JP6138570B2

JP6138570B2 - 免疫調節作用を有するｒｎａ

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Publication number: JP6138570B2
Application number: JP2013097037A
Authority: JP
Inventors: 卓巳渡邉; 祐子牧岡; 牛田　一成; 一成牛田; 井上　亮; 亮井上
Original assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; Combi Corp
Current assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; Combi Corp
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2033-05-02
Also published as: JP2014217291A

Description

本発明は、ヒトの免疫機能を調節する作用を有するＲＮＡに関し、より詳しくは、ＩＬ−１２等のサイトカイン等を介してヒトの免疫機能を調節する作用を有する、特定の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ及び当該１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡに関する。また、本発明は、前記１本鎖ＲＮＡ又は前記ＤＮＡを有効成分とする、ヒトの免疫機能を調節するための組成物に関する。

免疫は、細菌、酵母、カビといった微生物やウィルス等による感染や腫瘍に対する防御に深く関与している。また、免疫は、加齢やストレス、疾病等により機能の低下やバランスが崩れ、アレルギー性疾患や自己免疫疾患、免疫不全状態が惹起されることも明らかとなっている。そのため、賦活化も含めた免疫機能の調節は重要である。

インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は主に単球やマクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞で産生され、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞やヘルパーＴ細胞の増殖を促進し、さらにこれらの細胞に作用してインターフェロンγやＴＮＦ−αの産生を促進することが知られている。また、ＩＬ−１２は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の細胞傷害活性を亢進することも明らかになっている。さらに、ＩＬ−１２はナイーブＴ細胞を細胞性免疫を担うＴｈ１細胞に分化させ、ひいてはアレルギーの要因であるＴｈ２細胞の活性を抑制することも明らかになっている。このように、ＩＬ−１２は賦活化も含めた免疫機能の調節において重要な役割を担っているため、感染症、がん、アレルギー性疾患、免疫不全状態、自己免疫疾患等の治療、予防又は改善への適用が期待されている。

一方、ＩＬ−１２等を産生するマクロファージや樹状細胞は、体内に侵入してきた病原微生物に存在する特有の分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒｎｓ：ＰＡＭＰｓ）を認識する受容体（Ｐａｔｔｅｒｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＰＲＲｓ）を発現することが知られている。

マクロファージや樹状細胞が外来微生物を認識するために、最も重要な役割を果たしているＰＲＲｓの１つに、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）がある。現在、哺乳類で確認されているＴＬＲは１３種類であり、それらＴＬＲの多くは主に細菌のＰＡＭＰｓを認識することが知られており、ＴＬＲはＰＡＭＰｓを認識した後、細胞質内のＴＩＲ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からシグナルが伝達され、例えば前述の通りＩＬ−１２等のサイトカインを介して免疫系を調節することになる。

そこで、ＰＡＭＰｓに着目した免疫調節物質の開発が近年行われており、本発明者らもエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）等の乳酸菌由来の１本鎖ＲＮＡにＩＬ−１２の産生を促進する作用等を含む免疫調節作用があることを見出している（特許文献１）。

しかしながら、どの１本鎖ＲＮＡに免疫調節作用があるのかは不明である。更に、どのような塩基配列が免疫調節を担っているかについても、いまだ明らかになっていない。

国際公開第２０１１／０２７８２９号

本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトの免疫機能を調節する作用を有する１本鎖ＲＮＡを同定することにある。さらなる本発明の目的は、同定した１本鎖ＲＮＡにおいて、いかなる塩基配列が、ヒトの免疫機能を調節する作用を担っているかを解明することにある。

免疫調節作用を有する１本鎖ＲＮＡを同定し、さらに、かかる１本鎖ＲＮＡにおいて、免疫調節作用を有する塩基配列を同定できれば、例えば、特定のＰＡＭＰｓを認識する受容体に対する特異的なシグナル伝達を活性化することができるようになり、ひいては特定の免疫系の調節が可能となる。また、同定された塩基配列を繰り返す態様で利用することにより、免疫調節作用の強い物質を作りだすこともできる。そこで、本発明者らは、免疫調節作用を有する１本鎖ＲＮＡを同定すべく、マウス由来のマクロファージ様細胞株を用いて鋭意研究を重ねた。その結果、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス種のＥＣ−１２株のＲＮＡのうち、１本鎖ＲＮＡの１種である２３ＳｒＲＮＡが、免疫調節において重要な役割を担っているＩＬ−１２の産生を促進する作用（ＩＬ−１２産生促進能）を有することを見出した。さらに、この２３ＳｒＲＮＡにおいて、１９７４〜２１５２位の１７９塩基からなるＲＮＡがこの促進能を保持することをも見出した。また、この促進能を発揮するために必要な最小配列は、２３ＳｒＲＮＡの２０５５〜２０７４位の塩基配列であることも明らかにした。

しかしながら、この２０５５〜２０７４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡをヒト末梢血単核球に導入したところ、該細胞においてＩＬ−１２産生能の促進は認められなかった。すなわち、マウスにおいて免疫機能を調節する作用が認められた前記２０５５〜２０７４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡは、ヒトにおいては免疫機能を調節できないことが明らかになった。

そこで、ＥＣ−１２由来の成分がヒトにおいてもＩＬ−１２の産生を促進できるかどうかを評価した。その結果、ＥＣ−１２由来の１本鎖ＲＮＡは、ヒトのＴＬＲ７を活性化できることが明らかになった。さらに、該１本鎖ＲＮＡにおいて、その活性化能を有するのは２３ＳｒＲＮＡであることを見出し、またヒトのＴＬＲ７のみならず、ヒトのＴＬＲ８を活性化できることも明らかにした。さらに、ＥＣ−１２由来の２３ＳｒＲＮＡにおいて、ＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８を活性化させ、ＩＬ−１２等の産生を促進し、ひいてはヒトの免疫機能を調節できるのは、どの領域であるのかを解析した。その結果、ＥＣ−１２由来の２３ＳｒＲＮＡ（配列番号：１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ）において、ヒトの免疫機能を調節する作用を有するのは、１〜４１１位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ、１８３６〜１９９４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ及び２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡであることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載の１本鎖ＲＮＡ
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１〜４０個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１〜１５個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。
（２）ヒトＩＬ−１２の産生を促進する作用を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載の１本鎖ＲＮＡ
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１〜４０個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１〜１５個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。
（３）（１）又は（２）に記載の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（４）下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一の１本鎖ＲＮＡ又は該１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを有効成分とする、ヒトの免疫機能を調節するための組成物
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１〜４０個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１〜１５個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。
（５）下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一に記載の１本鎖ＲＮＡ又は該１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを有効成分とし、ＩＬ−１２の産生を促進するための組成物
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１〜４０個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１〜１５個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。

本発明によれば、ＩＬ−１２の産生を促進等することにより、ヒトの免疫機能を調節する、特定の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡを提供することが可能となる。

ＥＣ−１２２３ＳｒＲＮＡの２０５５〜２０７４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ（２３Ｓ（１７））をヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に導入し、該細胞におけるＩＬ−１２ｐ４０タンパク質量をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示すグラフである。なお、２３Ｓ（１７）はマウス由来のマクロファージ様細胞株においてＩＬ−１２産生促進能が認められた１本鎖ＲＮＡである。また図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＮＡを導入していないヒトＰＢＭＣの結果を示す。ＥＣ−１２由来成分を添加したヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１２ｐ４０タンパク質量をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示すグラフである。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＥＣ−１２由来成分等を添加していない培地にて培養したヒトＰＢＭＣの結果を示し、「ＥＣ−１２」はＥＣ−１２を添加した培地にて培養したヒトＰＢＭＣの結果を示し、「ＥＣ＋ＴＬＲ７ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」はＥＣ−１２とＴＬＲ７アンタゴニストとを添加した培地にて培養したヒトＰＢＭＣの結果を示し、「ＥＣ＋ＴＬＲ９ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」はＥＣ−１２とＴＬＲ９アンタゴニストとを添加した培地にて培養したヒトＰＢＭＣの結果を示し、「ＥＣ＋ＴＬＲ７，９ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」はＥＣ−１２、ＴＬＲ７アンタゴニスト及びＴＬＲ９アンタゴニストを添加した培地にて培養したヒトＰＢＭＣの結果を示し、「ＥＣ＋ＤＮａｓｅ」はＥＣ−１２をＤＮａｓｅにて処理したものを添加した培地にて培養したヒトＰＢＭＣの結果を示し、「ＥＣ＋ＲＮａｓｅ」はＥＣ−１２をＲＮａｓｅにて処理したものを添加した培地にて培養したヒトＰＢＭＣの結果を示し、「ＥＣ＋ＤＮａｓｅ＋ＲＮａｓｅ」はＥＣ−１２をＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅにて処理したものを添加した培地にて培養したヒトＰＢＭＣの結果を示す。また図中、「ｈｕｍａｎ１」及び「ｈｕｍａｎ２」は、上記培養に供したヒトＰＢＭＣを採取したヒトが異なることを示す。ＥＣ−１２由来のＲＮＡを添加したヒト胎児腎由来の細胞（ＨＥＫ２９３細胞）におけるＴＬＲ７及びＴＬＲ８の活性化を、ルシフェラーゼレポーター系にて解析した結果を示すグラフである。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＥＣ−１２由来のＲＮＡを導入していないＨＥＫ２９３細胞の結果を示し、「Ｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＥＣ−１２由来の全ＲＮＡを導入したＨＥＫ２９３細胞の結果を示し、「２３ＳｒＲＮＡ」はＥＣ−１２由来の２３ＳｒＲＮＡを導入したＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。また、縦軸の数値は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」においてルシフェラーゼレポーター系にて測定された発光値を１とした際の、各ＲＮＡ導入細胞における相対値を示す。ＥＣ−１２２３ＳｒＲＮＡの部分断片を導入したＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ７の活性化を、ルシフェラーゼレポーター系にて解析した結果を示すグラフである。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＮＡを導入していないＨＥＫ２９３細胞の結果を示し、「２３ＳｒＲＮＡ」は２３ＳｒＲＮＡ全長を導入したＨＥＫ２９３細胞の結果を示し、「１−４１１」等は２３ＳｒＲＮＡの部分断片を導入したＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。また「１−４１１」等の数値範囲は、ＨＥＫ２９３細胞に導入した部分断片の２３ＳｒＲＮＡにおける位置を示す（図中の表記については、図５及び６においても同じ）。ＥＣ−１２２３ＳｒＲＮＡの部分断片を導入したＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ８の活性化を、ルシフェラーゼレポーター系にて解析した結果を示すグラフである。ＥＣ−１２２３ＳｒＲＮＡの部分断片を導入したＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ７及びＴＬＲ８の活性化を、ルシフェラーゼレポーター系にて解析した結果を示すグラフである。ＥＣ−１２２３ＳｒＲＮＡの部分断片をヒトＰＢＭＣに導入し、該細胞におけるＩＬ−１２ｐ４０タンパク質量をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示すグラフである。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＮＡを導入していないヒトＰＢＭＣの結果を示し、「２３Ｓ（１１）」等は２３ＳｒＲＮＡの部分断片を導入したヒトＰＢＭＣの結果を示す。また、ヒトＰＢＭＣに導入した部分断片、２３Ｓ（１１）等については表２を参照のこと。さらに、縦軸の数値は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」におけるＩＬ−１２ｐ４０タンパク質量を１とした際の、各ＲＮＡ導入細胞における相対値を示す。

後述の実施例において示す通り、本発明者らによって、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス種に属するＥＣ−１２株の２３ＳｒＲＮＡが、ヒトＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８を活性化し、さらに転写因子であるＮＦ−κＢ等を活性化することにより、ＩＬ−１２等のサイトカインの産生を促進し、ひいては免疫機能を調節することが見出された。さらに、この２９０９塩基（配列番号：１に記載の塩基配列）からなる２３ＳｒＲＮＡにおいて、このＩＬ―１２産生促進能等を有するのは、１〜４１１位の塩基配列（配列番号：２に記載の塩基配列）からなる１本鎖ＲＮＡ、１８３６〜１９９４位の塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）からなる１本鎖ＲＮＡ及び２０８５〜２１０４位の塩基配列（配列番号：１２に記載の塩基配列）からなる１本鎖ＲＮＡであることが明らかになった。

従って、本発明は、ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載の１本鎖ＲＮＡを提供する。
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列、又は該配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。

また、本発明は、ヒトＩＬ−１２の産生を促進する作用を有する、前記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載の１本鎖ＲＮＡを提供する。

本発明において、「ＩＬ−１２」（インターロイキン−１２、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２）は、ＩＬ−１２ｐ４０（ＩＬ−１２Ｂ）、ＩＬ−１２ｐ３５（ＩＬ−１２Ａ）、及びこれらからなるヘテロダイマーＩＬ−１２ｐ７０であってもよいが、これらの中ではＩＬ−１２ｐ４０が好ましい。また、ヒト由来の典型的なＩＬ−１２ｐ４０としては、ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＰ＿００２１７８．２（ＮＭ＿００２１８７．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒト由来の典型的なＩＬ−１２ｐ３５としては、ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＰ＿０００８７３．２（ＮＭ＿０００８８２．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において、前記タンパク質にはこのような天然の変異体も含まれる。

本発明において、「ヒトＩＬ−１２の産生」とは、ヒトＩＬ−１２タンパク質自体の産生のみならず、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現を含む概念である。「ヒトＩＬ−１２の産生の促進」とは、ヒトＩＬ−１２を産生していない状態にある対象を前記因子を産生している状態に変化させること、並びに既にヒトＩＬ−１２を産生している対象におけるヒトＩＬ−１２の産生量を亢進させることを含む概念である。

本発明において、かかる「ヒトの免疫機能を調節する作用」、「ヒトＩＬ−１２の産生を促進する作用」等は、後述の実施例において示す通り、ＴＬＲ７及び８の受容体の活性化に起因し、細胞内シグナル伝達経路を介して、転写因子であるＮＦ−κＢ等を活性化することによって奏される作用である。

ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、マクロファージや樹状細胞が外来微生物を認識するための受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）の１種であり、細胞内エンドソームに発現し、ウィルス由来の１本鎖ＲＮＡ等を認識する受容体である。

本発明において、ヒトＴＬＲ７の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＰ＿０５７６４６．１（ＮＭ＿０１６５６２．３）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。また、ヒトＴＬＲ８の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＰ＿６１９５４２．１（ＮＭ＿１３８６３６．３）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において、ヒトＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８にはこのような天然の変異体も含まれる。

また、ＮＦ−κＢは、かかるＴＬＲ７又はＴＬＲ８の活性化によりシグナル伝達を介し活性化される転写因子であり、ＩＬ−１２等のサイトカインの産生を促進する。

本発明において、ヒトＮＦ−κＢの典型例として、ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＰ＿００３９８９．２（ＮＭ＿００３９９８．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において、ヒトＮＦ−κＢには、このような天然の変異体も含まれる。

本発明において、「免疫機能を調節する作用」とは、本発明の１本鎖ＲＮＡを摂取したヒトの免疫機能を賦活化させて免疫機能の低下を抑制することのみならず、アレルギー反応のような過度に亢進した免疫機能を抑制し、ひいては免疫機能のバランスを調節する作用を意味する。

本発明において、「ＲＮＡ」は、天然又は非天然由来のものとすることができる。天然に存在する状態のＲＮＡとは、特定のリボヌクレオチド単位のポリマーであって、各リボヌクレオチド単位がプリン又はピリミジン塩基、及びリボース糖で構成され、ヌクレオチド間がホスホジエステル結合によって連結されたもの（核酸）を意味する。また、本発明において、「１本鎖ＲＮＡ」は、相補的ＲＮＡと塩基対（二重らせん構造）を形成していないＲＮＡのことを言う。

なお、生体内等における分解の抑制等の観点から、本発明のＲＮＡは、ＩＬ−１２の産生を促進できる限り、その一部又は全部が非天然型のリボヌクレオチド単位となっていてもよい。また、ヌクレオチド間の結合の一部又は全部が非天然型の結合によって連結されていてもよい。

本発明にかかる「１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列」における「複数」とは、ＩＬ−１２の産生を促進できる範囲における置換等される塩基の個数であり、好ましくは置換等される塩基配列における３０％以下の個数、より好ましくは該塩基配列における２０％以下の個数、さらに好ましくは該塩基配列における１０％以下の個数である。すなわち、配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列において置換等される塩基の好ましい個数は１２０塩基以下であり、より好ましい個数は８０塩基以下であり、さらに好ましい個数は４０塩基以下（例えば、２０塩基以下、１０塩基以下、７塩基以下、５塩基以下、２塩基）である。配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列において置換等される塩基の好ましい個数は４５塩基以下であり、より好ましい個数は３０塩基以下であり、さらに好ましい個数は１５塩基以下（例えば、１０塩基以下、７塩基以下、５塩基以下、２塩基）である。配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列において置換等される塩基の好ましい個数は６塩基以下であり、より好ましい個数は４塩基以下であり、さらに好ましい個数は２塩基である。

「配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列において、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ」等のＩＬ−１２産生促進能は、置換等される前の「配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ」等のＩＬ−１２産生促進能と比較して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、１００％以上、２００％以上、３００％以上）である。

１本鎖ＲＮＡのＩＬ−１２産生促進能は、例えば後述の実施例に示す通り、「配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列からなる天然型の１本鎖ＲＮＡ」等を特定の細胞（例えば、ヒト末梢血単核球）に導入し、導入してから一定時間（例えば、４８時間）経過時までにおいて該細胞から該細胞の培養液中に放出、蓄積されたＩＬ−１２ｐ４０の量と、「配列番号：２に記載の１〜４１１位の塩基配列において、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ」等によるそれとを比較することにより評価することができる。

また、「配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列において、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ」等のＴＬＲ７又はＴＬＲ８の活性化能は、置換等される前の「配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ」等のＴＬＲ７又はＴＬＲ８の活性化能と比較して、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上（例えば、９０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上）である。

１本鎖ＲＮＡのＴＬＲ７又はＴＬＲ８の活性化能は、例えば後述の実施例に示すような以下の方法にて評価することができる。すなわち、先ず、特定の細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）に、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８をコードするベクターと、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）及びその上流にＮＦ−κＢの応答配列を有するベクターとを導入する。そして、かかるレポーター系が導入された細胞に「配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列からなる天然型の１本鎖ＲＮＡ」を導入し、導入してから一定時間（例えば、１５時間）経過した後の細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する。かかる発現量はレポーター遺伝子がルシフェラーゼであれば、発光基質を添加することによて生じる発光値として測定することもできる。そして、このようにして測定された発現量と、「配列番号：２に記載の１〜４１１位の塩基配列において、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ」等によるそれとを比較することにより評価することができる。

本発明の１本鎖ＲＮＡの製造は、例えば後述の実施例において示すように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を利用する方法によって調製することができる。かかる方法においては、例えば、Ｔ７プロモーターの下流にＥＣ−１２株の２３ＳｒＲＮＡの１〜４１１位等をコードするＤＮＡを挿入したベクターを用いることにより、本発明の「配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ」等を得ることができる。また、前記１〜４１１位等をコードするＤＮＡ部分に、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）等によって塩基の変異が導入されたベクターを用いることにより、本発明の「配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列において、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ」等を得ることができる。

本発明の１本鎖ＲＮＡの製造においては、当業者であれば、従来から用いられている化学合成法を適宜採用することもできる。かかる方法としては、例えば、２’−水酸基に保護基（例えば、２’−Ｏ−ブチルジメチルシリル（２’−ｔＢＤＭＳ）、２’−Ｏ−トリイソプロピルシリルオキシメチル(２’−ＴＯＭ)、２’−ＡＣＥ（５’−シリル−２’−アセトキシエトキシ）を導入したリボヌクレオチドを用いた、ホスホロアミダイト法又はＨ−ホスホネート法が挙げられる。

また、本発明の１本鎖ＲＮＡは、生体内で合成されてもよい。すなわち、本発明の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞等に導入して、細胞の内因性のＲＮＡポリメラーゼにより細胞内で転写され、本発明の１本鎖ＲＮＡが合成されるようにすることもできる。さらに、前述の通り、インビトロにおいても、本発明の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等によって転写されることにより、本発明の１本鎖ＲＮＡを合成することもできる。従って、本発明の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡも本発明は提供することができる。

本発明の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、インビボ（ｉｎｖｉｖｏ）、エクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）又はインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）において本発明の１本鎖ＲＮＡを転写させるため、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、ポリＡテール等の調節領域を含む発現カセットであることが好ましい。また、かかるプロモーター等としては、例えば、上流域制御要素（ＵＣＥ）、コアプロモーターエレメント（ＣＰＥ）、基本転写因子蛋白質（ＴＦII）によって制御されるプロモーター等、Ｔ７プロモーターが挙げられる。さらに、本発明の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡの態様としては、前記発現カセットを含むベクターが挙げられる。かかるベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクターが挙げられる。

本発明の１本鎖ＲＮＡ又は本発明の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡは、その他の成分を含む組成物（例えば、試薬、医薬、飲食品等の組成物）として調製することができる。

本発明の１本鎖ＲＮＡによって産生が促進されるＩＬ−１２は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞やヘルパーＴ細胞の増殖を促進し、さらにこれらの細胞に作用してインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）やＴＮＦ−αの産生を促進させることにより、細胞傷害活性を誘導することが知られている。従って、本発明の１本鎖ＲＮＡは、ＩＬ−１２の産生の促進等を介して、免疫機能を調節することもできる。

また、この免疫機能の調節作用に基づき、本発明の１本鎖ＲＮＡは、例えば、ウィルスや細菌等による感染症、がん、アレルギー性疾患（例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、食物アレルギー、花粉症）、免疫不全状態（例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖無γグロブリン症、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染症、臓器移植等における免疫抑制剤の投与、放射線照射）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、クローン病、膠原病、潰瘍性大腸炎、乾癬、多発性筋炎）、創傷・褥瘡等の治療又は予防に際して用いられる医薬組成物として、また、これら疾患の予防又は改善のための飲食品（動物用飼料を含む）に適用することができる。

さらに、本発明の１本鎖ＲＮＡ又は本発明の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを感作させることによって、活性化させた免疫担当細胞を含む、免疫細胞療法に用いられる医薬組成物としても利用することができる。

また、本発明の１本鎖ＲＮＡは、その免疫賦活化作用に基づき、アジュバント（抗原性補強剤）として利用することもできる。例えば、病原体やがん等に由来するペプチド、タンパク質、核酸、糖（例えば、ＬＰＳ）、又は弱毒化病原体等の各種抗原（細菌抗原、ウィルス抗原、がん抗原）と混合することにより、ワクチン組成物としての態様をとることもできる。さらに、上記作用や機能を有する研究用の試薬に適用することもできる。

本発明の１本鎖ＲＮＡ又は本発明の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的または非経口的に使用することができる。

これら製剤化においては、薬理学上若しくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。

製剤化等に際し、マクロファージや樹状細胞等への送達及び取り込みにより適するという観点から、カチオン性リポソーム等の正電荷を持つキャリアーとの複合体を形成させてもよい。

さらに、マクロファージや樹状細胞等への送達及び取り込みにより適し、生体内等におけるヌクレアーゼによる分解を回避するという観点から、製剤化等に際し、本発明の１本鎖ＲＮＡに親油性の物質を付加してもよい。かかる親油性の物質としては、例えば、コレステロール及びその誘導体、脂質（糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質等）、ビタミンＥ（トコフェロール）等のビタミン類が挙げられる。

本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリン等の油分を含む製品；スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の液状食品；飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品；ハム、ソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルト等の半固形状食品；みそ、発酵飲料等の発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ，インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。なお、本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。また、当該飲食品においては、他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。

本発明の組成物の対象はヒトであればよく、健常者であっても、前述の感染症、がん、アレルギー性疾患等を罹患しているヒトであってもよい。

本発明にかかる組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（例えば、医薬品、飲食品）等に応じて、適宜選択されるが、本発明にかかる組成物の有効摂取量は、ＲＮＡ換算で１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

また、後述のＥＣ−１２とは、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株（ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓＥＣ−１２）のことであり、平成１７年（２００５年）２月２５日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、受託番号は「ＦＥＲＭＢＰ−１０２８４」である。さらに、ＥＣ−１２由来の１本鎖ＲＮＡがマウスにおいてＩＬ−１２の産生を促進する作用等を有していることは、本発明者らにより既に明らかになっている（国際公開第２０１１／０２７８２９号）。

（比較例１）
＜哺乳動物の免疫機能を調節する作用を有する、ＥＣ−１２由来ＲＮＡの特定＞
前記の通り、ＥＣ−１２由来の１本鎖ＲＮＡがマウスにおいてＩＬ−１２の産生を促進する作用等を有していることは明らかになっている。そこで、本発明者らは、どのような配列からなる１本鎖ＲＮＡがかかる免疫調節作用を有しているのかを、マウス由来のマクロファージ様細胞株を用い、該細胞におけるＩＬ−１２産生能を指標として解析した。

その結果、ＥＣ−１２のＲＮＡのうち、１本鎖ＲＮＡの１種である２３ＳｒＲＮＡがＩＬ−１２産生促進能を有することを見出し、さらに、この２３ＳｒＲＮＡにおいて、１９７４〜２１５２位の１７９塩基からなるＲＮＡがこの促進能を保持することをも見出した。そして、この促進能を発揮するために必要な最小配列は、２３ＳｒＲＮＡの２０５５〜２０７４位の塩基配列（配列番号：１０に記載の塩基配列）であることも明らかにした。

次に、前記２０５５〜２０７４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡによる、ヒト末梢血単核球における免疫調節作用を評価した。なお、評価は、後述の実施例３に記載の方法と同様の方法にて行った。得られた結果を図１に示す。

図１に示した結果から明らかなように、コントロール（ＲＮＡ非導入ヒト末梢血単核球）と比較して、前記２０５５〜２０７４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ（２３Ｓ（１７））を導入したヒト末梢血単核球において、ＩＬ−１２産生能の有意な向上は認められなかった。

従って、マウスにおいて免疫機能を調節する作用が認められた前記２０５５〜２０７４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡは、ヒトにおいては免疫機能を調節できないことが明らかになった。

（試験例１）
＜ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、ＥＣ−１２由来成分の特定＞
前述の通り、マウスにおいてＩＬ−１２の産生を促進する作用を有する、ＥＣ−１２の２３ＳｒＲＮＡの２０５５〜２０７４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡは、ヒトにおいてはその作用が認められなかった。

そこで、ＥＣ−１２においてヒトの免疫機能を調節する作用を有する成分は存在するのか、さらにはＥＣ−１２のどのような成分が該調節作用を担うのかを、以下に示す方法にて調べた。

＜ヒト末梢血単核球の調製＞
先ず、ヒトの血液をＰＢＳで２倍希釈し、パーコール（比重：１．０７７ｇ／ｍＬ）に重層した。遠心分離した後、中間層を末梢血単核球（ＰＢＭＣ）として回収し、ＰＢＳにて洗浄した。次いで、ＡＣＫ溶解緩衝液にて残りの赤血球を除去した後、再度ＰＢＳにて洗浄した。次に、このようにして調製したＰＢＭＣの生細胞数を計測し、９６穴プレートに３ｘ１０^５細胞／穴になるよう、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）に播種し、ＣＯ_２インキュベーター内で２〜３時間静置した。なお、このようにしてヒト２名の血液からヒトＰＢＭＣを各々調製した。

＜ヒトＰＢＭＣへの添加用ＥＣ−１２の調製＞
前記ヒトＰＢＭＣに添加するため、ＥＣ−１２を次のように処理した。ＥＣ−１２（コンビ株式会社製）を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）に１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、３０分間処理し、前記ヒトＰＢＭＣに添加するための菌体懸濁液を調製した。また、ＥＣ−１２を、２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）及び／又は０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で３７℃、３０分間処理し、前記ヒトＰＢＭＣに添加するための、ヌクレアーゼ処理済み菌体懸濁液を調製した。そして、それら菌体懸濁液をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）で希釈し、２００μｇ／ｍｌとなるように調整した。

＜ＥＣ−１２由来の成分存在下でのヒトＰＢＭＣの培養＞
前記の通りに調製した添加用ＥＣ−１２をＥＣ−１２の終濃度が１００μｇ／ｍＬになるよう、前記ヒトＰＢＭＣに添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で４８時間培養した。

また、前記ＥＣ−１２由来成分の他、ＴＬＲ７阻害剤（ＴＬＲ７アンタゴニスト）及び／又はＴＬＲ９阻害剤（ＴＬＲ９アンタゴニスト）の存在下においてもヒトＰＢＭＣの培養を行った。

なお、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９のアンタゴニストとして、ホスホロチオエート化（Ｓ化）した合成オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いた（Ｂａｒｒａｔ，Ｆ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００５，２０２（８）：１１３１−９参照）。すなわち、ＴＬＲ７のアンタゴニストとしてＩＲＳ６６１、ＴＬＲ９のアンタゴニストとしてＩＲＳ８６９を使用した。各合成ＯＤＮの配列を表１に示す。

ヒトＰＢＭＣを９６穴プレートに播種する際に、ＩＲＳ６６１を５．６μＭ、ＩＲＳ８６９を０．７μＭになるよう各々ヒトＰＢＭＣに添加し、ＣＯ_２インキュベータ内で培養した。その後、前記同様にＥＣ−１２由来成分を更に添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で４８時間培養を行った。

また、コントロール（陰性対照）として、ＥＣ−１２由来成分等、何も添加しないで培養したヒトＰＢＭＣも調製した。

＜ＥＬＩＳＡ＞
前記４８時間培養後の細胞培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０タンパク質の濃度を、ＩＬ−１２ｐ４０ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて測定した。なお、測定の手順はキット添付のプロトコールに準拠した。得られた結果を図２に示す。

図２に示す通り、ヒトＰＢＭＣにおいても、ＥＣ−１２由来の成分はＩＬ−１２の産生を促進できることが明らかになった。また、その産生促進作用は、ＤＮａｓｅにて処理しても又ＴＬＲ９アンタゴニスト存在下にて培養しても、有意に抑制されなかった。一方、ＲＮａｓｅにて処理することによって又はＴＬＲ７アンタゴニスト存在下にて培養することによって、ＥＣ−１２由来成分のヒトＩＬ−１２の産生能は有意に抑制されることが明らかになった。

以上の結果から、ＴＬＲ７のリガンドは一本鎖ＲＮＡであることも併せ鑑みるに、ＥＣ−１２由来成分において、ヒトＩＬ−１２の産生を促進することができるのは、１本鎖ＲＮＡであることが明らかになった。

（試験例２）
＜ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、ＥＣ−１２由来ＲＮＡの特定＞
ヒトの免疫機能を調節する作用を有するＥＣ−１２の１本鎖ＲＮＡの配列を特定するために、ＥＣ−１２から全ＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡを抽出、精製し、ヒト胎児腎由来の細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に対するＴＬＲ７又はＴＬＲ８に対する活性化能を、以下に示す方法にて評価した。

なお、ＴＬＲ８もＴＬＲ７同様に１本鎖ＲＮＡをリガンドとすることが明らかになっている。さらに、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８に関しては、リガンドが結合することによって活性化され、活性化されたＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、細胞内シグナル伝達経路を介して、転写因子であるＮＦ−κＢ等を活性化することにより、ＩＬ−１２等のサイトカインの産生を促進し、ひいては免疫機能を調節することが明らかになっている。

＜ＥＣ−１２からの全ＲＮＡ抽出＞
ＥＣ−１２からの全ＲＮＡ(ｔｏｔａｌＲＮＡ）抽出にはクイックジーンＲＮＡ組織キットＳII（ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＲＮＡｔｉｓｓｕｅｋｉｔＳII、ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いた。抽出処理はクイックジーン−ミニ８０（ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−Ｍｉｎｉ８０、ＫＵＲＡＢＯ社製）を用い、キット添付のプロトコールに準拠して行った。

＜２３ＳｒＲＮＡの抽出＞
前記方法にて抽出した全ＲＮＡを１．５％アガロースゲル（ＴＢＥバッファー）にて電気泳動を行い、目的のバンド（２３ＳｒＲＮＡ：２９０９塩基）を切り出し、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。なお、精製の手順はキット添付のプロトコールに準拠した。

＜ルシフェラーゼアッセイ＞
先ず、ＨＥＫ２９３細胞を白色９６穴プレートに２ｘ１０^４細胞／穴になるよう播種し、ＣＯ_２インキュベーター内で一晩静置した。また、ルシフェラーゼアッセイ用ベクター、ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ−κＢ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（プロメガ社製）１８０ｎｇと、ｐＵＮＯ１−ｈＴＬＲ０７（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）４２０ｎｇ又はｐＵＮＯ１−ｈＴＬＲ０８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）４２０ｎｇと、９４μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを混合し、更にトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ社製、製品名：ＦｕＧＥＮＥＨＤ）６μＬを添加して混合した後、１０分間室温にて静置した。

次に、このようにして調製したルシフェラーゼアッセイ用ベクターとトランスフェクション試薬との混合液を、前記ＨＥＫ２９３細胞に、各穴５μＬずつ添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で一晩静置した。

また、前記全ＲＮＡ又は２３ＳｒＲＮＡ５μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ１００μＬに添加し、更にＦｕＧＥＮＥＨＤ６μＬを添加して、混合した後、１０分間室温にて静置した。そして、このようにして調製したＲＮＡとトランスフェクション試薬との混合液を、前記ルシフェラーゼアッセイ用ベクターが導入されたＨＥＫ２９３細胞に、各穴１０μＬずつ添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で１５時間静置した。さらに、コントロール（陰性対照）として、前記ルシフェラーゼアッセイ用ベクターは導入されているが、ＥＣ−１２由来のＲＮＡは導入されていないＨＥＫ２９３細胞も調製した。

その後、９６穴プレートを１時間室温にて静置し、細胞を室温に戻した。次いで、ルシフェラーゼ発光基質（プロメガ社製、Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ）を添加した後、プレートリーダー（パーキンエルマー社製、製品名：ＡＲＯＶＯＸ３）にて各ウェルの発光値を測定した。得られた結果を図３に示す。

図３に示した結果から明らかなように、試験例１に記載の結果同様に、全ＲＮＡを導入することによってＨＥＫ２９３細胞においてＮＦ−κＢによる転写の活性化、すなわちＴＬＲ７又はＴＬＲ８の活性化が認められた（図３の「Ｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ」参照）。さらに、図３の「２３ＳｒＲＮＡ」に示す通り、これらの活性化は２３ＳｒＲＮＡによって誘導されていることが明らかになった。

（実施例１）
＜ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、ＥＣ−１２由来２３ＳｒＲＮＡの特定１＞
ＥＣ−１２の２３ＳｒＲＮＡにおいて、ヒトの免疫機能を調節する作用を有するのはどの部位であるのかを特定するために、該２３ＳｒＲＮＡを４００塩基毎に分割し、これら１本鎖ＲＮＡについてヒトＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８の活性化能を評価した。

＜ＥＣ−１２からのＤＮＡ抽出＞
ＥＣ−１２からのＤＮＡ抽出にはクイックジーンＤＮＡ組織キットＳ（ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＤＮＡｔｉｓｓｕｅｋｉｔＳ、ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いた。抽出処理にはＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−Ｍｉｎｉ８０を用い、キット添付のプロトコールに準拠した。

＜ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）＞
ＰＣＲにはＫＯＤＦＸｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用した。なお、反応溶液の組成はＫＯＤＦＸｎｅｏ（１Ｕ／μｌ）０．７５μｌ、２×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤＦＸｎｅｏ１２．５μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ５μｌ、１０μＭのプライマーセット１．５μｌ、滅菌蒸留水３．２５μｌ、鋳型（ゲノム）０．５μｌの合計２５μｌとした。なお、これらプライマーセットは、２３ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡにおいて、１〜４１１位の塩基からなる部位、３５１〜７３８位の塩基からなる部位、６９９〜１１４８位の塩基からなる部位、１０８４〜１５２２位の塩基からなる部位、１５０１〜１８５６位の塩基からなる部位、１８３６〜２１５２位の塩基からなる部位、２１３３〜２５３０位の塩基からなる部位及び２５１１〜２９０９位の塩基からなる部位を各々増幅できるよう設計して合成したものである。

これらプライマーセットを用いたＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性後、９８℃で１０秒間の熱変性、５２℃で３０秒間のアニーリング反応、６８℃で２０秒間の伸長反応を３０サイクル行い、７２℃で３分間の最終伸長反応を行った後、増幅産物を４℃に冷却した。そして、反応終了後、０．０１％の臭化エチジウム入りの１．０％アガロースゲル（ＴＡＥバッファー）にて電気泳動を行い、目的のＰＣＲ産物の増幅を分子量から確認した。得られたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから回収、精製し、下記ライゲーションに供した。

＜ＰＣＲ産物からのクローニング及びプラスミド抽出＞
前記にて精製したＰＣＲ産物（ＤＮＡ）をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯに組み込んだ。かかるライゲーションの反応液の組成は、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ１μｌ、ＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ1μｌ、滅菌蒸留水１．５μｌ、ＰＣＲ産物２．５μｌとし、反応液を室温で５分間インキュベートした。その後、大腸菌（ＮＥＢＴｕｒｂｏＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉ（ＢｉｏＬａｂｓ社製））にヒートショック法にてライゲーション産物を導入し、形質転換を行った。次いで、このようにして得られた大腸菌を含カナマイシン５０μｇ／ｍｌＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。なお、以下の実験は５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した培地にて行った。

また、陽性クローンの選抜はコロニーＰＣＲによるインサートチェックにて行った。すなわち、２×ＧｏＴａｑ（Ｒ）ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μｌ、１０μＭプライマー各１μｌ、滅菌蒸留水８μｌにて全量２０μｌに調製したＰＣＲ反応溶液に、滅菌済イエローチップで採取したコロニーの一部を懸濁し、増幅反応を行った。また、プライマーとしては、Ｔ７プロモーター配列をセンスプライマー（Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ）とし、各々の領域を増幅する際に用いたリバースプライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。反応は、９４℃で３分間の初期変性後、９４℃で３０秒間の熱変性、５３℃で３０秒間のアニーリング反応、７２℃で３０秒間の伸長反応を２５サイクル行い、７２℃で３分間の最終伸長反応を行った後、増幅産物を４℃に冷却した。そして、このようにして得られた増幅産物を１．０％アガロースゲル（ＴＡＥバッファー）にて電気泳動を行い、陽性クローンを選抜した。得られた陽性クローンを、含カナマイシンＬＢ液体培地５ｍｌに植菌し、３７℃で８時間培養した。そして、増菌した陽性クローンからミニプラスプラスミド抽出システム（ＭｉｎｉＰｌｕｓ（ＴＭ）ＰｌａｓｍｉｄＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ、ＶＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてプラスミドＤＮＡの抽出を行った。なお、抽出の手順はキット添付のプロトコールに準拠した。

＜制限酵素処理＞
制限酵素ｓａｌI、ＳｐｅI、ＢａｍＨI（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、前記にて抽出したプラスミドＤＮＡの制限酵素処理を行った。反応溶液の組成は各制限酵素２μｌ、１０×Ｈバッファー又は１０×Ｍバッファー２μｌ、プラスミドＤＮＡ１６μｌの合計２０μｌとし、反応を３７℃にて２時間から一晩行った。

＜プロテナーゼＫ処理及び精製＞
反応終了後の制限酵素反応液に、プロテナーゼＫを最終濃度１００μｇ／ｍｌ、ＳＤＳを最終濃度０．５％となるように添加し、反応を３７℃にて３０分間行った。次いで、等量のフェノール／クロロホルムを加え１分間ボルテックスした後、室温にて、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清を１．５ｍｌ微量遠心チューブに回収し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールとを加えてエタノール沈殿を行った。軽く攪拌した後に、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、２．５倍量の８０％エタノールを加えて洗浄した。次いで、軽く攪拌した後に、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、回収したＤＮＡをＲＮａｓｅフリーの水５０μｌに溶解した。

＜インビトロ転写＞
前記にてプロテナーゼＫ処理及び精製したＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写（ｉｎｖｉｔｒｏＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）Ｔ７キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＲＮＡを合成した。反応溶液の組成は１０×転写バッファー（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ）２μｌ、ＡＴＰ溶液２μｌ、ＧＴＰ溶液２μｌ、ＣＴＰ溶液２μｌ、ＵＴＰ溶液２μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤０．５μｌ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ２μｌ及びＤＮＡ１００ｎｇに、ＲＮａｓｅフリーｄＨ_２Ｏを加え、全量２０μｌとした。そして、反応を４２℃にて１２０分間行った。

＜ＤＮａｓｅ処理及び精製＞
ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅI（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、前記にて合成したＲＮＡのＤＮａｓｅ処理を行った。１５Ｕ／２０μｌ反応液となるようにＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅIを混和し、３７℃にて３０分間インキュベートを行った。ＤＮａｓｅ処理後、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（ＴＭ）Ｋｉｔを用いて精製した。なお、精製の手順はキット添付のプロトコールに準拠した。

＜ルシフェラーゼアッセイ＞
先ず、ルシフェラーゼアッセイ用ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞を前記同様に調製した。また、前述のインビトロ転写にて調製した１本鎖ＲＮＡ５μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ１００μＬに添加し、更にＦｕＧＥＮＥＨＤ６μＬを添加して、混合した後、１０分間室温にて静置した。そして、このようにして調製したＲＮＡとトランスフェクション試薬との混合液を、前記ＨＥＫ２９３細胞に、各穴１０μＬずつ添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で１５時間静置した。さらに、コントロール（陰性対照）として、前記ルシフェラーゼアッセイ用ベクターは導入されているが、ＲＮＡは導入されていないＨＥＫ２９３細胞も調製した。

その後、９６穴プレートを１時間室温にて静置し、細胞を室温に戻した。次いで、ルシフェラーゼ発光基質を添加した後、ＡＲＯＶＯＸ３にて各ウェルの発光値を測定した。ＴＬＲ７の活性化能の有無を調べた結果を図４に、ＴＬＲ８の活性化能の有無を調べた結果を図５に示す。

図４及び５に示す通り、ＥＣ−１２由来の２３ＳｒＲＮＡにおいて、１〜４１１位の塩基からなる１本鎖ＲＮＡと、１８３６〜２１５２位の塩基からなる１本鎖ＲＮＡとが、ヒトＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８の活性化能を有していることが明らかになった。

（実施例２）
＜ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、ＥＣ−１２由来２３ＳｒＲＮＡの特定２＞
実施例１において、ヒトＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８の活性化能を有していることが明らかになった、前記１８３６〜２１５２位の塩基からなる１本鎖ＲＮＡを、更に２分割し、これら１本鎖ＲＮＡについてヒトＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８の活性化能を評価した。

なお、本評価は、前記実施例２同様に、インビトロ転写にて調製したＲＮＡを、ルシフェラーゼアッセイ用ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に導入し、発光値を測定することにより行った。得られた結果を図６に示す。

図６に示した結果から明らかなように、ＥＣ−１２由来の２３ＳｒＲＮＡにおいて、１９４７〜２１５２位の塩基からなる１本鎖ＲＮＡが、ヒトＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８の高い活性化能を有していることが明らかになった。また、該１本鎖ＲＮＡよりは劣るものの、ＥＣ−１２由来の２３ＳｒＲＮＡにおいて、１８３６〜１９９４位の塩基からなる１本鎖ＲＮＡもかかる活性化能を有していることが明らかになった。

（実施例３）
＜ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、ＥＣ−１２由来２３ＳｒＲＮＡの特定３＞
実施例２において、ヒトＴＬＲ７及びヒトＴＬＲ８の活性化能を有していることが明らかになった、前記１９４７〜２１５２位の塩基からなる１本鎖ＲＮＡを、更に１３分割し、これら１本鎖ＲＮＡについて、ヒトＩＬ−１２産生の促進能を、以下に示す方法にて評価した。

先ず、表２に示す通り、ＥＣ−１２由来２３ＳｒＲＮＡの１９６５〜２１６４位の塩基配列を、互いに５塩基ずつ重なり合うようにして１３個に分けた。そして、これら塩基配列に基づき、２０塩基からなる１本鎖ＲＮＡを株式会社ジーンデザインに委託して化学合成した。

次に、前記２０塩基からなる各１本鎖ＲＮＡ５００ｐｍｏｌを５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に添加した。そして、別チューブ内にてｓｉＲＮＡ用トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、製品名：ＲＮＡｉＭＡＸ）３μＬと５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地とを混合したものに、添加し、混合して、室温にて１５分間静置した。

そして、このように調製した１本鎖ＲＮＡとトランスフェクション試薬との混合液を、前記同様に調製したヒトＰＢＭＣを播種したプレートに各穴２０μＬずつ添加した後、ＣＯ_２インキュベーター内で４８時間静置した。次いで、培養上清を回収し、ＩＬ−１２ｐ４０ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１２ｐ４０タンパク質の濃度を測定した。得られた結果を図７に示す。

図７に示す通り、ＥＣ−１２由来２３ＳｒＲＮＡの１９６５〜２１６４位の塩基配列において、ＩＬ−１２促進能を有している１本鎖ＲＮＡは、該２３ＳｒＲＮＡの２０８５〜２１０４位の塩基配列からなるものであることが明らかになった（図中、２３Ｓ（１９）参照）。また、この評価においても、マウスの免疫機能を調節する作用を有する２０５５〜２０７４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡは、ヒトにおいては免疫機能を調節できないことが確認された（図中、２３Ｓ（１７）参照）。さらに、図には示さないが、前記同様にルシフェラーゼアッセイにて、該２３ＳｒＲＮＡの２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡのヒトＴＬＲ８の活性化能を評価したところ、コントロール（ＲＮＡ非導入細胞）と比較して、約３倍（２．６８〜３．４５倍）であることが明らかになった。

従って、以上の結果から、ＥＣ−１２由来の２３ＳｒＲＮＡ（配列番号：１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ）において、ヒトの免疫機能を調節する作用を有するのは、１〜４１１位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ、１８３６〜１９９４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ及び２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡであることが明らかになった。

以上説明したように、本発明によれば、ヒトＩＬ−１２の産生促進等を可能とする特定の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡを提供することが可能となる。

したがって、本発明の特定の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の活性化、それによって促進されるＩＬ−１２の産生等を介し、ヒトの免疫機能を調節することができるため、ウィルスや細菌等による感染症、がん、アレルギー性疾患、免疫不全状態、自己免疫疾患、創傷・褥瘡等の治療、改善又は予防において有用である。また、本発明の１本鎖ＲＮＡは、各種抗原（細菌抗原、ウィルス抗原、がん抗原）を含有するワクチンのアジュバントとしても有効に利用することができる。

配列番号：１７及び１８
＜２２３＞免疫調節能を有するＤＮＡの配列

Claims

ヒトの免疫機能を調節する作用を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載の１本鎖ＲＮＡ
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１〜４０個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１〜１５個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。
ヒトＩＬ−１２の産生を促進する作用を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載の１本鎖ＲＮＡ
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１〜４０個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１〜１５個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。
請求項１又は２に記載の１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ。
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一の１本鎖ＲＮＡ又は該１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを有効成分とする、ヒトの免疫機能を調節するための組成物
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１〜４０個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１〜１５個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一に記載の１本鎖ＲＮＡ又は該１本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを有効成分とし、ＩＬ−１２の産生を促進するための組成物
（ａ）配列番号：１に記載の１〜４１１位の塩基配列、又は該配列において１〜４０個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の１８３６〜１９９４位の塩基配列、又は該配列において１〜１５個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の２０８５〜２１０４位の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ。