JP5001830B2 - 免疫賦活用組成物 - Google Patents
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Description
本発明はビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）に属するビフィズス菌および／または該ビフィズス菌の処理物を含有してなることを特徴とする免疫賦活用組成物、ならびにそれを含む免疫賦活に有用な飲食品および医薬組成物に関する。
気管支、消化管、泌尿生殖器系などの粘膜面には、細菌、ウイルスなどの微生物や食物タンパクをはじめとする多くの外来抗原に対し、生体を防御するための分泌型IgAを主体とする強力な粘膜免疫機構が存在する。分泌型IgAは、血清中のIgAとは異なり、J鎖を含んだ二量体IgA（dimeric IgA: 2IgA・J）と分泌成分（SC: secretory component、またはsecretory piece）とが結合した形(2IgA・J・SC）で存在しており、唾液、涙、鼻汁、乳汁、さらに気管支や腸管などからの分泌液中に多く含まれている。そのような粘膜面におけるリンパ組織を粘膜関連リンパ組織とよび、IgA産生誘導において中心的な役割を演じている。粘膜免疫では、腸管の代表的な粘膜関連リンパ組織であるパイエル板（Peyer's patch）などで抗原刺激を受けた活性化B細胞が、全身の血液循環を経由しふたたび腸管のみならず外分泌腺や気管支・泌尿生殖器系の粘膜面に分布し、IgA産生細胞である形質細胞に分化して二量体IgAを産生する。さらにそのようにして産生された二量体IgAは、粘膜上皮細胞で産生される分泌成分と結合して分泌型IgAとなり、粘膜内から管腔や生体外へ分泌される。分泌成分は、二量体IgAを管腔や生体外へ分泌するために必須の成分であることが知られている。
そこで、気管支、消化管、泌尿生殖器系などの粘膜において二量体IgAの産生と分泌成分の産生を誘導し成立させる食品成分あるいは組成物は、分泌型IgAの産生量あるいは粘膜から管腔や生体外への分泌型IgAの分泌量を増加させ生体防御能を増強することが期待できる。また、粘膜免疫によるそのような生体防御能の増強は、とりわけ病原体の体内への侵入防止や食物アレルギーの発症予防等において有用である。
分泌型IgAの産生を亢進する物質として、例えば本発明者らはフラクトオリゴ糖およびその組成物（特許文献１）を見出している。このフラクトオリゴ糖は、分泌成分の産生に与える影響について報告されている数少ない食品成分の１つである。一方、ビフィズス菌ビフィドバクテリウム・ロンガムやビフィドバクテリウム・ブレーベは、パイエル板細胞においてIgA産生を誘導することが従来から知られている（特許文献２）。また本発明者らは、成人の糞便より分離したBifidobacterium longum OLB 6001株がIgA産生誘導能をもつことも過去に見出している（非特許文献１）。このビフィズス菌Bifidobacterium longum OLB 6001株は本発明者らのグループによりビフィドバクテリウム・ロンガムNo.7（受託番号FERM P-13610）として報告されているものと同一である（特許文献３）。しかし、それらのビフィズス菌をも上回る、より高い免疫賦活効果を有する免疫賦活用組成物のさらなる登場がなおも望まれている。
特開２００３−２０１２３９号公報
特公平７−１０６１４２号公報
特開平７−６９９０７号公報
Takahashi T., Nakagawa E., Nara T., Yajima T. and Kuwata T. Biosci Biotechnol Biochem 62(1), (1998) p.10-15
本発明は、免疫賦活用組成物、ならびに免疫賦活に有用な飲食品および医薬組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）に属するビフィズス菌株の中から、分泌成分の産生と腸管粘膜系における二量体IgA産生の両方を促進することができる、免疫賦活において有用な菌株を複数取得することに成功して、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下を包含する。
[1] 腸管上皮細胞における分泌成分産生量を少なくとも1.2倍に増加させる分泌成分産生誘導能を有するビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）に属するビフィズス菌および／または該ビフィズス菌の処理物を含有することを特徴とする、免疫賦活用組成物。
[2] 前記ビフィズス菌が、抗CD3抗体存在下でのパイエル板細胞5×105個当たりのIgA産生量を少なくとも10μg/mlに増加させるIgA産生誘導能をさらに有することを特徴とする、上記[1]に記載の免疫賦活用組成物。
[3] 前記ビフィズス菌が、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）またはBifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）である、上記[1]または[2]に記載の免疫賦活用組成物。
[4] 前記ビフィズス菌の処理物が、ビフィズス菌の懸濁物、培養物、培養上清、発酵物、加熱処理物、破砕物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物および希釈物からなる群より選択される少なくとも１つである、上記[1]〜[3]に記載の免疫賦活用組成物。
[5] 上記[1]〜[4]に記載の免疫賦活用組成物を含む飲食品。
[6] 乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健機能食品、サプリメント、発酵乳および乳酸菌飲料からなる群から選択される、上記[5]に記載の飲食品。
[7] 上記[1]〜[4]に記載の免疫賦活用組成物を含む、医薬組成物。
[8] 免疫賦活用の飲食品または医薬組成物を製造するための、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）またはBifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）の使用。
[9] 下記(a)または(b)のビフィズス菌。
(a) Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）
(b) Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）
(b) Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）
本発明の免疫賦活用組成物は、上皮細胞における分泌成分の産生を促進することができ、また、従来免疫賦活作用が報告されているビフィズス菌（ビフィドバクテリウム・ロンガムやビフィドバクテリウム・ブレーベなど）と比べてパイエル板細胞におけるIgA産生をかなり強力に誘導することができる。このため本発明の免疫賦活用組成物は、特に粘膜免疫の賦活において非常に有用である。さらに本発明の飲食品および医薬組成物は、食品として人類が長年摂取してきたビフィズス菌に由来する免疫賦活用組成物を有効成分として含むことから、副作用を生じる恐れが少ない。本発明のBifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）およびBifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）を用いれば、分泌成分の産生を促進することができ、かつ従来のビフィズス菌と比べて数倍も強力にIgA産生を誘導できる免疫賦活用組成物を、製造することができる。
本明細書は、本願の優先権の主張の基礎となる特願２００５−０２６６３１号および特願２００５−２５６８３５号に記載された内容を包含する。
以下、本発明を詳細に説明する。
1. 使用するビフィズス菌およびそのスクリーニング
本発明では、分泌成分産生誘導能と高いIgA産生誘導能とを備えた、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）に属するビフィズス菌を用いて、免疫賦活用組成物を製造する。
本発明では、分泌成分産生誘導能と高いIgA産生誘導能とを備えた、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）に属するビフィズス菌を用いて、免疫賦活用組成物を製造する。
本発明で使用するビフィズス菌が属する「ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）」は、ビフィドバクテリア属の１菌種である。本発明においてビフィドバクテリウム・ビフィダムに分類されるビフィズス菌は、通常の分類学上の基準に従って同定することができるが、近年頻繁に用いられる分子生物学的な手法、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに特異的なDNAプローブを用いる方法（腸内フローラシンポジウム８「腸内フローラの分子生態学的検出同定」）や、標準菌株とのDNAホモロジーにより、同定することもできる。
本発明において「分泌成分産生誘導能」とは、粘膜上皮細胞（例えば、限定されるものではないが、腸管上皮細胞）からの分泌成分の分泌を促進する能力を言う。この分泌成分産生誘導能は、例えば、ビフィズス菌またはビフィズス菌処理物と接触させた粘膜上皮細胞から分泌される分泌成分量を、ビフィズス菌等を使用しない対照実験群と比較した場合の、分泌成分濃度の増加率または分泌成分量の相対値によって示すことができる。より具体的には、本発明のビフィズス菌が有する「分泌成分産生誘導能」は、腸管上皮細胞における分泌成分産生量を少なくとも1.2倍、好ましくは1.4倍以上、一般的には1.2〜10倍、通常は1.2〜3倍に増加させる能力に相当する。
本発明で用いるビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するビフィズス菌の中で、腸管上皮細胞における分泌成分産生量を少なくとも1.2倍に増加させることができる菌を選択したものであることが好ましい。分泌成分産生量は、例えば後述の実施例に記載のようにしてin vitroで測定することができる。
このようなビフィズス菌の選択は、限定するものではないが、例えば本願明細書の実施例に記載したアッセイ法に基づいて行うことができる。簡単に述べれば、まず、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するビフィズス菌を、グルコースをラクトースに変更して調製した嫌気EG培地において培養し、得られた培養物中の菌体を洗浄し、次いで加熱処理と超音波破砕を行って菌体破砕物を得る。この菌体破砕物を、ヒト腸管上皮細胞由来細胞系（例えば、HT-29細胞）を播種した培地に添加し、好ましくは37℃で48時間にわたり培養した後、培養上清中の分泌成分濃度を測定する。あるいは菌体破砕物の代わりに、培養菌体のPBS(-)中懸濁液を上記培地に直接添加してもよい。さらに、菌体破砕物の代わりにPBS(-)［すなわち、CaおよびMgイオンを除去したDulbecco's Phosphate Buffered Saline］を用いること以外は同様の実験操作によって対照実験を行い、培養上清中の分泌成分濃度を測定する。分泌成分濃度はELISA法で測定することができる。次に、実験群で得られた分泌成分濃度の測定値を、対照実験群における分泌成分濃度の測定値を1としたときの相対値に換算する。こうして得られた相対値を、腸管上皮細胞における分泌成分産生量を増加させるレベルとみなすことができる。すなわち、この相対値が1.2以上を示すビフィズス菌を選択すればよい。例えば、あるビフィズス菌株を用いて上記アッセイを行って得られた相対値が1.5である場合には、そのビフィズス菌株は、腸管上皮細胞からの分泌成分産生量を1.5倍に増加させる能力を有するものとみなすことができ、本発明のビフィズス菌として選択されうる。なお、このアッセイ法の培養系には形質細胞（IgA産生細胞）が含まれないため、このアッセイ系では分泌成分はIgAと結合せず単独で培養上清中に分泌されている。
本発明で用いるビフィズス菌の分泌成分産生誘導能はまた、腸における分泌成分遺伝子の発現量を増加させる効果によっても裏付けられる。本発明で用いるビフィズス菌は、好ましくは、分泌成分遺伝子の発現量を少なくとも2.0倍に増加させることができる。本発明のビフィズス菌による分泌成分遺伝子の発現量増加は、具体的には、小腸又は大腸における、分泌成分遺伝子であるpIgR遺伝子（polymeric immunoglobulin receptor gene；GeneID:18703；Shimada S. et al., J Immunol. 1999;163(10):5367-73）から発現されたmRNA（例えばアクセッション番号BC013556 [国際塩基配列データベース]）のパーセンテージ（全mRNA量に対する）の増加として確認することができる。pIgR遺伝子由来のmRNA量は、例えば、小腸（例えば回腸、空腸など）又は大腸（例えば近位大腸など）の組織から抽出した全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーを用いる逆転写PCRによりcDNAを調製し、得られたcDNAを鋳型として、pIgR遺伝子特異的なプライマー対を用いてリアルタイムPCRを行うことにより、検出された増幅産物の量から決定することができる。pIgR遺伝子の発現量測定に供する腸組織は、測定条件を均一化するために器官培養したものであってよい。リアルタイムPCRの内部標準として、GAPDH遺伝子、βアクチン遺伝子などを利用することも好ましい。それらの遺伝子は、市販のハイブリダイゼーションプローブ（Applied Biosystems社、Stratagene社など）として入手することもでき、それらは内部標準として好適に使用することができる。
なお、上記のような粘膜上皮細胞からの分泌成分産生量の増強レベルを判定することにより、高い免疫賦活効果を含む有利な機能性を有するビフィズス菌をスクリーニングするようなビフィズス菌の選抜方法もまた、本発明に包含される。
本発明で用いるビフィズス菌はまた、上記のような分泌成分遺伝子の発現量増加とともに、腸におけるインターフェロン調節因子１遺伝子（IRF-1遺伝子）の発現量も増加させることができるものであることが好ましい。本発明で用いるビフィズス菌は、好ましくは、腸組織におけるIRF-1遺伝子の発現量を少なくとも1.5倍に増加させることができる。本発明のビフィズス菌によるIRF-1遺伝子の発現量増加は、具体的には、小腸又は大腸における、IRF-1遺伝子（interferon regulatory factor 1；GeneID:16362）から発現されたmRNA（例えばアクセッション番号NM008390 [国際塩基配列データベース]）のパーセンテージ（全mRNA量に対する）の増加として確認することができる。IRF-1遺伝子由来のmRNA量は、例えば、小腸（例えば回腸、空腸など）又は大腸（例えば近位大腸など）の組織から抽出した全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーを用いる逆転写PCRによりcDNAを調製し、得られたcDNAを鋳型として、IRF-1遺伝子特異的なプライマー対を用いてリアルタイムPCRを行うことにより、検出された増幅産物の量から決定することができる。さらに、IRF-1遺伝子由来のmRNA量の変化を全RNAを鋳型として調製したcRNAを用いたDNAマイクロアレイによって解析することも可能である。IRF-1遺伝子の発現量測定に供する腸組織は、測定条件を均一化するために器官培養したものであってよい。本発明に係るビフィズス菌またはその処理物を投与した腸組織においては、このようなIRF-1遺伝子の発現量増加が、細胞内シグナル伝達経路を介して分泌成分の産生量を増加させるものと考えられる。しかし本発明は、このような理論によって拘束されるものではない。
一方、本発明において「IgA産生誘導能」とは、粘膜関連リンパ組織（限定するものではないが、例えば腸管粘膜）に存在する形質細胞からのIgAの分泌を促進する能力を言う。このIgA産生誘導能は、例えば、ビフィズス菌またはビフィズス菌処理物と接触させた粘膜関連リンパ組織において分泌されるIgA量を、ビフィズス菌等を使用しない対照実験群と比較した場合の、IgA濃度の増加率によって示すことができる。あるいはこのIgA産生誘導能は、ある特定のアッセイ系において粘膜関連リンパ組織に由来するIgA産生細胞から産生されるIgA濃度で示してもよい。本発明のビフィズス菌は、IgA産生誘導能が従来報告されているビフィズス菌と比べて、高いIgA産生誘導能を有する。より具体的には、本発明のビフィズス菌が有する「高いIgA産生誘導能」とは、in vitro実験系において、抗CD3抗体存在下でのパイエル板細胞5×105個当たりのIgA産生量を、少なくとも10μg/ml、一般的には10μg/ml〜100μg/ml、通常は10μg/ml〜30μg/mlのレベルまで増加させる能力に相当する。
本発明で用いるビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するビフィズス菌の中で、例えば下記アッセイ系において、抗CD3抗体存在下でのパイエル板細胞5×105個当たりのIgA産生量が少なくとも10μg/mlとなる菌を選択したものであることが好ましい。
ビフィズス菌の選択のためのIgA産生量に基づくアッセイは、限定するものではないが、例えば本願明細書の実施例に記載に基づいて、以下のようにして行うことができる。簡単に述べれば、まず、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するビフィズス菌を、グルコースをラクトースに変更して調製した嫌気EG培地において培養し、得られた培養物中の菌体を洗浄した後、例えば4%-ホルマリン-PBSなどにより菌体を固定する。この固定菌体を、ホルマリン除去などを必要に応じて行ってから、660 nmでの濁度が1.6となるように菌液濃度を調整する。一方、マウスから採取したパイエル板を、培地（例えば、2％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地）中でほぐし、150ゲージの滅菌ステンレス鋼ふるいを通過させ、洗浄した後に培地に再懸濁して、T細胞およびB細胞を含むリンパ細胞群を調製する。本アッセイではこのリンパ細胞群をパイエル板細胞として用いる。そこで次にこのリンパ細胞群を、予め抗CD3抗体でコーティング済みのプレートに1ウェル当たり5×105個にて播種し、そこに上記菌液（濁度＝1.6）5μlを添加し、炭酸ガスインキュベーター内で37℃で5日間培養する。培養物からリンパ細胞を除去して培養上清を採取し、培養上清中のIgA量を測定する。この培養上清中のIgA量を、抗CD3抗体存在下でのパイエル板細胞5×105個当たりのIgA産生量とみなすことができる。すなわちこの培養上清中のIgA量が10μg/ml以上であることが示されたビフィズス菌を、選択すればよい。また、ビフィズス菌液を添加しないこと以外は上記と同様の対照実験を行って培養上清中のIgA量を測定し、この対照実験群のIgA量を1として、実験群の培養上清中のIgA量を相対値に換算することもできる。なお本アッセイ法において測定されるIgAは、大部分が、パイエル板細胞において抗CD3抗体存在下で分化した形質細胞（IgA産生細胞）から細胞外に分泌された二量体IgAであると考えられる。
本発明で用いるビフィズス菌のIgA産生誘導能はまた、従来から高いIgA産生誘導能が報告されているビフィズス菌株のBifidobacterium longum OLB 6001株（受託番号 FERM P-13610）またはBifidobacterium breve株（受託番号FERM BP-2824）のIgA産生誘導能を基準として、規定することもできる。これらは、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている菌株である。例えば、上記のIgA産生量に基づくアッセイ法において、実験群のビフィズス菌の代わりにBifidobacterium longum OLB 6001株またはBifidobacterium breve株（受託番号FERM BP-2824）を用いること以外は同様の操作により対照実験を行い、この対照実験群における培養上清中のIgA量を1として実験群の培養上清中のIgA量を相対値に換算することにより、その相対値で示される、当該ビフィズス菌が抗CD3抗体存在下でパイエル板細胞におけるIgA産生を促進する能力として、本発明のビフィズス菌のIgA産生誘導能を示すことができる。例えば、上記アッセイの結果、Bifidobacterium longum OLB 6001株における培養上清中のIgA量を1とした場合のビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するあるビフィズス菌株のIgA量の相対値が3であるならば、そのビフィズス菌株は、Bifidobacterium longum OLB 6001株と比較して、抗CD3抗体存在下でパイエル板細胞におけるIgA産生量を3倍に増加させることができるIgA産生誘導能を有する。本発明で用いるビフィズス菌のIgA産生誘導能は、例えばBifidobacterium longum OLB 6001株と比較して、抗CD3抗体存在下でのパイエル板細胞におけるIgA産生量を2〜10倍、好ましくは2.4〜5倍に増加させることができるIgA産生誘導能を有する。
本発明では、使用するビフィズス菌の分泌成分産生誘導能およびIgA産生誘導能について、上記のようなアッセイ法を用いて確認することもできる。
本発明において特に好適に使用できるビフィズス菌株は、本発明者らが乳児の糞便より独自に分離したビフィズス菌Bifidobacterium bifidum OLB 6377株およびBifidobacterium bifidum OLB 6378株である。これらの菌株については、菌種特異的DNA-プローブを用いて検討することにより、いずれもビフィドバクテリウム・ビフィダムに属する菌株であることが同定されている。これら菌株は、２００４年１０月２６日付（原寄託日）で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株については受託番号 NITE P-30として、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株については受託番号 NITE P-31として寄託された。これらの菌株は２００６年１月１８日付で原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託に移管され、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株については受託番号がNITE BP-30に、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株については受託番号がNITE BP-31に変更された。これらの菌株はまた、実施例に詳細に記載されている通り、上記のアッセイによって、分泌成分産生誘導能を有し、かつ、従来のビフィズス菌と比べて2〜5倍高いIgA産生誘導能とを有することが確認されている。なおこれらの菌株より得られる変異株なども、分泌成分産生誘導能と高いIgA産生誘導能を有する限り、本発明において好適に使用することができる。
本発明のビフィズス菌を培養するためには、ビフィズス菌の培養に通常用いられる培地を使用することができる。すなわち主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地ならばいずれの培地も使用可能であるが、システインやシスチンあるいはメチオニン等の含硫アミノ酸を添加せしめるとなお良好な生育が得られる。炭素源としてはラクトース、グルコース、スクロース、フラクトース、ガラクトース、廃糖蜜などが使用菌の資化性に応じて使用できる。窒素源としてはカゼインの加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物が使用できる。ほかに増殖促進剤として肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス等が用いられる。
本発明のビフィズス菌の培養は嫌気条件下で行えばよい。嫌気培養には炭素ガスを予め通気した培地中で培養する方法や、アネロパックやガスパック等、脱酸素剤を封入した嫌気ジャーなどの公知の手法を適用することができる。培養温度は一般に35〜40℃が好ましいが、菌が生育する温度であれば他の温度条件でも良い。培養開始時の培地のpHは5.0〜8.0に維持することが好ましい。免疫賦活用組成物の製造に用いる培養物を得るための培養時間は、通常10〜20時間が適当である。
2 免疫賦活用組成物
本発明では、上記のような本発明のビフィズス菌を含有する組成物を、免疫賦活用組成物として用いることができる。また、本発明のビフィズス菌に追加して、あるいはそれに代えて、本発明のビフィズス菌の処理物を含有する組成物を、免疫賦活用組成物として用いてもよい。本発明の免疫賦活用組成物は、腸管上皮細胞などの粘膜上皮細胞からの分泌成分の産生を誘導（促進）し、かつ、パイエル板細胞をはじめとする粘膜関連リンパ組織におけるIgA産生を高レベルに誘導（促進）する。
本発明では、上記のような本発明のビフィズス菌を含有する組成物を、免疫賦活用組成物として用いることができる。また、本発明のビフィズス菌に追加して、あるいはそれに代えて、本発明のビフィズス菌の処理物を含有する組成物を、免疫賦活用組成物として用いてもよい。本発明の免疫賦活用組成物は、腸管上皮細胞などの粘膜上皮細胞からの分泌成分の産生を誘導（促進）し、かつ、パイエル板細胞をはじめとする粘膜関連リンパ組織におけるIgA産生を高レベルに誘導（促進）する。
本発明の免疫賦活用組成物は、適量を添加することにより、例えば病原体の感染抑制等の免疫賦活作用を、飲食品や医薬組成物に付与することができる。この免疫賦活用組成物は、限定するものではないが、液体状、ゲル状、粉末状、顆粒状、固形状、カプセル状、又はタブレット状等の任意の形態であってよい。
本発明の免疫賦活用組成物に用いる本発明のビフィズス菌は、生菌体であっても死菌体であってもよく、湿潤菌であっても乾燥菌であってもよい。なお本明細書において用語「ビフィズス菌」は、ビフィズス菌の菌株と菌体のいずれをも意味する。
本発明においてビフィズス菌の「処理物」としては、限定するものではないが、例えばビフィズス菌の懸濁物（懸濁液）、培養物（菌体、培養上清および培地成分を含む）、培養上清（培養物から固形分を除去したもの）、発酵物（生乳、脱脂粉乳または豆乳などを、ビフィズス菌発酵させたもの；ヨーグルトなど）、加熱処理物、滅菌処理物（例えば、放射線殺菌したもの）、破砕物（例えば、超音波破砕物）、濃縮物、ペースト化物、乾燥物（例えば、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物など）液状物、および希釈物が挙げられる。
本発明においてビフィズス菌の「処理物」はまた、培養物または発酵物を濃縮して濃縮物としたものでもよく、その濃縮物をさらに乾燥して菌体濃度を乾燥物1gあたり1010個以上としたものでもよい。この濃縮物の乾燥は、通常の手法、例えば真空乾燥、噴霧乾燥、または凍結乾燥等により行うことができる。
本発明のビフィズス菌の処理物に含まれる最高菌体数は特に限定されないが、通常、濃縮物で約4×1010個／g、乾燥物で約5×1011個／g程度である。
本発明のビフィズス菌は、死菌体もまたパイエル板細胞からのIgA産生を顕著に誘導できることから（実施例参照）、ビフィドバクテリウム・ビフィダムのビフィズス菌の細胞壁にIgAの産生誘導を活性化する成分が含まれるものと考えられた。ただし本発明は、このような理論によって拘束されるものではない。
ところで、消化管内へ分泌された分泌成分は、単独で感染性大腸菌や毒素原性クロストリジウム菌体に結合しこれら病原菌の感染を抑制すると考えられている（J. Med. Biol. 1995, 42: 3-9；J. Med. Microbiol. 1998, 47: 879-888）。従って本発明の免疫賦活用組成物は、分泌成分の産生を促進することにより、感染性大腸菌や毒素原性クロストリジウム菌などの感染性病原体の感染のリスクを低減する効果を有する。
一方で、腸管粘膜上皮細胞から生体外（腸管腔内）への分泌型IgAの産生には、腸管粘膜における形質細胞からのIgA産生と腸管上皮細胞における分泌成分の産生の両方が重要な役割を果たすことが知られている。実際、分泌成分の遺伝子を欠損させた実験動物では、本来腸管腔に分泌されるべきIgAが血清中に蓄積する（J Exp Med 1999; 190: 915-22）。分泌成分の発現には環境からの刺激が関与することも示唆されており、栄養失調による分泌成分の発現低下が報告されている（Lab Invest 1998; 78: 1255-66）。本発明の免疫賦活用組成物は、分泌成分産生誘導能を示し、かつ高いIgA産生誘導能を有することから、例えば簡便な経口投与によって、分泌型IgAの産生を促進することができると考えられる。
本発明は、本願発明に係る免疫賦活用組成物を被験体に投与（好ましくは経口投与）することにより、被験体の免疫力を向上させる方法にも関する。この方法では、投与を受けた被験体において、好ましくは、分泌成分の産生とIgAの産生の両方が促進され、その結果、分泌型IgAの産生が促進される。この方法において免疫賦活用組成物を投与する被験体は、後述の医薬組成物の投与対象と同じである。好適な被験体の例としては、妊産婦、授乳婦、乳幼児、高齢者、免疫機能の低下した患者などが挙げられる。本願の免疫賦活用組成物の投与量は、後述の医薬組成物の投与量に従うことができる。
3. 免疫賦活用組成物を含有する飲食品
本発明は、分泌成分産生誘導能および高いIgA産生誘導能を有するビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するビフィズス菌および／またはそのビフィズス菌の処理物を含有する免疫賦活用組成物を添加した、飲食品にも関する。本明細書において「飲食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品および機能性食品を包含する。
本発明は、分泌成分産生誘導能および高いIgA産生誘導能を有するビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するビフィズス菌および／またはそのビフィズス菌の処理物を含有する免疫賦活用組成物を添加した、飲食品にも関する。本明細書において「飲食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品および機能性食品を包含する。
本発明の免疫賦活用組成物を含む飲食品は、特に限定されない。例えば本発明の免疫賦活用組成物を含む飲料として、発酵乳（ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、お茶系飲料（緑茶、紅茶およびウーロン茶など）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどうなどの果汁や、トマト、ニンジンなどの野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワインなど）、炭酸飲料および清涼飲料等の飲料を例示することができる。各種飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新・ソフトドリンクス」(2003)（株式会社光琳）等を参考にすることができる。
また本発明の免疫賦活用組成物を含む食品は、特に限定されず、生鮮食品であってもよいし、加工食品であってもよい。例えば、プリン、ゼリー、アイスクリーム類、ケーキ、キャンディ、パスタ、うどん、かまぼこ、ハム、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、豆腐、スープ、パン、魚の切り身、加工肉、野菜、きのこなどの様々な食品を例示することができる。本発明において特に好適な食品としては、本発明のビフィズス菌を生きたまま腸まで届けることが可能な発酵乳や乳酸菌飲料が挙げられる。
本発明の免疫賦活用組成物を含有する飲食品として、機能性食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ[特定保健用食品]を含む）および栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセルおよび液剤などの各種剤形のもの）および美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。
本発明の機能性食品として好ましいより具体的な例には、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品等の特別用途食品がある。本発明の免疫賦活用組成物は、副作用の恐れがほとんどなく広範な病原体等に対して比較的非特異的な免疫応答を全身的に惹起できる腸管免疫を増強可能であるため、免疫機能の発達が未熟な乳幼児のための調製粉乳または液体調製乳における使用（例えば、通常の乳幼児用調製乳の原料に添加すればよい）や、授乳婦用粉乳等の妊婦用または授乳婦用食品ならびに免疫機能の低下した高齢者や病者のための高齢者用食品および病者用食品における使用は特に好適である。
本発明の好適な機能性食品としては、さらに、免疫機能の発達が未熟な乳幼児のための乳幼児用サプリメント、ならびに免疫機能の増強や回復を目的とする、妊産婦・授乳婦用サプリメント、高齢者用サプリメントおよび病者用サプリメントが挙げられる。
本発明の免疫賦活用組成物を含有する機能性食品の好ましい例として、日本国法令に基づいて規定される保健機能食品が挙げられる。保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられた。この制度の下、保健機能食品は、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類の類型からなる。さらに、条件付きトクホ[特定保健用食品]等の新たな類型も含まれる。
本発明の機能性食品は、免疫賦活に有用であることが好ましい。本発明の機能性食品は、免疫機能の向上、好ましくは腸管免疫（粘膜免疫）の機能の向上を示す指標（例えば、IgA産生量の増加、分泌成分の産生量の増加、分泌型IgA量の増加、リンパ球数の増加など）によって、免疫賦活に有用であることが示されるものでもよい。本発明の機能性食品は、免疫賦活以外の用途を第一目的とするものでもよい。本発明の機能性食品（好ましくは、特定保健用食品または条件付きトクホ[特定保健用食品]）は、免疫賦活効果を有する旨あるいは免疫賦活と関連の深い指標をもたらす旨（分泌成分の産生量の増加など）について、記載または表示したものであってよい。免疫賦活効果を有する旨の記載または表示は、保健機能食品制度において定められた規定に基づいて表示承認されたものでありうる。例えば本発明の機能性食品においては、「低下した粘膜免疫機能を改善する」「感染防御能を高める」「風邪を引きにくくする」「身体の抵抗力を高める」などの記載が考えられる。
本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジェル剤などの製剤の形状であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、飲料、粉状茶葉、菓子など）であってもよい。
本発明の免疫賦活用組成物の飲食品への配合量は特に限定されず、場合に応じて様々であってよい。具体的な配合量は、飲食品の種類や求める味や食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。しかし通常は、添加される免疫賦活用組成物中のビフィズス菌および／またはそのビフィズス菌の処理物の総量が、0.001〜100質量％、特に0.1〜100質量％となるような免疫賦活用組成物の配合量が適当である。
本発明の免疫賦活用組成物は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって、飲食品に含有させればよい。例えば、本発明の免疫賦活用組成物を、液体状、ゲル状、固体状、粉末状または顆粒状に調製した後、それを飲食品に配合してもよい。あるいは本発明の免疫賦活用組成物を、飲食品の原料中に直接混合又は溶解してもよい。本発明の免疫賦活用組成物は、飲食品に塗布、被覆、浸透又は吹き付けてもよい。本発明の免疫賦活用組成物は、飲食品中に均一に分散させてもよいし、偏在させてもよい。本発明の免疫賦活用組成物を入れたカプセルなどを調剤してもよい。本発明の免疫賦活用組成物を、可食フィルムや食用コーティング剤などで包み込んでもよい。また本発明の免疫賦活用組成物に適切な賦形剤等を加えた後、錠剤などの形状に成形してもよい。本発明の免疫賦活用組成物を含有させた飲食品はさらに加工してもよく、そのような加工品も本発明の範囲に包含される。
本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤（亜硝酸ナトリウム等）、着色料（クチナシ色素、赤１０２等）、香料（オレンジ香料等）、甘味料（ステビア、アステルパーム等）、保存料（酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロイチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（ＥＤＴＡ二ナトリウム、ビタミンＣ等）、ｐＨ調整剤（クエン酸等）、化学調味料（イノシン酸ナトリウム等）、増粘剤（キサンタンガム等）、膨張剤（炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸カルシウム）等、結着剤（ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤（カルシウム強化剤、ビタミンＡ等）、賦形剤（水溶性デキストリン等）等が挙げられる。さらに、オタネニンジンエキス、エゾウコギエキス、ユーカリエキス、杜仲茶エキス等の機能性素材をさらに添加してもよい。
4. 免疫賦活用組成物を含有する医薬組成物
本発明は、分泌成分産生誘導能および高いIgA産生誘導能を有するビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するビフィズス菌および／またはそのビフィズス菌の処理物を含有する免疫賦活用組成物を有効成分として含有する、医薬組成物にも関する。
本発明は、分泌成分産生誘導能および高いIgA産生誘導能を有するビフィドバクテリウム・ビフィダムに属するビフィズス菌および／またはそのビフィズス菌の処理物を含有する免疫賦活用組成物を有効成分として含有する、医薬組成物にも関する。
本発明の医薬組成物には、医薬製剤上許容される担体又は添加物を配合してもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リポゾームなどの人工細胞構造物などが挙げられる。使用される添加物は、製剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択される。本発明の医薬組成物は、さらに他の薬理成分を含有していてもよい。
本発明の医薬組成物は、経口的又は非経口的に投与することができるが、特に経口的に投与することが好ましい。経口的に投与される本発明の医薬組成物は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、ジェル剤、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等の剤形であってよい。液体製剤として用いる場合には、本発明の医薬組成物を使用する際に再溶解させることを意図した乾燥物として供給してもよい。
上記剤形のうち経口用固形製剤は、薬学上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有してもよい。また、経口用液体製剤は、薬学上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有してもよい。
本発明の医薬組成物は、免疫賦活作用を発揮することが好ましい。本発明の医薬組成物は、他の薬理物質を含む別の治療用途のための医薬組成物に、免疫賦活作用を追加したものであってもよい。あるいは本発明の医薬組成物は、好ましくは免疫賦活剤である。
本発明の医薬組成物は、粘膜免疫系におけるIgA産生量を格段に増加させ、かつ分泌成分の産生量を増加させて、免疫系、特に粘膜免疫系を強化することができる。本発明の医薬組成物は、例えば、病原体の感染に対する防御能を高めることを目的として使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢および体重、投与経路、投与回数により異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。例えば、経口的に投与する場合には、医薬組成物中の免疫賦活用組成物に含まれるビフィズス菌および／またはそのビフィズス菌の処理物の投与量は、1〜1000mg/kg/dayが適当である。本発明の医薬組成物は、単回投与でもよいが、6〜8時間の間隔で反復的に投与してもよい。
本発明の医薬組成物を投与する対象は、ヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物である。特に、免疫機能が未発達な乳幼児期の哺乳動物、加齢または病気などにより免疫機能の低下した哺乳動物、体質的または環境的に免疫機能が低下しやすい哺乳動物が、本発明の医薬組成物を投与する対象として好ましい。本発明の医薬組成物は、副作用の心配が少ないことから、継続的に利用する上で非常に有用に用いることができる。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明の技術的範囲はこれらにより限定されるものではない。
[実施例１]ビフィズス菌のIgA産生誘導能の測定
1. ビフィズス菌の調製
Bifidobacterium longum OLB 6001株（受託番号 FERM P-13610）、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）、Bifidobacterium breve株（受託番号FERM BP-2824）およびBifidobacterium bifidum MEP170212（以前の名称：Bifidobacterium bifidum #1(明冶)株；本菌株は明治乳業株式会社(日本)が保有している）を、それぞれ、グルコースをラクトースに変更して調製した嫌気EG培地で37℃にて一夜培養した。なお嫌気EG培地は以下の組成に従って調製した。
1. ビフィズス菌の調製
Bifidobacterium longum OLB 6001株（受託番号 FERM P-13610）、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）、Bifidobacterium breve株（受託番号FERM BP-2824）およびBifidobacterium bifidum MEP170212（以前の名称：Bifidobacterium bifidum #1(明冶)株；本菌株は明治乳業株式会社(日本)が保有している）を、それぞれ、グルコースをラクトースに変更して調製した嫌気EG培地で37℃にて一夜培養した。なお嫌気EG培地は以下の組成に従って調製した。
嫌気EG培地の組成
40.0 g (1リットル当たり)
肉エキス・・・・・・・・・・2.6 g
プロテオーゼペプトン・・・・10.0 g
酵母エキス・・・・・・・・・5.0 g
リン酸一水素ナトリウム・・・4.0 g
ラクトース・・・・・・・・・1.5 g
溶性デンプン・・・・・・・・0.5 g
Ｌ−シスチン・・・・・・・・0.2 g
Ｌ−システイン塩酸塩・・・・0.5 g
消泡剤（シリコン）・・・・・0.2 ｇ
ポリソルベート８０・・・・・0.5 g
カンテン・・・・・・・・・ 15.0 g
pH 7.7
得られた培養物中の菌体を冷PBS(-)で2回洗浄した後、少量のPBS(-)に懸濁し、等量の8%-ホルマリン-PBSに懸濁して菌体を固定した。この固定した菌体から、IgA産生誘導能の測定実験を行う当日に冷PBS(-)で洗浄することによりホルマリンを除去した後、菌液をPBSに懸濁して660 nmでの濁度が1.6となるように菌液濃度を調整した。こうして得られた菌液をホルマリン処理済ビフィズス菌液と呼ぶこととした。
40.0 g (1リットル当たり)
肉エキス・・・・・・・・・・2.6 g
プロテオーゼペプトン・・・・10.0 g
酵母エキス・・・・・・・・・5.0 g
リン酸一水素ナトリウム・・・4.0 g
ラクトース・・・・・・・・・1.5 g
溶性デンプン・・・・・・・・0.5 g
Ｌ−シスチン・・・・・・・・0.2 g
Ｌ−システイン塩酸塩・・・・0.5 g
消泡剤（シリコン）・・・・・0.2 ｇ
ポリソルベート８０・・・・・0.5 g
カンテン・・・・・・・・・ 15.0 g
pH 7.7
得られた培養物中の菌体を冷PBS(-)で2回洗浄した後、少量のPBS(-)に懸濁し、等量の8%-ホルマリン-PBSに懸濁して菌体を固定した。この固定した菌体から、IgA産生誘導能の測定実験を行う当日に冷PBS(-)で洗浄することによりホルマリンを除去した後、菌液をPBSに懸濁して660 nmでの濁度が1.6となるように菌液濃度を調整した。こうして得られた菌液をホルマリン処理済ビフィズス菌液と呼ぶこととした。
2. ビフィズス菌のパイエル板細胞からのIgA産生誘導能の測定
8週齢のBALB/Cマウス（メス）を炭酸ガス気流下に50秒間さらすことにより殺し、無菌的に切り出された小腸からパイエル板を採取した。このパイエル板を少量の2％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地（Gibco）中に取り出し、Suzukiらの方法（スライド法；Bifidobacteria Microflora, 9: 87-98, 1990）を一部改変してパイエル板細胞を調製した。すなわち、採取したパイエル板を少量の2％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地（Gibco社）を入れたシャーレ上に取り出し、解剖用のメスの刃で切り刻み、プラスチックシリンジの柄（テルモ社）を用いて徐々に押しほぐした。こうして得られた細胞懸濁液を150ゲージの滅菌ステンレス鋼ふるいを通過させ、さらに2％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地にて2回洗浄した。細胞を適当量の2％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地に再懸濁し、T細胞およびB細胞を含むリンパ細胞群（パイエル板細胞）を得た。
8週齢のBALB/Cマウス（メス）を炭酸ガス気流下に50秒間さらすことにより殺し、無菌的に切り出された小腸からパイエル板を採取した。このパイエル板を少量の2％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地（Gibco）中に取り出し、Suzukiらの方法（スライド法；Bifidobacteria Microflora, 9: 87-98, 1990）を一部改変してパイエル板細胞を調製した。すなわち、採取したパイエル板を少量の2％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地（Gibco社）を入れたシャーレ上に取り出し、解剖用のメスの刃で切り刻み、プラスチックシリンジの柄（テルモ社）を用いて徐々に押しほぐした。こうして得られた細胞懸濁液を150ゲージの滅菌ステンレス鋼ふるいを通過させ、さらに2％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地にて2回洗浄した。細胞を適当量の2％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地に再懸濁し、T細胞およびB細胞を含むリンパ細胞群（パイエル板細胞）を得た。
得られたリンパ細胞群はRPMI-1640培地を2回交換して洗浄した後、トリパンブルーを用いて98％以上が生細胞であることを確認しつつ、96ウェルマイクロプレート（Falcon 3072）に1ウェル当たり5×105個にて播種した。なおこの96ウェルマイクロプレートは、各ウェルに予め抗CD3抗体（CEDARLANE, No.CL7202AP、使用濃度: 2.5μg/ml）を100μlずつ入れて、37℃で2時間保温し、その後200μl PBSで1回、次いで200μl FCS(-)RPMI培地で1回洗うことにより、予め抗CD3抗体でコーティングしておいたものを用いた。
さらに、リンパ細胞群を播種した96ウェルマイクロプレートに、上記「1. ビフィズス菌の調製」に従って調製した５菌株由来のホルマリン処理済ビフィズス菌液（濁度＝1.0）5μlを、それぞれ、３つのウェルに添加し、炭酸ガスインキュベーター内で37℃で5日間培養した。培養後の菌液から1400 rpm、10分の遠心分離によりリンパ細胞群を除いた培養上清をIgA量測定用試料とし、測定まで-80℃に保存した。次いでその培養上清試料中のIgA量を、Mouse IgA ELISA Quantitation Kit（Bethyl laboratories 社）を用いて、説明書に記載された方法に従って測定した。
一方、対照実験として、ホルマリン処理済ビフィズス菌液を添加しないこと以外は上記と同様にして、抗CD3抗体の共存下でリンパ細胞群を5日間培養し、その培養上清中のIgA量を同様に測定した。
以上によって測定された培養上清中のIgA濃度を表１に示す。
表１に基づき、図１には結果をグラフで示した。
図１のグラフ左側に示されるように、抗CD3抗体の共存下で上記リンパ球細胞群（パイエル板細胞）を５日間培養したところ、培養上清中にIgAが分泌された。このことは、抗CD3抗体の共存下で培養したパイエル板細胞において、IgA産生細胞（形質細胞）が分化してくることを確認するものである。
表１および図１のグラフ右側に示すように、本アッセイ系を用いることにより、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株およびBifidobacterium bifidum OLB 6378株のIgA産生誘導能は、IgA産生誘導能を有することが過去に報告されているBifidobacterium longum OLB 6001株（受託番号FERM P-13610）およびBifidobacterium breve株（受託番号FERM BP-2824）と比較して、2〜5倍大きいことが示された。
[実施例２]ビフィズス菌の分泌成分産生誘導能の測定I
1. ビフィズス菌破砕物の調製
Bifidobacterium bifidum OLB 6377株、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株、Bifidobacterium bifidum MEP170212（以前の名称：Bifidobacterium bifidum #1(明治)株；本菌株は明治乳業株式会社(日本)が保有している）およびBifidobacterium bifidum MEP170222（以前の名称：Bifidobacterium bifidum #2(明治)株；本菌株は明治乳業株式会社(日本)が保有している）のそれぞれを、実施例１と同様にして、グルコースをラクトースに変更して調製した嫌気EG培地において一夜培養した。次いで、得られた培養物中の菌体を冷PBS(-)で2回洗浄してから、PBS(-)中に10 mg/mlにて懸濁した。この懸濁物を75℃で60分間かけて加熱処理した後、超音波破砕機（BRANSON SONIFIER250、Duty cycle: 60%、Output control: 2 micro tip limit）にかけて、菌体破砕物を得た。
1. ビフィズス菌破砕物の調製
Bifidobacterium bifidum OLB 6377株、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株、Bifidobacterium bifidum MEP170212（以前の名称：Bifidobacterium bifidum #1(明治)株；本菌株は明治乳業株式会社(日本)が保有している）およびBifidobacterium bifidum MEP170222（以前の名称：Bifidobacterium bifidum #2(明治)株；本菌株は明治乳業株式会社(日本)が保有している）のそれぞれを、実施例１と同様にして、グルコースをラクトースに変更して調製した嫌気EG培地において一夜培養した。次いで、得られた培養物中の菌体を冷PBS(-)で2回洗浄してから、PBS(-)中に10 mg/mlにて懸濁した。この懸濁物を75℃で60分間かけて加熱処理した後、超音波破砕機（BRANSON SONIFIER250、Duty cycle: 60%、Output control: 2 micro tip limit）にかけて、菌体破砕物を得た。
2. ビフィズス菌破砕物によるHT-29細胞からの分泌成分産生誘導能の測定
ヒト腸管上皮細胞由来であるHT-29細胞を12ウェルプレートに3〜6×105個／ウェル程度になるように播種し、10％ウシ胎児血清を含むMcCoy's 5A培地（invitrogen社製）1.0 mlを加えた。翌日、上記「1. ビフィズス菌破砕物の調製」に従って調製した4菌株のビフィズス菌（Bifidobacterium bifidum OLB 6377株、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株、Bifidobacterium bifidum MEP170212およびBifidobacterium bifidum MEP170222）由来の菌体破砕物を、上記で調製した12ウェルプレートのそれぞれ３つのウェルの培地に、菌体破砕物濃度50〜500μg/mlになるように添加し、37℃で48時間培養した。対照実験には菌体破砕物の代わりにPBS(-)［CaおよびMgイオンを除去したDulbecco's Phosphate Buffered Saline］を用いた。得られた培養物から培養上清を採取し、培養上清中の分泌成分濃度をELISA法で測定した。このため、まずELISA プレートのウェルを、ヒト分泌成分に対するポリクローナル抗体（DAKO社、PBS(-)にて1000倍希釈して使用）を用いて4℃で一晩コーティングした後、0.01% tween 20加PBS(-)で洗浄し、次いで1% ウシ血清アルブミン(BSA)- PBS(-)を加えて室温にて１時間インキュベートしブロッキングした。次にこのプレートの各ウェルに、上記で得られた各培養上清の50μlをサンプルとして加え、室温で一時間インキュベートした。各ウェルを0.01% tween 20加PBS(-)で洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識した抗ヒト分泌成分抗体(DAKO社、1% BSA- PBS(-)にて1000倍希釈)を添加し、室温で30分間インキュベートした。次いで各ウェルを0.01% tween 20加PBS(-)で洗浄後、オルトフェニレンジアミン／過酸化水素水溶液100μlを各ウェルに入れ、30分間反応させた。反応後、2NH2SO4 20μlを添加して反応を停止させたのち、測定波長490nmで吸光度を測定した。測定結果は対照の分泌成分産生量を1としたときの相対値で示した。各群間の有意
差検定は、スチューデントt-検定により、危険率5%以下で有意差の有無を判定した。
ヒト腸管上皮細胞由来であるHT-29細胞を12ウェルプレートに3〜6×105個／ウェル程度になるように播種し、10％ウシ胎児血清を含むMcCoy's 5A培地（invitrogen社製）1.0 mlを加えた。翌日、上記「1. ビフィズス菌破砕物の調製」に従って調製した4菌株のビフィズス菌（Bifidobacterium bifidum OLB 6377株、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株、Bifidobacterium bifidum MEP170212およびBifidobacterium bifidum MEP170222）由来の菌体破砕物を、上記で調製した12ウェルプレートのそれぞれ３つのウェルの培地に、菌体破砕物濃度50〜500μg/mlになるように添加し、37℃で48時間培養した。対照実験には菌体破砕物の代わりにPBS(-)［CaおよびMgイオンを除去したDulbecco's Phosphate Buffered Saline］を用いた。得られた培養物から培養上清を採取し、培養上清中の分泌成分濃度をELISA法で測定した。このため、まずELISA プレートのウェルを、ヒト分泌成分に対するポリクローナル抗体（DAKO社、PBS(-)にて1000倍希釈して使用）を用いて4℃で一晩コーティングした後、0.01% tween 20加PBS(-)で洗浄し、次いで1% ウシ血清アルブミン(BSA)- PBS(-)を加えて室温にて１時間インキュベートしブロッキングした。次にこのプレートの各ウェルに、上記で得られた各培養上清の50μlをサンプルとして加え、室温で一時間インキュベートした。各ウェルを0.01% tween 20加PBS(-)で洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識した抗ヒト分泌成分抗体(DAKO社、1% BSA- PBS(-)にて1000倍希釈)を添加し、室温で30分間インキュベートした。次いで各ウェルを0.01% tween 20加PBS(-)で洗浄後、オルトフェニレンジアミン／過酸化水素水溶液100μlを各ウェルに入れ、30分間反応させた。反応後、2NH2SO4 20μlを添加して反応を停止させたのち、測定波長490nmで吸光度を測定した。測定結果は対照の分泌成分産生量を1としたときの相対値で示した。各群間の有意
差検定は、スチューデントt-検定により、危険率5%以下で有意差の有無を判定した。
上記測定においてBifidobacterium bifidum OLB 6377株の菌体破砕物を、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/mlと量を変化させて培地に添加した場合の、分泌成分の測定結果を表２および図２に示す。
この結果、菌体破砕物を50μg/mlで添加した場合でも、すでに対照と比べて約1.4倍の分泌成分産生量の増加が見られた。そして菌体破砕物の用量を増加させても分泌成分産生量の増加は同程度であった（図２）。
なおこの結果は、本発明のビフィズス菌が、75℃で60分間加熱処理を行って不活性化した菌体の破砕物でも分泌成分産生の促進効果があることも示した。
また上記測定においてBifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を500μg/mlにて培地に添加した場合の分泌成分の測定結果を、表３および図３に示す。
このようにBifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を500μg/mlにて添加した場合、対照と比べて約2.5倍の分泌成分産生量の増加が見られた。
さらに、上記測定においてBifidobacterium bifidum MEP170212およびBifidobacterium bifidum MEP170222の菌体破砕物を、250μg/mlおよび500μg/mlにて培地に添加した場合の分泌成分の測定結果を、表４および図４に示す。
図４に示されるように、Bifidobacterium bifidum MEP170212およびBifidobacterium bifidum MEP170222では、250μg/mlという比較的高濃度でも分泌成分産生量の増加は認められなかった。このことは、Bifidobacterium bifidumに属するビフィズス菌が必ずしも分泌成分産生を増強する能力を有するわけではないことを示している。
[実施例３]ビフィズス菌破砕物で処理した小腸および大腸器官培養組織における分泌成分遺伝子発現量の測定
出産された後24時間以内のBALB/cマウスから回腸および近位大腸を摘出し、器官培養したものを検討に用いた。すなわち、回腸および近位大腸を輪切りにして幅約2〜4mmの組織片を調製した。組織片をガラス濾紙上でシート状に縦方向に切り開き、筋板側の面をガラス濾紙に密着させた。作成した組織シートを48ウェルプレートに入れ、100 U/mlペニシリン（萬有製薬）、0.1 mg/mlストレプトマイシン（明治製菓）、0.05 mg/ml ゲンタマイシン（LIFE TECHNOLOGIES）、および10%ウシ胎児血清入りのRPMI培地（日水製薬）0.5mlを加えた。
出産された後24時間以内のBALB/cマウスから回腸および近位大腸を摘出し、器官培養したものを検討に用いた。すなわち、回腸および近位大腸を輪切りにして幅約2〜4mmの組織片を調製した。組織片をガラス濾紙上でシート状に縦方向に切り開き、筋板側の面をガラス濾紙に密着させた。作成した組織シートを48ウェルプレートに入れ、100 U/mlペニシリン（萬有製薬）、0.1 mg/mlストレプトマイシン（明治製菓）、0.05 mg/ml ゲンタマイシン（LIFE TECHNOLOGIES）、および10%ウシ胎児血清入りのRPMI培地（日水製薬）0.5mlを加えた。
続いて、上記実施例２の「１．ビフィズス菌破砕物の調製」にしたがって調製したB. bifidum OLB 6378株由来の菌体破砕物を、上記で調製した48ウェルプレートのそれぞれ3つのウェルの培地に、菌体破砕物濃度500μg/mlになるように添加し、37℃で18時間培養した（n=3）。対照実験には菌体破砕物の代わりにPBS(-)を用いた（n=3）。
培養完了後、RNA精製キット（QIAGEN、RNeasy mini kit）を用いて培養組織から総RNAを抽出し、それを鋳型としてオリゴdTプライマー（INVITROGEN）によりcDNAを調製した。さらにそのcDNAを鋳型とし、pIgR遺伝子（分泌成分遺伝子）に特異的なPCRプライマー（5'-AGGCAATGACAACATGGGG-3'（配列番号１）、および5'-ATGTCAGCTTCCTCCTTGG-3'（配列番号２））を用いるリアルタイムPCRを、LightCycler（Roche社）を用いて行い、cDNA中のpIgR遺伝子発現量を測定した。各試料について測定したpIgR遺伝子発現量は、ハウスキーピング遺伝子の１つであるGAPDH遺伝子（PCRプライマー、5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'（配列番号３）、および5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（配列番号４）を用いて同様の方法で検出）の発現量を利用して、以下の算出式に従って補正した。
pIgR遺伝子の相対発現量 ＝ pIgR遺伝子発現量 ／ GAPDH遺伝子発現量
以上のようにして算出されたpIgR遺伝子相対発現量に基づき、複数の実験サンプルからpIgR遺伝子の相対発現量の平均値を算出した結果を表５および図５に示す。
以上のようにして算出されたpIgR遺伝子相対発現量に基づき、複数の実験サンプルからpIgR遺伝子の相対発現量の平均値を算出した結果を表５および図５に示す。
図５中、白のバーが、対照実験でのpIgR遺伝子の相対発現量、黒のバーが、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を添加した場合のpIgR遺伝子の相対発現量を示す。各バーには標準偏差も示す。
表５および図５に示されるように、実施例２に従って調製したBifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を菌体破砕物濃度500μg/mlにて添加した場合、対照と比べて回腸（小腸の下部）で２．９倍、近位大腸（大腸の始めの部分）で２．４倍のpIgR遺伝子（分泌成分遺伝子）の遺伝子発現量の増加が見られた。大腸における増加はMann-WhitneyのU検定により有意（P < 0.05）な差が確認された。これらのことから、Bifidobacterium bifidumの菌体破砕物が、小腸および大腸において分泌成分遺伝子の発現を増強することが示された。
[実施例４]ビフィズス菌破砕物で処理した小腸および大腸器官培養組織における分泌成分遺伝子発現量、およびIRF-1遺伝子発現量のDNAマイクロアレイによる測定
胎生18日目のBALB/cマウスから回腸および近位大腸を摘出し、器官培養したものを検討に用いた。上記実施例３と同様に、回腸および近位大腸を輪切りにして幅約2〜4mmの組織片を調製した。組織片をガラス濾紙上でシート状に縦方向に切り開き、筋板側の面をガラス濾紙に密着させた。作成した組織シートを48ウェルプレートに入れ、100 U/mlペニシリン（萬有製薬）、0.1 mg/mlストレプトマイシン（明治製菓）、0.05 mg/ml ゲンタマイシン（LIFE TECHNOLOGIES）、および10%ウシ胎児血清入りのDMEM培地（Gibco）0.5mlを加えた。
胎生18日目のBALB/cマウスから回腸および近位大腸を摘出し、器官培養したものを検討に用いた。上記実施例３と同様に、回腸および近位大腸を輪切りにして幅約2〜4mmの組織片を調製した。組織片をガラス濾紙上でシート状に縦方向に切り開き、筋板側の面をガラス濾紙に密着させた。作成した組織シートを48ウェルプレートに入れ、100 U/mlペニシリン（萬有製薬）、0.1 mg/mlストレプトマイシン（明治製菓）、0.05 mg/ml ゲンタマイシン（LIFE TECHNOLOGIES）、および10%ウシ胎児血清入りのDMEM培地（Gibco）0.5mlを加えた。
続いて、上記実施例２の「１．ビフィズス菌破砕物の調製」にしたがって調製したB. bifidum OLB 6378株由来の菌体破砕物を、上記で調製した48ウェルプレートのそれぞれ3つのウェルの培地に、菌体破砕物濃度500μg/mlになるように添加し、37℃で18時間培養した。対照実験には菌体破砕物の代わりにPBS(-)を用いた（n=3）。
培養完了後、RNA精製キット（QIAGEN、RNeasy mini kit）を用いて培養組織から総RNAを抽出し、3つのウェルの総RNAをひとつにまとめて以下の測定に使用した。総RNAを鋳型としてGeneChip One-Cycle Target Labeling and Control Reagentsキット（Affymetrix社）を用いて断片化cRNAを合成した。すなわち、上記キットに含まれるGeneChip Expression 3’-Amplification Reagent One-Cycle cDNA Synthesis Kit（Affymetrix社）、およびGeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit（Affymetrix社）を用いてcDNAを合成した。次に、GeneChip Cleanup Module（Affymetrix社）を用いてcDNAを精製し、GeneChip Expression 3’- Amplification Reagent IVT labeling Kit（Affymetrix社）を用いてIn vitro転写反応を行った。GeneChip Cleanup Module（Affymetrix社）を用いてcRNAを精製した後、cRNAを断片化バッファー（Fragmentation buffer; Affimetrix社）によって断片化処理し、断片化cRNAを得た。断片化cRNAを用いてDNA Arrayシステム（Affymetrix社）による分析を行った。ここで用いたDNAアレイのプローブとしては、約36000種のマウス遺伝子を含むマウスゲノムMG U74Av2セット（Affymetrix社）を使用した。実験間の変動は遺伝子発現 対 内部コントロールの比を用いて補正した。各遺伝子の発現量に対するB. bifidum OLB 6378株での処理の効果を、対照実験（PBS(-)処理）における各遺伝子の発現量に対する比として表した。
その結果、小腸および大腸器官培養組織における分泌成分遺伝子（pIgR遺伝子）の発現量増加、および細胞内シグナル伝達因子であるIRF-1遺伝子の発現量増加が確認された（表６）。
表６に示されるように、実施例２に従って調製したBifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物を菌体破砕物濃度500μg/mlにて添加した場合、対照と比べて回腸（小腸の下部）で２．０倍、近位大腸（大腸の始めの部分）で６．１倍の分泌成分遺伝子（pIgR遺伝子）発現量の増加が見られ、実施例３の結果とほぼ一致した。さらに、Bifidobacterium bifidum OLB 6378株の菌体破砕物により、対照と比べて回腸で１．５倍、近位大腸（大腸の始めの部分）で４．０倍のIRF-1遺伝子発現量の増加が見られた。
IRF-1は分泌成分遺伝子の転写調節因子の１つであることが示されている（Blanch et al. J Immunol 1999, 162: 1232-1235）。したがって、B.bifidum OLB6378株を用いた処理による分泌成分遺伝子発現の誘導は、細胞内シグナル伝達経路を介して増強されることが示された。
[実施例５]ビフィズス菌の分泌成分産生誘導能の測定II
基本的には実施例２の方法に従って、ビフィズス菌Bifidobacterium bifidum OLB 6378株とBifidobacterium bifidum JCM 1255T株の分泌成分産生誘導能を測定し、比較した。なおBifidobacterium bifidum JCM 1255T株は、比較用の株として、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター 微生物材料開発室（JCM）（日本国埼玉県和光市広沢2-1）より入手した。
基本的には実施例２の方法に従って、ビフィズス菌Bifidobacterium bifidum OLB 6378株とBifidobacterium bifidum JCM 1255T株の分泌成分産生誘導能を測定し、比較した。なおBifidobacterium bifidum JCM 1255T株は、比較用の株として、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター 微生物材料開発室（JCM）（日本国埼玉県和光市広沢2-1）より入手した。
Bifidobacterium bifidum OLB 6378株とBifidobacterium bifidum JCM 1255T株は、実施例２の手順に従って一夜培養した後、冷PBS(-)で2回洗浄してからPBS(-)中に懸濁し、それを、実施例２の手順に従って調製したHT-29細胞を播いた培地（10％ウシ胎児血清を含むMcCoy's 5A培地（invitrogen社製））に菌体濃度500μg/mlとなる量で添加して、37℃で72時間培養した（n=2）。得られた培養物から48時間目および72時間目に培養上清を採取し、実施例２に記載の手順に従ってそれぞれの培養上清中の分泌成分濃度をELISA法で測定した。
なお対照実験では、菌体のPBS(-)中懸濁物の代わりにPBS(-)を上記培地に添加した（下記表７中、PBS(-)）。さらなる対照実験としては、上記培地に菌体のPBS(-)中懸濁物を添加せず、また代わりの物質も何も添加せずに培養した（下記表７中、培地のみ）。
この結果を表７および図６に示す。表７に示す分泌成分濃度はn=2の平均値である。
表７および図６に示すように、HT-29細胞は無刺激でも分泌成分を産生した。さらに、Bifidobacterium. bifidum OLB 6378株は、Bifidobacterium bifidum JCM 1255T株と比較しても顕著に多い量の分泌成分を産生誘導することができた。
本発明の免疫賦活用組成物は、分泌成分の産生を促進し、かつIgA産生を高度に促進することにより、とりわけ粘膜免疫系の機能を高めることができる。従って本発明の免疫賦活用組成物は、そのような免疫機能増強作用を飲食品や医薬組成物に付与する上で有用である。また本発明の免疫賦活用組成物を含む飲食品および医薬組成物は、免疫機能の低い患者、例えば乳幼児や高齢者、病者などにおいて用いるのに適している。また本発明の免疫賦活用組成物は、本発明のビフィズス菌の死菌体を使用して製造することができるので、育児用調製粉乳など生物学的規格を有する製品にも添加して使用することができ、製品形態などによらず様々な製品に利用可能である。
配列番号１〜４の配列はプライマーである。
Claims (7)
- 腸管上皮細胞における分泌成分産生量を少なくとも1.2倍に増加させる分泌成分産生誘導能を有するビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）に属するビフィズス菌および／または該ビフィズス菌の処理物を含有することを特徴とする、免疫賦活用組成物であって、該分泌成分は分泌型IgAを構成する成分であり、前記ビフィズス菌が、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）またはBifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）である、免疫賦活用組成物。
- 前記ビフィズス菌の処理物が、ビフィズス菌の懸濁物、培養物、培養上清、発酵物、加熱処理物、破砕物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物および希釈物からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１記載の免疫賦活用組成物。
- 請求項１または２記載の免疫賦活用組成物を含む飲食品。
- 乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健機能食品、サプリメント、発酵乳および乳酸菌飲料からなる群から選択される、請求項３記載の飲食品。
- 請求項１または２記載の免疫賦活用組成物を含む、医薬組成物。
- 免疫賦活用の飲食品または医薬組成物を製造するための、Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）またはBifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）の使用。
- 下記(a)または(b)のビフィズス菌。
(a) Bifidobacterium bifidum OLB 6377株（受託番号 NITE BP-30）
(b) Bifidobacterium bifidum OLB 6378株（受託番号 NITE BP-31）
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