
도 41: 다양한 처리 이후에 SKMEL31 세포주의 연한천 성장. "YCFA" = YCFA+
도 42: 다양한 처리 이후에 SKMEL31 세포주에서 ERK 신호전달 (인산화된 ERK1 및 2 (p44 및 p42)/ 총 ERK). "YCFA" = YCFA+
도 43: GAPDH에 비하여, 다양한 처리 이후에 451Lu 세포주에서 MAP2의 유전자 발현. "YCFA" = YCFA+
도 44: 다양한 처리 이후에 451Lu 세포주의 클론원성 생존. "YCFA" = YCFA+
도 45: 다양한 처리 이후에 451Lu 세포주의 연한천 성장. "YCFA" = YCFA+
도 46: 다양한 처리 이후에 451Lu 세포주에서 ERK 신호전달 (인산화된 ERK1 및 2 (p44 및 p42)/ 총 ERK). "YCFA" = YCFA+
도 47: GAPDH에 비하여, 다양한 처리 이후에 HT-29 세포주에서 MAP2의 유전자 발현. "YCFA" = YCFA+
도 48: 다양한 처리 이후에 HT-29 세포주의 클론원성 생존. "YCFA" = YCFA+
도 49a: 다양한 처리 이후에 HT-29 세포주의 연한천 성장. "YCFA" = YCFA+
도 49b: 다양한 처리 이후에 HT-29 세포주의 연한천 성장 (한천 평판의 사진). "YCFA" = YCFA+
도 50: 다양한 처리 이후에 HT29 세포주에서 ERK 신호전달 (인산화된 ERK1 및 2 (p44 및 p42)/ 총 ERK). "YCFA" = YCFA+
도 51: MAP-키나아제 경로의 개요 ([72]로부터).
도 52: MRx0029에 더하여 (a) 포르볼미리스테이트 처리가 없는 경우 및 (b) 이러한 처리가 있는 경우에, 분화된 Caco-2 세포에서 GPR109a RNA 발현. "YCFA" = YCFA+
도 53: (A) 조건부 배지와 함께 MRx0029 및 (B) MRx0029 단독에 의한, HT29 세포로부터 IL-8 분비의 유도.
도 54: 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 NCIMB 42787에 대한 대사산물 분석.
도 55: MRx0029 및 참조 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주에 대한 상층액에서 발레르산 생산.
도 56: MRx0029 및 참조 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주에 의한 유기 산 생산과 소비.
도 57: MRX029에 의한 NSE/에놀라아제 2의 억제. "YCFA" = YCFA+.
도 58: NCIMB 42787, NCIMB 43385, NCIMB 43388 및 NCIMB 43389에 의한 유기 산 생산과 소비.
도 59: NCIMB 42787 및 다른 기탁된 균주에 의한, U373 세포에서 IL-6 분비의 상향조절 (n=3).
도 60: NCIMB 42787, NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIMB 43386 및 NCIMB 43387에 의한 에놀라아제 2의 억제.
도 61a: NCIMB 42787 및 다른 기탁된 균주는 MAP2 발현을 증가시킨다; 도 61b 및 c: NCIMB 42787에 의한 사이토킨 수준 및 NFκB-AP1 프로모터의 조정.
도 62: NCIMB 42787은 부티르산, 발레르산 및 헥산산을 생산한다.
도 63: NCIMB 42787에 의해 생산된 대사산물의 면역자극 활성.
도 64: NCIMB 42787의 면역자극 활성에서 대사산물의 역할의 분석.
도 65: 메가스파에라 (Megasphaera) 균주 NCIMB 43387은 BALB/c 생쥐에서 결장 IDO-1 mRNA 발현에 영향을 준다.
도 66: 메가스파에라 (Megasphaera) 균주 NCIMB 43385 및 NCIMB 43387은 BALB/c 생쥐에서 결장 Tph1 mRNA 발현에 영향을 준다.
도 67: 메가스파에라 (Megasphaera) 균주 NCIMB 43385는 BALB/c 생쥐로부터 비장세포의 ConA 자극 시에 IFNγ 및 IL-6 생산을 조정한다.
도 68: 메가스파에라 (Megasphaera) 균주 NCIMB 43385는 BALB/c 생쥐의 뇌에서 IL-6과 CD11b 발현을 조정한다.
도 69: NCIMB 42787은 BALB/c 생쥐의 편도에서 TLR4 발현을 조정한다.
발명의 개시
세균 균주
본 발명의 조성물은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함한다. 실시예는 이러한 속의 세균이 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하는 데 유용하다는 것을 증명한다. 바람직한 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이다.
본 발명에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 종의 실례는 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii), 메가스파에라 세레비지애 (Megasphaera cerevisiae), 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis), 메가스파에라 인디카 (Megasphaera indica), 메가스파에라 파우시보란스 (Megasphaera paucivorans), 메가스파에라 수에시엔시스 (Megasphaera sueciensis) 및 메가스파에라 마이크로누시포르미스 (Megasphaera micronuciformis)를 포함한다. 본 발명에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 종의 추가 실례는 메가스파에라 헥사노이카 (Megasphaera hexanoica)이다. 메가스파에라 (Megasphaera)는 인간을 비롯하여, 반추 및 비반추 포유동물의 절대 혐기성, 유산염-발효, 위장관 미생물이다.
메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis)의 표준 균주는 NP3 (=CSUR P245=DSM 26228)이다 [16]. 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NP3의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 GenBank 수탁 번호는 JX424772.1이다.
실시예에서 검사된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 세균은 본원에서 균주 MRx0029로서 지칭된다. 검사된 MRx0029 균주에 대한 16S rRNA 서열은 서열 번호: 1에서 제공된다.
균주 MRx0029는 2017년 7월 13일자에 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 "메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029"로서 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고, 그리고 수탁 번호 NCIMB 42787이 배정되었다.
실시예에서 검사된 균주에 밀접하게 관련된 세균 균주 또한, 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:1와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:1에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다.
균주 MRx0029의 생물형인 세균 균주 또한, 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다. 생물형은 동일한 또는 매우 유사한 생리학적 및 생화학적 특징을 갖는 밀접하게 관련된 균주이다.
균주 MRx0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 균주 MRx0029에 대한 다른 뉴클레오티드 서열을 염기서열결정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 실제적으로 전체 유전체가 염기서열결정될 수 있고, 그리고 본 발명에서 이용을 위한 생물형 균주는 이의 전체 유전체의 적어도 80%에 걸쳐 (예를 들면, 이의 전체 유전체의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 전역에 걸쳐) 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 생물형 균주를 확인하는 데 이용을 위한 다른 적합한 서열은 hsp60 또는 반복 서열, 예컨대 BOX, ERIC, (GTG)5, 또는 REP 또는 [17]을 포함할 수 있다. 생물형 균주는 균주 MRx0029의 상응하는 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
대안으로, 균주 MRx0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 균주 MRx0029 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 이용함으로써, 예를 들면, 형광 증폭된 단편 길이 다형성 (FAFLP) 및 반복성 DNA 요소 (rep)-PCR 지문확인, 또는 단백질 프로파일링, 또는 부분적인 16S 또는 23S rDNA 염기서열결정을 이용함으로써 확인될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이런 기술은 다른 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주를 확인하는 데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 균주 MRx0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석 (ARDRA)에 의해 분석될 때, 예를 들면, Sau3AI 제한 효소를 이용할 때 균주 MRx0029와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다 (예시적인 방법 및 보도를 위해, 예를 들면 [18]을 참조한다). 대안으로, 생물형 균주는 균주 MRx0029와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로서 확인된다.
본 발명의 조성물과 방법에서 유용한 다른 메가스파에라 (Megasphaera) 균주, 예컨대 균주 MRx0029의 생물형은 실시예에서 설명된 검정을 비롯한, 임의의 적합한 방법 또는 전략을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 이용을 위한 균주는 세포 용해물 또는 전체 세포에 첨가하고, 그리고 MAP2 발현, DRD2 발현, 사이토킨 수준 또는 세포 생존을 검사함으로써 확인될 수 있다. 특히, 균주 MRx0029와 유사한 성장 패턴, 물질대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 세균 균주가 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 균주 MRx0029에 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 MAP2 발현, DRD2 발현, 사이토킨 수준 또는 세포 생존에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. 생물형 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 히스톤 탈아세틸화효소 저해 활성에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 수 있는데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 유용한 세균 균주는 세균 균주에 의한 대사산물의 생산과 소비를 일과적으로 프로파일링함으로써 확인될 수 있다. 본 발명자들은 실시예에서 이용된 세균 균주가 부티르산염, 발레르산 및 헥산산을 생산하고 아세트산염 및 프로피온산염을 소비한다는 것을 발견하였다 (참조: 도 54-56). 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 참조 1, 참조 2 및 참조 3 역시 이들 대사산물을 소비하고 생산하는 것으로 밝혀졌다 (참조: 도 54-56). 이런 이유로, 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 대사산물 부티르산염, 발레르산 및 헥산산 중에서 한 가지 또는 그 이상을 생산한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 아세트산염 및 프로피온산염 중에서 한 가지 또는 둘 모두를 소비한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 부티르산염, 발레르산 및 헥산산을 생산하고 아세트산염 및 프로피온산염을 소비한다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029 균주이다. 이것은 실시예에서 검사되고 질환을 치료하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 예시적인 균주이다. 이런 이유로, 본 발명은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029의 세포, 예컨대 단리된 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주이다. 이것은 실시예에서 검사되고, 그리고 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 예시적인 MRx0029 균주이다. 이런 이유로, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 예컨대 단리된 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 균주의 유도체는 본래 균주로부터 딸 균주 (자손) 또는 배양된 (하위클로닝된) 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 유도체는 생물학적 활성을 제거하지 않으면서, 예를 들면 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도 균주는 치료적으로 활성이다. 유도 균주는 MRx0029 균주에 필적하는 치료 활성을 가질 것이다. 특히, 유도 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 MAP2 발현, DRD2 발현, 사이토킨 수준 또는 세포 생존에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. 유도 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 히스톤 탈아세틸화효소 저해 활성에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 수 있는데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. MRx0029 균주의 유도체는 일반적으로 MRx0029 균주의 생물형일 것이다.
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029 균주의 세포에 대한 언급은 균주 MRx0029와 동일한 안전성 및 치료 효능 특징을 갖는 임의의 세포를 포괄하고, 그리고 이런 세포는 본 발명에 의해 포괄된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 생존가능하고, 그리고 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있다.
본 발명자들은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주가 염증성 사이토킨, 예컨대 IL-1β, TNF-α, MIP-3α, IL-23, IL-8 및/또는 IL-6의 활성화를 증가시킨다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주가 면역 세포의 활성화를 증가시키고 사이토킨, 예컨대 IL-1β, TNF-α, MIP-3α, IL-23, IL-8 및/또는 IL-6의 분비를 증강한다는 것을 발견하였다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 면역계를 자극하고 질환, 특히 암, 가장 바람직하게는 뇌암, 예컨대 신경모세포종을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 위암, 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 생존가능하고, 그리고 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 42787의 세포를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 균주가 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 균주가 아니다.
이들 세균 균주는 2019년 5월 6일자에 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) (수탁 번호 NCIMB 43388 및 NCIMB 43389 하에) 및 메가스파에라 (Megasphaera) 종 (수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386 및 NCIMB 43387)으로서 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었다. 따라서, 대안적 구체예에서, 본 발명의 조성물은 이들 세균 균주, 또는 이들의 생물형 또는 유도체 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함한다. 의심할 여지를 없애기 위해, 위에서 지칭된 참조 1은 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주이고, 위에서 지칭된 참조 2는 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주이고, 그리고 위에서 지칭된 참조 3은 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주이다.
실시예에서 검사된 균주에 밀접하게 관련된 세균 균주 또한, 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 면역계를 자극하고 질환, 특히 암, 가장 바람직하게는 뇌암, 예컨대 신경모세포종을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 위암, 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주가 아니다.
따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 면역계를 자극하고 질환, 특히 암, 가장 바람직하게는 뇌암, 예컨대 신경모세포종을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 위암, 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주가 아니다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:9와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:9에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:9와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:9에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:10과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:10에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:10과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:10에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 면역계를 자극하고 질환, 특히 암, 가장 바람직하게는 뇌암, 예컨대 신경모세포종을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 위암, 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주가 아니다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 면역계를 자극하고 질환, 특히 암, 가장 바람직하게는 뇌암, 예컨대 신경모세포종을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 위암, 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주가 아니다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 면역계를 자극하고 질환, 특히 암, 가장 바람직하게는 뇌암, 예컨대 신경모세포종을 치료하고 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 위암, 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주가 아니다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:8과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:11과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:12와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:8, 11 또는 12와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:8, 11 또는 12와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:8에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:11에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:12에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호: 8, 11 또는 12에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호: 8, 11 또는 12에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다.
수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형인 세균 균주 또한, 면역계를 자극하고 질환, 특히 암을 치료하고 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다. 생물형은 동일한 또는 매우 유사한 생리학적 및 생화학적 특징을 갖는 밀접하게 관련된 균주이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 세균 균주, 또는 이들의 생물형을 제공한다.
수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상에 대한 다른 뉴클레오티드 서열을 염기서열결정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 실제적으로 전체 유전체가 염기서열결정될 수 있고, 그리고 본 발명에서 이용을 위한 생물형 균주는 이의 전체 유전체의 적어도 80%에 걸쳐 (예를 들면, 이의 전체 유전체의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 전역에 걸쳐) 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 생물형 균주를 확인하는 데 이용을 위한 다른 적합한 서열은 hsp60 또는 반복 서열, 예컨대 BOX, ERIC, (GTG)5, 또는 REP를 포함할 수 있다. 생물형 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 상응하는 서열에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
대안으로, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 이용함으로써, 예를 들면, 형광 증폭된 단편 길이 다형성 (FAFLP) 및 반복성 DNA 요소 (rep)-PCR 지문확인, 또는 단백질 프로파일링, 또는 부분적인 16S 또는 23S rDNA 염기서열결정을 이용함으로써 확인될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이런 기술은 다른 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주를 확인하는 데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석 (ARDRA)에 의해 분석될 때, 예를 들면, Sau3AI 제한 효소를 이용할 때, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상과 동일한 패턴을 제공하는 균주이다. 대안으로, 생물형 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상과 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로서 확인된다.
본 발명의 조성물과 방법에서 유용한 다른 균주, 예컨대 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형은 실시예에서 설명된 검정을 비롯한, 임의의 적합한 방법 또는 전략을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 이용을 위한 균주는 세포 용해물 또는 전체 세포에 첨가하고, 그리고 MAP2 발현, DRD2 발현, 사이토킨 수준 또는 세포 생존을 검사함으로써 확인될 수 있다. 특히, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상과 유사한 성장 패턴, 물질대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 세균 균주가 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상에 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 MAP2 발현, DRD2 발현, 사이토킨 수준 또는 세포 생존에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. 생물형 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 히스톤 탈아세틸화효소 저해 활성에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 수 있는데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주이다. 이들은 실시예에서 검사되고 질환을 치료하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 예시적인 균주이다. 이런 이유로, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 세포, 예컨대 단리된 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 균주의 유도체는 본래 균주로부터 딸 균주 (자손) 또는 배양된 (하위클로닝된) 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 유도체는 생물학적 활성을 제거하지 않으면서, 예를 들면 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도 균주는 치료적으로 활성이다. 유도 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상에 필적하는 치료 활성을 가질 것이다. 특히, 유도 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 MAP2 발현, DRD2 발현, 사이토킨 수준 또는 세포 생존에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. 유도 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 히스톤 탈아세틸화효소 저해 활성에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 수 있는데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. 일반적으로, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 유도체는 각각, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형일 것이다.
본 발명자들은 실시예에서 이용된 세균 균주가 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고 포름산을 소비한다는 것을 발견하였다 (참조: 도 58). 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43388 및 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 또한, 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 수탁 번호 NCIMB 43385 및 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주는 포름산을 소비하는 것으로 또한 밝혀졌다. 이런 이유로, 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 대사산물 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산 중에서 한 가지 또는 그 이상을 생산한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 포름산을 소비한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고 포름산을 소비한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 부티르산염, 발레르산, 헥산산, 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고, 그리고 아세트산염, 프로피온산염 및 포름산을 소비한다.
일정한 구체예에서, 부티르산염 및/또는 발레르산의 생산은 IL-8 분비를 산출한다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부티르산염 및/또는 발레르산의 생산을 통해 면역계를 자극할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii)를 포함하지 않는다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물과 방법에서 유용한 세균 균주는 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii)가 아니다.
치료적 용도
면역계 자극
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMCs)에서 면역자극을 야기할 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에 대한 면역자극 효과를 갖는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 질환, 특히 감소된 면역 활성화에 의해 특징화되는 질환 및 증가된 면역 반응에 의해 치료가능한 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극함으로써 질환을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 Tregs의 백분율에서 감소를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (도 6c). 억제 T 세포로서 또한 알려져 있는 Tregs는 면역 반응을 억제하는 기능을 하는 T 세포의 개체군이다. Tregs는 세포 표면 마커 CD25의 높은 발현 및 CD127의 낮은 발현에 의해 특징화된다 [19]. 본 발명의 조성물의 투여가 Tregs의 개체군을 선별적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 (도 6c), 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율에서 증가에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율에서 증가에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 CD4+CD25+CD127- 세포의 백분율에서 증가에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율을 감소시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tregs에 의한 면역 반응의 억제를 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tregs의 선별적 감소에 의해 면역 반응을 자극하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역자극에서 이용을 위한 것인데, 여기서 본 발명의 조성물은 Tregs의 숫자 또는 백분율을 감소시킨다.
실시예는 본 발명의 조성물이 세포, 예컨대 B 세포, CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포에 유의미하게 영향을 주지 않으면서, Tregs를 선별적으로 표적으로 할 수도 있다는 것을 증명한다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 검사된 다른 세포 유형의 백분율에 유의미하게 영향을 주지 않으면서, PBMCs에서 Tregs를 선별적으로 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tregs의 숫자 또는 백분율을 선별적으로 감소시키는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 CD4 T 세포의 숫자 또는 백분율은 유의미하게 변하지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tregs의 숫자 또는 백분율을 선별적으로 감소시키는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 CD8 T 세포의 숫자 또는 백분율은 유의미하게 변하지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tregs의 숫자 또는 백분율을 선별적으로 감소시키는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 B 세포의 숫자 또는 백분율은 유의미하게 변하지 않는다. 추가 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tregs의 숫자 또는 백분율을 선별적으로 감소시키는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 B 세포, CD4 T 세포 및/또는 CD8 T 세포의 숫자 또는 백분율은 유의미하게 변하지 않는다.
Tregs의 백분율에서 감소는 특히 놀라웠는데, 그 이유는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029 균주가 부티르산염을 생산하고, 그리고 부티르산염이 혈액 내에 증가된 Treg 세포 수준 및 증가된 Treg 활성과 연관되었기 때문이다 [20]. 이런 이유로, 본 발명의 조성물이 PBMCs에서 Tregs의 백분율에서 감소를 야기할 것이라는 것은 예상치 못한 것이었다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 CD8 세포 대 Treg 세포의 비율에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. CD8+ T 세포 (CD8 세포)는 세포독성 T 세포이고, 그리고 세포내 병원체에 대항한 면역 방어에서 핵심적인 역할을 수행한다. 본 발명의 조성물의 투여가 CD8/Treg 세포 및 활성화된 CD8/Treg 세포 둘 모두의 비율을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 (도 6g 및 도 6h), 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 및/또는 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 세포의 비율에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율을 감소시키고, 따라서 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율을 감소시키고, 따라서 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 CD8/Treg 세포의 비율에서 증가는 면역자극을 유발한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율을 감소시키고, 따라서 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율을 감소시키고, 따라서 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율에서 증가는 면역자극을 유발한다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 면역 반응을 자극하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 면역 반응을 자극하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 CD19+CD3- 세포의 백분율에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (도 6f). 이런 이유로, 본 발명의 조성물의 투여는 세포 개체군에서 B 세포의 백분율에서 증가를 야기할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 B 세포의 백분율을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 B 세포의 숫자 또는 백분율에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 숫자 또는 백분율에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD19+CD3- 세포의 숫자 또는 백분율에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 B 세포의 숫자 또는 백분율을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 B 세포의 숫자 또는 백분율에서 증가는 면역자극을 유발한다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 숫자 또는 백분율을 증가시킴으로써, 면역 반응을 자극하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 CD8 T-세포독성 세포의 백분율에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (도 6d). 이런 이유로, 본 발명의 조성물의 투여는 세포 개체군에서 CD8 T 세포의 백분율에서 증가를 야기할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 CD8 T-세포독성 세포의 백분율을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 숫자 또는 백분율에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 숫자 또는 백분율에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 CD8 T-세포독성 세포의 숫자 또는 백분율을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 CD8 T-세포독성 세포의 숫자 또는 백분율에서 증가는 면역자극을 유발한다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 숫자 또는 백분율을 증가시킴으로써, 면역 반응을 자극하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 CD8+ 활성화된 세포의 백분율에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (도 6e). 이런 이유로, 본 발명의 조성물의 투여는 세포 개체군에서 CD8+ 활성화된 세포의 백분율에서 증가를 야기할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 CD8+ 활성화된 세포의 백분율을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 숫자 또는 백분율에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 숫자 또는 백분율에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 CD8+ 활성화된 세포의 숫자 또는 백분율을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것인데, 여기서 CD8+ 활성화된 세포의 숫자 또는 백분율에서 증가는 면역자극을 유발한다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 숫자 또는 백분율을 증가시킴으로써, 면역 반응을 자극하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 친염증성 분자, 예컨대 친염증성 사이토킨의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (도 7 및 도 9). 본 발명의 조성물의 투여 시에 발현 수준에서 증가를 보인 면역자극성 (예를 들면, 친염증성) 분자의 실례는 IL-23, TNF-α, IL-1β, MIP-3α, IL-8 및 IL-6을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여가 면역자극성 (예를 들면, 친염증성) 분자의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 친염증성 분자, 예컨대 친염증성 사이토킨의 발현에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 친염증성 분자의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환, 특히 친염증성 사이토킨의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23, TNF-α, IL-1β, MIP-3α 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD11b의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23, TNF-α, IL-1β, MIP-3α 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD11b의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23, TNF-α, IL-1β, MIP-3α 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD11b의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 IL-1β의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. IL-1β는 친염증성 사이토킨이다 [21]. IL-1β의 생산과 분비는 염증 반응의 활성화와 연관되는 단백질 복합체인 염증조절복합체에 의해 조절된다 [22]. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-1β의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-1β의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-1β의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 IL-23의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. IL-23은 염증에 연루되었다 [23,24]. 면역 반응에서 IL-23의 제안된 기능은 CD4+ 기억 T 세포의 증식을 증진하고 수지상 세포 (DCs)에 의한 IFN-γ의 분비를 증진하는 것을 포함한다 [25]. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-23의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-23의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-23의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-23의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 대식세포 염증성 단백질-3 (MIP3-α), 또는 CCL20의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. MIP3-α는 CCR6 수용체에 결합하고, 그리고 DCs 및 기억 T-세포에 대한 화학유인물질로서 기능하는 염증성 케모킨이다. MIP3-α는 미성숙 DCs를 염증의 부위에 모집함으로써 적응성 면역 반응을 촉발하는 것과 연관된다 [26]. MIP3-α의 조절장애가 발생된 발현은 질환, 예컨대 염증성 장 질환과 연관되었다 [27]. 본 발명의 조성물의 투여가 MIP3-α의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 MIP3-α의 발현에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 MIP3-α의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 MIP3-α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 MIP3-α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 MIP3-α의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 MIP3-α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 MIP3-α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. TNF-α는 세포 사멸을 증진하는 다양한 신호전달 경로에 관련되는 것으로 알려져 있는 친염증성 사이토킨이다. TNF-α는 아폽토시스성 경로에서 개열 사건의 연속을 야기하는, 이의 동계 수용체, TNFR-1에 결합에 의해 아폽토시스를 개시한다 [28]. TNF-α는 또한, RIP 키나아제-의존성 기전을 통해 괴사를 촉발할 수 있다 [29]. 본 발명의 조성물의 투여가 TNF-α 발현에서 증가를 나타내기 때문에, 본 발명의 조성물은 질환의 치료에서 유용할 수 있고, 특히 TNF-α의 발현에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 TNF-α 발현에 의해 특징화되는 질환을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 TNF-α의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 IL-6의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. IL-6은 염증 동안 생산되고, 그리고 미성숙 CD4+ T 세포의 분화 및 CD8+ T 세포의 세포독성 T 세포로의 분화를 증진하는 친염증성 사이토킨이다 [30]. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-6의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-6의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
Bettelli et al. [31]은 IL-6이 Tregs의 생산을 저해한다고 보고하였다. 실시예가 본 발명의 조성물이 IL-6의 발현을 증가시킨다는 것을 보여주기 때문에, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시킴으로써, Tregs의 숫자 또는 백분율을 선별적으로 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시킴으로써, 면역자극에서 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tregs의 숫자 또는 백분율을 감소시킴으로써, 면역자극에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-6의 발현을 증가시킴으로써, 면역자극에서 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 Tregs의 숫자 또는 백분율을 감소시킴으로써, 면역자극에서 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 IL-8의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (참조: 실시예 8). IL-8은 면역자극 효과를 갖는 대식세포에 의해 지배적으로 분비되는 친염증성 사이토킨이다. 이것은 표적 세포, 일차적으로 호중구에서뿐만 아니라 다른 과립구에서 화학주성을 유도하고, 이들이 감염 부위를 향해 이주하도록 유발한다. IL-8은 또한, 식균작용을 자극한다. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-8의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 IL-8의 발현에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-8의 발현 및/또는 IL-8의 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-8의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 IL-8의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 CD11b의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (참조: 실시예 12). CD11b는 면역자극 효과를 갖는 친염증성 사이토킨이다. CD11b는 선천성 면역계에 관련된 많은 백혈구의 표면 상에서 발현되고, 그리고 백혈구 부착과 이주를 조절함으로써 염증을 매개한다. CD11b는 여러 면역 과정, 예를 들면, 식균작용, 세포 매개 세포독성, 화학주성 및 세포 활성화에 연루되었다. 본 발명의 조성물의 투여가 CD11b의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 CD11b의 발현에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD11b의 발현 및/또는 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD11b의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD11b의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 CD11b의 발현 및/또는 CD11b의 활성에서 감소에 의해 특징화되는 질환의 치료에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 CD11b의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 CD11b의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 면역 반응을 증진하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 본 발명의 조성물이 NF-κB-Ap1 프로모터 활성화를 유도할 수 있다는 것을 보여준다 (참조: 도 61). NF-κB는 특히, 면역 반응에 관련되는 염증의 매개체 및 사이토킨, 예를 들면, IL-6의 발현을 자극함으로써 면역 반응의 활성화에 관련된다. 상기 개설된 바와 같이, IL-6의 발현에서 증가는 면역계를 자극하는 데 도움을 주고, 그리고 따라서 NF-κB 경로의 활성화는 면역자극 활성을 갖는다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB 신호전달을 활성화하고, 그리고 따라서 면역계를 자극한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB 프로모터의 활성화를 증가시킴으로써, 염증의 매개체 및 면역자극성 사이토킨의 발현을 자극한다.
암
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌암, 특히 신경모세포종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑색종, 특히 전이성 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경모세포종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전이성 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하고, 그리고 뇌암, 특히 신경모세포종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 다른 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하고, 그리고 흑색종, 특히 전이성 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예 (실시예 1)는 본 발명의 조성물의 투여가 미분화된 신경모세포종 세포에서 부류 III 베타 튜불린 (β3 튜불린) 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 증명한다. β3 튜불린은 뉴런 마커로서 폭넓게 알려져 있다 [32]. 실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 미분화된 신경모세포종 세포에서 미소관-연관된 단백질 2 (MAP2) 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 증명한다. MAP2는 뉴런에서 지배적으로 발현되고, 그리고 미소관을 안정화하고, 수상돌기의 발달 및 신경돌기 생장을 증진하는 기능을 한다 [33]. MAP2는 분화된 뉴런의 마커로서 알려져 있다.
세포 분화를 유발하는 작용제는 암 치료제와 연관되었는데, 그 이유는 세포-분화 작용제의 투여가 종양 성장의 저해와 상관되었기 때문이다 [34]. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 분화, 특히 뉴런 분화를 유도함으로써, 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뉴런 분화를 유도함으로써, 뇌암, 특히 신경모세포종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
게다가, MAP2는 원발성 피부 흑색종에서는 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌지만, 전이성 흑색종에서는 발현이 감소하였다 [35]. 미소관-안정화 단백질의 증가된 발현, 또는 미소관 안정화 단백질, 예컨대 MAP2로 치료는 세포 분열 동안 필요한 미소관의 동적 불안정성을 간섭할 수 있는 것으로 제안되었다. 이런 이유로, MAP2의 상향조절은 세포 분열을 방해하고 암에서 종양 성장을 지연시키는 것으로 생각된다 [35]. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 암, 특히 전이성 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암을 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 MAP2 발현에 의해 매개된 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 또는 부재하는 MAP2 발현에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 MAP2 발현을 증가시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전이성 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 치료적 병용은 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에 따라서, 본 발명의 치료적 병용은 멜라닌세포에 영향을 주고, 그리고 흑색종을 치료하는 데 효과적일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 치료적 병용은 흑색종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
특히, 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 미분화된 신경모세포종 세포에서 MAP2 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. MAP2가 분화된 뉴런의 마커로서 폭넓게 알려져 있고 이의 발현이 암에 연루되는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 뇌암, 예컨대 신경모세포종을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌암을 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경모세포종을 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이다.
게다가, 실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 도파민 수용체 D2 (DRD2) 발현에서 유의미한 감소를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (참조: 실시예 2 및 도 3). DRD2는 G-단백질 연계된 수용체 (GPCR)이고, 그리고 이것은 도파민 수용체 패밀리의 일부이다. DRD2는 세포 생존을 증진하는 신호전달 경로에 관련되고, 그리고 이런 이유로 암과 연관된다. DRD2의 과다발현 또는 상향조절은 여러 유형의 암에 연루되었는데, 그 이유는 악성 세포가 정상 세포와 비교할 때, DRD2의 증가된 발현을 나타내기 때문이다 [36]. DRD2-특이적 길항제를 통해 DRD2를 저해하는 것은 항종양 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. DRD2 길항제는 유방암 [37][38], 교모세포종 [39][40][41], 신경모세포종 [42], 간세포 암종 [43], 폐암, 전립선암 [44], 자궁경부암 [45], 난소암 [46], 림프종 [47] 및 위암 [48]을 비롯한, 많은 암에서 항종양 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, DRD2의 발현 수준을 감소시키는 조성물은 암의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 DRD2 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 유용할 수 있고, 특히 증가된 DRD2 발현에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 DRD2의 증가된 발현 및/또는 활성에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 DRD2 발현 및/또는 활성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암, 특히 유방암, 난소암, 자궁경부암, 뇌암, 특히 교모세포종 및 신경모세포종, 암종, 특히 간세포 암종, 폐암, 전립선암 림프종 및/또는 위암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 DRD2의 수준 및/또는 활성을 감소시킴으로써, 암을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
Prabhu et al.은 DRD2의 길항제인 ONC201이 교모세포종 모형에서 종양을 수축하는 데 효능을 나타낸다고 보고하였다. DRD2 발현은 교모세포종 종양에서 상향조절되고, 그리고 이런 이유로 DRD2는 암 치료제에 대한 매력적인 표적이다 [49]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 교모세포종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 SH-SY5Y 세포에서 카스파제 3 (Casp3) 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. 카스파제는 시스테인 프로테아제 패밀리의 일부이고, 그리고 아폽토시스를 증진하는 것으로 알려져 있다. Casp3은 "처형자 카스파제"로서 알려져 있는데, 이것은 아폽토시스성 경로에서 세포 단백질의 개열 연쇄 반응에서 중요한 역할을 수행한다. Casp3 발현의 하향조절이 유방, 난소 및 경부 종양 조직으로부터 암에서 이전에 밝혀졌고, 그리고 Casp3의 감소된 발현은 암성 조직에서 세포 생존을 증진하는 것으로 생각된다 [50]. 이런 이유로, 처형자 카스파제, 특히 Casp3의 발현 수준을 증가시키는 조성물은 암의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 Casp3 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 유용할 수 있고, 특히 Casp3 발현에 의해 매개된 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 또는 부재하는 Casp3 발현에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 또는 부재하는 처형자 카스파제 발현에 의해 특징화되는 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Casp3의 감소된 또는 부재하는 발현에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 Casp3 발현을 증가시키는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암, 특히 유방암, 난소암 및/또는 자궁경부암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Casp3의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 암을 치료하는 데 유용할 수 있다.
게다가, 카스파제는 아폽토시스 이외의 과정, 예컨대 세포 분화에 관련되는 것으로 보고되었다 [51]. 실시예 (실시예 1 및 실시예 3)는 본 발명의 조성물의 투여가 뉴런 마커 β3 튜불린 및 MAP2의 발현에서 증가를 야기하고, 그리고 또한, 미분화된 신경모세포종 세포에서 Casp3의 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 증명한다. 본 발명의 조성물이 세포 분화에서 역할을 하는 것으로 알려진 뉴런 마커와 단백질의 발현에서 증가를 야기할 수 있기 때문에, 본 발명의 조성물은 미분화된 세포로부터 뉴런의 분화에서 유용할 수 있다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 미분화된 신경모세포종 세포에서 세포 생존력에서 감소를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (도 5). 특히, 실시예는 5% 또는 10%의 농도에서 MRx0029의 투여가 세포 생존력에서 유의미한, 용량 의존성 감소를 유발한다는 것을 보여준다 (도 5).
세포 생존력에서 감소, 또는 암성 세포의 증가된 세포 사멸은 암 치료에 대한 목표인 것으로 알려져 있다 [52]. 이런 이유로, 암 세포주, 예컨대 신경모세포종 세포주에서 세포 생존력을 감소시키는 조성물은 암의 치료에 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 생존력을 감소시킴으로써, 암의 치료에서 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 사멸을 증가시킴으로써, 암의 치료에서 이용을 위한 것이다.
게다가, 실시예가 본 발명의 조성물이 Casp3 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 세포 생존력을 감소시킨다는 것을 보여주기 때문에 (도 4 및 도 5), 본 발명의 조성물은 아폽토시스를 상향조절함으로써 세포 생존력을 감소시키는 것으로 제안된다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 아폽토시스를 상향조절하는 데 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 사멸을 증가시킴으로써, 특히 아폽토시스를 증가시킴으로써, 암의 치료에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 생존력을 감소시킴으로써, 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 생존력을 감소시킴으로써, 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 아폽토시스를 상향조절함으로써, 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 아폽토시스를 상향조절함으로써, 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 아폽토시스를 상향조절함으로써, 감소된 또는 부재하는 Casp3 발현에 의해 특징화되는 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 아폽토시스를 증가시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 세포 생존력을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 본 발명의 조성물이 Casp3과 MAP2 발현 둘 모두를 증가시킨다는 것을 보여준다. 이런 이유로, Casp3 상향조절 및 MAP2 상향조절은 관련될 수 있다.
히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 유전자 발현의 중요한 후성적 조절인자이다. 후성적 조절은 세포 기능의 모든 양상을 조절하기 위한 유력한 도구이다. 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC)는 히스톤 상에서 ε-N-아세틸 리신 아미노산으로부터 아세틸 기를 제거하고, 이들 히스톤이 DNA를 더욱 단단하게 둘러싸는 것을 허용하고, 그리고 뉴클레오솜 도달불능을 통해 전사 억제를 유발함으로써 유전자 발현을 억제한다. HDAC는 4가지 부류로 조직화되는 18개의 동종형을 갖는다: 부류 I, II, III 및 IV. HDAC 수준에서 변화가 예를 들면, 암, 감염성 질환, 염증성 질환 및 신경변성 질환을 비롯한 많은 질환 유형에서 관찰되었다 [53,54,55].
HDAC 저해제 (HDACi)는 다양한 암 세포주에서 성장 정지, 분화, 아폽토시스, 혈관형성의 감소 및 면역 반응의 조정을 유발하는 것으로 밝혀진 유망한 항암 약물의 급부상하는 부류이다 [56,57,58,59]. 비록 이들 작용제의 임상적 활성이 매개되는 정확한 기전이 여전히 불분명한 상태이긴 하지만, 넓은 범위의 HDACi가 현재 잠재적인 항암제로서 조사되고 있다. 게다가, 시험관내와 생체내 연구 둘 모두에서 증명가능한 항암 활성으로 인해, 많은 HDACi가 단일요법으로서 또는 다른 항암제와 조합으로, 임상적 개발을 통해 신속하게 진전되었다 [60]. 이들 중에서, 보리노스탯 (Zolinza™), 로미뎁신 (Istodax™) 및 벨리노스탯 (Beleodaq™)은 림프종의 치료용으로 US FDA로부터 승인을 받았다. 림프종 및 다른 혈액암 (혈액학적 암 또는 혈액학적 악성종양으로 또한 불린다)은 HDACi에 특히 민감하다. 소화관 미생물총은 이의 막대한 다양성 및 물질대사 능력으로 인해, HDAC 활성에 대한 잠재적인 효과를 갖는 방대한 다양한 분자의 생산을 위한 거대한 물질대사 보관소를 나타낸다. HDAC를 저해하는 것으로 밝혀졌고 헌팅턴병에서 운동 기능의 향상과 연관되는 부티르산염 이외에, 미생물학적으로-유래된 대사산물의 HDAC 저해 활성이 극소수의 연구에서 사정되었다 [61].
실시예는 본 발명의 조성물이 HDAC 활성, 특히 부류 I HDAC, 예를 들면 HDAC2를 저해한다는 것을 보여준다 (실시예 9 및 10). 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC를 저해한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDACi이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 I HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 II HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 III HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 IV HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC1 활성을 감소시킨다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC2 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC3 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 발레르산의 생산을 통해 HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부티르산나트륨의 생산을 통해 HDAC 활성을 감소시킨다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성을 감소시킴으로써, 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 연관된 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성을 감소시킴으로써, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신경모세포종, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 결장직장암, 혈액학적 악성종양 및/또는 위암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성을 감소시킴으로써, 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물의 HDAC 저해 활성은 성장 정지를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물의 HDAC 저해 활성은 세포 주기 정지를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물의 HDAC 저해 활성은 세포 분화를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물의 HDAC 저해 활성은 아폽토시스를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물의 HDAC 저해 활성은 혈관형성의 감소를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물의 HDAC 저해 활성은 면역 반응의 조정을 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단일요법으로서 HDAC 활성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 복합 요법으로서 HDAC 활성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 다른 항암제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 다른 항암제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 화학요법제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 프로테아좀 저해제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 추가의 양상에서, 본 발명의 조성물은 후성적 조절인자이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 후성적 이상에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC 활성을 조정한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC를 저해한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDACi이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 부류 I HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 부류 II HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 부류 III HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 부류 IV HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC1 활성을 감소시킨다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC2 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC3 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 발레르산의 생산을 통해 HDAC 활성을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 부티르산나트륨의 생산을 통해 HDAC 활성을 감소시킨다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC 활성을 감소시킴으로써, 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC 연관된 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC 활성을 감소시킴으로써, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신경모세포종, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 결장직장암, 혈액학적 악성종양 및/또는 위암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 HDAC 활성을 감소시킴으로써, 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주의 HDAC 저해 활성은 성장 정지를 유발한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주의 HDAC 저해 활성은 세포 주기 정지를 유발한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주의 HDAC 저해 활성은 세포 분화를 유발한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주의 HDAC 저해 활성은 아폽토시스를 유발한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 혈관형성의 감소를 유발한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주의 HDAC 저해 활성은 면역 반응의 조정을 유발한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 단일요법으로서 HDAC 활성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 복합 요법으로서 HDAC 활성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 다른 항암제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 하나 이상의 다른 항암제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 화학요법제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 프로테아좀 저해제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 추가의 양상에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 후성적 조절인자이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 후성적 이상에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 소화관 장벽 기능에 관련된 단백질의 발현과 국부화에 관련된 세포내 신호 전달을 변경함으로써 상피 투과성을 조절할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 오클루딘, 빌린, 치밀 이음 단백질 1 (TJP1) 및 치밀 이음 단백질 2 (TJP2) mRNA 발현을 증강한다. 본 발명의 조성물은 이런 이유로, 소화관 장벽 기능을 증가시키고 소화관 투과성을 감소시키는 기능을 한다 (실시예 11). 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소화관 장벽 기능을 증가시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소화관 투과성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소화관 장벽 기능의 감소를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증가된 소화관 투과성을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소화관 장벽 기능의 감소에 의해 특징화되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증가된 소화관 투과성에 의해 특징화되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 방사선요법 또는 화학요법으로부터 발생하는 소화관 장벽 기능의 감소를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 방사선요법 또는 화학요법으로부터 발생하는 증가된 소화관 투과성을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소화관 장벽 기능을 증가시킴으로써, 악액질을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소화관 투과성을 감소시킴으로써, 악액질을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서. 악액질은 암 악액질이다.
일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 소화관 장벽 기능을 증가시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 소화관 투과성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 소화관 장벽 기능의 감소를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 증가된 소화관 투과성을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 소화관 장벽 기능의 감소에 의해 특징화되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 증가된 소화관 투과성에 의해 특징화되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 방사선요법 또는 화학요법으로부터 발생하는 소화관 장벽 기능의 감소를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 방사선요법 또는 화학요법으로부터 발생하는 증가된 소화관 투과성을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 소화관 장벽 기능을 증가시킴으로써, 악액질을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 소화관 투과성을 감소시킴으로써, 악액질을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 악액질은 암 악액질이다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 방사선요법 또는 화학요법을 겪는 환자에서 암을 치료하기 위한 것이다. 이런 구체예에서, 조성물은 방사선요법 또는 화학요법에 앞서, 동안, 또는 이후에 투여될 수 있다. 방사선요법 또는 화학요법을 겪는 환자는 누출성 소화관을 유도하는 어떤 작용제도 투여되지 않아야 하지만, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)는 소화관-장벽 기능을 증진하고 [62], 따라서 본 발명의 조성물은 방사선요법 또는 화학요법을 겪는 환자를 치료하는 데 특히 적합하다. TLR-5의 활성화는 생체내에서 방사선유발 상피 손상을 개선하는 것으로 밝혀졌다 [63]. 본 발명의 조성물은 또한, 면역계를 활성화한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 방사선요법-유도된 손상을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 방사선요법-유도된 손상을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 종양 성장에서 감소를 야기할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 치료는 종양 크기에서 감소 또는 종양 성장에서 감소를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양 성장을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 종양 크기 또는 성장을 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 고형 종양을 앓는 환자에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 혈관형성을 감소시키거나 또는 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 혈관형성에서 중심적인 역할을 하는 면역 또는 염증 시스템에 대한 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 조성물은 항전이 활성을 가질 수 있다. 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 항전이 활성을 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전이를 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 전이를 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs에서 Tregs의 백분율에서 감소를 야기할 수 있다는 것을 보여준다 (도 6c). Tregs는 암에 연루되었고, 그리고 종양 조직에서 Tregs의 침윤은 불량한 예후에 연결되었다 [64]. 본 발명의 조성물의 투여가 Tregs의 개체군을 선별적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 (도 6c), 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율에서 증가에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 CD4+CD25+CD127- 세포의 백분율에서 증가에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 특히, 암성 조직에서 Tregs의 숫자 또는 백분율을 감소시킴으로써, 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tregs의 선별적 감소에 의해 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
Tregs의 숫자를 선별적으로 감소시키고 작동체 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포를 활성화하는 것은 효과적인 암 요법일 것으로 제안되었다 [64]. 실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 CD8 세포 대 Treg 세포의 비율에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명의 조성물의 투여가 CD8/Treg 세포 및 활성화된 CD8/Treg 세포 둘 모두의 비율을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 (도 6g 및 도 6h), 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 및/또는 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율에서 감소에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 세포의 비율에서 감소에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율에서 감소에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율을 감소시키고, 따라서 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 개체군에서 Tregs의 백분율을 감소시키고, 따라서 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시킴으로써, 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. 대장염-연관된 암에서, 종양 부위에서 IL-1β의 감소된 발현은 증상, 예컨대 증가된 질환 결과 및 이환율에 연계되었다 [65]. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 감소된 또는 부재하는 발현에 의해 특징화되는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현을 증가시킴으로써, 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. TNF-α는 세포 사멸을 증진하는 다양한 신호전달 경로에 관련되는 것으로 알려져 있는 친염증성 사이토킨이다. TNF-α는 아폽토시스성 경로에서 개열 사건의 연속을 야기하는, 이의 동계 수용체, TNFR-1에 결합에 의해 아폽토시스를 개시한다. TNF-α는 또한, RIP 키나아제-의존성 기전을 통해 괴사를 촉발할 수 있다. 많은 유형의 암이 결함성 아폽토시스성 및 괴사성 경로를 갖고, 그리고 TNF-α가 이들 세포 사멸 경로를 매개하는 것으로 알려져 있기 때문에, TNF-α는 암 요법에 대한 잠재적 표적이다. 본 발명의 조성물의 투여가 TNF-α 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 유용할 수 있고, 특히 TNF-α 발현에 의해 매개된 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α 발현에 의해 매개된 암, 특히 TNF-α의 감소된 발현 및/또는 활성을 갖는 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 암을 치료하는 데 유용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유방암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유방암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 유방암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 유방암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서 암은 유방 암종이다. 바람직한 구체예에서 암은 IV 기 유방암이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 폐암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 폐암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 폐암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 폐암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서 암은 폐 암종이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 간암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 간암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 간암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 간암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서 암은 간암 (간세포 암종)이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑색종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 흑색종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서 흑색종은 전이성 흑색종이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 난소암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 난소암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 난소암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 난소암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 자궁경부암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 자궁경부암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 자궁경부암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 자궁경부암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경모세포종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경모세포종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 신경모세포종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 신경모세포종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 교모세포종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 교모세포종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 교모세포종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 교모세포종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전립선암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전립선암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 전립선암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 전립선암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 혈액학적 악성종양의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 혈액학적 악성종양의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 급성 백혈병이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 만성 백혈병이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 급성 골수성 백혈병이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 만성 골수성 백혈병이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 급성 림프성 백혈병이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 만성 림프성 백혈병이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 림프종이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 다발성 골수종이다. 일정한 구체예에서, 혈액학적 악성종양은 골수형성이상 증후군이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 만성 림프구 백혈병을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 만성 림프구 백혈병의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 만성 림프구 백혈병을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 만성 림프구 백혈병의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 림프종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 림프종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 림프종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 림프종의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 림프종은 호지킨 림프종이다. 일정한 구체예에서, 림프종은 비호지킨 림프종이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 위암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 위암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 결장암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 결장직장암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 결장암 세포에 대한 효과를 나타낼 수 있고 결장암을 치료하는 데 효과적일 수 있다. 본 발명의 조성물은 결장암 세포에 대한 효과를 나타낼 수 있고 결장직장암을 치료하는 데 효과적일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 결장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 결장직장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 결장암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 결장직장암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 결장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 결장직장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서 암은 결장직장 선암종이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 치료적 병용은 신장암 (본원에서 신장암으로서 또한 지칭됨)을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 치료적 병용은 신장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 신장암 (본원에서 신장암으로서 또한 지칭됨)을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 신장암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 치료적 병용이 신장암 세포에 영향을 주고 신장암을 치료하는 데 효과적일 수 있다는 것을 증명한다. 바람직한 구체예에서 암은 신장 세포 암종 또는 이행 세포 암종이다. 일부 구체예에서, 암은 장의 암이다. 일부 구체예에서, 암은 장이 아닌 신체의 부분이다. 일부 구체예에서, 암은 장의 암이 아니다. 일부 구체예에서, 암은 결장직장암이 아니다. 일부 구체예에서, 암은 소장의 암이 아니다. 일부 구체예에서, 치료하거나 예방하는 것이 장 이외의 부위에서 일어난다. 일부 구체예에서, 치료하거나 예방하는 것이 장에서 그리고 또한, 장 이외의 부위에서 일어난다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 다양한 유형의 암종을 치료하는 데 효과적일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 비면역원성 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 암종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 다양한 유형의 암종을 치료하는 데 효과적일 수 있다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 비면역원성 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 조성물이 비면역원성 암을 치료하는 데 효과적일 수 있다는 것을 증명한다.
암에 대한 본 발명의 조성물의 치료 효과는 친염증성 기전에 의해 매개될 수 있다. 다수의 친염증성 사이토킨의 발현은 MRx0029의 투여 이후에 증가될 수 있다. 염증은 암-억제 효과를 나타낼 수 있고 [66], 그리고 친염증성 사이토킨, 예컨대 TNF-α는 암 요법으로서 조사 중에 있다 [67]. 유전자, 예컨대 실시예에서 도시된 TNF-α의 상향조절은 본 발명의 조성물이 유사한 기전을 통해 암을 치료하는 데 유용할 수 있다는 것을 지시할 수 있다. CXCR3 리간드, 예컨대 CXCL9)의 상향조절은 본 발명의 조성물이 IFNγ-유형 반응을 이끌어 낸다는 것을 지시할 수 있다. IFNγ은 종양파괴 활성을 자극할 수 있는 강력한 대식세포 활성 인자이고 [68], 그리고 예를 들면, CXCL9 또한 항암 효과를 나타낸다 [69-71]. 실시예는 다수의 친염증성 사이토킨의 발현이 MRx0029의 투여 이후에 증가될 수 있다는 것을 증명한다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 염증을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 Th1 염증을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. Th1 세포는 IFNγ을 생산하고 강력한 항암 효과를 나타낸다 [66]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 초기 단계 암, 예컨대 전이되지 않은 암, 또는 0 기 또는 1 기 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 염증을 증진하는 것은 초기 단계 암에 대항하여 더욱 효과적일 수 있다 [66]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 두 번째 항암제의 효과를 증강하기 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 두 번째 항암제의 효과를 증강하기 위해, 염증을 증진하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 암의 치료 또는 예방은 한 가지 또는 그 이상의 사이토킨의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, 암의 치료 또는 예방은 한 가지 또는 그 이상의 친염증성 사이토킨의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 일정한 구체예에서, 암의 치료 또는 예방은 IL-1β, IL-6, MIP-3α, CXCL9, IL-23, MCP-1, GMCSF 및 TNF-α 중에서 한 가지 또는 그 이상의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, 암의 치료 또는 예방은 IL-1β 및 MIP-3α 중에서 한 가지 또는 그 이상의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함한다. IL-1β, IL-6 및 TNF-α 중에서 어느 것의 발현의 수준에서 증가는 암의 치료에서 효능을 지시하는 것으로 알려져 있다.
본원에서 설명된 바와 같은 세균 균주가 지질다당류 (LPS)와 조합으로 이용될 때, IL-1β에서 상승적 증가가 있을 수 있다. LPS는 친염증성 효과를 이끌어 내는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일정한 구체예에서, 치료 또는 예방은 IL-1β를 상향조절하는 작용제와 조합으로, 본원에서 설명된 바와 같은 세균 균주를 이용하는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, 치료 또는 예방은 LPS와 조합으로, 본원에서 설명된 바와 같은 세균 균주를 이용하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 IL-1β를 상향조절하는 작용제를 부가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 LPS를 부가적으로 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 화학요법을 이전에 제공받았던 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 화학요법 치료를 견뎌내지 못한 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 이런 환자에게 특히 적합할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 재발을 예방하기 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 장기간 투여에 적합할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 진행을 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 비-소세포 폐 암종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소세포 폐 암종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 편평상피-세포 암종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 선암종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 선 종양, 카르시노이드 종양, 또는 미분화된 암종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 간모세포종, 담관암종, 담관세포 낭선암종, 또는 바이러스 감염으로부터 발생하는 간암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 침습성 관암종, 관상피내암 또는 침습성 소엽암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
추가 구체예에서, 본 발명의 조성물은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병, 부신 피질 암종, 기저-세포 암종, 담관암, 방광암, 뼈 종양, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 유방암, 기관지 선종/카르시노이드, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종, 안구내 흑색종, 망막모세포종, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질성 종양 (GIST), 생식 세포 종양, 신경교종, 아동기 시각 경로 및 시상하부, 호지킨 림프종, 흑색종, 도세포 암종, 카포시 육종, 신장 세포 암, 후두암, 백혈병, 림프종, 중피종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 인두암, 뇌하수체 선종, 형질 세포 신생물, 전립선암, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 육종, 고환암, 갑상선암, 또는 자궁암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 추가 구체예에서, 본 발명의 조성물은 혈액학적 악성종양, 다발성 골수종, 또는 골수형성이상 증후군을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 특히, 추가 치료제와 조합으로 이용될 때 효과적일 수 있다. 본 발명의 조성물의 면역조절 효과는 더욱 직접적인 항암제와 병용될 때 효과적일 수 있다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주 및 항암제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 본 발명의 조성물은 암을 자극하여, 두 번째 항암제로 치료에 대한 이의 감수성을 증강하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 본 발명의 조성물은 두 번째 항암제로 치료에 대한 암, 예컨대 뇌암의 감수성을 증강함으로써, 이를 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 두 번째 항암제는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물과 동시에 투여될 수 있거나, 또는 상기 조성물의 투여 후, 예컨대 적어도 1 일, 1 주, 또는 1 개월 후 투여될 수 있다.
바람직한 구체예에서 항암제는 면역 관문 저해제, 표적화된 항체 면역요법, CAR-T 세포 요법, 암용해 바이러스, 또는 정균성 약물이다. 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 항암제를 포함한다: 예르보이 (이플리무맙, BMS); 키트루다 (펨브로리주맙, Merck); 옵디보 (니볼루맙, BMS); MEDI4736 (AZ/MedImmune); MPDL3280A (Roche/Genentech); 트레멜리무맙 (AZ/MedImmune); CT-011 (피딜리주맙, CureTech); BMS-986015 (리릴루맙, BMS); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MSB-0010718C (Merck); PF-05082566 (Pfizer); MEDI6469 (AZ/MedImmune); BMS-986016 (BMS); BMS-663513 (우렐루맙, BMS); IMP321 (Prima Biomed); LAG525 (Novartis); ARGX-110 (arGEN-X); PF-05082466 (Pfizer); CDX-1127 (바릴루맙; CellDex Therapeutics); TRX-518 (GITR Inc.); MK-4166 (Merck); JTX-2011 (Jounce Therapeutics); ARGX-115 (arGEN-X); NLG-9189 (인독시모드, NewLink Genetics); INCB024360 (Incyte); IPH2201 (Innate Immotherapeutics/AZ); NLG-919 (NewLink Genetics); 항-VISTA (JnJ); 에파카드스타트 (INCB24360, Incyte); F001287 (Flexus/BMS); CP 870893 (University of Pennsylvania); MGA271 (Macrogenix); 에막투주맙 (Roche/Genentech); 갈루니서팁 (Eli Lilly); 울로쿠플루맙 (BMS); BKT140/BL8040 (Biokine Therapeutics); 바비툭시맙 (Peregrine Pharmaceuticals); CC 90002 (Celgene); 852A (Pfizer); VTX-2337 (VentiRx Pharmaceuticals); IMO-2055 (Hybridon, Idera Pharmaceuticals); LY2157299 (Eli Lilly); EW-7197 (Ewha Women's University, Korea); 베무라페닙 (Plexxikon); 다브라페닙 (Genentech/GSK); BMS-777607 (BMS); BLZ945 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre); 유니툭신 (디누툭시맙, United Therapeutics Corporation); 블린사이토 (블리나투모맙, Amgen); 시람자 (라무시루맙, Eli Lilly); 가지바 (오비누투주맙, Roche/Biogen); 캐드실라 (아도-트라스투주맙 엠탄신, Roche/Genentech); 퍼제타 (페르투주맙, Roche/Genentech); 애드세트리스 (브렌툭시맙 베도틴, Takeda/Millennium); 아르제라 (오파투무맙, GSK); 벡티빅스 (파니투무맙, Amgen); 아바스틴 (베바시주맙, Roche/Genentech); 어비툭스 (세툭시맙, BMS/Merck); 벡사르 (토시투모맙-I131, GSK); 제발린 (이브리투모맙 티욱세탄, Biogen); 캄패스 (알렘투주맙, Bayer); 밀로타르그 (겜투주맙 오조가미신, Pfizer); 헤르셉틴 (트라스투주맙, Roche/Genentech); 리툭산 (리툭시맙, Genentech/Biogen); 볼로식시맙 (Abbvie); 에나바투주맙 (Abbvie); ABT-414 (Abbvie); 엘로투주맙 (Abbvie/BMS); ALX-0141 (Ablynx); 오자랄리주맙 (Ablynx); 악티맙-C (Actinium); 악티맙-P (Actinium); 밀라투주맙-독스 (Actinium); Emab-SN-38 (Actinium); 나프투모맙 에스타페나톡스 (Active Biotech); AFM13 (Affimed); AFM11 (Affimed); AGS-16C3F (Agensys); AGS-16M8F (Agensys); AGS-22ME (Agensys); AGS-15ME (Agensys); GS-67E (Agensys); ALXN6000 (사말리주맙, Alexion); ALT-836 (Altor Bioscience); ALT-801 (Altor Bioscience); ALT-803 (Altor Bioscience); AMG780 (Amgen); AMG 228 (Amgen); AMG820 (Amgen); AMG172 (Amgen); AMG595 (Amgen); AMG110 (Amgen); AMG232 (아데카투무맙, Amgen); AMG211 (Amgen/MedImmune); BAY20-10112 (Amgen/Bayer); 릴로투무맙 (Amgen); 데노수맙 (Amgen); AMP-514 (Amgen); MEDI575 (AZ/MedImmune); MEDI3617 (AZ/MedImmune); MEDI6383 (AZ/MedImmune); MEDI551 (AZ/MedImmune); 목세투모맙 파수도톡스 (AZ/MedImmune); MEDI565 (AZ/MedImmune); MEDI0639 (AZ/MedImmune); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MEDI562 (AZ/MedImmune); AV-380 (AVEO); AV203 (AVEO); AV299 (AVEO); BAY79-4620 (Bayer); 아네투맙 라브탄신 (Bayer); 반틱투맙 (Bayer); BAY94-9343 (Bayer); 시브로투주맙 (Boehringer Ingleheim); BI-836845 (Boehringer Ingleheim); B-701 (BioClin); BIIB015 (Biogen); 오비누투주맙 (Biogen/Genentech); BI-505 (Bioinvent); BI-1206 (Bioinvent); TB-403 (Bioinvent); BT-062 (Biotest) BIL-010t (Biosceptre); MDX-1203 (BMS); MDX-1204 (BMS); 네시투무맙 (BMS); CAN-4 (Cantargia AB); CDX-011 (Celldex); CDX1401 (Celldex); CDX301 (Celldex); U3-1565 (Daiichi Sankyo); 파트리투맙 (Daiichi Sankyo); 티가투주맙 (Daiichi Sankyo); 니모투주맙 (Daiichi Sankyo); DS-8895 (Daiichi Sankyo); DS-8873 (Daiichi Sankyo); DS-5573 (Daiichi Sankyo); MORab-004 (Eisai); MORab-009 (Eisai); MORab-003 (Eisai); MORab-066 (Eisai); LY3012207 (Eli Lilly); LY2875358 (Eli Lilly); LY2812176 (Eli Lilly); LY3012217 (Eli Lilly); LY2495655 (Eli Lilly); LY3012212 (Eli Lilly); LY3012211 (Eli Lilly); LY3009806 (Eli Lilly); 식수투무맙 (Eli Lilly); 플란보투맙 (Eli Lilly); IMC-TR1 (Eli Lilly); 라무시루맙 (Eli Lilly); 타발루맙 (Eli Lilly); 자놀리무맙 (Emergent Biosolution); FG-3019 (FibroGen); FPA008 (Five Prime Therapeutics); FP-1039 (Five Prime Therapeutics); FPA144 (Five Prime Therapeutics); 카투막소맙 (Fresenius Biotech); IMAB362 (Ganymed); IMAB027 (Ganymed); HuMax-CD74 (Genmab); HuMax-TFADC (Genmab); GS-5745 (Gilead); GS-6624 (Gilead); OMP-21M18 (뎀시주맙, GSK); 마파투무맙 (GSK); IMGN289 (ImmunoGen); IMGN901 (ImmunoGen); IMGN853 (ImmunoGen); IMGN529 (ImmunoGen); IMMU-130 (Immunomedics); 밀라투주맙-독스 (Immunomedics); IMMU-115 (Immunomedics); IMMU-132 (Immunomedics); IMMU-106 (Immunomedics); IMMU-102 (Immunomedics); 에프라투주맙 (Immunomedics); 클리바투주맙 (Immunomedics); IPH41 (Innate Immunotherapeutics); 다라투무맙 (Janssen/Genmab); CNTO-95 (인테투무맙, Janssen); CNTO-328 (실툭시맙, Janssen); KB004 (KaloBios); 모가물리주맙 (Kyowa Hakko Kirrin); KW-2871 (에크로멕시맙, Life Science); 소네프시주맙 (Lpath); 마게툭시맙 (Macrogenics); 에노블리투주맙 (Macrogenics); MGD006 (Macrogenics); MGF007 (Macrogenics); MK-0646 (달로투주맙, Merck); MK-3475 (Merck); Sym004 (Symphogen/Merck Serono); DI17E6 (Merck Serono); MOR208 (Morphosys); MOR202 (Morphosys); Xmab5574 (Morphosys); BPC-1C (엔시툭시맙, Precision Biologics); TAS266 (Novartis); LFA102 (Novartis); BHQ880 (Novartis/Morphosys); QGE031 (Novartis); HCD122 (루카투무맙, Novartis); LJM716 (Novartis); AT355 (Novartis); OMP-21M18 (뎀시주맙, OncoMed); OMP52M51 (Oncomed/GSK); OMP-59R5 (Oncomed/GSK); 반틱투맙 (Oncomed/Bayer); CMC-544 (이노투주맙 오조가미신, Pfizer); PF-03446962 (Pfizer); PF-04856884 (Pfizer); PSMA-ADC (Progenics); REGN1400 (Regeneron); REGN910 (네스바쿠맙, Regeneron/Sanofi); REGN421 (에노티쿠맙, Regeneron/Sanofi); RG7221, RG7356, RG7155, RG7444, RG7116, RG7458, RG7598, RG7599, RG7600, RG7636, RG7450, RG7593, RG7596, DCDS3410A, RG7414 (파르사투주맙), RG7160 (임가투주맙), RG7159 (오비누투주맙), RG7686, RG3638 (오나르투주맙), RG7597 (Roche/Genentech); SAR307746 (Sanofi); SAR566658 (Sanofi); SAR650984 (Sanofi); SAR153192 (Sanofi); SAR3419 (Sanofi); SAR256212 (Sanofi), SGN-LIV1A (린투주맙, Seattle Genetics); SGN-CD33A (Seattle Genetics); SGN-75 (보르세투주맙 마포도틴, Seattle Genetics); SGN-19A (Seattle Genetics) SGN-CD70A (Seattle Genetics); SEA-CD40 (Seattle Genetics); 이브리투모맙 티욱세탄 (Spectrum); MLN0264 (Takeda); 가니투맙 (Takeda/Amgen); CEP-37250 (Teva); TB-403 (Thrombogenic); VB4-845 (Viventia); Xmab2512 (Xencor); Xmab5574 (Xencor); 니모투주맙 (YM Biosciences); 카를루맙 (Janssen); NY-ESO TCR (Adaptimmune); MAGE-A-10 TCR (Adaptimmune); CTL019 (Novartis); JCAR015 (Juno Therapeutics); KTE-C19 CAR (Kite Pharma); UCART19 (Cellectis); BPX-401 (Bellicum Pharmaceuticals); BPX-601 (Bellicum Pharmaceuticals); ATTCK20 (Unum Therapeutics); CAR-NKG2D (Celyad); 오닉스-015 (Onyx Pharmaceuticals); H101 (Shanghai Sunwaybio); DNX-2401 (DNAtrix); VCN-01 (VCN Biosciences); 콜로-Ad1 (PsiOxus Therapeutics); 프로스타타크 (Advantagene); 온코스-102 (Oncos Therapeutics); CG0070 (Cold Genesys); 펙사벡 (JX-594, Jennerex Biotherapeutics); GL-ONC1 (Genelux); T-VEC (Amgen); G207 (Medigene); HF10 (Takara Bio); SEPREHVIR (HSV1716, Virttu Biologics); OrienX010 (OrienGene Biotechnology); 레올리신 (Oncolytics Biotech); SVV-001 (Neotropix); 카바탁 (CVA21, Viralytics); 알림타 (Eli Lilly), 시스플라틴, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 폴리닌산, 메토트렉사트, 시클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 지카디아 (Novartis), 타핀라 (GSK), 잴코리 (Pfizer), 이레싸 (AZ), 질로트리프 (Boehringer Ingelheim), 타세바 (Astellas Pharma), 할라벤 (Eisai Pharma), 벨리파립 (Abbvie), AZD9291 (AZ), 알렉티닙 (Chugai), LDK378 (Novartis), 제네테스핍 (Synta Pharma), 테르젠푸마투셀-L (NewLink Genetics), GV1001 (Kael-GemVax), 티반티닙 (ArQule); 사이톡산 (BMS); 온코빈 (Eli Lilly); 아드리아마이신 (Pfizer); 겜자르 (Eli Lilly); 젤로다 (Roche); 익셈프라 (BMS); 아브락산 (Celgene); 트렐스타 (Debiopharm); 탁소테르 (Sanofi); 넥사바르 (Bayer); IMMU-132 (Immunomedics); E7449 (Eisai); 써모독스 (Celsion); 코메트리크 (Exellxis); 론서프 (Taiho Pharmaceuticals); 캄프토사르 (Pfizer); UFT (Taiho Pharmaceuticals); 및 TS-1 (Taiho Pharmaceuticals).
일부 구체예에서, 수탁 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주는 본 발명의 조성물에서 유일한 치료적으로 활성제이다.
본 발명자들은 메가스파에라 (Megasphaera) 속으로부터 세균 균주가 특히, 종양원성 세포외 신호-관련된 키나아제 (ERK) 신호전달을 포함하는 암을 치료하거나 예방하는 데 효과적일 수 있다는 것을 확인하였다. 세포외 신호-관련된 키나아제 (ERK)는 모든 진핵생물에서 발견되는 고도로 보존된 신호 전달 경로인 유사분열물질-활성화된 단백질 (MAP) 키나아제 경로에서 하류 작동체이다 [72]. MAP-키나아제 경로는 세포 증식, 분화, 생존 및 아폽토시스와 같은 과정을 조절하고, 그리고 상기 경로의 일탈적 활성화는 암 발병과 밀접하게 연계된다. 실시예에서 설명된 바와 같이, 메가스파에라 (Megasphaera) 균주를 포함하는 조성물의 투여는 암 세포주에서 ERK 신호전달을 저해할 수 있다; 다시 말하면, 총 ERK 단백질에 비하여 인산화된 ERK의 세포 수준을 감소시킬 수 있다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 (Megasphaera) 균주로 치료가 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 암 세포주, 특히 흑색종 및 결장직장암 세포주의 클론원성 생존을 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 (Megasphaera) 균주로 치료가 미소관-연관된 단백질 2 (MAP2)의 유전자 발현을 유도할 수 있다는 것을 확인하였는데, 이것은 전이성 암을 치료함에 있어서 특정 유용성을 지시한다.
이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명은 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 암은 종양원성 ERK 신호전달을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이 "종양원성 ERK 신호전달"은 MAP 키나아제 경로를 통한 조절장애가 발생된 세포 신호전달, 예컨대 자극-독립된 신호전달을 포함하는 암을 지칭하는데, 이러한 신호전달의 결과는 증가된 암 세포 증식 및/또는 생존을 주동하는 ERK (ERK1 또는 ERK2 동종형 중에서 어느 한 가지, 또는 둘 모두)에 의한 과활동성 신호전달이다. ERK1은 위치 Thr202 및 Tyr204에서 인산화될 때 활성이다 (다시 말하면, 신호전달한다). ERK 2는 위치 Thr173 및 Tyr185에서 인산화될 때 활성이다 (다시 말하면, 신호전달한다). 따라서, "종양원성 ERK 신호전달"은 MAP 키나아제 경로의 양성 조절인자에서 종양원성 돌연변이 (기능 획득 돌연변이) 또는 이들의 과다발현, 또는 MAP 키나아제 경로의 음성 조절인자에서 종양원성 돌연변이 (기능 상실 돌연변이) 또는 이들의 하향조절된 발현의 존재로부터 발생할 수 있다.
종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 암은 대안으로, 종양원성 ERK 신호전달을 "전시하는" 또는 "이것에 의해 특징화되는" 암으로서 규정될 수 있다. 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 암은 대안으로, 악성 세포의 증식 및/또는 생존이 ERK 신호전달에 의해 "자극된", "유도된" 또는 "상향조절된" 암으로서 규정될 수 있다. 종양원성 ERK를 포함하는 암은 대안으로, "자극-독립된" ERK 신호전달을 포함하거나, 전시하거나 또는 이것에 의해 특징화되는 암으로서 규정될 수 있다.
"종양원성 돌연변이"는 치환 (단일 아미노산 치환 포함), 삽입 및/또는 결실을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 암 세포 증식 및/또는 생존을 증진하는, 야생형 단백질에 비하여 단백질에서 임의의 아미노산 변이를 포괄한다. 상기에서 지적된 바와 같이, 종양원성 돌연변이는 단백질 및 MAP-키나아제 경로 내에서 이의 기능에 따라서, 기능 상실 또는 기능 획득 돌연변이일 수 있다. "과다발현" 또는 "하향조절된 발현"은 각각, 비암성 세포에 비하여 암성 세포에서 단백질의 증가된 또는 감소된 발현을 지칭한다.
따라서, 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 암은 BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, KRAS4A, KRAS4B, MEK1, MEK2, ERK1 또는 ERK2; 예컨대 BRAF, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 또는 ERK2에서 종양원성 돌연변이, 또는 이것의 과다발현을 포함하는 것들을 포함한다. 이들 단백질은 MAP 키나아제 경로의 양성 조절인자 (다시 말하면, 종양단백질)이다 [72]. 예를 들면, 암은 BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 또는 ERK2에서 종양원성 돌연변이를 포함할 수 있다.
종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 암은 또한, RSK, DUSP1, DUSP5, DUSP6 또는 SPRY에서 종양원성 돌연변이, 또는 이것의 하향조절된 발현을 포함하는 것들을 포함한다 (상기 종양원성 돌연변이/과다발현에 대안적으로, 또는 이것에 더하여). 이들 단백질은 MAP 키나아제 경로의 음성 조절인자 (다시 말하면, 종양 억제인자 단백질)이다 [72].
종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 임의의 암, 예컨대 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양이 본 발명의 조성물을 이용하여 치료되거나 예방될 수 있다. 이런 암은 결장직장암, 흑색종, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병, 부신 피질 암종, 기저-세포 암종, 담관암, 방광암, 뼈 종양, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 유방암, 기관지 선종/카르시노이드, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종, 안구내 흑색종, 망막모세포종, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질 종양 (GIST), 생식 세포 종양, 신경교종, 아동기 시각 경로 및 시상하부, 호지킨 림프종, 도세포 암종, 카포시 육종, 신장 세포 암, 후두암, 백혈병, 림프종, 중피종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 인두암, 뇌하수체 선종, 형질 세포 신생물, 전립선암, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 육종, 고환암, 갑상선암, 또는 자궁암을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 임의의 암, 그리고 바람직하게는 결장직장암, 흑색종, 전립선암, 폐 선암종, 예컨대 비소세포 폐 선암종, 췌장암, 방광암, 백혈병, 예컨대 모발상 세포 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병, 신경교종, 털모양 성상세포종, 난소암, 유두상 또는 여포성 갑상선암, 정상피종, 간암, 골수형성이상 증후군, 신장암 또는 호지킨병이 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물에 의해 치료되거나 예방될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 BRAF에서 종양원성 돌연변이를 포함하는 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공하는데, 임의적으로 여기서 암은 BRAF의 과다발현을 더욱 포함한다. 본 발명자들은 메가스파에라 (Megasphaera) 균주로 치료가 결장직장암 및 흑색종 세포주에서 종양원성 BRAF 돌연변이, 특히 종양원성 BRAF V600E 돌연변이를 포함하는 암 세포주에서 클론원성 생존을 저해하고, ERK 신호전달을 저해하고, 그리고 MAP2 유전자 발현을 상향조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 이런 이유로, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 또한, BRAF의 위치 600에서 종양원성 돌연변이, 바람직하게는 BRAF V600E를 포함하는 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구체예에서, 암은 결장직장암 또는 흑색종이다.
BRAF의 위치 600에서 종양원성 돌연변이 (예컨대 V600E)에 더하여, 또는 이것 대신에, 암은 BRAF K601E, G469A, G469V, L597R, K601N, G464V, N581S, L597Q, A598V, G464R, G466A 또는 G469E에서 선택되는 종양원성 돌연변이를 포함할 수 있는데; 임의적으로 여기서 암은 결장직장암이다. 다른 구체예에서, V600E 돌연변이에 더하여, 또는 이것 대신에, 암은 BRAF V600K, V600R 또는 V600D에서 선택되는 종양원성 돌연변이를 포함할 수 있는데; 임의적으로 여기서 암은 흑색종이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 또한, 결장직장암, 예컨대 전이성 결장직장암을 치료하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명자들은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주가 결장직장암 세포주에서 클론원성 생존 및 ERK 신호전달을 저해할 수 있다는 것을 발견하였다.
추가의 양상에서, 본 발명은 또한, 흑색종, 예컨대 전이성 흑색종을 치료하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명자들은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주가 흑색종 세포주에서 클론원성 생존 및 ERK 신호전달을 저해할 수 있다는 것을 발견하였다. 게다가, 흑색종 세포주에서 MAP2 유전자 발현을 유도하는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 능력은 전이성 흑색종에 대한 특정 효능을 지시한다.
바람직한 구체예에서, BRAF 저해제가 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물의 투여에 비하여 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여된다. 바람직하게는, BRAF 저해제는 바람직하게는 베무라페닙, 파브라피닙 또는 엔코라페닙에서 선택되는, BRAFV600E의 선별적 저해제이다. 더욱 바람직하게는, BRAF 저해제는 베무라페닙이다.
본 발명의 추가의 양상에서, 본 발명은 또한, 암의 치료 또는 예방에서 동시적, 별개의 또는 순차적 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주 및 BRAF 저해제, 바람직하게는 앞서 규정된 것들을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 바람직한 구체예에서, 시티딘 유사체가 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물의 투여에 비하여 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여된다. 바람직하게는, 시티딘 유사체는 아자시티딘-c, 데시타빈, 또는 제불라린에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 시티딘 유사체는 아자시티딘-c이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 또한, 암의 치료 또는 예방에서 동시적, 별개의 또는 순차적 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주 및 시티딘 유사체, 바람직하게는 앞서 규정된 것들을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 바람직한 구체예에서, 튜불린 중합 저해제 또는 튜불린 해중합 저해제가 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물의 투여에 비하여 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여된다. 바람직하게는, 튜불린 중합 저해제 또는 튜불린 해중합 저해제는 파클리탁셀, 아브락산, 도세탁셀, 에포틸론, (+)-디스코데르몰리드, 콜히친, 콤브레타스타틴, 2-메톡시에스타라디올, E7010, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈플루닌; 더욱 바람직하게는 파클리탁셀에서 선택된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 또한, 암의 치료 또는 예방에서 동시적, 별개의 또는 순차적 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주 및 튜불린 중합 저해제 또는 튜불린 해중합 저해제, 바람직하게는 앞서 규정된 것들을 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 또한, 튜불린 중합 또는 해중합 저해제, 바람직하게는 앞서 규정된 것들에 대한 암의 감수성을 증가시킴으로써 암 요법에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 이와 같은 구체예에서, 본 발명은 하기를 제공한다:
1. 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물, 특히 여기서 암은 종양원성 ERK 신호전달을 포함한다.
2. 구체예 1에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, KRAS4A, KRAS4B, MEK1, MEK2, ERK1 또는 ERK2에서 종양원성 돌연변이, 또는 이것의 과다발현을 포함한다.
3. 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 RSK, DUSP1, DUSP5, DUSP6 또는 SPRY에서 종양원성 돌연변이, 또는 이것의 하향조절된 발현을 포함한다.
4. 구체예 2에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 BRAF, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 또는 ERK2에서 종양원성 돌연변이, 또는 이것의 과다발현을 포함한다.
5. 구체예 2에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 또는 ERK2에서 종양원성 돌연변이를 포함한다.
6. 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 BRAF 또는 NRAS에서 종양원성 돌연변이를 포함하고, 임의적으로 여기서 암은 BRAF 또는 NRAS의 과다발현을 더욱 포함한다.
7. 구체예 6에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 BRAF에서 종양원성 돌연변이를 포함하고, 임의적으로 여기서 암은 BRAF의 과다발현을 더욱 포함한다.
8. 구체예 7에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 BRAF의 위치 600에서 종양원성 돌연변이를 포함한다.
9. 구체예 6-8 중에서 어느 것에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 BRAF V600E, K601E, G469A, G469V, L597R, K601N, G464V, N581S, L597Q, A598V, G464R, G466A 또는 G469E에서 선택되는 종양원성 돌연변이를 포함하고; 임의적으로 여기서 암은 결장직장암이다.
10. 구체예 6-8 중에서 어느 것에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 BRAF V600E, V600K, V600R 또는 V600D에서 선택되는 종양원성 돌연변이를 포함하고; 임의적으로 여기서 암은 흑색종이다.
11. 구체예 6-10 중에서 어느 것에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 종양원성 돌연변이 BRAF V600E를 포함한다.
12. 구체예 6-11 중에서 어느 것에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 종양원성 돌연변이 NRAS Q61R을 포함하고, 임의적으로 여기서 암은 흑색종이다.
13. 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 결장직장암, 흑색종, 전립선암, 폐 선암종, 예컨대 비소세포 폐 선암종, 췌장암, 방광암, 백혈병, 예컨대 모발상 세포 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병, 신경교종, 털모양 성상세포종, 난소암, 유두상 또는 여포성 갑상선암, 정상피종, 간암, 골수형성이상 증후군, 신장암 또는 호지킨병에서 선택된다.
14. 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 결장직장암이다.
15. 구체예 1-13 중에서 어느 것에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 흑색종이다.
16. 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이다.
17. 암의 치료 또는 예방에서 ERK1 및/또는 ERK2 신호전달을 저해하는 방법에서, 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물.
18. 암의 치료 또는 예방에서 ERK1 및/또는 ERK2 인산화를 저해하는 방법에서, 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물.
19. 암의 치료 또는 예방에서 MAP2 유전자 발현을 유도하는 방법에서, 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물.
20. 암의 치료 또는 예방에서 종양 크기를 감소시키는, 종양 성장을 감소시키는, 전이를 예방하거나 또는 저해하는, 또는 혈관형성을 예방하는 방법에서, 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물.
21. 암의 치료에서 전이를 저해하는 방법에서, 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물.
22. 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 상기 방법은 조성물의 투여에 비하여, BRAF 저해제의 동시적, 별개의 또는 순차적 투여를 포함한다.
23. 구체예 22에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 BRAF는 BRAFV600E를 선별적으로 저해하고, 바람직하게는 여기서 BRAF 저해제는 베무라페닙, 파브라피닙 또는 엔코라페닙에서 선택된다.
24. 구체예 23에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 BRAF 저해제는 베무라페닙이다.
25. 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 상기 방법은 조성물의 투여에 비하여, 시티딘 유사체의 동시적, 별개의 또는 순차적 투여를 포함한다.
26. 구체예 25에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 시티딘 유사체는 아자시티딘-c, 데시타빈, 또는 제불라린에서 선택된다.
27. 구체예 26에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 시티딘 유사체는 아자시티딘-c이다.
28. 임의의 선행하는 구체예에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 상기 방법은 조성물의 투여에 비하여, 튜불린 중합 저해제 또는 튜불린 해중합 저해제의 동시적, 별개의 또는 순차적 투여를 포함한다.
29. 구체예 28에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 튜불린 중합 저해제 또는 튜불린 해중합 저해제는 파클리탁셀, 아브락산, 도세탁셀, 에포틸론, (+)-디스코데르몰리드, 콜히친, 콤브레타스타틴, 2-메톡시에스타라디올, E7010, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈플루닌에서 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 (특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 것들)을 이용하여 치료되거나 예방될 수 있는 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 암은 결장직장암, 흑색종, 전립선암, 폐 선암종, 예컨대 비소세포 폐 선암종, 췌장암, 방광암, 백혈병, 예컨대 모발상 세포 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병, 신경교종, 털모양 성상세포종, 난소암, 유두상 또는 여포성 갑상선암, 정상피종, 간암, 골수형성이상 증후군, 신장암 및 호지킨병을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이런 암은 과활동성 MAP-키나아제 경로 (다시 말하면, 종양원성 ERK 신호전달)를 포함하는 것으로 보고되었다 [72].
특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 BRAF 또는 NRAS에서 종양원성 돌연변이를 포함하는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것인데, 임의적으로 여기서 암은 BRAF 또는 NRAS의 과다발현을 더욱 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 (특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 것들)은 BRAF에서 종양원성 돌연변이, 그리고 BRAF의 임의적 과다발현을 포함하는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
BRAF에서 종양원성 돌연변이는 결장직장암에서 확인된 V600E, K601E, G469A, G469V, L597R, K601N, G464V, N581S, L597Q, A598V, G464R, G466A 또는 G469E를 포함하고 [73], 그리고 본 발명의 조성물 (특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 것들)은 이런 암을 치료하거나 예방하는 데 이용될 수 있다. BRAF에서 추가 종양원성 돌연변이는 흑색종에서 확인된 V600E, V600K, V600R 또는 V600D를 포함하고 [74], 그리고 본 발명의 조성물 (특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 것들)은 이런 암을 치료하거나 예방하는 데 이용될 수 있다. BRAF에서 아미노산은 UniProt 엔트리 P15056 [75] (야생형 BRAF)에 따라서 넘버링된다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물 (특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 것들)은 돌연변이 BRAF V600E를 포함하는 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 암 세포주 SKMEL28, 451Lu 및 HT29는 BRAF에서 이러한 돌연변이를 포함하고, 그리고 메가스파에라 (Megasphaera)의 균주는 실시예에서 이런 세포주에서 클론원성 생존을 저해하고, ERK 신호전달을 저해하고, MAP2 유전자 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 암은 종양원성 돌연변이 NRAS Q61R을 더욱 포함할 수 있다. 암 세포주 SKMEL2는 NRAS에서 이러한 돌연변이를 포함하고, 그리고 메가스파에라 (Megasphaera)의 균주는 실시예에서 이러한 세포주에서 MAP2 유전자 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
실시예에서 이용된 HT29 세포주는 결장직장암 세포주이고, 그리고 메가스파에라 (Megasphaera)의 균주는 이러한 세포주에서 클론원성 생존을 저해하고 ERK 신호전달을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물 (특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 것들)은 결장직장암, 예컨대 돌연변이 BRAF V600E를 포함하는 결장직장암을 치료하거나 예방하는 데 이용된다.
실시예에서 이용된 SKMEL2 및 SKMEL28 및 451Lu 세포주는 흑색종 세포주이고, 그리고 메가스파에라 (Megasphaera)의 균주는 이런 세포주에서 클론원성 생존을 저해하고, ERK 신호전달을 저해하고, MAP2 유전자 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물 (특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 것들)은 흑색종, 예컨대 돌연변이 BRAF V600E를 포함하는 흑색종을 치료하거나 예방하는 데 이용된다.
다른 양상에서, 본 발명의 조성물은 결장직장암을 치료하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명의 조성물은 흑색종을 치료하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함한다.
상기 상술된 양상과 구체예 중 어느 것에서, 본 발명의 조성물 (특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물)은 바람직하게는, 전이성 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 실시예에서 보고된 바와 같이, 메가스파에라 (Megasphaera)의 균주는 MAP2 유전자 발현을 상향조절하는 것으로 밝혀졌다. MAP2는 원발성 피부 흑색종에서는 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌지만, 전이성 흑색종에서는 발현이 감소하였다 [76]. 미소관-안정화 단백질의 증가된 발현, 또는 미소관 안정화 단백질, 예컨대 MAP2로 치료는 세포 분열 동안 필요한 미소관의 동적 불안정성을 간섭할 수 있는 것으로 제안되었다. 이런 이유로, MAP2의 상향조절은 세포 분열을 방해하고 암에서 종양 성장을 지연시키는 것으로 생각되는데 [76], 이것은 본 발명의 조성물이 전이성 암을 치료함에 있어서 특정 용도를 가질 수 있다는 것을 지시한다.
실시예에서 증명된 바와 같이, 메가스파에라 (Megasphaera) 균주를 포함하는 본 발명의 조성물은 흑색종 및 결장직장암 세포주에서 MAP2 유전자 발현을 유도하고 ERK 신호전달을 저해하는 효과를 갖는다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 앞서 규정된 바와 같이, 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 암의 치료 또는 예방에서, ERK 신호전달, 예컨대 ERK1 및/또는 ERK2 신호전달을 저해하는 방법에서 유용하다. 본 발명의 조성물은 이런 암의 치료 또는 예방에서, ERK 인산화, 예컨대 ERK1 및/또는 ERK2 인산화를 저해하는 방법에서 또한 유용하다. 본 발명의 조성물은 이런 암의 치료 또는 예방에서, MAP2 유전자 발현을 유도하는 방법에서 또한 유용하다. MAP2 유전자 발현은 미소관-표적화 화합물, 예컨대 파클리탁셀에 대한 증가된 암 민감도와 연관되었다 [77]. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 튜불린 중합 또는 해중합 저해제, 특히 파클리탁셀에 대한 이런 암의 감수성을 증가시키는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 암의 치료 또는 예방에서, 종양 크기를 감소시키는, 종양 성장을 감소시키는, 전이를 예방하거나 또는 저해하는, 또는 혈관형성을 예방하는 방법에서 또한 유용하다. 실시예에서 증명된 MAP2 유전자 발현에 대한 효과로 인해, 본 발명의 조성물은 바람직하게는, 이런 암의 치료에서 전이를 저해하는 방법에서 이용을 위한 것이다.
추가의 양상에서, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물은 암의 치료 또는 예방에서 ERK1 및/또는 ERK2 신호전달을 저해하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 추가의 양상에서, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물은 암의 치료 또는 예방에서 ERK1 및/또는 ERK2 인산화를 저해하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 추가의 양상에서, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물은 암의 치료 또는 예방에서 MAP2 유전자 발현을 유도하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 상기 추가 양상에서, 바람직하게는 암은 상기 상술된 바와 같이 특징화된다 ("암 및 이들의 특징").
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 소장암, 예컨대 소장 선암종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 실시예에서 이용된 메토트렉사트-처리된 HT29 세포주는 소장의 상피 세포와 닮은 표현형을 갖고, 그리고 본 발명의 조성물은 이런 세포에 대한 유용한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암, 특히 소장암의 치료 또는 예방에서 아폽토시스를 증진하는 데 이용된다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료 또는 예방에서 GPR109a 유전자 발현을 유도하는 방법에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료 또는 예방에서 IL-8 수준을 증가시키는 방법에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 결장직장암, 예컨대 결장직장 선암종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 실시예에서 이용된 Caco-2 세포주는 결장직장 선암종 세포주이고, 그리고 본 발명의 조성물은 이런 세포에 대한 유용한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
일정한 구체예에서, 이들 조성물은 전이성 흑색종, 소세포 폐암 또는 선편평상피 폐 암종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 실시예에서 도시된 NSE에 대한 효과는 본 발명의 조성물이 이들 암에 대항하여 특히 효과적일 수 있다는 것을 암시한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이 아니다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암이 아닌 질환 또는 장애를 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
백신 어쥬번트로서 용도
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. TNF-α는 백신 반응에 중요한 것으로 알려져 있다. 예를 들면, TNF-α는 노인 개체군의 독감 예방접종에서 효율적인 백신 반응을 위해 필요한 것으로 밝혀졌다 [78]. 본 발명의 조성물의 투여가 TNF-α 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 요법에서 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 증강하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 항원과 조합으로 투여되는 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 예방접종 직전에 또는 예방접종 후 환자에게 투여를 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 IL-6의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. 증가된 IL-6 발현은 많은 질환에 대한 백신 반응과 연관되었다. 예를 들면, 성인에게 인플루엔자 백신이 투여된 후, CD14+CD16- 염증성 단핵구에 의해 IL-6이 생산되었고 [79], 그리고 더욱 높은 수준의 IL-6은 인플루엔자 백신에 대한 백신 반응을 달성하는 것과 연관되었다 [80]. 게다가, AS03 어쥬번트 시스템의 주사 후, IL-6이 생산되었고 [81], 그리고 생쥐에서 IL-6의 하향조절은 결핵 백신의 투여 후, 보조 T 세포 반응을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 [82]. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-6 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 결핵 요법에서 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다.
게다가, IL-6과 TNF-α 발현은 치료적 HIV 백신 [Huang et al], 결핵 백신 및 클라미디아 백신 [83]의 효능과 상관하는 것으로 밝혀졌다. Su et al. [84]은 FMDV DNA 백신과 함께 IL-6 또는 TNF-α의 동시접종이 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 증가된 IFN-γ 발현, CD4+ T 세포에서 IL-4의 더욱 높은 발현, 그리고 더욱 높은 항원 특이적 세포독성 반응을 유발한다는 것을 보여주었다. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-6과 TNF-α 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α와 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HIV 요법에서 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 클라미디아 요법에서 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다.
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 MIP-3α의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. MIP-3α는 HIV 백신에 대한 반응을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [85]. 본 발명의 조성물의 투여가 MIP-3α 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. Li et al. [86]은 어쥬번트 수산화알루미늄이 IL-1β의 분비를 활성화시킨다는 것을 보여주었고, 그리고 IL-β 그 자체가 어쥬번트로서 행동할 수 있다는 것을 암시하였다. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 CD8+ T 세포 대 Tregs의 비율을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다. 어쥬번트는 CD8+ T 세포를 자극하는 것으로 밝혀졌고 [87], 그리고 본 발명의 조성물의 투여가 CD8+ T 세포 대 Tregs의 비율을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ T 세포 대 Tregs의 비율을 증가시킴으로써 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 IL-8의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. 증가된 Il-8 발현은 많은 질환에 대한 백신 반응과 연관되었다. 예를 들면, 더욱 높은 수준의 IL-8은 조류 인플루엔자 백신에 대한 백신 반응을 달성하는 것과 연관되었다 [88]. 게다가, IL-8은 DNA 예방접종 모형에서 분자 어쥬번트로서 역할을 한다 [89]. 이런 이유로, IL-8은 예를 들면, 조류 인플루엔자 백신의 면역 효율을 증강하기 위한 면역자극제로서 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-8 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 요법에서 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 백신 어쥬번트로서 이용될 때, 본 발명의 조성물은 스스로, 환자에게 별개로 투여된 항원에 대한 어쥬번트 효과를 제공하기 위해 투여될 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항원이 비경구 주사되는 동안, 경구 투여된다.
본 발명의 조성물은 임의의 유용한 항원에 대한 면역 반응을 증강하는 데 이용될 수 있다. 본 발명용으로 예시적인 항원은 바이러스 항원, 예컨대 바이러스 표면 단백질; 세균 항원, 예컨대 단백질 및/또는 당류 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원을 포함한다. 본 발명은 인플루엔자 바이러스, HIV, 구충, B형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 광견병, 호흡기 합포체 바이러스, 시토메갈로바이러스, 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 클라미디아, SARS 코로나바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 엡스타인 바르 바이러스, 인간 유두종 바이러스 등에 대항하는 백신용으로 특히 유용하다. 본 발명용으로 추가 항원은 당단백질과 리포글리칸 항원, 고세균류 항원, 흑색종 항원 E (MAGE), 암배아 항원 (CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn (STn), 인간 텔로머라아제 역전사효소 (hTERT), 윌름 종양 유전자 (WT1), CA-125, 전립선-특이적 항원 (PSA), 엡스타인 바르 바이러스 항원, 신항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9, 그리고 습관 형성 물질, 예를 들면, 니코틴, 알코올 또는 아편제를 포함한다.
본 발명용으로 바람직한 항원은 병원체 항원 및 종양 항원을 포함한다. 항원은 병원체로 감염으로부터 보호하거나 또는 종양을 공격하는 데 효과적일, 이러한 항원에 특이적인 면역 반응을 이끌어 낼 것이다. 항원은 예를 들면, 펩티드 또는 다당류일 수 있다.
본 발명은 또한, 환자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조에서, (i) 항원의 수성 제조물; 및 (ii) 메가스파에라 (Megasphaera) 속, 바람직하게는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이들 방법과 용도에 의해 상승된 면역 반응은 일반적으로, 항체 반응, 바람직하게는 방어적 항체 반응을 포함할 것이다.
일부 구체예에서, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주는 항원을 제시하도록 가공된다. 본 발명의 세균 균주 상에서 항원을 제시하는 것은 면역자극 활성을 최대화하고, 그리고 항원에 대하여 산출된 보호 면역 반응을 더욱 증강할 수 있다. 이에 더하여, 항원 및 본 발명의 세균을 포함하는 치료제를 제조하고 전달하는 것은 항원 및 세균 균주를 포함하는 조성물 각각이 별개로 제조되고 투여될 때보다 이러한 방식으로 더욱 효율적이고 효과적일 수 있다. 이런 이유로, 일부 구체예에서, 본 발명은 예를 들면, 세포 표면 상에 항원을 제시하는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 항원을 제시하는 세균 균주를 포함하는 조성물은 백신 항원으로서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 항원은 HIV, 구충, B형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 광견병, 호흡기 합포체 바이러스, 시토메갈로바이러스, 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 클라미디아, SARS 코로나바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidis), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 엡스타인 바르 바이러스 또는 인간 유두종 바이러스로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 항원은 당단백질 항원, 리포글리칸 항원, 고세균류 항원, 흑색종 항원 E (MAGE), 암배아 항원 (CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn (STn), 인간 텔로머라아제 역전사효소 (hTERT), 윌름 종양 유전자 (WT1), CA-125, 전립선-특이적 항원 (PSA), 엡스타인 바르 바이러스 항원, 신항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9 또는 습관 형성 물질, 예컨대, 알코올, 아편제 등이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세균은 하나 또는 그 이상의 항원을 발현한다. 일반적으로 항원은 재조합적으로 발현될 것이고 본 발명의 세균에 이종성일 것이다. 이런 이유로, 본 발명은 이종성 항원을 발현하는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 제공한다. 항원은 세균에 상동한 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드와 함께 발현된 융합 폴리펩티드의 부분일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 세균은 항원을 비-융합 폴리펩티드로서 발현한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주의 세포를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 세포는 이종성 항원을 발현한다. 일부 구체예에서, 조성물은 백신으로서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주의 세포를 제공하는데, 여기서 상기 세포는 이종성 항원을 발현한다. 일부 구체예에서, 세포는 백신으로서 이용을 위한 것이다.
본 발명용으로 예시적인 항원은 바이러스 항원, 예컨대 바이러스 표면 단백질; 세균 항원, 예컨대 단백질 및/또는 당류 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원을 포함한다. 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주에서 발현하기 위한 추가 항원은 당단백질 및 리포글리칸 항원, 고세균류 항원, 흑색종 항원 E (MAGE), 암배아 항원 (CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn (STn), 인간 텔로머라아제 역전사효소 (hTERT), 윌름 종양 유전자 (WT1), CA-125, 전립선-특이적 항원 (PSA), 엡스타인 바르 바이러스 항원, 신항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9, 그리고 습관 형성 물질, 예를 들면 니코틴, 알코올, 아편제, 또는 기타 유사한 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 비-전염성 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 다른 신경변성 장애에 대항하여 백신에 대한 반응을 증강하는 데 유용할 수 있는데, 이러한 사례에서 본 발명용으로 항원은 아밀로이드-베타 또는 타우일 수 있다. 비-전염성 질환을 위한 다른 이와 같은 항원은 PCSK9 (상승된 콜레스테롤의 치료용)를 포함한다.
본 발명은 또한, 습관 형성 물질, 예를 들면, 니코틴, 알코올 또는 아편제에 대항하여 백신에 대한 반응을 증강하는 데 유용할 수 있다.
세포 요법
키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T) 요법
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 IL-6의 발현에서 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여준다. 증가된 Il-6 발현은 만성 림프구 백혈병의 CD19 CAR-T 요법에 대한 반응과 상관되었다. 혈청 IL-6에서 증가는 CAR-T 세포 확대와 연관되었고, 반면 IL-6의 저해는 CAR-T 세포 증식의 저해와 연관되었다 [90]. 본 발명의 조성물의 투여가 IL-6 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 세포 요법, 특히 CAR-T 세포 요법에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 세포 요법에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CAR-T 세포 요법에서 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 만성 림프구 백혈병의 치료에서 이용을 위한 것이다.
놀랍게도, 실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 PBMCs의 개체군 내에 Tregs의 백분율을 선별적으로 감소시킨다는 것을 보여준다 (도 6c). Tregs의 선별적 고갈은 세포독성 림프구의 효능을 증강하는 것으로 밝혀졌다 [91]. CAR-T 세포는 세포독성 림프구의 부분집합이고, 그리고 이런 이유로, Tregs의 선별적 고갈은 CAR-T 세포 요법에서 효과적인 것으로 생각된다. 본 발명의 조성물의 투여가 Tregs를 고갈시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 조성물은 세포 요법, 특히 CAR-T 세포 요법에서 유용할 수 있다.
이런 이유로, 본 발명의 조성물은 세포 요법에서, 특히 세포 요법에 대한 반응을 증강하는 데 유용할 수 있다.
중간엽 줄기 세포 (MSC) 요법
중간엽 줄기 세포 (MSC) 요법은 면역자극 성질을 갖는 것으로 보고되었다. MSCs가 LPS로 처리될 때, 이들은 친염증성 사이토킨 IL-6과 IL-8을 상향조절하는데, 이것은 증가된 B 세포 증식을 유발한다 [92]. 이런 이유로, 본 발명의 조성물이 IL-6의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이들은 MSC 세포 요법과 병용으로 유용할 수 있다.
줄기 세포 이식 요법
줄기 세포 이식 요법에서 미분화된 줄기 세포를 이용하는 대신에, 이식에 앞서 줄기 세포를 얼마간 분화시키는 것이 유익할 수 있는 것으로 보고되었다. 예를 들면, Heng et al. [93]은 줄기 세포의 심근생성 분화가 더욱 높은 이식 효율, 근세포의 증강된 재생 및 심장 기능의 증가된 수복을 가짐으로써 유익할 수 있다고 보고하였다. 본 발명의 조성물의 투여가 미분화된 신경모세포종 세포에서 뉴런 분화를 개시하였기 때문에, 본 발명의 조성물은 줄기 세포 이식 요법에서 줄기 세포 분화에 유용할 수 있다.
면역노화
실시예는 또한, 본 발명의 조성물의 투여가 Tregs를 선별적으로 고갈시키고 B 세포 숫자를 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다 (도 6c 및 도 6f). Fulop et al. [94]은 Treg 세포 수에서 증가 및 B 세포 수에서 감소가 적응성 면역계에서 노화와 연관된다는 것을 확인하였다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하거나 또는 지연시키는 데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포 수에서 증가에 의해 특징화되는 면역노화를 지연시키는 데 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포 수에서 감소에 의해 특징화되는 면역노화를 지연시키는 데 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포 수에서 증가 및 B 세포 수에서 감소에 의해 특징화되는 면역노화를 지연시키는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포 수를 감소시킴으로써 면역노화를 지연시키는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포 수를 증가시킴으로써 면역노화를 지연시키는 데 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포 수를 감소시키고 B 세포 수를 증가시킴으로써 면역노화를 지연시키는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화에 의해 유발된 질환을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연시키고 및/또는 예방함으로써 노화-관련된 질환을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
게다가, 백신 어쥬번트가 면역노화를 극복할 수 있는 것으로 제안되었다 [95]. 본 발명의 조성물이 백신 어쥬번트로서 이용에 적합하기 때문에, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하거나 또는 지연시키는 데 유용할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서, 면역노화를 지연시키고 및/또는 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 백신 어쥬번트로서 이용을 위한 것인데, 여기서 이들 조성물은 면역노화를 지연시키고 및/또는 예방한다.
면역노화와 연관되는 질환은 심혈관 질환, 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 파킨슨병, 암, 제2형 당뇨병 [96] 및 자가면역 장애 [97]를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 심혈관 질환을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연시키고 및/또는 예방함으로써 심혈관 질환을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 질환을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연시키고 및/또는 예방함으로써 신경변성 질환, 특히 알츠하이머병 및 파킨슨병을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연시키고 및/또는 예방함으로써 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 제2형 당뇨병을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연시키고 및/또는 예방함으로써 제2형 당뇨병을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 자가면역 장애를 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연시키고 및/또는 예방함으로써 자가면역 장애를 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
투여 방식
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주로 장에 전달 및/또는 장의 부분적인 또는 전체 집락형성을 할 수 있게 하기 위해 위장관에 투여될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 경구 투여되지만, 이들은 직장, 비내, 또는 협측 또는 설하 루트를 통해 투여될 수도 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 거품, 스프레이 또는 겔로서 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 예를 들면, 테오브로마 오일 (코코아 버터), 합성 경지방 (예를 들면, 수포시르, 위텝솔), 글리세로-젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 비누 글리세린 조성물의 형태에서 좌약, 예컨대 직장 좌약으로서 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 튜브, 예컨대 비강영양관, 입위관, 위관, 공장조루술 튜브 (J 튜브), 경피적 내시경 위조루술 (PEG), 또는 포트, 예컨대 위, 공장 및 다른 적합한 접근 포트에 접근을 제공하는 흉벽 포트를 통해 위장관에 투여된다.
본 발명의 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 또는 이들은 치료 섭생의 일부로서 순차적으로 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 매일 투여될 것이다.
본 발명의 일정한 구체예에서, 본 발명에 따른 치료는 환자의 소화관 미생물총의 사정을 동반한다. 만약 본 발명의 균주의 전달 및/또는 이것으로 부분적인 또는 전체 집락형성이 효능이 관찰되는 정도로 달성되지 않으면 치료는 반복될 수 있고, 또는 만약 전달 및/또는 부분적인 또는 전체 집락형성이 성공적이고 효능이 관찰되면 치료는 중단될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 자궁내 소아에서 및/또는 소아가 출생한 후 암이 발달하는 가능성을 감소시키기 위해 임신 동물, 예를 들면, 포유동물, 예컨대 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 감소된 면역 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애로 진단되었거나, 또는 감소된 면역 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 위험에 처해 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 이들 조성물은 또한, 건강한 환자에서 감소된 면역 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 발달을 예방하기 위한 예방적 조치로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 암으로 진단되었거나, 또는 암의 위험에 처해 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 환자는 메가스파에라 (Megasphaera), 그리고 특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)에 의한 감소된 집락형성을 갖거나 또는 집락형성이 부재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품 산물, 예컨대 영양 보충제로서 투여될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 비록 이들이 단위 포유동물, 예컨대 가금류, 돼지, 고양이, 개, 말 또는 토끼를 비롯한 동물을 치료하는 데 이용될 수 있긴 하지만, 인간의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 동물의 성장 및 성과를 증강하는 데 유용할 수 있다. 만약 동물에게 투여되면, 경구 위관영양이 이용될 수 있다.
조성물
일반적으로, 본 발명의 조성물은 세균을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 조성물은 동결건조된 형태에서 조제된다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주를 포함하는 과립 또는 젤라틴 캡슐, 예를 들면, 경성 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 동결건조된 세균을 포함한다. 세균의 동결건조는 충분히 확립된 절차이고, 그리고 유관한 보도가 예를 들면, 참고문헌 [98,,100]에서 가용하다.
대안으로, 본 발명의 조성물은 살아있는, 활성 세균 배양액을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장에 세균 균주의 전달을 가능하게 하기 위해 캡슐화된다. 캡슐화는 예를 들면, 화학적 또는 물리적 자극, 예컨대 압력, 효소 활성, 또는 pH에서 변화에 의해 촉발될 수 있는 물리적 붕괴로 파열하는 것을 통해, 목표 위치에서 전달 때까지 조성물을 분해로부터 보호한다. 임의의 적합한 캡슐화 방법이 이용될 수 있다. 예시적인 캡슐화 기술은 다공성 매트릭스 내에 포획, 고체 운반체 표면상에 부착 또는 흡착, 면상반응에 의한 또는 교차연결 작용제로 자가-응집, 그리고 미소다공성 막 또는 마이크로캡슐 뒤에서 기계적 봉쇄를 포함한다. 본 발명의 조성물을 제조하는 데 유용할 수 있는 캡슐화에 관한 보도는 예를 들면, 참고문헌 [101] 및 [102]에서 가용하다.
조성물은 경구 투여될 수 있고, 그리고 정제, 캡슐 또는 분말의 형태일 수 있다. 메가스파에라 (Megasphaera)가 혐기균이기 때문에, 캡슐화된 산물이 선호된다. 다른 성분 (예컨대, 예를 들면, 비타민 C)이 생체내에서 전달 및/또는 부분적인 또는 전체 집락형성과 생존을 향상시키기 위한 산소 스캐빈저 및 프리바이오틱 기질로서 포함될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 식품 또는 영양적 산물, 예컨대 우유 또는 유장 기초된 발효된 유제품으로서, 또는 제약학적 산물로서 경구 투여될 수 있다.
조성물은 프로바이오틱으로서 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주의 치료 효과량을 포함한다. 세균 균주의 치료 효과량은 환자에게 유익한 효과를 발휘하는 데 충분하다. 세균 균주의 치료 효과량은 환자의 장에 전달 및/또는 이것의 부분적인 또는 전체 집락형성을 유발하는 데 충분할 수 있다.
예를 들면, 성인에 대한 세균의 적합한 일일량은 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 집락 형성 단위 (CFU); 예를 들면, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 108 내지 약 1 x 1011 CFU일 수 있다.
일정한 구체예에서, 세균의 용량은 적어도 하루에 109개 세포, 예컨대 하루에 적어도 1010, 적어도 1011, 또는 적어도 1012개 세포이다.
일정한 구체예에서, 조성물은 조성물의 중량에 대하여 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/g; 예를 들면, 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU/g의 양으로 세균 균주를 내포한다. 용량은 예를 들면, 1 g, 3g, 5g 및 10g일 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주의 양이 조성물의 중량에 대하여 그램당 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 집락 형성 단위인 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 제약학적 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 500mg 및 1000mg 사이, 600mg 및 900mg 사이, 700mg 및 800mg 사이, 500mg 및 750mg 사이, 또는 750mg 및 1000mg 사이의 용량으로 투여된다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 제약학적 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 제약학적 조성물에서 동결 건조된 세균은 500mg 및 1000mg 사이, 600mg 및 900mg 사이, 700mg 및 800mg 사이, 500mg 및 750mg 사이, 또는 750mg 및 1000mg 사이의 용량으로 투여된다.
전형적으로, 프로바이오틱, 예컨대 본 발명의 조성물은 임의적으로, 적어도 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 조합된다. 프리바이오틱 화합물은 통상적으로, 비소화성 탄수화물, 예컨대 올리고당류 또는 다당류, 또는 당 알코올인데, 이것은 상부 소화관에서 분해되거나 또는 흡수되지 않는다. 공지된 프리바이오틱스는 상업적인 산물, 예컨대 이눌린 및 트랜스갈락토-올리고당류를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 총 중량 조성물에 대하여 중량으로 약 1 내지 약 30% (예를 들면, 중량으로 5 내지 20%)의 양으로 프리바이오틱 화합물을 포함한다. 탄수화물은 하기와 같이 구성된 군에서 선택될 수 있다: 프럭토- 올리고당류 (또는 FOS), 짧은 사슬 프럭토-올리고당류, 이눌린, 이소말트-올리고당류, 펙틴, 자일로-올리고당류 (또는 XOS), 키토산-올리고당류 (또는 COS), 베타-글루칸, 경작가능 검 변형된 및 난소화성 전분, 폴리덱스트로스, D-타가토오스, 아카시아 섬유, 캐럽, 귀리, 그리고 감귤류 섬유. 한 양상에서, 프리바이오틱스는 짧은 사슬 프럭토-올리고당류 (단순함을 위해 본원에서 FOSs-c.c로서 아래에 도시됨)이다; 상기 FOSs-c.c는 일반적으로 첨채당의 전환에 의해 획득되고, 그리고 3개의 글루코오스 분자가 결합되는 사카로오스 분자를 포함하는 가소화성 탄수화물이 아니다.
본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 운반체를 포함할 수 있다. 이런 적합한 부형제의 실례는 참고문헌 [103]에서 발견될 수 있다. 치료적 용도를 위한 허용되는 운반체 또는 희석제는 제약 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 예를 들면, 참고문헌 [104]에서 설명된다. 적합한 운반체의 실례는 락토오스, 전분, 글루코오스, 메틸 셀룰로오스, 스테아르산마그네슘, 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 적합한 희석제의 실례는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다. 제약학적 운반체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 루트 및 표준 제약학적 관례에 대하여 선별될 수 있다. 제약학적 조성물은 운반체, 부형제 또는 희석제로서, 또는 이것에 더하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 실례는 전분, 젤라틴, 천연당, 예컨대 글루코오스, 무수성 락토오스, 자유 유동 락토오스, 베타-락토오스, 옥수수 감미료, 천연과 합성 검, 예컨대 아카시아, 트래거캔스 또는 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 윤활제의 실례는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등을 포함한다. 보존제, 안정제, 염료 및 심지어 풍미제가 제약학적 조성물에서 제공될 수 있다. 보존제의 실례는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품 산물로서 조제될 수 있다. 예를 들면, 식품 산물은 예컨대, 영양 보충제에서 본 발명의 치료 효과에 더하여 영양적 유익성을 제공할 수 있다. 유사하게, 식품 산물은 본 발명의 조성물의 맛을 증강하거나, 또는 상기 조성물이 제약학적 조성물보다는 통상적인 식품과 더욱 유사함으로써 소비하기에 더욱 매력적으로 만들어지도록 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 우유-기초된 산물로서 조제된다. 용어 "우유-기초된 산물"은 변하는 지방 함량을 갖는 임의의 액체 또는 반고체 우유- 또는 유장-기초된 산물을 의미한다. 우유-기초된 산물은 예를 들면, 우유, 산양유, 양유, 탈지된 우유, 전유, 어떤 처리도 없이 분말화된 우유 및 유장으로부터 재조합된 우유, 또는 가공된 산물, 예컨대 요구르트, 응유, 응유, 신 우유, 신 전유, 버터 우유 및 다른 신 우유 산물일 수 있다. 다른 중요한 군은 우유 음료, 예컨대 유장 음료, 발효유, 연유, 영아 또는 유아용 우유; 가미유, 아이스크림; 우유-내포 식품, 예컨대 사탕을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단일 세균 균주 또는 종을 내포하고 임의의 다른 세균 균주 또는 종을 내포하지 않는다. 이런 조성물은 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 다른 세균 균주 또는 종을 포함할 수 있다. 이런 조성물은 다른 종의 생물체가 실제적으로 없는 배양액일 수 있다.
본 발명에 따른 용도를 위한 조성물은 시판 승인을 필요로 하거나 또는 필요로 하지 않을 수도 있다.
일부 경우에, 동결건조된 세균 균주는 투여에 앞서 재구성된다. 일부 경우에, 재구성은 본원에서 설명된 희석제의 이용에 의한다.
본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 운반체를 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 치료가 필요한 개체에게 투여될 때 장애를 치료하는 데 충분한 양으로 있고; 그리고 여기서 상기 장애는 암, 예컨대 신경모세포종, 뇌암, 흑색종, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암이다. 추가 구체예에서 암은 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 만성 림프구 백혈병, 림프종 또는 혈액학적 악성종양이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 MAP2에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질환 또는 장애는 암, 예컨대 신경모세포종, 뇌암, 흑색종, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암이다. 추가 구체예에서 암은 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 만성 림프구 백혈병, 림프종 또는 혈액학적 악성종양이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 B3 튜불린에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질환 또는 장애는 암, 예컨대 신경모세포종, 뇌암, 흑색종, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암이다. 추가 구체예에서 암은 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 만성 림프구 백혈병, 림프종 또는 혈액학적 악성종양이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 DRD2에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질환 또는 장애는 암, 예컨대 신경모세포종, 뇌암, 흑색종, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암이다. 추가 구체예에서 암은 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 만성 림프구 백혈병, 림프종 또는 혈액학적 악성종양이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 HDAC에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질환 또는 장애는 암, 예컨대 신경모세포종, 뇌암, 흑색종, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암, 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 만성 림프구 백혈병, 림프종 또는 혈액학적 악성종양이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 친염증성 사이토킨, 예컨대 IL-1β, TNF-α, MIP-3α, IL-23 또는 IL-6에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 TNF-α에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 IL-8에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 CD11b에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질환 또는 장애는 암, 예컨대 신경모세포종, 뇌암, 흑색종, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암이다. 추가 구체예에서 상기 암은 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 만성 림프구 백혈병, 림프종 또는 혈액학적 악성종양이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 Casp3에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질환 또는 장애는 암, 예컨대 신경모세포종, 뇌암, 흑색종, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암이다. 추가 구체예에서 상기 암은 난소암, 자궁경부암, 교모세포종, 암종, 만성 림프구 백혈병, 림프종 또는 혈액학적 악성종양이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주의 양이 조성물의 중량에 대하여 그램당 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 집락 형성 단위인 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 1 g, 3 g, 5 g 또는 10 g의 용량에서 투여되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 경구, 직장, 피하, 코, 협측 및 설하로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 투여되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 락토오스, 전분, 글루코오스, 메틸 셀룰로오스, 스테아르산마그네슘, 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군에서 선택되는 운반체를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 에탄올, 글리세롤 및 물로 구성된 군에서 선택되는 희석제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 전분, 젤라틴, 글루코오스, 무수성 락토오스, 자유 유동 락토오스, 베타-락토오스, 옥수수 감미료, 아카시아, 트래거캔스, 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 및 염화나트륨으로 구성된 군에서 선택되는 부형제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 보존제, 항산화제 및 안정제 중에서 적어도 한 가지를 더욱 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르로 구성된 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 세균 균주가 동결건조되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 밀봉된 용기에서 약 4℃ 또는 약 25℃에서 보관되고 상기 용기가 50% 상대 습도를 갖는 공기에서 배치될 때, 집락 형성 단위에서 계측에서 세균 균주 중에서 적어도 80%가 적어도 약: 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 2.5 년 또는 3 년의 기간 후 남아있는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
배양하는 방법
본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 예를 들면, 참고문헌 [105,107]에서 상술된 바와 같은 표준 미생물학 기술을 이용하여 배양될 수 있다.
배양에 이용되는 고체 또는 액체 배지는 YCFA 한천 또는 YCFA 배지일 수 있다. YCFA 배지는 하기를 포함할 수 있다 (100ml마다, 근사 값): 카시톤 (1.0 g), 효모 추출물 (0.25 g), NaHCO3 (0.4 g), 시스테인 (0.1 g), K2HPO4 (0.045 g), KH2PO4 (0.045 g), NaCl (0.09 g), (NH4)2SO4 (0.09 g), MgSO4 ㆍ 7H2O (0.009 g), CaCl2 (0.009 g), 레자주린 (0.1 mg), 헤민 (1 mg), 비오틴 (1 μg), 코발라민 (1 μg), p-아미노벤조산 (3 μg), 엽산 (5 μg), 그리고 피리독사민 (15 μg).
백신 조성물에서 이용을 위한 세균 균주
본 발명자들은 본 발명의 세균 균주가 감소된 면역 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 유용하다는 것을 확인하였다. 이것은 본 발명의 세균 균주가 숙주 면역계에 대해 갖는 효과의 결과일 가능성이 높다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 또한, 백신 조성물로서 투여될 때, 암과 같은 질환 또는 장애를 예방하는 데 유용할 수 있다. 일정한 이런 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 사멸되거나, 비활성화되거나 또는 약독화될 수 있다. 일정한 이런 구체예에서, 조성물은 백신 어쥬번트를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 조성물은 주사에 의한, 예컨대 피하 주사에 의한 투여를 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 포름산의 수준을 감소시킨다. 포름산은 전자 전달 연쇄계의 최종 전자 수용체인, 시토크롬 옥시다아제 활성을 저해함으로써 미토콘드리아 전자 수송 및 에너지 생산을 교란하는 데 연루된 포름산염의 짝염기이다. 따라서, 포름산, 그리고 따라서 포름산염의 감소는 반응성 산소 종의 축적의 어느 한 쪽 시토크롬 옥시다아제 저해를 통해 세포 사멸의 발생을 감소시킬 것이다. 따라서, 일정한 구체예에서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주는 포름산의 수준을 감소시킴으로써, 질환의 치료에서 면역계를 자극한다.
일반적
본 발명의 실시는 별도로 지시되지 않으면, 당해 분야의 기술 내에 화학, 생화학, 분자생물학, 면역학 및 약리학의 전통적인 방법을 이용할 것이다. 이런 기술은 기존 문헌에서 충분히 설명된다. 참조: 예를 들면, 참고문헌 [108] 및 [109,115] 등.
용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐만 아니라 "구성되는"을 포괄한다, 예를 들면, X를 "포함하는" 조성물은 X로 배타적으로 구성될 수 있거나, 또는 추가로 무언가, 예를 들면, X + Y를 포함할 수 있다.
수치 값 x와 관련하여 용어 "약"은 임의적이고 예를 들면, x +10%를 의미한다.
단어 "실제적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다, 예를 들면, Y가 "실제적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요한 경우에, 단어 "실제적으로"는 본 발명의 정의로부터 제외될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 서열 동일성 백분율에 대한 언급은 정렬될 때, 뉴클레오티드들의 상기 백분율이 이들 두 서열의 비교에서 동일하다는 것을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 퍼센트는 당해 분야에서 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들면, 참고문헌 [116]의 섹션 7.7.18에서 설명된 것들을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 12의 갭 개방 페널티 및 2의 갭 연장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스에서 아핀 갭 검색을 이용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 참고문헌 [117]에서 개시된다.
특정적으로 언급되지 않으면, 다양한 단계를 포함하는 과정 또는 방법은 상기 방법의 시작 또는 종결 시점에서 추가 단계를 포함할 수 있거나, 또는 추가 개재성 단계를 포함할 수 있다. 또한, 단계는 적절하면, 조합되거나, 제외되거나, 또는 대안적 순서에서 수행될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예가 본원에서 설명된다. 각 구체예에서 특정된 특질은 추가 구체예를 제공하기 위해 다른 특정된 특질과 조합될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 특히, 본원에서 적합한, 전형적인 또는 바람직한 것으로 부각된 구체예는 서로 조합될 수 있다 (이들이 상호간에 배타적일 때를 제외하고).
발명을 실행하기 위한 방식
실시예 1 - MRx0029는 SH-SY5Y 세포에서 성숙 표현형을 유도한다
도입
본 발명자들은 신경모세포종 세포에서 신경분화 마커, β3튜불린 및 MAP2의 발현에 대한 MRx0029의 효과를 확인하는 것을 모색하였다. β3튜불린은 뉴런에서 전분화의 마커이고, 그리고 MAP2는 성숙 (분화된) 뉴런의 마커이다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
SH-SY5Y 세포
방법
qPCR
SH-SY5Y는 10cm 페트리 접시에서 2x106개 세포의 밀도로 도말되었다. 24 시간 후, 세포는 10% 세균 상층액 또는 YCFA+, 10uM RA, 200uM 헥산산 또는 200uM 발프로산을 포함하는 분화 배지 (RA 없이 1% FBS를 내포하는 성장 배지)에서 17 시간 동안 처리되었다. 그 이후, 대표적인 이미지가 40X/0.65 배율에서 위상차 EVOS XL 코어 현미경을 이용하여 촬영되었다. 세포가 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNAs가 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현이 qPCR을 이용하여 계측되었다. GAPDH가 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화가 2(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다.
면역표지화 및 세포 영상화
세포는 8-웰 챔버 슬라이드 (Marienfeld Laboratory Glassware) 위에 하룻밤 동안 5x104개 세포/웰로 파종되고, 그리고 24 시간 동안 10% 세균 상층액으로 처리되었다. 분화를 위해, 세포는 24 시간 동안 세포-없는 세균 상층액으로 처리하기 전 5 일 동안 10 nM RA로 처리되었다.
그 후, 이들 세포는 실온 (RT)에서 20 분 동안 PBS에서 4% 파라포름알데히드로 고정되었다. 고정된 세포는 PBS로 세척되고, 그리고 10 분 동안 PBS에서 1% Triton X-100으로 투과화되었다. PBS로 세척한 후, 슬라이드는 4℃에서 12 시간 동안 1% BSA/PBS에서 희석된 항-MAP2 항체 또는 β3-튜불린 (각각 sc-74421 및 sc-80005, Santa Cruz Biotechnology Inc)을 첨가하기 전, 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 (4% BSA/PBS)과 함께 배양되었다. 이들은 이후, PBS로 2회 세척되고, 그 이후에 실온에서 1 시간 동안 Alexa Flour 488 접합된 항생쥐 (Molecular Probes Inc) 및 Alexa Flour 594 접합된 팔로이딘 (ab176757, Abcam)과 함께 배양되었다. PBS로 3X 세척한 후, 슬라이드는 DAPI로 염색되고 Vectashield® (Vector laboratories)가 적재되었다. 슬라이드는 이용된 플루오로크롬의 검출에 적합한 63x/1.2 W Korr 대물렌즈 및 필터 세트가 구비된 Axioskop 50 현미경 (Zeiss)을 이용하여 개관되었다. MAP-2로 면역표지화된 이미지의 디지털 획득을 위한 수동 노출 시간은 일정하게 유지되어 상이한 웰 및 처리 사이에 비교를 허용하였다. 팔로이딘 (F-액틴) 및 DAPI 노출 시간은 시계에 알맞도록 변하였다. 무작위화된 시계는 Image Pro Plus 소프트웨어에 의해 제어되는 QImaging 카메라를 이용하여 획득되었다. 이미지는 TIFF 파일로서 저장되고 Adobe Photoshop CC 2015.1.2에서 열렸다. MAP-2, DAPI 및 팔로이딘 이미지의 이미지는 덧씌워지고 병합되었다. 대표적인 이미지는 조사된 단백질의 존재비 및 위치에서 차이를 도해하도록 선별되었다.
면역블롯팅
SH-SY5Y 세포는 전술된 지시된 조건 하에 배양되고, MRx0029로 24 시간 동안 처리되고, 그리고 이후, 프로테아제 저해제의 칵테일을 내포하는 RIPA 완충액 (Roche Diagnostics, UK)에서 용해되었다. 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 이용하여 추정되고, SDS-PAGE에 의해 분리되고, PVDF 막으로 이전되었다. 막은 이후, 5% 탈지분유 또는 5% BSA로 차단되고, 그리고 4℃에서 하룻밤 동안 일차 항체 (각각 MAP2 및 β3-튜불린)와 함께 배양되었다. 블롯은 이후, 온당한 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합된 이차 항체와 함께 배양되었고, 그리고 단백질이 화학발광 검출 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 의해 검출되었다. MAP2 및 β3-튜불린 둘 모두의 경우에, β-액틴이 표본 사이에서 단백질 부하 가변성을 모니터링하기 위한 대조로서 역할을 하였다.
결과
MRx0029는 미분화된 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서 β3튜불린의 발현을 유도한다. 도 1은 MRx0029로 처리가 처리되지 않은 SH-SY5Y 세포와 비교하여 β3튜불린의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다.
MRx0029는 미분화된 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서 MAP2의 발현을 유도한다. 도 2는 MRx0029로 처리가 처리되지 않은 SH-SY5Y 세포와 비교하여 MAP2의 발현을 유의미하게 증가시켰다는 것을 보여준다.
논의
이들 결과는 MRx0029가 분화, 특히 뉴런 분화를 증진하는 데 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다. 게다가, 이들 결과는 MRx0029가 뇌암, 특히 신경모세포종, 그리고 흑색종, 특히 전이성 흑색종의 치료에서 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 2 - MRx0029는 SH-SY5Y 세포에서 DRD2의 발현을 감소시킨다
도입
본 발명자들은 신경모세포종 세포에서 DRD2의 발현에 대한 MRx0029의 효과를 확인하는 것을 모색하였다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
SH-SY5Y 세포
방법
본 발명자들은 실시예 1에서 설명된 바와 동일한 방법을 이용하여, 신경모세포종 세포에서 DRD2 발현에서 변화를 계측하였다.
결과
MRx0029는 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서 DRD2의 발현을 감소시킨다. 도 3은 MRx0029로 처리가 처리되지 않은 SH-SY5Y 세포와 비교하여 DRD2의 발현을 유의미하게 감소시켰다는 것을 보여준다.
논의
이것은 MRx0029가 암의 치료에서 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 3 - MRx0029는 SH-SY5Y 세포에서 카스파제 3의 상향조절을 유도한다
도입
본 발명자들은 신경모세포종 세포에서 카스파제 3 (Casp3)의 발현에 대한 MRx0029의 효과를 확인하는 것을 모색하였다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
SH-SY5Y 세포
방법
본 발명자들은 신경모세포종 세포에서 Casp3 발현에서 변화를 계측하였다.
결과
MRx0029는 미분화된 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서 Casp3의 상향조절을 유도한다. 도 4는 MRx0029로 처리가 처리되지 않은 SH-SY5Y 세포와 비교하여 Casp3의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. 특히, 도 4는 MRx0029의 투여가 대조와 비교하여, Casp3의 발현을 3배 증가시켰다는 것을 보여준다.
논의
미분화된 SH-SY5Y 세포에서, MRx0029에 의한 Casp3 유전자 발현에서 증가는 세포 분화 및 예정된 세포 사멸, 예컨대 아폽토시스의 유도 둘 모두에 연계될 수 있었다.
카스파제 3은 처형자 카스파제이고, 그리고 이런 이유로 아폽토시스와 연관된다. 조절장애가 발생된 아폽토시스는 암에 연루되었고, 그리고 이런 이유로, 이들 결과는 MRx0029가 암의 치료에서 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다.
카스파제는 세포 분화에서 일정한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, MRx0029로 치료 후 Casp3 발현에서 증가는 MRx0029가 세포 분화를 증가시키는 데 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4 - SH-SY5Y 세포에서 MTT 검정:
도입
본 발명자들은 생존가능 세포의 숫자에서 반영되는 세포 대사 활동을 사정하기 위해 폭넓게 이용되는 방법인 MTT 검정을 이용하여, 신경모세포종 세포 생존력에 대한 MRx0029의 효과를 확인하는 것을 모색하였다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
SH-SY5Y 세포
방법
MTT 검정
SH-SY5Y 세포는 10,000개 세포/웰의 파종 밀도로 도말되었고, 24 시간 후 세포가 정지기 배양액으로부터 상이한 농도 (백분율 v/v로서 표현됨)의 세포-없는 세균 상층액을 갖는 100ul의 1% FBS 성장 배지에서 22 시간 동안 처리되었다. 그 후에 10μl의 MTT 용액이 첨가되었고, 그리고 세포가 CO2 배양기에서 4 시간 동안 배양되었고, 이러한 시간의 종결 시점에서 0.04 HCL을 포함하는 100μl의 이소프로판올이 각 웰에 첨가되었다. 흡광도가 560nm 파장 및 655 nm의 참조 파장에서 계측되었다. MTT 검정 키트는 Merck Millipore (카탈로그 번호 CT01)로부터 구입되었다.
결과
MRx0029는 신경모세포종 세포 생존력에 대한 용량 의존성 효과를 보여주었는데, 여기서 10% MRx0029는 대조와 비교하여 생존력을 대략 70% 감소시켰다. 10%의 MRx0029 세포-없는 세균 상층액으로 처리는 세포 생존력에서 감소를 보여주었다. 이들 실험의 결과는 도 5에서 도시된다.
논의
이것은 MRx0029가 세포 사멸을 증가시키는 데 효과적인 조성물일 수 있고, 그리고 이런 이유로 MRx0029가 암의 치료에서 이용을 위한 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 5 - 건강한 공여자로부터 PBMCs에 대한 기본 세포 표현형분석
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
방법
PBMCs 처리
동결된 건강한 인간 PBMCs가 Stem Cells Technologies (Cambridge UK)로부터 구입되었다. 간단히 말하면, 세포는 해동되고, 그리고 37 ℃에서 CO2 배양기에서 완전 성장 배지 (10% FBS, 2mM L. 글루타민, 55μM 2-메르캅토에탄올 및 100 U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640)에서 하룻밤 동안 안정 상태로 남겨졌다. 실험을 위해 세포가 48 웰 평판에서 750,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었고, 그리고 1 ng/ml LPS의 존재 또는 부재에서 10% 세균 상층액을 포함하는 완전 성장 배지에서 처리되었다. 세포 배양 배지가 처리되지 않은 웰에 첨가되었다. 세포가 72 시간 동안 안정 상태로 남겨졌고, 그 후에 세포-없는 상층액이 수집되고 4 ℃에서 10,000g에서 3 분 동안 스핀다운되었다. 표본은 사이토킨 분석을 위해 -80℃에서 보관되었다.
면역표현형분석
살아있는 세포 및 죽은 세포를 구별하기 위해, 표본마다 1.5x106개 세포가 생존력 고정가능 염료 (Miltenyi)로 실온에서 10 분 동안 염색되었다. 그 후, 이들 세포는 기본 면역표현형분석 (CD3/CD4/CD8/CD25/CD127 및 CD19)을 위해 아래에 열거된 항체의 칵테일 (Miltenyi)로 염색되고 실온에서 10 분 동안 배양되었다.
하기의 세포 개체군의 백분율을 계측하기 위한 실험이 수행되었다:
ㆍ CD4+ CD3+ 세포 (CD4 T-보조 세포의 마커)
ㆍ CD4+ CD25+ 세포 (CD4+ 활성화된 세포의 마커)
ㆍ CD4+ 세포 개체군 중에서 CD25++ CD17- 세포 (Tregs 세포의 마커)
ㆍ CD8+ CD3+ 세포 (세포독성 T 세포의 마커)
ㆍ CD25+ CD8+ 세포 (CD8+ 활성화된 세포의 마커)
ㆍ CD19+ CD3- 세포 (B 세포의 마커).
CD8+/Tregs의 비율 및 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율이 결정되었다.
항체
Figure pct00001
결과
이들 실험의 결과는 도 6에서 도시된다.
가장 놀라운 결과는 Treg 세포를 대표하는 CD25++ CD17- 세포의 백분율에 대한 MRx0029 처리의 효과이다 (참조: 도 6c). MRx0029는 PBMC 개체군에서 Tregs의 백분율을 선별적으로 감소시켰다. MRx0029 처리는 CD4 T-보조 세포, CD4+ 활성화된 세포, 세포독성 T 세포, CD8+ 활성화된 세포 또는 B 세포의 백분율을 유의미하게 변화시키지 않았다.
MRx0029로 처리는 처리되지 않은 세포와 비교하여 CD8+/Tregs의 비율 및 활성화된 CD8/Treg 세포의 비율을 증가시켰다 (참조: 도 6g 및 도 6h).
논의
MRx0029로 처리가 Tregs의 백분율을 선별적으로 감소시키고, 따라서 CD8/Treg 및 활성화된 CD8/Treg의 비율을 증가시킨다는 관찰 결과는 놀라운데, 그 이유는 MRx0029가 부티르산염을 생산하고, 그리고 부티르산염 생산이 Tregs의 개체군에서 증가와 연관되었기 때문이다.
건강한 공여자로부터 PBMCs에서 MRx0029의 기본 면역표현형분석 프로필은 MRx0029로 처리가 림프구 개체군에서 Tregs의 상대적 백분율을 감소시킨다는 것을 암시하는데, 이것은 CD8/Tregs 세포 사이에 증가하는 비율에서 반영된다.
이것은 MRx0029가 면역 반응을 자극하고, 그리고 Tregs에 의한 면역 억제를 감소시키는 데 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다. 이들 결과는 또한, MRx0029가 암의 치료에서 이용을 위한 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 6 - 건강한 공여자로부터 PBMCs의 사이토킨 분석
도입
본 발명자들은 MRx0029와 함께 배양후 PBMCs를 더욱 분석하는 것을 모색하였다. 본 발명자들은 친염증성 사이토킨 TNF-α, IL-1β 및 IL-23을 비롯하여, MRx0029으로 처리 시에 PBMCs로부터 특정 사이토킨의 발현을 분석하였다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
방법
PBMCs 처리
PBMCs는 실시예 5에서 설명된 바와 같이 처리되었다.
사이토킨 정량
제조업체의 권고 (Thermo Fischer Scientific)에 따라서 ProcartaPlex 멀티플렉스 면역검정을 이용하여 사이토킨 정량이 수행되었다. 간단히 말하면, 50 μl의 세포-없는 공동배양 상층액이 xPONENT 소프트웨어 (Luminex, Austin, TX, USA)가 구비된 MAGPIX® MILLIPLEX® 시스템 (Merck)을 이용한 사이토킨 정량에 이용되었다. 데이터는 평균 형광 강도를 pg/ml 값으로 전환하기 위한 5-파라미터 로지스틱 곡선 및 배경 차감을 이용하는 MILLIPLEX® 분석가 소프트웨어 (Merck)를 이용하여 분석되었다.
결과
건강한 공여자로부터 PBMC 배양액에서 MRx0029의 사이토킨 분석에 대한 결과는 MRx0029에 대한 면역자극 시그너처를 증명하였다. 특히, MRx0029 처리는 TNF-α, IL-1β 및 IL-23의 발현을 증가시켰다.
이들 결과는 또한, MRx0029로 처리가 MIP-3α, IL-6 및 IL-10의 발현을 증가시켰다는 것을 증명한다. MCP-1, CXCL9 및 GMCSF의 발현 수준은 대조와 유사하였다.
논의
이것은 MRx0029가 면역자극 성질을 갖고, 그리고 면역자극을 위한 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다. 이들 결과는 또한, MRx0029가 암의 치료에서 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 7 - 상이한 세포 개체군의 유세포 분석
도입
본 발명자들은 MRx0029와 함께 배양후 PBMCs를 더욱 분석하는 것을 모색하였다. 유세포 분석이 CD4 세포 (CD4+ CD3+), Tregs (CD25++ CD127-) CD8 세포 (CD8+ CD3+) 및 B 세포 (CD19+ CD3-)의 백분율을 결정하는 데 이용되었다.
방법
PBMC 처리
PBMCs는 실시예 5에서 설명된 바와 같이 처리되었다.
상이한 세포 개체군의 유세포 분석
살아있는 세포 및 죽은 세포를 구별하기 위해, 표본마다 1.5x106개 세포가 생존력 고정가능 염료 (Miltenyi)로 실온에서 10 분 동안 염색되었다. 그 후, 이들 세포는 기본 면역표현형분석 (CD3/CD4/CD8/CD25/CD127 및 CD19)을 위해 아래에 열거된 항체의 칵테일 (Miltenyi)로 염색되고 실온에서 10 분 동안 배양되었다. 세포는 이후, 세척되고, PBS에서 재현탁되고, 그리고 청색 (488nm), 적색 (633nm) 및 보라색 (405nm) 레이저가 구비된 FACS Aria II를 이용하여 즉시 분석되었다. FMOs가 모든 실험에 걸쳐 포함되었다. 분석을 위해 Flowjo 버전 10.4.2 소프트웨어 (FlowJo, LLC)가 이용되었다.
결과
유세포분석 실험에 대한 결과는 도 8에서 도시된다.
도 8a는 PBMCs의 0.73%가 Tregs (CD25++ CD127-)이라는 것을 도시한다.
논의
이들 결과는 MRx0029가 Tregs를 하향조절하는 데 유용할 수 있다는 것을 증명한다. 게다가, 이들 결과는 MRx0029가 면역 반응을 자극하고, 그리고 Tregs에 의한 면역 억제를 감소시키는 데 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다. 이들 결과는 또한, MRx0029가 암의 치료에서 이용을 위한 효과적인 조성물일 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 8 - MRx0029는 MG U373 세포에서 IL-8 분비를 증가시킨다
도입
본 발명자들은 신경모세포종 세포에서 IL-8의 분비에 대한 MRx0029의 효과를 확인하는 것을 모색하였다. 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 IL-8의 수준을 조정하는 능력을 관찰하기 위해, LPS와 조합으로 MRx0029를 포함하는 조성물로 처리되었다. IL-8은 면역자극 효과를 갖는 대식세포에 의해 지배적으로 분비되는 친염증성 사이토킨이다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
MG U373은 악성 종양으로부터 유래된 인간 교모세포종 성상세포종이고, 그리고 Sigma-Aldrich (카탈로그 번호 08061901-1VL)로부터 구입되었다. MG U373 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, 1X MEM 비필수 아미노산 용액 및 1X 피루브산나트륨으로 보충된 MEM (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 M-2279)에서 성장되었다.
방법
일단 성장되면, MG U373 세포는 24-웰 평판에서 100,000개 세포/웰로 도말되었다. 이들 세포는 단독으로 또는 MRx0029로부터 10%의 세균 상층액과 함께 LPS (1ug/mL)로 24 시간 동안 처리되었다. LPS는 친염증성 사이토킨, 예컨대 IL-8의 공지된 자극기이다. 그 후, 세포-없는 상층액이 수집되고, 4℃에서 3분 동안 10,000g에서 원심분리되었다. IL-8은 제조업체의 사용설명서에 따라서 Peprotech로부터 인간 IL-8 ELISA 키트 (카탈로그 번호 #900-K18)를 이용하여 계측되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 9에서 도시된다. 상기 세균 균주로 이들 세포의 처리는 LPS의 존재와는 관계없이 IL-8 분비에서 증가를 야기한다.
논의
이들 결과는 MRx0029가 IL-8 분비를 증가시키는 데 유용할 수 있다는 것을 증명한다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 질환, 특히 감소된 면역 활성화에 의해 특징화되는 질환 및 증가된 면역 반응에 의해 치료가능한 질환의 치료에서 유용할 수 있다.
실시예 9 - MRx0029는 HT-29 세포에서 히스톤 탈아세틸화효소 활성의 수준을 감소시킨다
도입
히스톤 탈아세틸화효소 활성을 변경하는, MRx0029를 포함하는 조성물의 능력이 조사되었다. HDACi는 다양한 암 세포주에서 성장 정지, 분화, 아폽토시스, 혈관형성의 감소 및 면역 반응의 조정을 유발하는 것으로 밝혀졌다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
히스톤 탈아세틸화효소가 존재하기 때문에, 세포주 HT-29가 이용되었다.
방법
정지기 세균 배양액의 세포-없는 상층액이 원심분리 및 0.22 uM 필터에서 여과에 의해 단리되었다. HT-29 세포가 합류후 3 일에 이용되고, 그리고 실험의 시작보다 24 시간 앞서 1 mL DTS에서 점감되었다. HT-29 세포는 DTS에서 희석된 10 % 세포-없는 상층액으로 공격되었고, 그리고 48 시간 동안 배양되도록 방치되었다. 이후, 뉴클레아제 단백질이 Sigma Aldrich 뉴클레아제 추출 키트를 이용하여 추출되었고, 그리고 표본은 HDAC 활성 계측에 앞서 즉시 동결되었다. HDAC 활성은 Sigma Aldrich (UK) 키트를 이용하여 형광분석적으로 사정되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 10에서 도시된다. 도 109는 MRx0029가 히스톤 탈아세틸화효소 활성의 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.
논의
이들 결과는 MRx0029가 HDAC 활성의 저해를 통해, 후성적 이상에 의해 특징화되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 유망한 후보라는 것을 증명한다. 암은 후성적 이상에 의해 특징화되는 질환이다. 게다가, HDAC 저해제 (HDACi)는 다양한 암 세포주에서 성장 정지, 분화, 아폽토시스, 혈관형성의 감소 및 면역 반응의 조정을 유발하는 것으로 밝혀진 유망한 항암 약물의 급부상하는 부류이다. 이런 이유로, 이들 결과는 본 발명의 조성물이 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위해 효과적일 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 10 - 히스톤 탈아세틸화 저해의 기전의 추가 분석
도입
소화관 미생물 균총은 이의 막대한 다양성 및 물질대사 능력으로, HDAC 활성에 영향을 주는 잠재력을 갖는 방대한 다양한 분자의 생산을 위한 거대한 물질대사 보관소를 나타낸다. 본 발명자들은 이런 이유로, 어떤 대사산물이 HDAC 저해에 대한 책임이 있는 지를 결정하고, 그리고 저해가 달성되는 기전을 더욱 석명하려 모색하였다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
방법
세균 배양 및 세포-없는 상층액 수집
세균의 순수한 배양액은 이들이 그들의 정체 성장기에 도달할 때까지, YCFA+ 액상배지에서 혐기성으로 성장되었다. 배양액은 5,000 x g에서 5 분 동안 원심분리되었고, 그리고 세포-없는 상층액 (CFS)은 0.2 μM 필터 (Millipore, UK)를 이용하여 여과되었다. CFS의 1 mL 분취량이 이용 때까지 -80 ℃에서 보관되었다. 부티르산나트륨, 헥산산 및 발레르산은 Sigma Aldrich (UK)로부터 획득되었고, 그리고 현탁액은 YCFA+ 액상배지에서 제조되었다.
세균 상층액의 SCFA 및 MCFA 정량
세균 상층액으로부터 짧은 사슬 지방산 (SCFAs) 및 중간 사슬 지방산 (MCFAs)은 하기와 같이 분석되고 MS Omics APS에 의해 정량되었다. 표본은 염산염 산 및 중수소 표지화된 내부 표준 (첨가되는 경우에)을 이용하여 산성화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)에서 설치된 높은 극성 칼럼 (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 칼럼 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)을 이용하여 수행되었다. 상기 시스템은 ChemStation (Agilent)에 의해 제어되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 이후 상기 데이터는 [118]에서 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
특정한 HDAC 활성 분석
특정한 HDAC 저해 활성은 각 유형의 HDAC에 대한 형광원 검정 키트 (BPS Bioscience, CA)를 이용하여 HDAC1, 2, 3, 4, 5, 6, 9에 대해 분석되었다. 검정은 제조업체의 사용설명서에 따라서 수행되었고, 그리고 각 표본은 반복 검증으로 수행되었다. 세포-없는 상층액은 방법 사이에 일관성을 유지하기 위해 10분의 1로 희석되고 키트에 담겨 제공된 특정한 HDAC 단백질에 노출되었다.
결과
히스톤 탈아세틸화효소-저해 소화관 공생 미생물 대사산물은 부티르산염 및 발레르산이다
상층액이 HT29 전체 세포 또는 HT29 세포 용해물 둘 모두에서 강한 HDAC 저해를 보여주었던 MRx0029 (참조: 도 11a)는 각각, 5.08 mM 및 1.60 mM의 평균 농도에서 발레르산 및 헥산산을 생산하였다 (참조: 도 11b).
어떤 대사산물이 균주-유도된 HDAC 저해에 대한 책임이 있는 지를 조사하기 위해, 상이한 농도의 헥산산, 발레르산 및 부티르산나트륨이 전체 HT-29 세포 및 HT-29 세포 용해물에 대한 그들의 HDAC 저해에 대해 계측되었다. 도 11c에서 결과는 전체 세포에서뿐만 아니라 세포 용해물에서 부티르산나트륨에 의한 HDAC 활성의 유의미한 (P<0.05) 저해를 증명하고, 반면 헥산산은 유의미한 저해 활성을 보여주지 않았다. 발레르산 또한, 전체 세포에서뿐만 아니라 세포 용해물에서 HDAC 활성을 저해하였다 (* (p<0.05), ** (p<0.005), *** (P<0.001), **** (p<0.0001)).
조사된 강력한 전체 HDAC 저해제는 부류 I HDACs를 표적으로 한다.
검사 세균 균주의 특정한 HDAC 저해 프로필이 조사되었다. 특정한 HDAC 저해 검정 (BPS Bioscience, CA)이 부류 I 및 부류 II HDACs에 대해 실행되었다. HDAC 효소를 저해하는 세균 균주의 능력이 부티르산염, 헥산산 및 발레르산과 비교되었다. 우리의 결과는 MRx0029가 부류 1 HDAC 효소 (HDAC1, 2 및 3)의 매우 강력한 저해제라는 것을 증명한다. 부류 II HDACs의 저해는 유의미하지 않았다 (데이터 제시되지 않음).
논의
HDAC 저해 활성을 갖는 균주는 유의미한 양의 발레르산 및 헥산산뿐만 아니라 유의미한 양의 부티르산나트륨을 생산하였다 (도 11b). 순수한 물질로서 검사될 때, 발레르산 및 부티르산나트륨은 유의미한 HDAC 저해 (p<0.0001)를 유발하였다.
흥미롭게도, 특정한 HDAC 활성에 대한 결과는 검사된 균주가 부류 I HDACs, 그리고 특히 HDAC2의 강력한 저해제이라는 것을 증명한다 (도 12 및 도 13). 부류 I HDACs (HDAC1, 2, 3 및 8)는 핵 안에 있고, 그리고 여러 인간 세포 유형에서 편재성으로 발현된다. HDACs 1-3은 50% 이상의 상동성을 공유하지만, 상이한 구조 및 세포 기능을 갖는다 [119]. 이들은 세포 생존, 증식 및 분화에 일차적으로 관련되고, 그리고 따라서, 이들의 저해는 질환의 넓은 어레이에서 유용할 수 있다 [120]; [121]; [122]; [123]; [124]. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 부류 I HDACs 활성이 상향조절되는 질환의 치료에 특히 유용할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 부류 I HDACs 활성이 상향조절되는 암의 치료에 특히 유용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 HDAC2 활성이 상향조절되는 암의 치료에 특히 유용할 수 있다.
실시예 11 - MRx0029에 의한 소화관 장벽 기능 및 소화관 투과성의 조정
도입
임의의 장관 장벽 기능장애를 유발하는 MRx0029의 능력이 조사되었다. HT29-mtx 상피, 점액소-생산 세포 단층 [125]이 MRx0029로 치료 이후에 소화관 장벽 붕괴 및 면역 자극을 평가하기 위한 시험관내 모형으로서 이용되었다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
방법
RNA 추출 및 qPCR 분석
전체 RNA가 제조업체의 사용설명서에 따라서 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Manchester, JUK)를 이용하여 추출되었고, 그리고 RNA 농도가 분광광도계 (nano-Drop ND-1000; Thermo Scientific, Wilmington, DE)를 이용하여 260/280nm에서 흡광도에 의해 결정되었다. mRNA 발현 분석을 위해, cDNA가 제조업체의 사용설명서에 따라서 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems, UK)를 이용하여 전체 RNA로부터 제조되었다. 역전사 반응은 10 분 동안 25℃, 120 분 동안 37℃ 및 5 분 동안 85℃에서 유전자증폭기 (Biometra, Germany)에서 수행되고, 4℃에서 유지되었다. 결과의 cDNA는 SYBR-Green PCR 검정에 의해 이중으로 증폭되었고, 그리고 산물은 프라이머에 따라서, 표준화된 프로필 (10 분 동안 95℃의 초기 변성, 그 이후에 95℃에서 15 초의 변성 및 60/65℃에서 60 초의 어닐링/연장의 40회 주기를 이용하여 QuantStudio 6 플렉스 실시간 PCR 기계 (Applied Biosystems, UK)에서 검출되었다. 용융 곡선을 산출하기 위해 40회 주기 후 해리 단계가 추가되었다. 분석은 Applied Biosystems QuantStudio 실시간 PCR 소프트웨어 v1.2를 이용하여 수행되었다.
결과
포르볼 12-미리스트산염-13-아세트산염 (PMA)에 노출된 분화된 HT29-mtx 세포는 유의미한 양의 IL-8을 분비하였다; 대조적으로 MRx0029 세균 상층액으로 24 시간 동안 처리는 처리되지 않은 세포 및 YCFA+-처리된 세포 둘 모두와 비교하여 IL-8의 훨씬 낮은 분비를 유도하였다 (도 14a).
소화관 장벽 형성에 관련된 단백질의 발현 및 국부화에 관련된 세포내 신호 전달을 변경함으로써 상피 투과성을 조절하는 MRx0029의 능력이 이후 조사되었다.
RNA가 단리되었고, 그리고 MRx0029와 함께 배양 동안 치밀 이음 단백질의 유전자 발현에서 변화를 특징짓기 위해 정량적 RT-PCR (qRT-PCR) 분석이 수행되었다. MRx0029의 투여는 2 시간 배양 후 오클루딘, 빌린, 치밀 이음 단백질 1 및 2 (각각 TJP1 및 TJP2) mRNA 발현을 증강시켰다 (도 14b).
이들 시험관내 결과는 MRx0029가 급이된 생쥐의 소화관에서 탈체 병렬 분석으로부터 데이터와 비교되었다. TJP1 및 오클루딘의 유전자 발현이 결장 및 회장에서 정량되었다. 탈체 데이터는 시험관내 데이터를 완벽하게 반영하는데, 그 이유는 MRx0029가 뮤린 장의 결장 영역에서 TJP1 및 오클루딘 (p=0.073)을 유의미하게 상향조절할 수 있었기 때문이다 (도 14c+14d). MRx0029는 또한, 동일한 생쥐의 결장에서 투과성 기능을 감소시킬 수 있었다 (도 14f).
논의
이들 결과는 MRx0029가 소화관 장벽 형성에 관련된 단백질 (예를 들면, 오클루딘, 빌린, TJP1 및 TJP2)의 발현 및 국부화에 관련된 세포내 신호 전달을 변경함으로써 상피 투과성을 조절할 수 있다는 것을 증명한다. 이들 결과는 이런 이유로, MRx0029가 소화관 장벽 기능을 증가시키고 소화관 투과성을 감소시키는 기능을 한다는 것을 증명한다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 소화관 장벽 기능의 감소 또는 증가된 소화관 투과성에 의해 특징화되는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 효과적이다.
실시예 12
도입
본 발명자들은 MRx0029가 급이된 생쥐의 해마, 편도 및 전전두엽 피질로부터 뇌 조직에서 염증성 마커에 대한 유전자의 발현을 분석하는 것을 모색하였다. 본 발명자들은 또한, MRx0029가 투여된 동일한 생쥐에서 비장으로부터 사이토킨 생산에 대한 효과를 탐구하였다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
방법
동물
BALBc (Envigo, UK) 성체 수컷 생쥐는 12 시간 명암 주기 하에 집단 수용되었다; 표준 설치류 사료 및 물이 무제한으로 가용하였다. 모든 실험은 University College Cork Animal Ethics Experimentation Committee에 의한 승인 이후에 유럽 지침에 따라서 수행되었다. 동물은 실험의 시작 시점에서 8 주령이었다.
연구 설계
동물은 동물 단위 내로 도착 후 1 주 동안 그들의 홀딩 룸에 순치하도록 허용되었다. 이들은 6 연일 동안 15:00 및 17:00 사이에 1 X 109 CFU의 용량에서 살아있는 생체치료제의 경구 위관영양 (200μL 용량)을 제공받는다. 7 일자에서, 이들 동물은 머리가 제거되고, 그리고 실험을 위해 조직이 수확된다.
조직 수집
동물은 치료 및 검사 조건에 관하여 무작위 방식으로 희생되었다; 표본추출은 9.00 a.m. 및 2:30 p.m 사이에 일어났다. 체간 혈액이 칼륨 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 튜브에서 수집되고 4000 g에서 15 분 동안 회전되었다. 혈장이 단리되고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다. 뇌가 빠르게 절제되고, 절개되고, 그리고 각 뇌 영역이 드라이아이스에서 즉시 동결되고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다. 비장이 제거되고, 5 mL RPMI 배지 (L-글루타민 및 중탄산나트륨, R8758 Sigma + 10 % FBS (F7524, Sigma) + 1% Pen/Strep (P4333, Sigma) 포함)에서 수집되고, 탈체 면역자극을 위해 도태 직후에 처리되었다. 장관 조직 (맹장에 가장 가까운 회장 및 결장의 2 3cm 분절이 절제되었고, 그리고 맹장으로부터 가장 먼 1cm 2cm의 조직이 이용되었다)이 장관 투과성 검정을 위해 Ussing 챔버 내로 적재되었다. 맹장이 제거되고, 계량되고, 그리고 SCFAs 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다.
비장 사이토킨 검정
비장이 희생 이후에 5mL RPMI 배지에서 즉시 수집되고 즉시 배양되었다. 비장세포는 먼저, 이러한 RPMI 배지에서 균질화되고, 그 이후에 1ml의 RBC 용해 완충액 (11814389001 ROCHE, Sigma)과 함께 5 분간 배양되었다. 추가 10 ml의 RPMI 배지가 첨가되고, 그 이후에 5 분 동안 200G 원심분리가 뒤따랐다. 상층액이 이후, 40um 여과기를 통해 여과되었다. 세포는 계수되고 파종되었다 (4,000,000/mL 배지). 2.5 시간의 적응 후, 세포는 24 시간 동안 지질다당류 (LPS-2 μg/ml) 또는 콘카나발린 A (ConA-2.5 μg/ml)로 자극되었다. 자극 이후에, 친염증성 패널 1 (생쥐) V-PLEX 키트 (Meso Scale Discovery, Maryland, USA)를 이용하여 TNF-α, IL-10, IL-1β, 인터페론 γ, CXCL2 및 IL6에 대한 사이토킨 방출을 사정하기 위해 상층액이 수확되었다. 이들 분석은 MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR 영상장치 2400, SECTOR 영상장치 6000, SECTOR S 600을 이용하여 수행되었다.
유전자 발현 분석
전체 RNA가 제조업체 권고에 따라서 mirVana™ miRNA 단리 키트 (Ambion/Llife technologies, Paisley, UK) 및 처리된 DNA분해효소 (Turbo DNA-없음, Ambion/life technologies)를 이용하여 추출되었다. RNA가 제조업체의 사용설명서에 따라서 NanoDrop™ 분광광도계 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, USA)를 이용하여 정량되었다. RNA 품질이 제조업체의 절차에 따라서 Agilent 바이오분석기 (Agilent, Stockport, UK)를 이용하여 사정되었고, 그리고 RNA 무결성 숫자 (RIN)가 계산되었다. >7의 RIN 값을 갖는 RNA가 차후 실험에 이용되었다. RNA는 제조업체의 사용설명서에 따라서 Applied Biosystems 높은 수용력 cDNA 키트 (Applied Biosystems, Warrington, UK)를 이용하여 cDNA로 역전사되었다. 간단히 말하면, Multiscribe 역전사효소 (50 U/μL) (1)(2)(1)(10)가 RT 마스터 믹스의 일부로서 첨가되고, 25℃에서 10 분 동안, 37℃에서 2 시간 동안, 85℃에서 5 분 동안 항온처리되고, 그리고 4℃에서 보관되었다. β-액틴을 내인성 대조로서 이용하면서, 생쥐 특이적인 표적화된 유전자에 대해 Applied Biosystems에 의해 설계된 프로브 (6 카르복시 플루오레세인 - FAM)를 이용하여 정량적 PCR이 실행되었다. 증폭 반응물은 1 μl cDNA, 5 μl의 2X PCR 마스터 믹스 (Roche), 900 nM의 각 프라이머를 내포하고, 그리고 RNA분해효소-없는 물의 첨가에 의해 총 10 μl가 되었다. 모든 반응은 LightCycler®480 시스템에서 96-웰 평판을 이용하여 삼중으로 수행되었다. 열 주기 조건은 55회 주기 동안 제조업체 (Roche)에 의해 권장된 바와 같았다. 앰플리콘 오염을 점검하기 위해, 각 실행은 이용된 각 프로브에 대해 삼중으로 주형 없음 대조를 내포하였다. 주기 역치 (Ct) 값이 기록되었다. 데이터는 β-액틴을 이용하여 정규화되고, 2-△△CT 방법을 이용하여 변환되고, 그리고 대조 군과 대비하여 배수 변화로서 제시되었다.
통계학적 분석
정규적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 비파라미터 데이터세트는 사분위수간 범위를 갖는 중간값으로서 제시된다. 비대칭 양측 t 검증이 파라미터 데이터를 분석하는 데 적용되었고, 그리고 만 휘트니 검증이 비파라미터에 이용되었다. 스피어먼의 순위 상관 계수가 모아진 데이터세트에서 상관 분석에 이용되었다. p 값 < 0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과 - 유전자 발현
염증성 마커 [IL-1β, IL6, CD11b, TNF-α 및 TLR-4]에 대한 유전자의 발현이 해마, 편도 및 전전두엽 피질로부터 뇌 조직에서 분석되었다. 도 15-25은 해마, 편도 및 전전두엽 피질에서 MRx0029 치료 후 유전자 발현에서 변화를 보여준다. MRx0029로 치료는 편도에서 TLR-4의 발현을 유의미하게 증가시켰다 (도 20). MRx0029로 치료는 또한, 편도에서 CD11b의 발현을 증가시켰다 (도 21).
결과 - 비장세포로부터 사이토킨 발현에 대한 효과
탈체 비장세포 검정은 비장세포 (비장 - 면역 방어에 관련된 주요 장기로부터 단리된 세포)를 세균- 또는 바이러스-모방체로 공격 접종하는 것을 수반한다.
MRx0029로 치료는 LPS로 공격 접종 이후에 인터페론-γ, 인터류킨-1β 및 인터류킨-6에서 감소를 야기하였다 (각각, 도 26, 27 및 28).
MRx0029로 치료는 화학유인물질 CXCL1의 수준에서 증가를 야기하였다 (도 30).
논의
MRx0029로 치료는 편도에서 친염증성 사이토킨 TLR-4 및 CD11b의 발현을 유의미하게 증가시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 질환, 특히 감소된 면역 활성화에 의해 특징화되는 질환 및 증가된 면역 반응에 의해 치료가능한 질환의 치료에서 유용할 수 있다.
실시예 13 - 안정성 검사
본원에서 설명된 적어도 하나의 세균 균주를 내포하는 본원에서 설명된 조성물은 25℃ 또는 4℃에서 밀봉된 용기에서 보관되고, 그리고 상기 용기는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95% 상대 습도를 갖는 공기에서 배치된다. 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 2.5 년 또는 3 년 후, 세균 균주 중에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 표준 프로토콜에 의해 결정된 집락 형성 단위에서 계측될 때, 남아있을 것이다.
실시예 14 - ERK 신호전달 경로에 대한 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis)의 효과의 분석
재료와 방법
RNA 추출 및 MAP2 qPCR 분석
세포가 12-웰 평판에서 2x105개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 24 시간 후, 세포는 10% 세균 상층액의 존재 또는 이것의 부재 (YCFA+)에서 DMSO 또는 베무라페닙 (662005; EMD Millipore; VEMU; SKMEL28, SKMEL31, 451Lu, HT29 (1μM) SKMEL2 (10μM) 또는 아자시티딘-C (A3656;Sigma Aldrich; AzaC; 5μg/ml) 중에서 어느 한 가지로 처리되거나, 또는 양쪽 약물 (VEMU+Aza)로 함께 처리되었다. 전체 RNA가 제조업체의 사용설명서에 따라서 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Manchester, UK)를 이용하여 추출되었고, 그리고 RNA 농도가 260/280 nm에서 분광광도계 (NanoDrop ND-1000; Thermo Fisher Scientific, Loughborough)에 의해 결정되었다. mRNA 발현 분석을 위해, cDNA가 제조업체의 사용설명서에 따라서 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Thermo Fisher, Loughborough)를 이용하여 2000 ng의 전체 RNA로부터 제조되었다. 역전사 반응은 10 분 동안 25℃, 120 분 동안 37℃ 및 5 분 동안 85℃에서 유전자증폭기 (Biometra, Germany)에서 수행되었다. 결과의 cDNA는 SYBR-Green PCR 검정에 의해 이중으로 증폭되었고, 그리고 산물은 표준화된 프로필 (10 분 동안 95℃의 초기 변성, 그 이후에 95℃에서 10 초의 변성 및 65℃에서 30 초의 어닐링/연장의 40회 주기)을 이용하여 QuantStudio 6 플렉스 실시간 PCR 기계 (Applied Biosystems, UK)에서 검출되었다. 용융 곡선을 산출하기 위해 40회 주기 후 해리 단계가 추가되었다. 분석은 Applied Biosystems QuantStudio 실시간 PCR 소프트웨어 v1.2를 이용하여 수행되었다. GAPDH 및 MAP2에 대한 프라이머 서열은 아래에 도시된다.
웨스턴 블롯 분석
10% 세균 상층액의 존재 또는 부재 (YCFA+)에서 적합한 약물로 24 시간 처리 이후에, 단백질 추출물이 프로테아제 저해제 (완전 단백질분해효소 저해제 칵테일 정제; Roche, Switzerland) 및 1 mM/L 나트륨 오르소바나듐산염, 0.5 mM/L PMSF로 보충된 RIPA 완충액 (R0278; Sigma Aldrich)에서 세포를 용해시킴으로써 획득되었다. 단백질 정량은 BCA 단백질 검정에 의해 행위되었다. 동등한 양의 총 단백질 (20μg/레인)이 이후, 4-15% 구배 겔 (BioRad)에서 SDS-PAGE에 의해 분리되고 폴리비닐리덴 이플루오르화물 (PVDF) 막 (Thermo Fisher Scientific, Loughborough)으로 이전되었다. TBST (10 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5% Tween 20)에서 5% BSA 또는 탈지분유로 60 분 동안 차단한 후, 막이 포스포-ERK (9101S, 1:1000, 세포 신호전달; New England Biolabs (UK)) 또는 총 ERK (4696S, 1:1000, 세포 신호전달; New England Biolabs (UK))에 대한 일차 항체로 탐침되었다.
관심 단백질은 적합한 HRP-접합된 이차 항체 (1:10,000, Thermo Fisher Scientific, Loughborough)로 검출되고, ECL 웨스턴 블롯팅 Super Signal PicoPlus 기질 (34577; Thermo Fisher Scientific, Loughborough)로 현상되고, 그리고 Chemidoc XRS 영상장치 (BioRad)에서 가시화되었다.
96 웰 평판에서 앵커리지-독립된 성장 (연한천 성장 검정)
20% FBS, 4 mM L-Glu, 2x NEAA, 0.6% 중탄산나트륨, 200 U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 내포하는 25 μL 미리 가온된 (37℃) 2x 적합한 성장 배지 (흑색종 세포주의 경우에 EMEM; HT29의 경우에 DMEM 높은 글루코오스) (Invitrogen), 그리고 25 μL 미리 가온된 (47℃) 1.2% Noble 한천 (A5431; Sigma Aldrich)의 혼합물이 96 웰 마이크로평판의 각 웰 위에 도말되어 검정을 위한 전층으로서 역할을 하였다. 0-2 x 103개 세포를 내포하는 10 마이크로리터의 세포 현탁액이 96 웰 둥근 바닥 폴리프로필렌 마이크로평판에서 25 μL 2x 성장 배지 및 35 μL 0.8% Noble 한천과 혼합되었고, 그리고 고형화된 전층을 내포하는 96 웰 마이크로평판으로 이전되었다. 이들 세포는 2 일 동안 성장하도록 허용되었고, 그리고 이후, 3 일마다 10% 세균 상층액 또는 YCFA+의 존재에서 약물을 내포하는 배지가 공급되었다. 이들은 5% CO2를 갖는 가습된 37℃ 배양기에서 1-2 주 동안 성장하도록 남겨졌고, 이후 제조업체의 프로토콜에 따라서 CytoSelect 96 웰 세포 형질전환 검정 (CBA-130; Cell Biolabs)을 이용하여 연한천 성장이 채점되었다. 485 nm에서 여기 및 530 nm에서 방출을 갖는 Tecan Infinite F200 Pro 시리즈 다중웰 평판 판독기 (Tecan Biosystems)를 이용하여 세포 성장이 계측되었다.
32-mm 평판에서 앵커리지-독립된 성장 (연한천 성장 검정)
1 mL의 미리 가온된 (37℃) 2x 적합한 성장 배지 (흑색종 세포주의 경우에 EMEM; HT29의 경우에 DMEM 높은 글루코오스) 및 평판당 1 mL 미리 가온된 (47℃) 0.8% Noble 한천 (0.4% 최종 한천)의 혼합물이 1 mL 세포 현탁액과 혼합되고 6-웰 평판에서 0.6% 한천/세포 성장 전층 (2 mL) 위에 파종되었다. 이들 세포는 5% CO2를 갖는 가습된 37℃ 배양기에서 21-28 일 동안 성장하도록 허용되었다. 이들은 3 일마다 10% 세균 상층액의 부재 (YCFA+) 또는 존재에서 약물이 공급되었다. 집락은 Evos XL 코어 현미경 (Thermo Fisher Scientific, Loughborough)을 이용하여 촬영되었다.
클론원성 검정
세포가 트립신처리되었고, 그리고 200개 세포/웰이 12-웰 평판에 파종되었다. 48 시간 후, 세포는 10% 세균 상층액의 부재 (YCFA+) 또는 존재에서 적합한 약물로 처리되고 3 일마다 재공급되었다. 파종 후 21 일자에, 세포는 얼음같이 차가운 메탄올에서 고정되고 크리스털 바이올렛 블루로 염색되었다. 집락 (.50개 세포)이 계수되었고, 그리고 생존 분율이 대조의 평판배양 효율에 의해 나눗셈된, 처리의 도말된 세포의 숫자 (평판배양 효율)에 의해 나눗셈된 집락의 숫자로서 계산되었다.
실시예 14A - SKMEL2 흑색종 세포주
하기의 처리의 효과가 SKMEL2 흑색종 세포주 (WT BRAF; Nras에서 N61R 종양원성 돌연변이)에서 사정되었다: (1) MRX0029; (2) YFCA+ 배지에서 베무라페닙 (VEMU); (3) VEMU 및 MRX029; (4) YFCA+ 배지에서 아자시티딘-C (Aza-c); (5) Aza-c 및 MRX029; (6) VEMU, Aza-c 및 MRX0029.
SKMEL2 세포주에서 MAP2 유전자 발현이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 31에서 도시된다. MRX029 (단독으로 또는 VEMU 및/또는 Aza-c와 조합으로)로 모든 처리는 양쪽 음성 대조 (세포주 단독, 그리고 YCFA+)에 비하여 MAP2 유전자 발현을 증가시켰다. SKMEL2 세포주의 클론원성 생존이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 32에서 도시된다. SKMEL2 세포주의 연한천 성장이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도면 33에서 도시된다. VEMU+Aza-c는 MRX029에 의한 연한천 성장 저해를 향상시켰다. SKMEL2 세포주에서 ERK 신호전달이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 34에서 도시된다 (VEMU, Aza-c 및 MRX029는 사정되지 않았다).
이들 결과는 단독으로 또는 베무라페닙 및/또는 아자시티딘-C와 조합으로 MRX0029가 흑색종 세포주 (SKMEL2)에서 MAP2 유전자 발현을 유도하는 효과를 가질 수 있다는 것을 지시한다. 게다가, 베무라페닙+아자시티딘-C는 MRX0029에 의한 연한천 성장 저해를 증강시켰다. 이러한 기초에서, 본 발명의 조성물은 다양한 암, 특히 전이성 암, 특히 전이성 흑색종의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다.
실시예 14B -SKMEL28 흑색종 세포주
하기의 처리의 효과가 SKMEL28 흑색종 세포주 (BRAF에서 V600E 종양원성 돌연변이)에서 사정되었다: (1) MRx0029; (2) YCFA+ 배지에서 베무라페닙 (VEMU); (3) VEMU 및 MRx0029; (4) YCFA+ 배지에서 아자시티딘-C (Aza-c); (5) Aza-c 및 MRX0029; (6) VEMU, Aza-c 및 MRx0029.
SKMEL28 세포주에서 MAP2 유전자 발현이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 35에서 도시된다. SKMEL28 세포주의 클론원성 생존이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 36에서 도시된다. VEMU 및/또는 Aza-c와 조합으로 MRx0029는 양쪽 음성 대조 (YCFA+ 및 세포주 단독)에 비하여 클론원성 생존을 감소시켰다. SKMEL28 세포주의 연한천 성장이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 37에서 도시된다. SKMEL28 세포주에서 ERK 신호전달이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 38에서 도시된다 (VEMU, Aza-c 및 MRx0029는 사정되지 않았다). MRx0029 (단독으로 또는 VEMU 또는 Aza-c와 조합으로)로 모든 처리는 음성 대조 (YFCA+)에 비하여 ERK 신호전달을 감소시켰다.
이들 결과는 단독으로 또는 베무라페닙 및/또는 아자시티딘-C와 조합으로 MRx0029가 ERK 신호전달을 저해하고, 그리고 BRAF V600E 돌연변이를 포함하는 흑색종 세포주 (SKMEL28)의 클론원성 생존을 감소시키는 효과를 나타낼 수 있다는 것을 지시한다. 이러한 기초에서, 본 발명의 조성물은 암, 특히 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 것들, 특히 흑색종의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다. 특히, 본 발명의 조성물은 BRAF에서, 특히 위치 600에서 종양원성 돌연변이 및 특히 돌연변이 BRAF V600E를 포함하는 이런 암의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다.
실시예 14C -SKMEL31 흑색종 세포주
하기의 처리의 효과가 SKMEL31 흑색종 세포주 (BRAF V600E에 이형접합성)에서 사정되었다: (1) MRx0029; (2) YFCA+ 배지에서 베무라페닙 (VEMU); (3) VEMU 및 MRx0029; (4) YFCA+ 배지에서 아자시티딘-C (Aza-c); (5) Aza-c 및 MRx0029; (6) VEMU, Aza-c 및 MRx0029.
SKMEL31 세포주에서 MAP2 유전자 발현이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 39에서 도시된다. SKMEL31 세포주의 클론원성 생존이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 40에서 도시된다. SKMEL31 세포주의 연한천 성장이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 41에서 도시된다. VEMU, Aza-c 및 VEMU+Aza-c는 MRx0029에 의한 연한천 성장과 클론원성 생존 저해를 향상시켰다. SKMEL31 세포주에서 ERK 신호전달이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 42에서 도시된다 (조합에서 VEMU, Aza-c 및 MRx0029는 사정되지 않았다). MRx0029 (단독으로 또는 VEMU 또는 Aza-c와 조합으로)로 모든 처리는 음성 대조 (YFCA+)에 비하여 ERK 신호전달을 감소시켰다.
실시예 14D - 451Lu 흑색종 세포주
하기의 처리의 효과가 451Lu 흑색종 세포주 (BRAF에서 V600E 종양원성 돌연변이)에서 사정되었다: (1) MRx0029; (2) YFCA+ 배지에서 베무라페닙 (VEMU); (3) VEMU 및 MRx0029; (4) YFCA+ 배지에서 아자시티딘-C (Aza-c); (5) Aza-c 및 MRx0029; (6) VEMU, Aza-c 및 MRx0029.
451Lu 세포주에서 MAP2 유전자 발현이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 43에서 도시된다. MRx0029 (단독으로 또는 VEMU 및/또는 Aza-c와 조합으로)로 모든 처리는 세포주 단독 음성 대조에 비하여 MAP2 유전자 발현을 증가시켰다. 451Lu 세포주의 클론원성 생존이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 44에서 도시된다. MRx0029 (단독으로 또는 VEMU 및/또는 Aza-c와 조합으로)로 모든 처리는 양쪽 음성 대조 (세포주 단독, 그리고 YCFA+ +DMSO)에 비하여 클론원성 생존을 감소시켰다. 451Lu 세포주의 연한천 성장이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 45에서 도시된다. 아자시티딘 C는 MRx0029에 의한 연한천 성장 저해를 증강하였다. 451Lu 세포주에서 ERK 신호전달이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 46에서 도시된다 (조합에서 VEMU, Aza-c 및 MRx0029는 사정되지 않았다). VEMU 또는 Aza-c와 조합으로 MRx0029는 음성 대조 (YFCA+ +DMSO)에 비하여 ERK 신호전달을 감소시켰다.
이들 결과는 단독으로 또는 베무라페닙 및/또는 아자시티딘-C와 조합으로 MRx0029가 MAP2 유전자 발현을 유도하고, 그리고 BRAF V600E 종양원성 돌연변이를 보유하는 흑색종 세포주 (451Lu)의 클론원성 생존 및 성장을 감소시키는 효과를 나타낸다는 것을 지시한다. 이러한 기초에서, 본 발명의 조성물은 암, 특히 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 것들, 특히 흑색종, 예컨대 전이성 흑색종의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다. 특히, 본 발명의 조성물은 BRAF에서, 특히 위치 600에서 종양원성 돌연변이 및 특히 돌연변이 BRAF V600E를 포함하는 이런 암의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다.
실시예 14E - HT29 결장직장암 세포주
하기의 처리의 효과가 HT29 결장직장암 세포주 (BRAF에서 V600E 종양원성 돌연변이)에서 사정되었다: (1) MRx0029; (2) YFCA+ 배지에서 베무라페닙 (VEMU); (3) VEMU 및 MRx0029; (4) YCFA+ 배지에서 아자시티딘-C (Aza-c); (5) Aza-c 및 MRx0029; (6) VEMU, Aza-c 및 MRx0029.
HT29 세포주에서 MAP2 유전자 발현이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 47에서 도시된다. VEMU 및/또는 Aza-c와 조합으로 MRx0029는 양쪽 음성 대조 (세포주 단독 및 YCFA+)에 비하여 MAP2 유전자 발현을 증가시켰다. HT29 세포주의 클론원성 생존이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 48에서 도시된다. MRx0029 (단독으로 또는 VEMU 및/또는 Aza-c와 조합으로)로 모든 처리는 양쪽 음성 대조 (세포주 단독, 그리고 YCFA+ +DMSO)에 비하여 클론원성 생존을 감소시켰다. Aza-c는 클론원성 생존을 저해하는 MRx0029의 효과를 향상시켰다. HT29 세포주의 연한천 성장이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 49a 및 b에서 도시된다. HT29 세포주에서 ERK 신호전달이 재료와 방법에서 프로토콜을 이용하여 사정되었고, 그리고 결과가 도 50에서 도시된다 (조합에서 VEMU, Aza-c 및 MRx0029는 사정되지 않았다). 음성 대조 (YFCA+ +DMSO)에 비하여 MRx0029 단독 ERK 신호전달.
이들 결과는 단독으로 또는 베무라페닙 및/또는 아자시티딘-C와 조합으로 MRx0029가 MAP2 유전자 발현을 유도하고, 클론원성 생존을 감소시키고, 그리고 V600E 종양원성 돌연변이를 보유하는 세포주 (HT29)에서 ERK 신호전달을 저해하는 효과를 나타낸다는 것을 지시한다. 이러한 기초에서, 본 발명의 조성물은 암, 특히 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 것들, 특히 결장직장암, 예컨대 전이성 결장직장암의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다. 특히, 본 발명의 조성물은 BRAF에서, 특히 위치 600에서 종양원성 돌연변이 및 특히 돌연변이 BRAF V600E를 포함하는 이런 암의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다.
실시예 15 - 분화된 Caco-2 세포에서 GPR109a RNA 발현
GPR109a는 결장과 장관 상피 세포의 내강-대면 정단막에서 발현되는 G-단백질 연계된 수용체이다. GPR109a 발현 침묵이 결장암 세포주에서 발견되고, 그리고 이의 발현의 유도는 세균 발효 산물, 예컨대 부티르산염의 존재에서 종양 세포 아폽토시스를 유도하는 것으로 보고되었다 [126].
HT29mtx 세포가 12 웰 평판에서 파종되고 10 일 동안 분화되었다; 이후, 이들은 12 시간 동안 혈청 결핍되고, 그리고 차후에, 정지기 세균으로부터 유래된 10% 상층액에 24 시간 동안 노출되었다. 세포가 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNA가 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현이 qPCR에 의해 계측되었다. β액틴이 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화가 2^(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다 [127]. 이용된 정방향과 역방향 프라이머의 서열은 각각, 서열 번호: 6 및 7로서 제공된다.
분화된 Caco2는 불투과성이고 소장의 상피 세포와 구조적으로 및 기능적으로 유사한 양극화된 정점/점막 및 기저/장막 막을 형성한다. MRx0029로 Caco-2 세포의 처리는 GPR109a의 증가된 발현을 유도하였다 (도 52a). 또한, 포르볼-12-미리스트산염-13-아세트산염 (PMA) 상층액으로 처리된 Caco-2는 PMA 단독 (또는 YCFA+ 배지에서 PMA)으로 처리보다, GPR109a RNA의 더욱 큰 발현을 전시하였다 - 참조: 도 52b. 이런 이유로, 이들 데이터는 본 발명의 조성물이 암, 특히 전이성 암, 특히 전이성 결장직장암 또는 소장암, 예컨대 소장 선암종, 그리고 특히 종양원성 ERK 신호전달을 포함하는 것들의 치료에서 유용할 수 있다는 것을 암시한다. 이들 데이터는 또한, 본 발명의 조성물이 GPR109a 발현의 결과로서, 아폽토시스를 유도하는 기전을 통해 이런 치료를 달성할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 16 - HT29 세포주에 의한 IL-8 분비에 대한 MRx0029의 효과
분화된 HT29 세포는 불투과성이고 소장의 상피 세포와 구조적으로 및 기능적으로 유사한 양극화된 정점/점막 및 기저/장막 막을 형성한다.
HT29 세포는 12 웰 평판에서 200,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포는 10 일 동안 분화되었다 (2 일마다 배지 교체). 상기 일자의 실험 세포가 혐기성 후드에 배치되고 혐기성 평형화된 행크 용액으로 세척되었다. 이후 900 ul의 성장 배지 (FBS 및 항생제 없음)가 이들 세포에 첨가되었다. 세균 세포가 성장 배지 (FBS 및 항생제 없음)에서 재현탁되었고, 그리고 이후 100ul에서 총 10^7 CFU로 첨가되었다. 세포는 혐기성 후드에서 2 시간 동안 세균과 공동배양되었다. 그 후에 세포는 FBS가 없지만 항생제를 내포하는 성장 배지에서 세척되었다. 세포는 1 ml의 THP1 조건부 배지에서 24 시간 동안 안정 상태로 남겨졌다. 24 시간 배양 후, 상층액이 수집되고 4℃에서 10,000g에서 3 분 동안 스핀다운되었다. 표본은 추가 이용 때까지 -80℃에서 동결되었다.
THP1 조건부 배지: THp1은 4x10^6/ 플라스크의 밀도로 T25 플라스크에 파종되었다. 세포는 1ug/ml LPS 또는 LPS +5mM ATP (ATP는 LPS 후 3 시간 시점에 첨가됨)를 포함하는 RPMI 배지 (2mM L-글루타민을 내포하지만 FBS가 없음)에서 처리되었다. 세포는 24 시간 동안 안정 상태로 남겨졌다. 그 후, 조건부 배지 (CM)가 실온에서 5 분 동안 250g에서 세포를 스핀다운함으로써 수집되었다. 상이한 CMs가 HT29 세포를 처리하는 데 이용되었다. ELISA를 위해 적은 분취량이 80℃에서 동결되었다.
상이한 표본으로부터 상층액이 수집되었고, 그리고 사이토킨 분석이 Peprotech로부터 인간 IL-8 ELISA 키트를 이용하여 제조업체의 사용설명서에 따라서 수행되었다. GraphPad Prism7이 데이터를 플롯팅하고 분석하는 데 이용되었다.
MRx0029는 강력한 면역자극성 사이토킨인 IL-8 분비를 증가시켰다 (도 53). 이들 데이터는 MRx0029의 면역자극 활성을 증명한다.
상기에서 지적된 바와 같이, IL-8의 분비는 B 세포 증식을 증가시킨다. B 세포는 종양에 대한 면역 반응을 조정하는 데 연루되었다. 실제로, B 세포에 의한 항종양 항체의 분비는 종양 제어의 강력한 기전이다. 종양 특이적 항체의 생산은 자연 살해 세포가 항체의 불변 도메인에 결합하도록 촉발하여, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 통해 종양 세포 용해를 유발할 수 있는 것으로 널리 알려져 있다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 증가된 항종양 면역 반응을 담보하는 B 세포 반응의 적절한 조정을 통해 암의 치료를 달성할 수 있다.
대다수의 암의 병리의 기전이 숙주 면역계에 의한 감시의 회피를 수반한다는 사실에 근거하여, 면역 반응의 자극에 관련된 임의의 기전은 치료적으로 유익한 영향을 나타낼 것이다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 다양한 암의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다.
실시예 17 - 대사산물 분석
도입
소화관 미생물총은 이의 막대한 다양성 및 물질대사 능력으로 인해, 방대한 다양한 분자의 생산을 위한 거대한 물질대사 보관소를 나타낸다. 본 발명자들은 어떤 짧은 사슬 지방산 및 중간 사슬 지방산이 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787, 그리고 본원에서 참조 1, 참조 2 및 참조 3으로서 확인된 다른 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주에 의해 생산되고 소비되는 지를 결정하는 것을 모색하였다.
재료와 방법
세균 배양 및 세포-없는 상층액 수집
세균의 순수한 배양액은 이들이 그들의 정체 성장기에 도달할 때까지, YCFA+ 액상배지에서 혐기성으로 성장되었다. 배양액은 5 분 동안 5,000 x g에서 원심분리되었고, 그리고 세포-없는 상층액 (CFS)은 0.2 μM 필터 (Millipore, UK)를 이용하여 여과되었다. CFS의 1 mL 분취량이 이용 때까지 -80 ℃에서 보관되었다. 부티르산나트륨, 헥산산 및 발레르산은 Sigma Aldrich (UK)로부터 획득되었고, 그리고 현탁액은 YCFA+ 액상배지에서 제조되었다.
세균 상층액의 SCFA 및 MCFA 정량
세균 상층액으로부터 짧은 사슬 지방산 (SCFAs) 및 중간 사슬 지방산 (MCFAs)은 하기와 같이 분석되고 MS Omics APS에 의해 정량되었다. 표본은 염산염 산 및 중수소 표지화된 내부 표준 (첨가되는 경우에)을 이용하여 산성화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)에서 설치된 높은 극성 칼럼 (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 칼럼 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)을 이용하여 수행되었다. 상기 시스템은 ChemStation (Agilent)에 의해 제어되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 이후 상기 데이터는 [128]에서 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
결과
도 54-56에서 도시된 바와 같이, 균주 42787은 발레르산, 부티르산염 및 헥산산을 생산하고 프로피온산염 및 아세트산염을 소비한다. 본 발명자들은 또한, 필적하는 수준의 발레르산, 헥산산 및 부티르산염을 생산하고 유사한 양의 아세트산염 및 프로피온산염을 소비하는 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 종의 다른 균주를 발견하였다.
실시예 18 - 에놀라아제 2의 억제
도 57은 MRx0029가 뉴런 특이적 에놀라아제(NSE)/에놀라아제 2를 억제하는 통계학적으로 유의한 효과를 갖는다는 것을 보여준다. NSE는 증가된 종양 세포 대사 요구량을 뒷받침하고, 종양 세포를 스트레스성 조건으로부터 보호하고, 이들의 침습과 이주를 증진하는 것으로 생각된다 [129]. 이것은 또한, 전이성 흑색종의 진행 [130], 소세포 폐암에서 생존과 진행 [131], 그리고 선편평상피 폐 암종의 예후 [132]에 연루된다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 암, 특히, 전이성 흑색종, 소세포 폐암 및 선편평상피 폐 암종을 치료하고 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다.
실시예 19 - 대사산물 분석
실시예 17에서 제공된 데이터에 더하여, 도 58은 어떤 다른 짧은 사슬 지방산이 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787, 그리고 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43388 및 NCIMB 43389 하에 기탁된 다른 균주에 의해 생산되고 소비되는 지를 보여준다.
메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787은 포름산을 감소시키지만, 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산의 수준을 증가시킨다 (도 58). 이런 이유로, 균주 NCIMB 42787은 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고 포름산을 소비한다. 본 발명자들은 또한, 기탁된 다른 균주가 필적하는 수준의 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고 유사한 양의 포름산을 소비한다는 것을 발견하였다.
실시예 20 - IL-6의 상향조절
도입
세균 균주는 성상세포종 세포주 U373에 의한 IL-6 분비에서 증가를 촉발하는 능력에 대해 조사되었다.
재료와 방법
인간 교모세포종 성상세포종 세포주 (U373)는 10% 열 비활성화 FBS, 4mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 5 μg/ml 플라스모신, 1% 비필수 아미노산, 1% 피루브산나트륨으로 보충된 25ml MEME 4.5 g/L D-글루코오스 (완전 성장 배지로서 지칭됨)에서 유지되었다.
세포는 24-웰 평판에서 1ml의 완전 성장 배지에서 100,000개 세포/웰의 밀도로 도말되고, 그리고 37 ℃/5% CO2에서 72 시간 동안 안정 상태로 남겨졌다. 처리 당일에, 배지가 각 웰로부터 제거되었고, 세포가 0.5 ml 세척 배지 (혈청 없는 MEME), 0.9ml 자극 배지 (2% FBS를 내포하는 MEME 배지)로 헹굼되었다. 1 시간 전배양 후, 세포가 CO2 배양기로부터 이전되고 100 μl 세균 상층액으로 처리되었다. YCFA+ 배지가 대조로서 이용되었다. 세포는 이후, 37 ℃/5% CO2에서 추가 24 시간 동안 배양되었고, 그 후 세포-없는 상층액이 수집되고 4 ℃에서 10,000g에서 3 분 동안 스핀다운되었다. 표본이 hIL-6 ELISA를 위해 1.5 ml 마이크로튜브에서 분취되고 -80℃에서 보관되었다.
결과와 결론
도 59는 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787이 처리되지 않은 대조 및 YCFA+ 대조와 비교하여, U373 세포에서 IL-6 분비를 상향조절한다는 것을 보여준다. 다른 기탁된 균주, 특히 NCIMB 43389 역시 IL-6의 분비를 증가시켰다. 추가 기탁된 균주는 NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43386 및 NCIMB 43387이다.
IL-6의 분비는 B 세포 증식을 증가시킨다. 상기 개설된 바와 같이, 증가된 B 세포 증식은 암에 대한 면역 반응을 향상시키기 위한 강력한 기전으로서 행동할 수 있다 (예를 들면, 항체의 생산 및 ADCC를 촉발하는 것을 통해).
실제로, 면역자극 활성이 기탁된 균주뿐만 아니라 관련된 기탁된 균주에 의해 나타난다. 이런 이유로, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 균주, 또는 이들의 생물형을 포함하는 본 발명의 조성물은 다양한 암의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다.
실시예 21 - 에놀라아제 2의 억제
재료와 방법
신경모세포종 세포주 SH-SY5Y는 2mM L-글루타민, 10% 열 비활성화 FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 50% MEM 및 50% 영양소 혼합물 F-12 Ham 배지에서 성장되었다. SH-SY5Y는 6 웰 평판에서 0.5x106개 세포의 밀도로 도말되었다. 24 시간 후, 세포는 10% 세균 상층액 또는 YCFA+를 포함하는 분화 배지 (1% FBS를 내포하는 성장 배지)에서 17 시간 동안 처리되었다. 세포가 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNA가 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현이 qPCR에 의해 계측되었다. GAPDH가 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화가 2(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다. 이용된 프라이머 세트는 서열 번호: 2, 3, 13 및 14로서 열거된다.
결과
도 60은 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787이 뉴런 특이적 에놀라아제(NSE)/에놀라아제 2를 억제하는 통계학적으로 유의한 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 이에 더하여, 본 발명자들은 또한, 기탁된 표준 균주가 YCFA+ 배양액 대조와 비교하여, 에놀라아제 2의 통계학적으로 유의한 감소를 촉발한다는 것을 발견하였다. 특히, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIMB 43386 및 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주는 에놀라아제 2의 유의미한 억제를 유발하였다.
결론
따라서, 상기 실시예 18에서 발언과 일관하게, 본 발명의 조성물은 예시적인 표준 균주를 포함하는 일정한 구체예에서, 암, 특히, 전이성 흑색종, 소세포 폐암 및 선편평상피 폐 암종을 치료하고 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다.
실시예 22 - MAP2의 상향조절
재료와 방법
신경모세포종 세포주 SH-SY5Y는 2mM L-글루타민, 10% 열 비활성화 FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 50% MEM 및 50% 영양소 혼합물 F-12 Ham 배지에서 성장되었다. SH-SY5Y는 6 웰 평판에서 0.5x106개 세포의 밀도로 도말되었다. 24 시간 후, 세포는 10% 세균 상층액 또는 YCFA+를 포함하는 분화 배지 (1% FBS를 내포하는 성장 배지)에서 17 시간 동안 처리되었다. 세포가 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNA가 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현이 qPCR에 의해 계측되었다. GAPDH가 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화가 2(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다. 이용된 프라이머 세트는 서열 번호: 2, 3, 4 및 5로서 열거된다.
결과
도 61a는 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787 및 다른 기탁된 균주가 대조 (다시 말하면, 음성 대조 및 배지 대조)와 비교하여, MAP2 발현의 통계학적으로 유의한 증가를 촉발한다는 것을 보여준다. 특히, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIMB 43386 및 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주는 MAP2 발현에서 유의미한 증가를 유발하였다. 이러한 기초에서, 본 발명의 조성물은 다양한 암, 특히 전이성 암, 특히 전이성 흑색종의 치료 또는 예방에서 유용할 것으로 예상된다.
실시예 23 - 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787로 처리 시에 TNFα에 노출된 HMC3 세포에서 사이토킨 분비의 조정
도입
HMC3 세포는 TNFα로 처리되었고, 그리고 NCIMB 42787의 정지기 배양액으로부터 세포-없는 상층액으로 처리 시에 IL-8의 분비가 계측되었다.
재료와 방법
인간 소교세포 HMC3 세포는 15% 열 비활성화 FBS 및 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신을 내포하는 글루타민-보충된 EMEM 배지에서 성장되었다. HMC3 세포는 24 웰 평판에서 50,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포가 CO2 배양기에서 48 시간 동안 안정 상태로 남겨졌다. 이들 세포는 이후, 블랭크 EMEM에서 세척되고, 그리고 10ng/ml TNF-α를 포함하는 2% FBS 성장 배지에서 1 시간 동안 사전 처리되었다. 그 후, NCIMB 42787 정지기 성장 배양액 (전술된 바와 같이 단리됨)에 대한 10% 세포-없는 세균 상층액이 TNF-α-처리된 웰 및 처리되지 않은 웰에 첨가되고 CO2 배양기에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양되었다. 세포-없는 상층액이 수집되고 4℃에서 3 분 동안 10,000xg에서 원심분리되었다. 표본이 hIL-8 ELISA를 위해 1.5ml 마이크로튜브에서 분취되고 -80℃에서 보관되었다.
전술된 바와 같이 처리된 HMC3 세포로부터 세포-없는 상층액에서 제조업체의 프로토콜에 따라서 hIL-8 표준 ELISA 키트를 이용하여 IL-8의 분비가 분석되었다. 표본이 405nm에서 계측되었는데, 교정 파장은 마이크로평판 판독기 (iMark, Bio-Rad)에서 655nm로 설정되었다. 미가공 데이터는 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 이용하여 플롯팅되고 분석되었다.
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과
NCIMB 42787은 자극의 부재에서 IL-8 분비를 유도한다 (도 61b). 상기 개설된 바와 같이, IL-8은 특히, B 세포 증식의 자극에 의해 면역계의 활성화에 관련된다.
실시예 24 - 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) NCIMB 42787에 의한 HEK-TLR4 세포에서 NF-κB 프로모터 활성화
도입
NCIMB 42787로 처리가 TLR4의 참여에 의해 유도된 NF-κB-Ap1 프로모터 활성을 유도할 것인지를 실증하기 위해, HEK-TLR4 세포가 단독으로 또는 LPS와 조합으로, NCIMB 42787에 대한 세포-없는 세균 상층액으로 처리되었다.
재료와 방법
인간 TLR4를 안정되게 발현하는 HEK293-Blue 리포터 세포 (HEK-TLR4)가 제조업체의 사용설명서에 따라서 배양되었다. 간단히 말하면, HEK-TLR4 세포는 10% (v/v) 열 비활성화 FBS, 4mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 100μg/ml 노르모신, 1X HEK-Blue 선별 배지로 보충된 DMEM 4.5g/L D-글루코오스에서 유지되었다.
간단히 말하면, 세포가 PBS로 세척되고, PBS에서 해리되고, 성장 배지에서 수집되었다. 세포가 96 웰 평판에서 25,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. LPS 유도 NF-κB 프로모터 활성화에 대한 세균 균주의 효과를 평가하기 위해, 세포가 10% 상층액 (전술된 바와 같이 단리됨)의 존재 또는 부재에서 10 ng/ml LPS로 처리되고 CO2 배양기에서 배양되었다. 처리는 37 ℃ 및 5% CO에서 22 시간 동안 진행되었고, 그 후 세포 배양 상층액으로부터 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제 (SEAP) 활성의 검출이 제조업체의 사용설명서에 따라서 QUANTI-blue 용액을 이용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 20 μl의 세포-없는 상층액이 수집되었고, 그리고 200μl의 무균 여과된 QUANTI-Blue 검출 배지와 혼합함으로써 SEAP의 존재에 대해 분석되었다. 37 ℃에서 2 시간 배양 후, 흡광도가 마이크로평판 판독기 (iMark 마이크로평판, Bio-Rad) 상에서 655nm에서 계측되었다.
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과
NCIMB 42787은 스스로, NF-κB-Ap1 프로모터 활성화를 유도하였다 (도 61c).
NF-κB는 특히, 면역 반응에 관련된 염증의 매개체 및 사이토킨, 예를 들면, IL-6의 발현을 자극함으로써 면역 반응의 활성화에 관련된다. 상기 개설된 바와 같이, IL-6의 발현에서 증가는 면역계를 자극하는 데 도움을 주고, 그리고 따라서 NF-κB 경로의 활성화는 면역자극 활성을 갖는다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB 신호전달을 활성화하고, 그리고 따라서 면역계를 자극한다.
실시예 25 - 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주는 부티르산, 발레르산 및 헥산산을 생산한다
재료와 방법
YCFA+, SCFAs의 표준 혼합물 (40 mM 아세트산 및 20 mM 포름산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산 및 헥산산)로 스파이킹된 YCFA+로부터 SCFA 추출이 De Baere et al.133의 방법에 따라서 수행되었다.
SCFAs의 HPLC 분석
SCFAs의 HPLC 검출과 정량은 약간 변경된 점을 제외하고, De Baere et al.133의 방법에 따라서 수행되었다. 간단히 말하면, HPLC 분석은 Waters 광다이오드 어레이 (PDA) 검출기 2998이 구비된 Waters e2695 HPLC 시스템 (Waters Limited, Elstree, UK)을 이용하여 수행되었다. SCFAs 표준, MRx0005와 MRx0029 BCFS 및 MRx0005와 MRx0029 헥산으로부터 추출된 SCFAs, 디에틸 에테르, 에틸 아세트산염, 아세토니트릴 및 메탄올 추출물의 HPLC 분석은 Xselect® HSS T3 3.5 μm 4.6x150mm LC 칼럼 (Waters Limited, Elstree, UK)을 이용하여 수행되었다. LC 분석은 200-800nm의 파장을 분석하도록 설정된 광다이오드 어레이 검출기 (PDA)를 이용하여 수행되었다. SCFA 검출과 정량은 210nm에서 수행되었다. 이동상은 HPLC 물에서 25mM 인산나트륨 완충액으로 구성되었다 (인산 (A) 및 아세토니트릴 (B)을 이용하여 pH가 3.0으로 조정됨. SCFA 검출과 정량을 위한 LC 방법은 하기의 구배를 갖는 용매 시스템을 이용하여 실행되었다: t0′ A=95%, B=5%; t10′ A=95%, B=5%; t30′ A=30%, B=70%; t31′ A=0%, B=100%; t36′ A=0%, B=100%; t38′ A=5%, B=95%; t60′ A=5%, B=95%; 유속=1ml/분.
SCFA (40mM 아세트산 및 20mM 포름산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산 및 헥산산)의 20μl의 2 배 연속 희석액을 주입함으로써, 각 SCFA에 대한 7-포인트 교정 곡선이 준비되었다. 정량-추출 효율은 아래의 공식을 이용하여 계산되었다:
[스파이킹되고 추출된 YCFA+에서 SCFA]/[스파이킹되지만 추출되지 않은 YCFA+에서 SCFA]
추출 효율은 각 표본에서 개별 SCFAs의 농도를 결정하는 데 이용되었다. 특정한 SCFAs의 생산은 스파이킹되지 않은 배지 대조 내에 존재하는 상응하는 SCFA의 양을 차감함으로써 계산되었다.
표적화된 대사체학: 세균 대사산물 및 지방산 분석
표본 분석은 MS-Omics (Copenhagen, Denmark)에 의해 실행되었다. 각 표본으로부터 분취량을 취함으로써, 혼합된 한데 모아진 표본 (QC 표본)이 창출되었다. 이러한 표본은 순서 내내 규칙적인 간격에서 분석되었다. QC 표본을 최소한 2가지 수준에서 스파이킹함으로써, 정량된 화합물에 대한 매트릭스 효과가 검사되었다.
GC-대사산물 분석을 위해, 표본은 Smart et al.134에 의해 설명된 프로토콜의 약간 변형된 버전을 이용하여, 메틸 클로로포름산염으로 유도체화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)를 이용하여 수행되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 그 후 상기 데이터는 Johnsen et al.135에 의해 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
SCFA 분석을 위해, 표본은 염화수소산을 이용하여 산성화되었고, 그리고 중수소-표지화된 내부 표준이 첨가되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)에서 설치된 높은-극성 칼럼 (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 칼럼 30mX0.25mmX0.25μm)을 이용하여 수행되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 그 후 상기 데이터는 Johnsen et al.135에 의해 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
결과
표적화된 대사체학을 이용한 지방산 분석은 NCIMB 42787이 부탄산 (부티르산), 펜탄산 (발레르산) 및 헥산산 (카프로산)을 선형 및 분지된 형태 (C4-C6) 둘 모두로 생산한다는 것을 증명하였다 (도 62a). 게다가, 4-히드록시-페닐아세트산:배지의 비율이 NCIMB 42787 세포-없는 상층액에서 증가되었다. 세포-없는 상층액의 HPLC 분석이 NCIMB 42787에 의한 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산 및 헥산산의 생산을 모니터링하는 데 이용되었다 (유관한 SCFAs의 체류 시간 및 흡광도 스펙트럼에 근거됨). SCFAs에 대한 추출된 NCIMB 42787 세포-없는 상층액에 덧씌워진 SCFA 표준에 대한 대표적인 크로마토그램은 도 62c에서 보고된다. HPLC 분석은 NCIMB 42787에 의한 부티르산, 발레르산 및 헥산산의 생산을 확증하였다.
실시예 26 - 부티르산염 및 발레르산염을 내포하는 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 메탄올성 분획물은 U373 세포에서 면역자극 활성을 보여준다
IL-8의 분비를 감소시키는데 있어서 SCFAs의 역할을 조사하기 위해, U373 세포는 증가하는 농도의 부티르산나트륨 (SB), 발레르산나트륨 (SV) 및 헥산산 (HA)으로 처리되었다.
방법
U373 세포는 앞서 설명된 바와 같이 준비되었다. 세포는 상기 지시된 1μg/ml LPS로 1 시간 동안 사전 처리되고 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었다. 1 시간 전배양 후, 세포가 CO2 배양기로부터 이전되고 증가하는 농도의 갓 제조된 부티르산나트륨 (SB), 발레르산나트륨 (SV) 및 헥산산 (HA)으로 처리되었다.
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과와 결론
검사된 농도는 상이한 지방산에 대한 세포-없는 상층액에서 계측된 농도의 범위를 커버하였고, 그리고 전술된 상층액의 단지 10%만 세포-기초된 검정에서 이용된다는 사실을 고려하였다. SB와 SV 둘 모두 동일한 세포에서 IL-8의 LPS-유도된 분비를 증가시켰는데 (도 63), 이것은 NCIMB 42787이 배양액에 첨가될 때, 양쪽 SCFAs의 존재가 아마도 IL-8 유도에 기여한다는 것을 암시하였다. HA는 LPS로 공격접종 후, IL-8 분비를 저해하지 않았다. 검사된 SFCAs 중에서 어느 것도 그 자체로는 IL-8의 분비를 기저 수준 (처리되지 않은 세포 대조)을 초과하여 유도하지 않았다. 이들 3가지 SCFAs의 재구성된 혼합물은 LPS의 존재와 부재 둘 모두에서, NCIMB 42787 세포-없는 상층액의 생물학적 활성을 재현하였다.
따라서, 일정한 구체예에서 부티르산 및/또는 발레르산은 IL-8의 산출에 관련되고, 그리고 이런 이유로 예를 들면, B 세포 증식을 통해 면역계를 자극하는 데 중요하다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 부티르산 및/또는 발레르산의 생산을 통해 면역계를 자극한다.
실시예 27 - NCIMB 42787에 의해 산출된 SCFAs는 면역자극 활성을 적어도 부분적으로 책임진다
도입
NCIMB 42787의 활성이 SCFAs에 적어도 부분적으로 기인하는 지를 더욱 확증하기 위해, 세포-없는 세균 상층액이 증가하는 극성의 상이한 용매로 분획되었다. NCIMB 42787의 정지기 세포-없는 상층액의 생화학적 복잡성을 분석할 뿐만 아니라 극성 및 용해도에 기초하여 화합물을 소분획하기 위해, 이러한 균주 상층액의 탈단백분해된 미가공 추출물 (헥산, F5; 디에틸 에테르, F4; 에틸 아세트산염, F3; 아세토니트릴, F4; 메탄올, F1)의 HPLC 분석이 수행되었다.
방법
순차적 용매 추출- 미가공 추출물의 준비
NCIMB 42787 균주 BCFSs 및 YCFA+ (배지 대조)의 3가지 생물학적 복제물이 HPLC-등급 헥산 (HEX), 디에틸 에테르 (DE), 에틸 아세트산염 (EtOAc), 아세토니트릴 (ACN) 및 메탄올 (MeOH)로 순차적으로 추출되었다. 간단히 말하면, 20ml의 BCFS가 유리 바이알에 배치되고, 그리고 회전 진탕기 (70rpm) 상에서 20ml의 HEX에서 실온 (RT)에서 30 분 동안 추출되었다. 총 3회 추출이 각 BCFS 및 YCFA+ 배지 대조에서 수행되었다. 남아있는 수성 층은 이후, MX-RD-Pro 회전 진탕기 (70rpm) 상에서 20ml의 DE, EtOAc에서 실온에서 30 분 동안 총 3회 추출되었다. 각 표본의 조합된 추출물은 30℃를 초과하지 않는 온도에서 V-300 진공 펌프 (B
Figure pct00002
chi, Flawil, Switzerland)가 구비된 R-300 회전 증발기에서 감소된 압력 하에 건조되었다. 결과의 추출물은 2ml의 상응하는 용매에서 재용해되고 4개의 1.5ml 에펜도르프 튜브 (500μl 각각이 5ml의 본래 표본에 상응)에 분취되었다. 남아있는 수성 층은 이후, MX-RD-Pro 회전 진탕기 (70rpm) 상에서 20ml의 DE, EtOAc에서 실온에서 30 분 동안 총 3회 추출되었다. 각 표본의 조합된 추출물은 30℃를 초과하지 않는 온도에서 V-300 진공 펌프 (B
Figure pct00003
chi, Flawil, Switzerland)가 구비된 R-300 회전 증발기에서 감소된 압력 하에 건조되었다. 결과의 추출물은 2ml의 상응하는 용매에서 재용해되고 4개의 1.5ml 에펜도르프 튜브 (500μl 각각이 5ml의 본래 표본에 상응)에 분취되었다.
남아있는 수성 층은 R-300 회전 증발기를 이용하여 증발 건조되었다. 결과의 건성 추출물은 20ml의 ACN에서 30 분 동안 총 3회 추출되었다. ACN 추출물은 조합되고, 회전 증발기를 이용하여 증발 건조되고, 2ml의 ACN에서 재용해되고, 4개의 1.5ml 에펜도르프 튜브 (각각 500μl)에 분취되었다. 남아있는 건성 추출물 (추출물의 ACN 불용성 부분)은 이후, 20ml의 MeOH에서 30 분 동안 총 3회 추출되었다. MeOH 추출물은 조합되고, R-300 회전 증발기를 이용하여 증발 건조되고, 2ml의 MeOH에서 재용해되고, 4개의 1.5ml 에펜도르프 튜브 (각각 500μl)에 분취되었다.
미가공 추출물의 분취량은 -20 ℃에서 하룻밤 동안 유지하여, 단백질성 성분의 침전을 유도하였다. 하룻밤 침전 이후에, 각 분취량은 6 분 동안 10,000xg에서 원심분리되고 새로운 2ml 튜브로 이전되었다. 하룻밤 침전은 3회 반복되었고, 그 후 추출물은 RVC 2-18 CDPlus speedvac (Christ, Osterode am Harz, Germany)에서 건조되고 계량되었다. 각 추출물의 모든 건조된 분취량은 추가 이용 때까지 -80℃에서 보관되었다.
처리
U373 세포는 앞서 설명된 바와 같이 준비되었다. 세포는 상기 지시된 바와 같이 1μg/ml LPS로 1 시간 동안 사전 처리되었다. 그 후, 세포가 CO2 배양기로부터 이전되고 100μl의 상이한 분획물로 처리되었다. 배지로부터 분획물은 대조로서 이용되었다. 처리 후 24 시간 시점에, 세포-없는 상층액이 수집되고, 그리고 IL-8 분비에 대해 ELISA에 의해 분석되었다 (상기 개설된 바와 같음).
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과
HPLC 분석은 탈단백분해된 상층액 내에 존재하는 화합물의 선별적 추출 및 미가공 분획을 확증하였다. 미분획된 NCIMB 42787은 LPS의 존재와 부재 둘 모두에서 U373 세포에서 IL-8 분비를 유도하였고, 그리고 동일한 활성이 메탄올성 분획물 F1에 의해 산출되었고, 따라서 이들 세포 유형에 의한 IL-8 생산에서 부티르산과 발레르산의 중요한 역할을 재확인하였다 (도 64a 및 b).
이런 이유로, 상기 개설된 바와 같이, 일정한 구체예에서, 부티르산 및/또는 발레르산의 생산은 면역계를 자극하였다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 부티르산 및/또는 발레르산의 생산을 통해 면역계를 자극한다.
실시예 28: 메가스파에라 (Megasphaera) 표준 균주 NCIMB 43387은 BALB/c 생쥐에서 결장 IDO-1 mRNA 발현을 유의미하게 감소시킨다.
도 65는 NCIMB 43387이 운반제 대조와 비교하여, BALB/c 생쥐의 결장에서 IDO-1 mRNA 발현에서 유의미한 감소 (β-액틴에 대해 정규화된 qPCR에 의해 정량됨)를 유발한다는 것을 보여준다.
IDO-1은 염증 또는 감염에 대응하여 면역억제를 증진하는 데 연루되었다. 따라서, IDO-1 발현에서 감소를 주동하는 것은 면역자극과 연관된다. 게다가, IDO-1에서 감소는 암 세포의 증식과 이동 능력을 감소시키고, 그리고 종양에 대항하여 면역 감시를 향상시킨다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 IDO-1 발현을 감소시키는 데 역할을 한다. 일정한 구체예에서, 면역자극은 IDO-1 발현의 감소와 연관된다. 이에 더하여, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전이성 암 성장을 예방한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전이에 대항하는 그들의 활성에 비추어, 암, 특히, 전이성 흑색종, 소세포 폐암 및 선편평상피 폐 암종을 치료하고 예방하는 데 효과적이다.
실시예 29 - 수탁 번호 NCIMB 43385 및 NCIMB 43387 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주는 BALB/c 생쥐에서 결장 Tph-1 mRNA 발현을 감소시킨다
BALB/c 생쥐는 살아있는 생물치료제가 투여되었고, 그리고 qPCR을 이용한 유전자 발현의 분석을 위해 조직이 단리되었다.
도 66은 운반제 대조와 비교하여, Tph-1 mRNA의 발현을 감소시키는 본 발명의 조성물의 능력을 보여준다 (β-액틴에 대해 정규화된 qPCR에 의한 정량을 이용하여).
Tph-1에서 감소는 증가된 암 저항성 및 감소된 암 세포 성장과 연관되는 것으로 알려져 있다. 이에 더하여, Tph-1 활성에서 감소는 비만 세포가 항종양 면역성을 주동하는 데 충분한 수준의 필수 아미노산 트립토판을 제공함으로써 면역계를 자극한다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tph-1 발현의 수준을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역자극을 촉발하고, 그리고 Tph-1의 수준을 감소시킴으로써 본원에서 개시된 질환을 치료하고 및/또는 예방한다.
실시예 30 - 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주는 BALB/c 생쥐로부터 비장세포의 ConA 자극 시에 IFNγ와 IL-6 생산을 증가시킨다
살아있는 생물치료 균주가 BALB/c 생쥐로부터 단리되고 ConA로 자극된 비장세포에서 면역 마커 생산의 효능에 대해 탈체에서 선별검사되었다.
도 67은 친염증성 사이토킨 IFNγ와 IL-6의 생산을 유의미하게 증가시키는 본 발명의 조성물의 능력을 보여준다. 상기 개설된 바와 같이, 이들 사이토킨의 양쪽 모두 면역 반응의 자극에 관련된다. 게다가, IFNγ은 유의미한 종양파괴 활성을 갖는다.
따라서, 상기 개설된 바와 같이, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IFNγ 및/또는 IL-6의 생산을 증가시키고, 그리고 이런 이유로 면역 반응의 자극을 주동한다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물의 치료적 유익성은 IFNγ 및/또는 IL-6 생산에서 증가에 연계된다.
실시예 30 - 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 표준 균주는 IL-6과 CD11b 발현을 유의미하게 증가시킨다
BALB/c 생쥐는 살아있는 생물치료제가 투여되었고, 그리고 qPCR을 이용한 유전자 발현의 분석을 위해 조직이 단리되었다.
도 68은 운반제 대조와 비교하여, BALB/c 생쥐의 해마에서 IL-6과 CD11b 발현을 유의미하게 증가시키는 NCIMB 43385의 능력을 보여준다.
따라서, 상기 개설된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 일정한 구체예에서, 면역 반응의 자극에 관련된 친염증성 사이토킨, 특히 IL-6과 CD11b의 발현을 증가시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6과 CD11b 발현에서 증가에 비추어 치료적으로 효과적이다.
실시예 31 - NCIMB 42787은 TLR4 발현을 증가시킨다
BALB/c 생쥐는 살아있는 생물치료제가 투여되었고, 그리고 qPCR을 이용한 유전자 발현의 분석을 위해 조직이 단리되었다.
도 69는 운반제 대조와 비교하여, BALB/c 생쥐의 편도에서 TLR4 발현을 유의미하게 증가시키는 NCIMB 42787의 능력을 보여준다.
TLR4는 면역 반응을 활성화하는 것과 연관된다. 따라서, TLR4 발현을 증가시키는 것은 면역자극을 향상시킬 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TLR4의 발현을 증가시킨다. 일정한 구체예에서, TLR4 발현에서 증가는 면역 반응을 증가시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 증가시키고, 그리고 TLR4 발현에서 증가를 통해 본원에서 개시된 질환을 치료하는 데 치료적으로 효과적이다.
서열
서열 번호: 1 (메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029에 대한 공통 16S rRNA 서열)
TGAGAAGCTTGCTTCTTATCGATTCTAGTGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTTCAGATGGGGACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGAATACGTTCTTTCCGCCGCATGACGGGAAGAAGAAAGGGAGGCCTTCGGGCTTTCGCTGGAGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTGTTATATGGGACGAACAGGACATCGGTTAATACCCGGTGTCTTTGACGGTACCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGCATCGCAAGTCGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACCGAAACTGTGAAGCTCGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGAGGTATCGACTCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGCCTTGACATTGATTGCTACGGAAAGAGATTTCCGGTTCTTCTTCGGAAGACAAGAAAACAGGTGGTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTCTGTTGCCAGCACCTCGGGTGGGGACTCAGAAGAGACTGCCGCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGGCTTGGGCTACACACGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGATCCGGAGCAAACCCCAAAAACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCATTCACACCCGAAGCCGGTGAGGCAACCGCAAG
qPCR에 이용된 프라이머
Figure pct00004
서열 번호: 8 (수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
GGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTATCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATC
서열 번호: 9 (수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massilliensis) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
GGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCGAGGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAAAGACACCGGGTATTAACCGATGTCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCTTCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTAGAATCGATAAGAAGCAAGCTTCTCATGTCTTCT
서열 번호: 10 (수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massilliensis) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
CGACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCGAGGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAAAGACACCGGGTATTAACCGATGCCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACCAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCTTCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTAGAATCGATAAGAAGCAAGCTTCTCATGTCTTCTCGTTCGACTTGCAT
서열 번호: 11 (수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
CGACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTATCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATCTCTTCTCGTTCGACTGCA
서열 번호: 12 (수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
TCGAACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTATCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATCTCTTCTCGTTCGACTTGCA
에놀라아제의 qPCR에 이용된 프라이머
Figure pct00005
참고문헌
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> 4D PHARMA RESEARCH LIMITED <120> COMPOSITIONS COMPRISING BACTERIAL STRAINS <130> P073343WO <141> 2019-05-13 <150> 18171893.3 <151> 2018-05-11 <150> 18178136 <151> 2018-06-15 <150> 1810386.1 <151> 2018-06-25 <150> 1813460.1 <151> 2018-08-17 <150> 1817642.0 <151> 2018-10-29 <150> 1820264.8 <151> 2018-12-12 <150> 1820256.4 <151> 2018-12-12 <160> 14 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 1398 <212> DNA <213> consensus 16S rRNA sequence for Megasphaera massiliensis strain MRx0029 <400> 1 tgagaagctt gcttcttatc gattctagtg gcaaacgggt gagtaacgcg taagcaacct 60 gcccttcaga tggggacaac agctggaaac ggctgctaat accgaatacg ttctttccgc 120 cgcatgacgg gaagaagaaa gggaggcctt cgggctttcg ctggaggagg ggcttgcgtc 180 tgattagcta gttggagggg taacggccca ccaaggcgac gatcagtagc cggtctgaga 240 ggatgaacgg ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300 ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgaacg atgacggcct 360 tcgggttgta aagttctgtt atatgggacg aacaggacat cggttaatac ccggtgtctt 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gggatactta 600 ttgcgttaac tccggcacag aaggagtcga tacctcctac acctagtatc catcgtttac 660 ggccaggact accggggtat ctaatcccgt ttgctcccct ggctttcgcg cctcagcgtc 720 agttgtcgtc cagaaagccg ctttcgccac tggtgttcct cctaatatct acgcatttca 780 ccgctacact aggaattccg ctttcctctc cgacactcga gcttcacagt ttcggtcccc 840 tcacggggtt aagccccgca cttttaagac cgacttgcga tgccgcctgc gcgcccttta 900 cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960 ttagccgtgg ctttctctta cggtaccgtc agggataacg ggtattgacc gctatcctgt 1020 tcgtcccata taacagaact ttacaacccg aaggccgtca tcgttcacgc ggcgttgctc 1080 cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140 cgtgtctcag tcccaatgtg gccgttcatc ctctcagacc ggctactgat cgtcgccttg 1200 gtgggccgtt acccctccaa ctagctaatc agacgcaagc ccctcctcca gcgaaagccc 1260 gaaggcctcc ctttcttcat cccgtcatgc ggcggaaaga acgtattcgg tattagcagc 1320 cgtttccagc tgttgtcccc atctgaaggg caggttgctt acgcgttact cacccgtttg 1380 ccactcgaat tgataagaag caagcttctc atctcttctc gttcgactgc a 1431 <210> 12 <211> 1434 <212> DNA <213> consensus 16S rRNA sequence for the Megasphaera strain deposited under accession number NCIMB 43387 <400> 12 tcgaacggct ggttccttgc ggttgcctca ccggcttcgg gtgtgaatga ctttcgtggt 60 gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcagtatgct gacctgcgat 120 tactagcgat tcctgcttca tgcaggcgag ttgcagcctg caatccgaac tgggactctg 180 tttttggggt ttgctccgga tcgctccttc gcttccctct attaagagcc attgtagtac 240 gtgtgtagcc caagccataa ggggcatgat gacttgacgt catccccgcc ttcctccgca 300 ttgtctgcgg cagtctcttc tgagtcccca cccttagtgc tggcaacaga agataggggt 360 tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccgtgcac 420 cacctgtttt cttgtcttcc gaagaagaac cggaaatctc tttccgtagc aatcaatgtc 480 aaggcttggt aaggttcttc gcgttgcgtc gaattaaacc acatactcca ccgcttgtgc 540 gggcccccgt caattccttt gagtttcagc cttgcggccg tactccccag gcgggatact 600 tattgcgtta actccggcac agaaggagtc gatacctcct acacctagta tccatcgttt 660 acggccagga ctaccggggt atctaatccc gtttgctccc ctggctttcg cgcctcagcg 720 tcagttgtcg tccagaaagc cgctttcgcc actggtgttc ctcctaatat ctacgcattt 780 caccgctaca ctaggaattc cgctttcctc tccgacactc gagcttcaca gtttcggtcc 840 cctcacgggg ttaagccccg cacttttaag accgacttgc gatgccgcct gcgcgccctt 900 tacgcccaat aattccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960 agttagccgt ggctttctct tacggtaccg tcagggataa cgggtattga ccgctatcct 1020 gttcgtccca tataacagaa ctttacaacc cgaaggccgt catcgttcac gcggcgttgc 1080 tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg 1140 gccgtgtctc agtcccaatg tggccgttca tcctctcaga ccggctactg atcgtcgcct 1200 tggtgggccg ttacccctcc aactagctaa tcagacgcaa gcccctcctc cagcgaaagc 1260 ccgaaggcct ccctttcttc atcccgtcat gcggcggaaa gaacgtattc ggtattagca 1320 gccgtttcca gctgttgtcc ccatctgaag ggcaggttgc ttacgcgtta ctcacccgtt 1380 tgccactcga attgataaga agcaagcttc tcatctcttc tcgttcgact tgca 1434 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Enolase qPCR forward primer <400> 13 ccctgtatcg taagaacggt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Enolase qPCR reverse primer <400> 14 gccaccattg atcacgttga 20

Claims (28)

  1. 개체에서 면역계를 자극하는 데 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물.
  2. 청구항 제 1항에 있어서, 암, 예컨대 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 신경모세포종, 교모세포종, 암종, 폐암, 만성 림프구 백혈병, 전립선암, 림프종, 위암, 결장직장암 및/또는 혈액학적 악성종양을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한, 조성물.
  3. 청구항 제 2항에 있어서, 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 저해 활성을 갖는, 조성물.
  4. 청구항 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 조성물은 친염증성 사이토킨을 상향조절하는, 조성물.
  5. 청구항 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 소화관 장벽 투과성을 감소시키는 데 이용을 위한, 조성물.
  6. 청구항 제 1항에 있어서, 면역노화를 치료하거나, 예방하거나 또는 지연시키는 데 이용을 위한, 조성물.
  7. 청구항 제 1항에 있어서, 백신 어쥬번트로서 이용을 위한, 조성물.
  8. 청구항 제 1항에 있어서, 세포 요법, 예컨대 CAR-T를 증강하는 데 이용을 위한, 조성물.
  9. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 카스파제 3, MAP2, IL-1β, IL-23 및/또는 TNF-α의 발현 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 이용을 위한, 조성물.
  10. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세포 개체군에서 Tregs의 숫자 및/또는 백분율을 선별적으로 감소시키는 방법에서 이용을 위한, 조성물.
  11. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는, 조성물.
  12. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 서열 번호:8, 9, 10, 11 또는 12 중에서 한 가지와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나, 또는 세균 균주는 서열 번호:8, 9, 10, 11 또는 12 중에서 한 가지에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는, 조성물.
  13. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주인, 조성물.
  14. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 서열 번호:1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나, 또는 세균 균주는 서열 번호:1에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는, 조성물.
  15. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 수탁 번호 42787 하에 NCIMB에 기탁된 균주인, 조성물.
  16. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 조성물은 경구 투여용인, 조성물.
  17. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 조성물은 한 가지 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 운반체를 포함하는, 조성물.
  18. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 동결 건조되는, 조성물.
  19. 임의의 전술한 청구항의 이용을 위한, 임의의 전술한 청구항의 조성물을 포함하는 식품 산물.
  20. 감소된 면역자극과 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에 있어서, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 청구항 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에서 규정된 세균 균주의 세포를 포함하는 조성물에 있어서, 세포는 하나 또는 그 이상의 이종성 항원을 발현하는, 조성물.
  22. 청구항 제 21항에 있어서, 세포는 하나 또는 그 이상의 이종성 항원을 제시하는, 조성물.
  23. 청구항 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 백신으로서 이용을 위한, 조성물.
  24. 청구항 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에서 규정된 세균 균주의 세포에 있어서, 세포는 하나 또는 그 이상의 이종성 항원을 발현하는, 세포.
  25. 청구항 제 24항에 있어서, 세포는 하나 또는 그 이상의 이종성 항원을 제시하는, 세포.
  26. 청구항 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 백신으로서 이용을 위한, 세포.
  27. 요법에서 이용을 위한 세균 균주에 있어서, 세균 균주는 서열 번호:8, 9, 10, 11 또는 12 중에서 한 가지와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는, 세균 균주.
  28. 요법에서 이용을 위한, 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12 중에서 한 가지에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주.
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