JP2023053719A

JP2023053719A - インターフェロン－λ産生促進用組成物及びその製造方法

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Publication number: JP2023053719A
Application number: JP2021162922A
Authority: JP
Inventors: 翔平里見; Shohei Satomi; 大智國府; Daichi Kokubu; 重▲徳▼ 鈴木; Shigenori Suzuki; 一素村田; Kazumoto Murata
Original assignee: Kagome Co Ltd; Jichi Medical University
Current assignee: Kagome Co Ltd; Jichi Medical University
Priority date: 2021-10-01
Filing date: 2021-10-01
Publication date: 2023-04-13

Abstract

【課題】樹状細胞以外の細胞においても高いインターフェロン－λ産生促進効果を示す乳酸菌を含む組成物を提供する。【解決手段】エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を有効成分として含有する組成物を対象に投与することで、対象のインターフェロン－λの産生が促進される。【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り〔メール送信による公開〕送信日：令和２年１０月５日送信先：国立研究開発法人国立国際医療研究センター肝炎・免疫研究センター

本発明は、乳酸菌を有効成分とする、インターフェロン－λ産生を促進する組成物及びその製造方法に関する。

免疫とは、体内で発生した癌細胞や体外から侵入した細菌やウイルスなどを常に監視し撃退する自己防衛システムのことをいう。免疫力を高める組成物や食品については、古くから研究が進められてきた。

インターフェロン－λ（ＩＦＮ－λ）はＩＩＩ型インターフェロンに属する生理活性物質（サイトカイン）の１種であり、ＩＦＮ－λファミリーは、ヒトでは、ＩＦＮ－λ１（ＩＬ－２９）、ＩＦＮ－λ２（ＩＬ－２８Ａ）、ＩＦＮ－λ３（ＩＬ－２８Ｂ）及びＩＦＮ－λ４の４つのタンパク質で構成される。これまでに樹状細胞、肝細胞、腸管上皮細胞、肺上皮細胞などによる産生が認められている。ＩＦＮ－λは抗ウイルス作用等の自然免疫を賦活化する作用を有し、抗ウイルス活性、免疫賦活活性、ウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス等）感染の抑制作用、抗腫瘍増殖活性、抗腫瘍活性、抗癌活性などを示し得ることから、これらの活性を有する飲食品、治療剤、予防剤、改善剤、緩和剤などに利用することが期待されている（非特許文献１）。

ＩＦＮ－λを体内に直接投与することのみならず、ＩＦＮ－λの生体内での発現量や産生量を増やすこと、すなわち、ＩＦＮ－λ産生を高める物質を体内に投与することにより、ＩＦＮ－λの生理活性を生体内で引き起こすことが期待される。特許文献１では、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及び同ＪＣＭ５８０５株が、プラズマサイトイド樹状細胞のＩＦＮ－λ産生を高めることが報告されている。特許文献２では、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株が樹状細胞ＢＤＣＡ３ＤＣのＩＦＮ－λ産生を高めることが報告されている。特許文献３では、合成二本鎖ＲＮＡであるｐｏｌｙ：ＩＣで擬似感染させた腸管上皮細胞（ＨＴ－２９細胞）において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４株、Ｍ－１６Ｖ株、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムＢＢ５３６株、及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＭ－６３株がＩＦＮ－λ産生を高めることが報告されている。

国際公開第２０１２／０９１０８１号国際公開第２０１７／１７５７７４号特開２０１９－１６７３２７号

Lazear H.M. et al., Shared and distinct functions of type I and type III interferons. Immunity 50 (4): 907-923 (2019)

特許文献１及び２に記載の乳酸菌は、もともとＩＦＮ産生能の高い樹状細胞について、その産生能をさらに高める効果を有するものである。一方、特許文献３に記載の乳酸菌は、腸管上皮細胞のＩＦＮ－λ産生能を高めるものであるが、その効果は、予め免疫活性を高めた状態の細胞で確認されたものであった。そのため、樹状細胞以外の細胞において、他の免疫賦活化処理を要することなく、ＩＦＮ－λ産生を顕著に促進する乳酸菌が望まれる。

本発明は、樹状細胞以外の細胞においても高いＩＦＮ－λ産生促進効果を示す乳酸菌を含む組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、樹状細胞以外の細胞においても高いＩＦＮ－λ産生促進効果を示す乳酸菌を含む組成物の製造方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、エンテロコッカス属細菌が、他の免疫賦活処理を要することなく、大腸上皮細胞のＩＦＮ－λ産生量を増加させることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は以下を包含する。
（１）エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を有効成分として含有する、対象のインターフェロン－λの産生を高めるための組成物。
（２）前記エンテロコッカス属細菌が、エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株（受領番号ＮＩＴＥＡＰ－０３５３５）である、（１）に記載の組成物。
（３）前記エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物が殺菌済みである、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）対象の抗ウイルスタンパク質遺伝子の発現量を高める、（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）前記抗ウイルスタンパク質遺伝子が、Ｍｘダイナミン様ＧＴＰアーゼ１（Ｍｘ１）遺伝子、２’－５’－オリゴアデニル酸合成酵素１（ＯＡＳ１）遺伝子及びインターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である、（４）に記載の組成物。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載の組成物を含む、医薬組成物。
（７）（１）～（５）のいずれかに記載の組成物を含む、食品組成物。
（８）（１）～（５）のいずれかに記載の組成物を含む、外用組成物。
（９）エンテロコッカス属細菌を培養する工程、及びエンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を得る工程、を含む、対象のインターフェロン－λの産生を高めるための組成物の製造方法。
（１０）前記エンテロコッカス属細菌が、エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株（受領番号ＮＩＴＥＡＰ－０３５３５）である、（９）に記載の製造方法。

本発明によると、樹状細胞以外の細胞においても高いＩＦＮ－λ産生促進効果を示す乳酸菌を含む組成物を提供することができる。また、本発明は、樹状細胞以外の細胞においても高いＩＦＮ－λ産生促進効果を示す乳酸菌を含む組成物の製造方法を提供することができる。

エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株培養物の添加量とＷｉＤｒ細胞のＩＦＮ－λ１産生量との関係を示すグラフである。図中のエラーバーは標準誤差を示す。図中の「＊」は、Ｓｔｅｅｌ法検定で、対照に対して有意差が認められた（ｐ＜０．０５）ことを示す（ｎ＝６）。エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株培養物の添加量とＷｉＤｒ細胞のＩＦＮ－λ３産生量との関係を示すグラフである。図中のエラーバーは標準誤差を示す。図中の「＊」は、Ｓｔｅｅｌ法検定で、対照に対して有意差が認められた（ｐ＜０．０５）ことを示す（ｎ＝６）。エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株培養物による処理時間とＷｉＤｒ細胞のＭｘ１遺伝子発現量との関係を示すグラフである。図中のエラーバーは標準誤差を示す。図中の「＊」は、Ｓｔｅｅｌ法検定で、０時間に対して有意差が認められた（ｐ＜０．０５）ことを示す（ｎ＝６）。エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株培養物による処理時間とＷｉＤｒ細胞のＯＡＳ１遺伝子発現量との関係を示すグラフである。図中のエラーバーは標準誤差を示す。図中の「＊」は、Ｓｔｅｅｌ法検定で、０時間に対して有意差が認められた（ｐ＜０．０５）ことを示す（ｎ＝６）。エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株培養物による処理時間とＷｉＤｒ細胞のＩＳＧ１５遺伝子発現量との関係を示すグラフである。図中のエラーバーは標準誤差を示す。図中の「＊」は、Ｓｔｅｅｌ法検定で、０時間に対して有意差が認められた（ｐ＜０．０５）ことを示す（ｎ＝６）。

１．組成物
本発明の組成物は、エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を有効成分として含有する、対象のインターフェロン－λ（ＩＦＮ－λ）の産生を高めるための組成物である。本発明の組成物は、対象に経口摂取等の手段により投与することで、対象におけるＩＦＮ－λの産生を促進することができる、という特徴を有する。

本発明者らは、乳酸菌の一種であるエンテロコッカス属細菌により、大腸癌細胞株であるＷｉＤｒ細胞のＩＦＮ－λ産生が促進されることを見出した。ＷｉＤｒ細胞は、大腸上皮に由来する細胞であり、樹状細胞のようにもともとＩＦＮ産生量の高い細胞ではなく、通常の体細胞に近い細胞であるといえる。大腸上皮細胞は、経口投与した場合の医薬品・食品の成分と接触する機会が多く、この細胞においてＩＦＮ－λ産生が促進されることは、特に生体の免疫機能向上への寄与度が高いといえる。

本発明者らは、さらに、エンテロコッカス属細菌により、ＷｉＤｒ細胞における各種のＩＦＮ誘導性の抗ウイルスタンパク質遺伝子の発現が促進されることを見出した。すなわち、エンテロコッカス属細菌が、大腸上皮細胞においてＩＦＮ－λ産生を促進するのみでなく、同細胞において実際に免疫防御機能を誘導することを確認した。

本明細書において「対象」とは、ヒト若しくは非ヒト動物、又はヒト若しくは非ヒト動物に由来する細胞を指す。ここでいう非ヒト動物としては、特に制限されるものではないが、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などであり、好ましくは、ニワトリ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなどが挙げられる。本発明の組成物は、対象に投与されることで、その対象が産生するＩＦＮ－λの産生量を増加させることができることを特徴とする。

本発明の組成物によって産生量が高められるＩＦＮ－λは、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３及びＩＦＮ－λ４のいずれであってもよいが、特に、ＩＦＮ－λ１及び／又はＩＦＮ－λ３であることが好ましい。

本明細書において「ＩＦＮ－λ１」は、配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。なお、配列番号１のアミノ酸配列は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＡＮ８６１２５の配列である。

本明細書において「ＩＦＮ－λ２」は、配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。なお、配列番号２のアミノ酸配列は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＡＮ８６１２６の配列である。

本明細書において「ＩＦＮ－λ３」は、配列番号３のアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。なお、配列番号３のアミノ酸配列は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＡＮ８６１２７の配列である。

本明細書において「ＩＦＮ－λ４」は、配列番号４のアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。なお、配列番号４のアミノ酸配列は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿００１２６３１８３の配列である。

本明細書において「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列または塩基配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアラインメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸配列（翻訳開始点となるアミノ酸を含む）または塩基配列（開始コドンを含む）に対する同一アミノ酸または塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出する。配列同一性は、この分野で汎用されているアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用いて容易に調べることができる。例えばＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトから誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に配列同一性を調べることができる。
配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士は無視する）／短いほうの配列長（ギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）

本発明の組成物は、エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を含む。本明細書において、細菌の「培養物」とは、生菌体、死菌体、生菌体又は死菌体の破砕物、生菌体又は死菌体の凍結乾燥物、該凍結乾燥物の破砕物、培養液、培養液抽出物等を指す。培養物には、菌体の一部や菌体の処理物が含まれてもよく、また、菌体から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ等が含まれてもよい。細菌の「処理物」とは、菌体に、例えば、酵素処理、熱処理、抽出処理、塩析処理、エタノール沈殿処理、乾燥処理等を加えたものを指す。

本明細書において、「エンテロコッカス属細菌」とは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌とも表示される、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に属する乳酸菌を指す。グラム陽性球菌であり、双球菌又は短い連鎖球菌の状態で主に動物の腸管に存在する。

本発明の組成物に含まれるエンテロコッカス属細菌は、エンテロコッカス・キャセリフラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）であることが好ましい。特に、エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株であることが好ましい。エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株は、２０２１年９月１０日付で、ＮＩＴＥＡＰ－０３５３５の受領番号で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８１２２号室）で、ブダペスト条約に基づく国際寄託のために受領された細菌である。エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株は、伝統的な発酵食品である漬物から単離された細菌であり、食品として使用されてきた細菌である。特に経口摂取において、安全性の高い細菌であるといえる。

本発明の組成物において、エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物は、生菌菌体を含んでいてもよいが、殺菌済み、すなわち菌体の生育・増殖が不可能な状態で組成物中に含まれることが好ましい。本発明の組成物において、有効成分であるエンテロコッカス属細菌、特にエンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株の培養物又は処理物は、生菌を含まなくても効果があることが確認されている。本発明の組成物は、殺菌済みとすることで、生菌を含む場合と比較して、医薬品、食品等として市場に流通させる際に、輸送・保存時の温度、時間等の管理が簡便になる、という利点を有する。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型の３種類に分類され、各型が特異的な免疫応答を誘導する。ＩＦＮを介したシグナル伝達によって、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子のアップレギュレーションが促進され、多くの下流シグナル伝達カスケードが活性化されることで、抗ウイルス機構、特に各種の抗ウイルスタンパク質の産生が生じることが知られる。ＩＦＮ誘導性の抗ウイルスタンパク質としては、Ｍｘダイナミンン様ＧＴＰアーゼ１（Ｍｘ１）、２’－５’－オリゴアデニル酸合成酵素１（ＯＡＳ１）、インターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）、ビペリン（Ｖｉｐｅｒｉｎ）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、インターフェロン調節因子７（ＩＲＦ７）等を含む１２０種類以上が知られる。

本明細書において、「Ｍｘダイナミン様ＧＴＰアーゼ１（Ｍｘ１）遺伝子」とは、配列番号５で示される塩基配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列同一性を有する塩基配列を有する遺伝子を指す。Ｍｘ１は、細胞内で、インフルエンザ、パラインフルエンザ、麻疹、コクサッキー、Ｂ型肝炎等の幅広いウイルスに対して抗ウイルス活性を持つタンパク質として知られる。なお、配列番号５の塩基配列は、ＡｃｃｅｓｉｏｎＮｏ．ＮＧ＿０２７７８８の配列である。

本明細書において、「２’－５’－オリゴアデニル酸合成酵素１（ＯＡＳ１）遺伝子」とは、配列番号６で示される塩基配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列同一性を有する塩基配列を有する遺伝子を指す。ＯＡＳ１は、不活性型ＲＮａｓｅＬに結合して活性化させてｍＲＮＡやｒＲＮＡを分解し、ウイルスや細菌の増殖を抑制する。なお、配列番号６の塩基配列は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＧ＿０１１５３０の配列である。

本明細書において、「インターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）遺伝子」とは、配列番号７で示される塩基配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列同一性を有する塩基配列を有する遺伝子を指す。なお、配列番号７の塩基配列は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＧ＿０３３０３３の配列である。

本発明の組成物は、対象の抗ウイルスタンパク質遺伝子の発現量を高める効果を有することが好ましい。抗ウイルスタンパク質遺伝子としては、対象由来の抗ウイルス活性を有するタンパク質の遺伝子であれば特に限定されないが、特にＩＦＮ活性の有用な指標である、Ｍｘ１遺伝子、ＯＡＳ１遺伝子及びＩＳＧ１５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子であることが好ましい。

本発明の組成物の形態は、特に限定されず、水溶液、乾燥粉末、凍結乾燥品、凍結品等のいずれの形態としてもよいが、後述の組成物の用途によって、その形態は適宜選択され得る。

本発明の組成物は、対象に投与するための組成物である。投与形態は、対象に有効成分が取り込まれる形態であれば投与形態は特に限定されず、経口投与であっても非経口投与であってもよいが、後述の組成物の用途によって、その投与形態は適宜選択され得る。本発明の組成物は、対象に経口摂取等で投与した場合にも高い安全性を有する。一方、投与形態に関わらず、対象のＩＦＮ－λ産生を促進する効果を有し、ＩＦＮに関連して、対象において抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗腫瘍増殖効果、抗腫瘍効果、抗癌効果を有し得る。

２．組成物の用途
本発明の組成物の用途は、特に限定されるものではなく、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品、飼料などに配合される。ここでいう医薬品、医薬部外品、化粧品とは「医薬品、医療機器等の品質、有効性及び安全性の確保等に関する法律（薬機法）」に規定されるものをいう。以下、用途に応じて、本発明の組成物を含む「医薬組成物」、「食用組成物」及び「外用組成物」を分けて説明するが、これらは完全に分けられるものではなく、互いに重複し得るものである。

２－１医薬組成物
本発明の医薬組成物は、「１．組成物」の項に記載の本発明の組成物を含むことを特徴とする。本明細書において「医薬組成物」とは、ヒト又は非ヒト動物の疾病の治療及び／又は予防を行うための組成物を指し、主に薬機法上の医薬品及び一部の医薬部外品がこれに含まれる。

本発明の医薬組成物は、有効成分として、エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を含む。本発明の医薬組成物は、有効成分に加えて、必要に応じて製薬上許容される担体を含有してもよい。ここでいう「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。

賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。

結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。

崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が例として挙げられる。

充填剤としては、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が例として挙げられる。

乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。

流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。

このような担体は、主として前記剤形形成を容易にし、また剤形及び薬理効果を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。

本発明の医薬組成物は、ＩＦＮ－λ産生促進の効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、他の抗生物質を所定量含有していても良い。

本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分であるエンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物、及び他の付加的な有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、経口投与として、糖衣錠、バッカル錠、コーティング錠、チュアブル錠などの錠剤、トローチ剤、丸剤、散剤、ソフトカプセルを含むカプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、ドライシロップを含むシロップ剤、エリキシル剤などの液剤など、及び非経口投与形態として、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射などの注射剤、経皮投与、経鼻投与、経肺投与、経腸投与、口腔内投与、経粘膜投与などのための経皮吸収テープ、エアゾール剤、坐剤などが挙げられる。利便性、汎用性の観点から、経口投与形態が好ましい。

本発明の医薬組成物は、エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を、ＩＦＮ産生促進に効果的で、かつ、重篤な副作用が発生する可能性が極めて低い量で含むことが好ましい。エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物の投与量は、特に限定されないが、例えば、菌体細胞数に換算して１×１０^８～１×１０^１２細胞／個体／日、特に、１×１０^９～１×１０^１１細胞／個体／日となるように調整することができる。

本発明の医薬組成物の投与回数は、ＩＦＮ産生促進効果が十分に得られ、かつ重篤な副作用が生じない限り、特に限定しないが、例えば、３日に１回～１日５回、特に１日１回～１日３回とすることが好ましい。本実施形態の医薬組成物の投与期間は、特に限定されないが、例えば、１～２４週間、特に８～１２週間とすることができる。

２－２食用組成物
本発明の食用組成物は、「１．組成物」の項に記載の本発明の組成物を含むことを特徴とする。本明細書において「食用組成物」とは、ヒト又は非ヒト動物が栄養分として経口摂取するための組成物をいう。ヒトの摂取に適した食用組成物を飲食品、非ヒト動物の摂取に適した食用組成物を飼料とも称する。

本発明の食用組成物（飲食品、飼料）の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、加工食品、健康食品（栄養補助食品、栄養機能食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品など）、サプリメント、病者向け食品（病院食、病人食、介護食など）、菓子、油脂類、乳製品、レトルト食品、レンジ食品、冷凍食品、調味料、健康補助食品、飲料、栄養ドリンクなどが挙げられる。

本発明の食用組成物（飲食品、飼料）の形状や性状は、特に限定されるものではなく、例えば、固体状、半固体状、ゲル状、液体状、粉末状などが挙げられる。特に、健康食品やサプリメントとして使用する場合は、継続的で簡便な摂取ができるように、顆粒、カプセル、錠剤、チュアブル剤、飲料パウダー、ドリンク剤、スムージー、ゼリー、グミ、アメ、ガムなどの形態にすることが好ましい。

本発明の食用組成物に含まれるエンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物の量は、健康被害が生じる可能性が極めて低い量であれば特に限定されないが、例えば、菌体細胞数に換算して１×１０^８～１×１０^１２細胞／個体／日、特に、１×１０^９～１×１０^１１細胞／個体／日となるように調整することができる。

２－３外用組成物
本発明の外用組成物は、「１．組成物」の項に記載の本発明の組成物を含むことを特徴とする。本明細書において「外用組成物」とは、ヒト又は非ヒト動物の皮膚、毛髪、爪等、体表面の疾患の治療及び／若しくは治療、又は体表面の健康若しくは美観の改善及び／若しくは維持のために使用され、体表面に貼付、塗擦、散布又はこれらに類似する方法で接触させるための組成物を指す。主に、薬機法上の医薬品・医薬部外品の一部及び化粧品がこれに含まれる。

本発明の外用組成物の形態は、体表面に適用できる形態であれば、特に限定されず、経皮吸収テープ、エアゾール剤、パッチ剤、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、パック等のいずれの形態としてもよい。

本発明の外用組成物は、エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物に加えて、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。各成分の詳細については、「２－１医薬組成物」の項に記載した通りである。

本発明の外用組成物に含まれるエンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物の量は、健康被害が生じる可能性が極めて低い量であれば特に限定されないが、例えば、菌体細胞数に換算して１×１０^８～１×１０^１２細胞／個体／日、特に、１×１０^９～１×１０^１１細胞／個体／日となるように調整することができる。

３．組成物の製造方法
本発明の製造方法は、対象のＩＦＮ－λの産生を高めるための組成物の製造方法であって、エンテロコッカス属細菌を培養する工程、及びエンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を得る工程、を含む、ことを特徴とする。

本発明の製造方法は、ＩＦＮ-λ産生及び抗ウイルスタンパク質遺伝子発現を高める作用を示すエンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物が得られる限り、エンテロコッカス属細菌の培養条件、有効成分である培養物又は処理物の採取、処理方法は特に限定されない。

本発明の製造方法において、エンテロコッカス属細菌は、エンテロコッカス・キャセリフラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）であることが好ましい。特に、エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株であることが好ましい。

３－１培養工程
本発明の製造方法は、エンテロコッカス属細菌を培養する工程を有する。培養工程の一例として、例えば、ＭＲＳ培地にエンテロコッカス属細菌を植菌し、当該細菌の最適温度である３０～３７℃にて２０～２４時間培養して培養液を得る手段をとり得る。

３－２加工工程
本発明の製造方法は、エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を得る工程を含む。より具体的には、培養工程で得られた培養液を加工して、組成物として使用可能な培養物又は処理物を得るための、加工工程を含む。

加工工程の一例として、以下の手法をとり得る。培養工程で得られた培養液から、菌体を集菌して、滅菌処理した水や生理食塩水などで洗浄する。得られた菌体を、熱殺菌処理後又は無処理の状態で乾燥処理に供して乾燥殺菌体粉末又は乾燥粉末を有効成分として得る。なお、有効成分は、粉末に限られず、水溶液、凍結品としてもよい。

加工工程における乾燥処理手段は、特に限定されないが、自然乾燥、風乾、凍結乾燥等の手段を用いることができる。殺菌処理手段も、特に限定さないが、例えば、熱殺菌、加圧殺菌、浸透圧殺菌等の手段を用いることができる。

本発明の製造方法により得られた組成物は、対象に経口摂取等により投与することで、対象のＩＦＮ－λ産生を促進することが可能である。また、ＩＦＮに関連して、対象において抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗腫瘍増殖効果、抗腫瘍効果、抗癌効果を有し得る。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１．エンテロコッカス属乳酸菌によるＷｉＤｒ細胞のＩＦＮ－λ産生促進の評価試験］
［１－１］試験試料の調製
凍結保存されたエンテロコッカス属細菌（エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株）の菌液を、ＭＲＳ液体培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した後、３０℃、２４時間培養した。

２４時間培養後の培養液を再度ＭＲＳ液体培地に添加し、３０℃、２４時間さらに培養した。その後、５０ｍＬ容遠沈管中のＭＲＳ液体培地４０ｍＬへ接種し、３０℃で２０～２４時間静置培養した。その後、２，５９０×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して上清を除去した。菌体に生理食塩水を加え、ボルテックス処理により懸濁した後、同様の条件にて遠心分離し上清を除去した。超純水を３ｍＬ加え、菌体をボルテックス処理により懸濁した。この懸濁液の全量を１５ｍＬ容遠沈管に移し、１００℃、３０分間加熱殺菌し、流水で冷却した後、－８０℃ディープフリーザーで一晩凍結させた。凍結した懸濁液の入った１５ｍＬ容遠沈管の蓋をとり、１２１℃、１５分滅菌したベンコットで遠沈管の口を覆った後、真空凍結乾燥機（ＡＧＣＴＥＣＨＮＯＧＬＡＳＳ、ＦＲＥＥＺＥ－ＤＲＹＥＲ、ＳＲＧ－４０Ｍ）を用いて、６日間乾燥させた。乾燥が終了した殺菌体の入った１５ｍＬ容遠沈管からベンコットを取り除き、マイクロスパーテルを用いて乾燥したサンプルを細かく粉砕した後、菌末１０ｍｇを１．５ｍＬチューブに移した。ここに、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン・ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地（以下、「完全培地」とも称する）を１ｍＬ加えてボルテックス処理により懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬ濃度の殺菌体懸濁液とした。殺菌体懸濁液を完全培地を用いて段階希釈して１、３、１０、３０μｇ／ｍＬ濃度の殺菌体懸濁液を調製し、試験試料とした。

［１－２］細胞培養試験
ＷｉＤｒ細胞（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク、Ｎｏ．ＪＣＲＢ０２２４）は、直径１００ｍｍディッシュ（ＡＧＣＴＥＣＨＮＯＧＬＡＳＳ）で３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で維持した。培地は２－３日おきに１回交換した。継代培養は週に２回行った。培地を除去し、１０ｍＬのＰＢＳで細胞を洗浄した後、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン－１ｍＭＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ_２で３分間反応させ、細胞をシャーレ底面から剥離した。そこに完全培地を８ｍＬ加えて反応を停止させ、剥離した細胞を回収した。トリパンブルー染色法で細胞数を計測後、完全培地で生細胞数が１．１×１０^６細胞／ディッシュになるように調製し、１００ｍｍディッシュに継代した。継代したＷｉＤｒ細胞が８０～９０％コンフルエント状態になったことを確認した後、ＷｉＤｒ細胞を６ウェルプレート（ＡＧＣＴＥＣＨＮＯＧＬＡＳＳ）に１×１０^６細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。培養開始から４８時間後、培地を除去し、０．５ｍＬのＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。ＰＢＳを除去した後、０．５ｍＬのＰＢＳを加えて細胞を再度洗浄した。ＰＢＳを除去し、各ウェルに各濃度の殺菌体懸濁液をそれぞれ１，０００μＬ添加し、４８時間反応させた。対照として、殺菌体を含まない完全培地を同様に添加し反応させた。反応後、細胞上清を１．５ｍＬチューブに回収し、遠心分離（１，５００×ｇ、４℃、５分間）した。遠心後に上清を１．５ｍＬチューブに回収し、－８０℃で保管した。細胞上清中のＩＦＮ－λ１濃度及びＩＦＮ－λ３濃度を測定した。ＩＦＮ－λ１濃度は、ＩＬ－２９ＨｕｍａｎＥＬＩＳＡＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、キット付属のプロトコルに準じて測定した。ＩＦＮ－λ３濃度は、M. Sugiyama, et al., Hepatology Research, 42(11) pp. 1089-1099 (2012)に記載の測定方法に準じて、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）により測定した。

［１－３］結果
各殺菌体懸濁液を添加した際のＷｉＤｒ細胞培養液中のＩＦＮ－λ１及びＩＦＮ－λ３の濃度を、それぞれ図１及び２に示す。殺菌体の添加により、ＷｉＤｒ細胞のＩＦＮ－λ１及びＩＦＮ－λ３の産生量が有意に増加することが確認された。

［実施例２．エンテロコッカス属乳酸菌により高まる抗ウイルスタンパク遺伝子発現量の評価試験］
［２－１］試験試料の調製
実施例１と同様の条件にて、１０μｇ／ｍＬ濃度の殺菌体懸濁液を調製し、試験試料とした。

［２－２］細胞培養試験
ＷｉＤｒ細胞は、直径１００ｍｍディッシュ（ＡＧＣＴＥＣＨＮＯＧＬＡＳＳ）で３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で維持した。培地は２－３日おきに１回交換し、継代培養は週に２回行った。培地を除去し、１０ｍＬのＰＢＳで細胞を洗浄した後、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン－１ｍＭＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ_２で３分間反応させ、細胞をシャーレ底面から剥離した。そこに完全培地を８ｍＬ加え反応を停止させ、剥離した細胞を回収した。トリパンブルー染色法で細胞数を計測後、完全培地で生細胞数が１．１×１０^６細胞／ディッシュになるように１００ｍｍディッシュに継代した。継代したＷｉＤｒ細胞が８０～９０％コンフルエント状態になったことを確認した後、ＷｉＤｒ細胞を３５ｍｍディッシュ（ＡＧＣＴＥＣＨＮＯＧＬＡＳＳ）に１×１０^６細胞／ディッシュとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。培養開始から４８時間後、培地を除去し、０．５ｍＬのＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。ＰＢＳを除去した後、もう１度０．５ｍＬのＰＢＳを加え、細胞を再度洗浄した。ＰＢＳを除去、各ウェルに１０μｇ／ｍＬの殺菌体懸濁液１，０００μＬを添加して、０、４、８、２４、４８時間反応させた。各反応後、培地を除去し、０．５ｍＬのＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。ＰＢＳを除去した後、もう１度０．５ｍＬのＰＢＳを加え、細胞を再度洗浄した。上清を除去した３５ｍｍディッシュを－８０℃で保存した。

［２－３］ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出
ＴＲＩｚｏｌ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）９００μＬを用いて各ウェルの細胞を剥がしてピペッティングして、細胞抽出液を１．５ｍＬリングロックチューブに回収した。サンプルを氷上で静置し、１８０μＬのクロロホルムを加え、ボルテックスで攪拌後、室温で３分以上静置した。１２，０００×ｇ、４℃、１５分間の条件で遠心分離を行い、上清２５０μＬを１．５ｍＬチューブに取り、２００μＬのイソプロパノールを加えてボルテックスで攪拌した。室温で１０分間静置した後、１２，０００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離を行った。上清を除去して、チューブを１０分程度風乾させた。沈殿物に７５％エタノールを加え、１２，０００×ｇ、４℃、５分間、遠心分離を行い、上清を取り除いた。同様の作業を２回繰り返した。ＲＮＡを室温で乾燥させた後、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ蒸留水３０－５０μＬに溶解し、ＲＮＡ抽出溶液を作製した。ＲＮＡ抽出溶液の０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５倍量のエタノールを加え、軽く混和した後、－８０℃で一晩静置した。１２，０００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離を行った。上清を除去して、チューブを１０分程度風乾させた。沈殿物に７５％エタノールを加え、１２，０００×ｇ、４℃、５分間、遠心分離を行った。上清を除き、ＲＮＡを室温で乾燥させた後、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ蒸留水３０μＬに溶解し、ＲＮＡ溶液を作製した。

［２－４］ｃＤＮＡ合成
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ（タカラバイオ）を用い、使用説明書に準じて、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応を行った。具体的には、キット中の酵素ミックス、抽出したＲＮＡ溶液及び水をマイクロチューブに入れ、サーマルサイクラ―により３７℃で１５分、８５℃で５秒加熱することで逆転写反応を行った。調製したｃＤＮＡ溶液は－８０℃で保管した。

［２－５］定量ＰＣＲ
ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（タカラバイオ）を用い、７５００ＦａｓｔＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるリアルタイムＰＣＲにより各ｃＤＮＡ溶液中のＭｘ１、ＯＡＳ１、ＩＳＧ１５及びＧＡＰＤＨの遺伝子量を測定した（ｍＲＮＡ量に相当）。９６ウェルのＰＣＲ用プレートに、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ、ＰＣＲプライマー（フォワードプライマー（Ｆ）及びリバースプライマー（Ｒ））、各ｃＤＮＡサンプル、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ蒸留水を加え、ＰＣＲ装置にセットしＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度条件は、初期変性（９５℃３０秒）の後、９５℃５秒－６０℃３０秒の温度変化を４０サイクル繰り返した。使用したプライマーの配列を表１に配列番号８～１５として示す。各遺伝子の発現量は、内部標準遺伝子であるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現量で補正した後、同条件の０時間反応時の遺伝子発現量を１とした相対値として解析した。

［２－６］結果
殺菌体懸濁液を添加した際の、ＷｉＤｒ細胞のＭｘ１、ＯＡＳ１及びＩＳＧ１５の遺伝子発現量を、それぞれ図３、４及び５に示す。殺菌体懸濁液を添加することで、各種ＩＦＮ誘導性の抗ウイルスタンパク質遺伝子の発現が促進されることが確認された。

Claims

エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を有効成分として含有する、対象のインターフェロン－λの産生を高めるための組成物。
前記エンテロコッカス属細菌が、エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株（受領番号ＮＩＴＥＡＰ－０３５３５）である、請求項１に記載の組成物。
前記エンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物が殺菌済みである、請求項１又は２に記載の組成物。
対象の抗ウイルスタンパク質遺伝子の発現量を高める、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記抗ウイルスタンパク質遺伝子が、Ｍｘダイナミン様ＧＴＰアーゼ１（Ｍｘ１）遺伝子、２’－５’－オリゴアデニル酸合成酵素１（ＯＡＳ１）遺伝子及びインターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である、請求項４に記載の組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を含む、食用組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を含む、外用組成物。
エンテロコッカス属細菌を培養する工程、及びエンテロコッカス属細菌の培養物又は処理物を得る工程、を含む、対象のインターフェロン－λの産生を高めるための組成物の製造方法。
前記エンテロコッカス属細菌が、エンテロコッカス・キャセリフラバスＫＢ１７３３株（受領番号ＮＩＴＥＡＰ－０３５３５）である、請求項９に記載の製造方法。