JP2014217291A - 免疫調節作用を有するrna - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 乳酸菌 エンテロコッカス・フェカリス種に属するEC−12株の23S rRNAが、ヒトの免疫機能を調節する作用を有することを見出した。さらに、この2909塩基からなる23S rRNAにおいて、この免疫調節作用を有するのは、1〜411位の塩基配列からなる1本鎖RNA、1836〜1994位の塩基配列からなる1本鎖RNA及び2085〜2104位の塩基配列からなる1本鎖RNAであることも明らかにした。
【選択図】 なし
Description
(1) ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、下記(a)〜(c)のうちのいずれか一に記載の1本鎖RNA
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。
(2) ヒトIL−12の産生を促進する作用を有する、下記(a)〜(c)のうちのいずれか一に記載の1本鎖RNA
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。
(3) (1)又は(2)に記載の1本鎖RNAをコードするDNA。
(4) 下記(a)〜(c)からなる群から選択される少なくとも一の1本鎖RNA又は該1本鎖RNAをコードするDNAを有効成分とする、ヒトの免疫機能を調節するための組成物
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。
(5) 下記(a)〜(c)からなる群から選択される少なくとも一に記載の1本鎖RNA又は該1本鎖RNAをコードするDNAを有効成分とし、IL−12の産生を促進するための組成物
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。
<哺乳動物の免疫機能を調節する作用を有する、EC−12由来RNAの特定>
前記の通り、EC−12由来の1本鎖RNAがマウスにおいてIL−12の産生を促進する作用等を有していることは明らかになっている。そこで、本発明者らは、どのような配列からなる1本鎖RNAがかかる免疫調節作用を有しているのかを、マウス由来のマクロファージ様細胞株を用い、該細胞におけるIL−12産生能を指標として解析した。
<ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、EC−12由来成分の特定>
前述の通り、マウスにおいてIL−12の産生を促進する作用を有する、EC−12の23S rRNAの2055〜2074位の塩基配列からなる1本鎖RNAは、ヒトにおいてはその作用が認められなかった。
先ず、ヒトの血液をPBSで2倍希釈し、パーコール(比重:1.077g/mL)に重層した。遠心分離した後、中間層を末梢血単核球(PBMC)として回収し、PBSにて洗浄した。次いで、ACK溶解緩衝液にて残りの赤血球を除去した後、再度PBSにて洗浄した。次に、このようにして調製したPBMCの生細胞数を計測し、96穴プレートに3x105細胞/穴になるよう、RPMI1640培地(L−グルタミン、10%ウシ胎児血清、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン含有)に播種し、CO2インキュベーター内で2〜3時間静置した。なお、このようにしてヒト2名の血液からヒトPBMCを各々調製した。
前記ヒトPBMCに添加するため、EC−12を次のように処理した。EC−12(コンビ株式会社製)を、RPMI1640培地(L−グルタミン、10%ウシ胎児血清、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン含有)に10mg/mLとなるように添加し、37℃、30分間処理し、前記ヒトPBMCに添加するための菌体懸濁液を調製した。また、EC−12を、20units/mLのRNase free DNase I(Roche社製)及び/又は0.1mg/mLのRNase A(Invitrogen社製)で37℃、30分間処理し、前記ヒトPBMCに添加するための、ヌクレアーゼ処理済み菌体懸濁液を調製した。そして、それら菌体懸濁液をRPMI1640培地(L−グルタミン、10%ウシ胎児血清、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン含有)で希釈し、200μg/mlとなるように調整した。
前記の通りに調製した添加用EC−12をEC−12の終濃度が100μg/mLになるよう、前記ヒトPBMCに添加し、CO2インキュベーター内で48時間培養した。
前記48時間培養後の細胞培養上清中のIL−12p40タンパク質の濃度を、IL−12p40 ELISAキット(Biolegend社製)を用いて測定した。なお、測定の手順はキット添付のプロトコールに準拠した。得られた結果を図2に示す。
<ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、EC−12由来RNAの特定>
ヒトの免疫機能を調節する作用を有するEC−12の1本鎖RNAの配列を特定するために、EC−12から全RNA、23S rRNAを抽出、精製し、ヒト胎児腎由来の細胞(HEK293細胞)に対するTLR7又はTLR8に対する活性化能を、以下に示す方法にて評価した。
EC−12からの全RNA(totalRNA)抽出にはクイックジーンRNA組織キットSII(QuickGene RNA tissue kit SII、KURABO社製)を用いた。抽出処理はクイックジーン−ミニ80(QuickGene−Mini80、KURABO社製)を用い、キット添付のプロトコールに準拠して行った。
前記方法にて抽出した全RNAを1.5%アガロースゲル(TBEバッファー)にて電気泳動を行い、目的のバンド(23S rRNA:2909塩基)を切り出し、QIAクイックゲル抽出キット(QIAquick Gel Extraction Kit、QIAGEN社製)を用いて精製した。なお、精製の手順はキット添付のプロトコールに準拠した。
先ず、HEK293細胞を白色96穴プレートに2x104細胞/穴になるよう播種し、CO2インキュベーター内で一晩静置した。また、ルシフェラーゼアッセイ用ベクター、pGL4.32[luc2P/NF−κB−RE/Hygro](プロメガ社製)180ngと、pUNO1−hTLR07(Invivogen社製)420ng又はpUNO1−hTLR08(Invivogen社製)420ngと、94μLのOPTI−MEM(Invitrogen)とを混合し、更にトランスフェクション試薬(Roche社製、製品名:FuGENE HD)6μLを添加して混合した後、10分間室温にて静置した。
<ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、EC−12由来23S rRNAの特定1>
EC−12の23S rRNAにおいて、ヒトの免疫機能を調節する作用を有するのはどの部位であるのかを特定するために、該23S rRNAを400塩基毎に分割し、これら1本鎖RNAについてヒトTLR7及びヒトTLR8の活性化能を評価した。
EC−12からのDNA抽出にはクイックジーンDNA組織キットS(QuickGene DNA tissue kit S、KURABO社製)を用いた。抽出処理にはQuickGene−Mini80を用い、キット添付のプロトコールに準拠した。
PCRにはKOD FX neo(TOYOBO社製)を使用した。なお、反応溶液の組成はKOD FX neo(1U/μl)0.75μl、2×PCR Buffer forKOD FX neo12.5μl、2mM dNTP5μl、10μMのプライマーセット1.5μl、滅菌蒸留水3.25μl、鋳型(ゲノム)0.5μlの合計25μlとした。なお、これらプライマーセットは、23S rRNAをコードするDNAにおいて、1〜411位の塩基からなる部位、351〜738位の塩基からなる部位、699〜1148位の塩基からなる部位、1084〜1522位の塩基からなる部位、1501〜1856位の塩基からなる部位、1836〜2152位の塩基からなる部位、2133〜2530位の塩基からなる部位及び2511〜2909位の塩基からなる部位を各々増幅できるよう設計して合成したものである。
前記にて精製したPCR産物(DNA)をpCR−BluntII−TOPOに組み込んだ。かかるライゲーションの反応液の組成は、pCR−BluntII−TOPO1μl、Salt Solution1μl、滅菌蒸留水1.5μl、PCR産物2.5μlとし、反応液を室温で5分間インキュベートした。その後、大腸菌(NEB Turbo Competent E.coli(BioLabs社製))にヒートショック法にてライゲーション産物を導入し、形質転換を行った。次いで、このようにして得られた大腸菌を含カナマイシン50μg/mlLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩培養した。なお、以下の実験は50μg/mlカナマイシンを添加した培地にて行った。
制限酵素salI、SpeI、BamHI(TOYOBO社製)を用いて、前記にて抽出したプラスミドDNAの制限酵素処理を行った。反応溶液の組成は各制限酵素2μl、10×Hバッファー又は10×Mバッファー2μl、プラスミドDNA16μlの合計20μlとし、反応を37℃にて2時間から一晩行った。
反応終了後の制限酵素反応液に、プロテナーゼKを最終濃度100μg/ml、SDSを最終濃度0.5%となるように添加し、反応を37℃にて30分間行った。次いで、等量のフェノール/クロロホルムを加え1分間ボルテックスした後、室温にて、15,000rpmで5分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清を1.5ml微量遠心チューブに回収し、1/10量の3M酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノールとを加えてエタノール沈殿を行った。軽く攪拌した後に、4℃、15,000rpmで5分間遠心分離後、上清を除去し、2.5倍量の80%エタノールを加えて洗浄した。次いで、軽く攪拌した後に、4℃、15,000rpmで5分間遠心分離後、上清を除去し、回収したDNAをRNaseフリーの水50μlに溶解した。
前記にてプロテナーゼK処理及び精製したDNAを鋳型として、インビトロ転写(in vitro Transcription)T7キット(Takara社製)を用いてRNAを合成した。反応溶液の組成は10×転写バッファー(Transcription Buffer)2μl、ATP溶液2μl、GTP溶液2μl、CTP溶液2μl、UTP溶液2μl、RNase阻害剤0.5μl、T7RNAポリメラーゼ2μl及びDNA 100ngに、RNaseフリーdH2Oを加え、全量20μlとした。そして、反応を42℃にて120分間行った。
RNaseフリーDNaseI(Takara社製)を用いて、前記にて合成したRNAのDNase処理を行った。15U/20μl反応液となるようにRNaseフリーDNaseIを混和し、37℃にて30分間インキュベートを行った。DNase処理後、MEGAclear(TM)Kitを用いて精製した。なお、精製の手順はキット添付のプロトコールに準拠した。
先ず、ルシフェラーゼアッセイ用ベクターを導入したHEK293細胞を前記同様に調製した。また、前述のインビトロ転写にて調製した1本鎖RNA5μgをOPTI−MEM100μLに添加し、更にFuGENE HD6μLを添加して、混合した後、10分間室温にて静置した。そして、このようにして調製したRNAとトランスフェクション試薬との混合液を、前記HEK293細胞に、各穴10μLずつ添加し、CO2インキュベーター内で15時間静置した。さらに、コントロール(陰性対照)として、前記ルシフェラーゼアッセイ用ベクターは導入されているが、RNAは導入されていないHEK293細胞も調製した。
<ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、EC−12由来23S rRNAの特定2>
実施例1において、ヒトTLR7及びヒトTLR8の活性化能を有していることが明らかになった、前記1836〜2152位の塩基からなる1本鎖RNAを、更に2分割し、これら1本鎖RNAについてヒトTLR7及びヒトTLR8の活性化能を評価した。
<ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、EC−12由来23S rRNAの特定3>
実施例2において、ヒトTLR7及びヒトTLR8の活性化能を有していることが明らかになった、前記1947〜2152位の塩基からなる1本鎖RNAを、更に13分割し、これら1本鎖RNAについて、ヒトIL−12産生の促進能を、以下に示す方法にて評価した。
<223> 免疫調節能を有するDNAの配列
Claims (5)
- ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、下記(a)〜(c)のうちのいずれか一に記載の1本鎖RNA
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。 - ヒトIL−12の産生を促進する作用を有する、下記(a)〜(c)のうちのいずれか一に記載の1本鎖RNA
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。 - 請求項1又は2に記載の1本鎖RNAをコードするDNA。
- 下記(a)〜(c)からなる群から選択される少なくとも一の1本鎖RNA又は該1本鎖RNAをコードするDNAを有効成分とする、ヒトの免疫機能を調節するための組成物
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。 - 下記(a)〜(c)からなる群から選択される少なくとも一に記載の1本鎖RNA又は該1本鎖RNAをコードするDNAを有効成分とし、IL−12の産生を促進するための組成物
(a)配列番号:1に記載の1〜411位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(b)配列番号:1に記載の1836〜1994位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA
(c)配列番号:1に記載の2085〜2104位の塩基配列、又は該配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加した塩基配列からなる1本鎖RNA。
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