JP2003201239A

JP2003201239A - 免疫賦活食品組成物

Info

Publication number: JP2003201239A
Application number: JP2002081842A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Nakamura; 吉孝中村; Shinya Nagabuchi; 真也永渕; Takeshi Takahashi; 高橋　　毅
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 2001-11-05
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2003-07-18

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、粘膜免疫賦活組成物および該組成
物の有効量を含有せしめた粘膜免疫賦活飲食品を提供す
ることを課題とする。【解決手段】難消化性のオリゴ糖の一種であるフラク
トオリゴ糖が腸管粘膜においてIgAおよびpIgR産生を増
強することを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、粘膜免疫賦活組成
物および該組成物の有効量を含有せしめた粘膜免疫賦活
飲食品に関する。

【０００２】

【従来の技術】気管支、消化管、泌尿生殖器系の粘膜面
には、細菌、ウイルスなどの微生物や食物タンパクをは
じめとする多くの外来抗原に対し、生体を防御するため
の分泌型IgAを主体とする強力な粘膜免疫機構が存在す
る。分泌型IgAは血清中のIgAとは異なり、J鎖を含んだ
二量体（dimeric IgA）と抗体分泌因子（pIgR：polymer
ic immunoglobulin receptor) の細胞外ドメイン（secr
etory component：SC）が結合した形で存在しており、
唾液、涙、鼻汁、乳汁、さらに気管支や腸管などの分泌
液中に多く存在している。このような粘膜面におけるリ
ンパ組織を粘膜関連リンパ組織とよび、IgA産生誘導に
おいて中心的な役割を演じている。腸管の代表的な粘膜
関連リンパ組織であるパイエル板（Peyer's patch）で
抗原刺激を受けた活性化B細胞が、全身の血液循環に沿
ってふたたび腸管のみならず外分泌腺や気管支・泌尿生
殖器系の粘膜面に分布し、IgA産生細胞である形質細胞
に分化してIgAを産生する。この一連のB細胞の活性化に
はヘルパーT細胞が産生するサイトカインが重要な役割
を演じている。このように、局所粘膜面での分泌型IgA
の産生は全身的な免疫応答とも関連している。そこで、
気管支、消化管、泌尿生殖器系の粘膜面に分泌型IgAの
産生を誘導・成立させる食品成分あるいは組成物は、生
体防御機構（自然免疫および獲得免疫）を増強すること
が期待できる。このようなIgA産生を亢進する食品成分
あるいは組成物として、例えば、乳果オリゴ糖およびそ
の組成物が提案されている（特開2001-64181）。また、
ラクチュロースを経口摂取したラットは盲腸粘膜のIgA
呈示リンパ球比率が増加し、血清中のIgAは低下傾向を
示したとの報告がある〔Kudoh, K. et al.: J. Nutr. S
ci. Vitaminol. (Tokyo), 45: 173, 1999〕。しかしな
がら、これらの評価はこれからである。そこで、粘膜免
疫系を増強する作用を有する新たな免疫賦活組成物およ
び該組成物を含有せしめた粘膜免疫賦活飲食品の開発が
望まれている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、粘膜免疫賦活組成物および該組成物の有効量を含有
せしめた粘膜免疫賦活飲食品を提供することを課題とす
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】粘膜免疫実効組織で分泌
型IgAが産生されるためには、pIgRを介したIgAの上皮内
輸送が必要である。ヒトpIgRは小胞体内で分子量100 kD
aのタンパク質として合成され、Golgi装置で糖の添加を
受けて分子量120 kDaの糖タンパク質になり、涙腺、唾
液腺、乳腺などの腺房細胞や胃、腸、肝などの上皮細胞
の基底側細胞膜上に分布する。粘膜固有層の形質細胞よ
り産生・分泌されたJ鎖を含むdimeric IgAはpIgRに結合
後、細胞内を輸送され、管腔側細胞膜上で切断され、分
泌型IgAとして放出される。本発明者らは、難消化性の
オリゴ糖の一種であるフラクトオリゴ糖を経口摂取する
と、(1) 糞便中のIgA量が有意に増加する、(2) 腸管組
織中のIgA含量が有意に増加する、(3)腸管上皮細胞にお
いてpIgRの発現量が有意に増強する、(4) 糞便中IgA量
の増加が最大となる時期は腸管組織のIgA量およびpIgR
発現量の増加が最大となる時期とほぼ一致することか
ら、腸管組織のIgAおよびpIgRの発現増強を介して腸管
内へのIgA抗体分泌を促進する、（5）糞便中のコレラト
キシンに対する抗原特異的なIgA量が増加する、（6）パ
イエル板リンパ細胞からのIgA産生量が有意に増加する
ことを見出した。これらの結果は、フラクトオリゴ糖
は、腸管の代表的な粘膜関連リンパ組織であるパイエル
板において抗原特異的なIgA産生を誘導し腸管免疫を賦
活すること示したものである。すなわち、本発明は、（１）下記の一般式(I)で表されるフラクトオリゴ糖を
有効成分とする粘膜免疫賦活組成物。 Glucosyl(1→2)(fructosyl)_nβ(2→1)fructose (I)（式
中、nは、１〜３である。）（２）フラクトオリゴ糖がGlucosyl(1→2)fructosylβ
(2→1)fructose(1-ケストース)、Glucosyl(1→2)(fruct
osyl)₂β(2→1)fructose(ニストース)およびGlucosyl(1
→2)(fructosyl)₃β(2→1)fructose(1^F-β-フラクトフ
ラノシルニストース)の混合物である（１）の粘膜免疫
賦活組成物。（３）腸管上皮細胞におけるpolymeric Ig receptor（p
IgR）の産生増強作用を有する（１）または（２）の粘
膜免疫賦活組成物。（４）腸管粘膜における抗原特異的分泌型IgA産生増強
作用を有する（１）または（２）の粘膜免疫賦活組成
物。（５）感染症による感染を防御する作用を有する（１）
〜（４）のいずれかの粘膜免疫賦活組成物。（６）感染症が大腸菌感染症である（５）の粘膜免疫賦
活組成物。（７）（１）〜（６）のいずれかの粘膜免疫賦活組成物
の有効量を含有せしめた粘膜免疫賦活飲食品。（８）乳児用調製粉乳、高齢者用食品、保健機能食品、
栄養補助食品、または病者用食品である（７）の粘膜免
疫賦活飲食品。（９）有効量が0.5〜70重量%である（７）または（８）
の粘膜免疫賦活飲食品。（１０）有効量が１〜30g/日である（７）または（８）
の粘膜免疫賦活飲食品。（１１）（７）〜（１０）のいずれかの粘膜免疫賦活飲
食品を製造するための（１）〜（６）のいずれかの粘膜
免疫賦活組成物の使用。からなる。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明で用いるフラクトオリゴ糖
は、フラクトースが２分子以上連結した構造をもつオリ
ゴ糖で、一般式(I)で表される。 Glucosyl(1→2)(fructosyl)_nβ(2→1)fructose(I)（式
中、nは、１〜３である。）一般式(I)において、n=1のフラクトオリゴ糖として1-ケ
ストース（GF2）、n=2のフラクトオリゴ糖としてニスト
ース（GF3）、そしてn=3のフラクトオリゴ糖として1^F-
β-フラクトフラノシルニストース（GF4）があげられ
る。本発明の有効成分であるフラクトオリゴ糖は、主と
してGF2、GF3、およびGF4の混合物である。構成比（重
量）は、グルコースおよびショ糖が0〜5%、GF2が29〜41
%、GF3が44〜56%、GF4が6〜14%である。現在、フラクト
オリゴ糖はショ糖を原料とし、転移酵素（Aureobacidiu
m、Aspergillusなどのカビのβ-fructo-furanosidase）
を用いて大量生産され、市販されている。例えば、メイ
オリゴ^R（明治製菓、日本）、ACILIGHT^R（Beghin Meiji
-France）、NUTRAFLORA^R（GTC Nutrition Company-U.S.
A）があげられる。

【０００６】本発明では、後述する試験例において、明
治製菓のメイオリゴP（単糖：2%、ショ糖：3%、GF2：35
%、GF3：50%、およびGF4：10%の混合物で純度が95%以
上）が、腸管粘膜においてIgAおよびpIgR産生を誘導
し、結果、腸管免疫を賦活することが見出された。さら
にメイオリゴPが腸管免疫の活性化に重要な役割を果た
すパイエル板リンパ細胞からのIgA産生を促進するこ
と、このパイエル板リンパ細胞の活性化にはフラクトオ
リゴ糖の腸管内発酵産物であるプロピオン酸が関与する
ことを明らかにした。そこで、当業者は、本発明が動機
付けとなって、メイオリゴP以外の、その他のフラクト
オリゴ糖、あるいはこれらのフラクトオリゴを適宜組み
合わせたもの、さらには、腸管内発酵によりプロピオン
酸を生じるその他の様々な組成をもつ難消化性オリゴ
糖、難消化性食物繊維、あるいはそれらの混合物につい
て、腸管粘膜におけるIgA産生増強およびpIgR発現増強
を指標として、粘膜免疫賦活作用を検定・評価すること
が可能となった。そして、有効摂取量を決定することが
可能となった。したがって、このようにして得られる粘
膜免疫賦活組成物およびそれらの有効摂取量はいずれも
本発明に含まれるべきである。さらに、本発明の粘膜免
疫賦活組成物は、現在使用されている免疫賦活食品素
材、例えば、キノコ多糖体（きのこ由来β-グルカンな
ど）、キチン・キトサン、水溶性核酸（オリゴ核タンパ
ク）など、あるいはこれから開発される免疫賦活食品素
材と組み合わせて用いることによる相乗効果あるいは相
加効果が期待できる。免疫機構はB細胞や各種T細胞、ナ
チュラルキラー細胞、食細胞（マクロファージや好中
球）など多種の白血球によって担われている複雑かつ重
要な生体恒常性維持機構の１つであり、免疫監視機構あ
るいは生体防御機構ともよばれている。このような免疫
機構における食品成分の免疫賦活作用を検定・評価する
方法は多岐にわたり、万全の検定・評価系はない。これ
までにさまざまな免疫学的指標となりうるパラメーター
が報告されている。例えば、細胞増殖促進/阻害活性、
モノサイト/マクロファージ系細胞（例えばIL-1やTNFα
の産生促進活性検定）リンパ球系細胞、インターフェロ
ン-β産生促進および阻害、単核細胞のナチュラルキラ
ー活性および抗体依存性細胞傷害活性、発がんプロモー
ション促進/抑制活性、抗腫瘍活性、肥満細胞からのヒ
スタミン遊離活性および抑制活性、血球凝集性、赤血球
変形能および白血球活性度、培養細胞内外酵素系活性な
ど（村上浩紀, 上野川修一編：食品と生体防御. 講談社
サイエンティフィク, pp155, 1992）の検定評価系があ
げられる。当業者は、これらの系を適切に用いて、フラ
クトオリゴ糖の免疫賦活作用をさらに詳細に調べること
が可能である。

【０００７】フラクトオリゴ糖は、整腸作用に続き、カ
ルシウム・マグネシウムなどのミネラル吸収促進作用が
特定保健用食品の保健用として評価され、現在販売され
ている。したがって、その安全性は確立されており、ヒ
トによる試験でその有効性および有効量の確認が可能で
ある。例えば、１つの方法として、公知方法（例えば、
特開2001-64181公開公報の試験例１参照）に準拠するこ
とも考えられる。一般式(I)で表されるフラクトオリゴ
糖を免疫賦活組成物として用いる場合、それ自身（液状
または粉末状）で、また、他の活性物質と共に、あるい
は他の薬理学的な活性物質と共に用いることができる。
形態は、例えば、錠剤、もしくは被覆錠、カプセル、溶
液、シロップ、乳液または分散性粉末を包含する。摂取
量は、年齢、身体状態等に依存して変化するが、通常、
フラクトオリゴ糖として20〜300 mg/kg体重、好ましく
は20〜100 mg/kg体重と推定される。一般式(I)で表され
るフラクトオリゴ糖は、免疫機能の発達が未熟な乳幼児
の育児用調製粉乳やフォーロアップミルク、あるいは免
疫機能の低下した高齢者向けの食品にその有効量を添加
して免疫賦活飲食品とすることができる。また、保健機
能食品や病者用食品に適用することができる。保健機能
食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制
度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、
カプセル等の形状をした食品を対象として設けられたも
ので、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品
（規格基準型）の２種類の類型からなる。

【０００８】特に乳幼児へのフラクトオリゴ糖の投与
は、大腸のみならず小腸においてもIgAおよびpIgRの産
生を亢進することから、小腸へのIgA分泌促進を介して
経口的に摂取されるアレルギー物質ならびに病原性細菌
の生体内への侵入を抑制できると考えられる。したがっ
て、本特許はフラクトオリゴ糖によるIgA分泌促進を介
した感染防御ならびにアレルギーの予防に関する技術を
含む。また、消化管内へ分泌されたpIgRは単独で感染性
大腸菌や毒素原性クロストリジウム菌体に結合しこれら
病原菌の感染を抑制すると考えられている（J. Med. Bi
ol. 1995, 42: 3-9、J. Med. Microbiol. 1998, 47: 87
9-888）。したがって、本特許はフラクトオリゴ糖によ
るpIgR産生促進を介した感染性大腸菌ならびに毒素原性
クロストリジウム菌の感染防止に関する技術を含む。

【０００９】有効量は、動物実験から推定すると以下の
ようである。実施例１における試験期間中のマウス1匹
当たりのフラクトオリゴ糖の摂取量は6.5-11g/kg体重/
日であった。この数値からヒト成人に対する有効投与量
を外挿すると6.5-11g/日と推定される。また、米国FDA
（食品医薬品局）のGRAS（generally recognised as sa
fe）認定では、フラクトオリゴ糖の安全な摂取量の上限
として、成人で20g/日という数字が示されている（第一
回フラクトオリゴ糖国際シンポジウム、2001/7/3）。し
たがって、免疫賦活食品組成物を製造するための、フラ
クトオリゴ糖の食品中に含ませるべき有効量は、成人で
1-20g/日、好ましくは6.5-11g/日、と推定される。表１
に示した免疫賦活食品組成物（高齢者用流動食、約100k
cal/100ml）では、1日当たり500mlの摂取により、約10g
のフラクトオリゴ糖が摂取できる組成とした。粘膜免疫
賦活飲食品に含ませるフラクトオリゴ糖の有効量および
１日当たりの摂取量として、0.5〜70重量%および１〜30
g/日は参考となる（特開2001-64181）。

【００１０】

【表１】

【００１１】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明
するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものでは
ない。［実施例1］フラクトオリゴ糖によるIgA抗体の産生誘
導１．離乳マウスにおけるIgA抗体産生生後3週齢の離乳マウスに対するフラクトオリゴ糖のIgA
抗体の産生に対する影響を調べた。〈材料および方法〉実験動物は、雄性BALB/cマウスを3
週齢で購入（日本クレア社）したものを用いた。フラク
トオリゴ糖は、メイオリゴP（明治製菓株式会社：1-ケ
ストース、ニストース、1^F-β-フルクトフラノシルニス
トースの混合物、純度95%以上）を用いた。RPMI 1640は
Gibco 社（11875-093）、ウシ胎仔血清（FBS）は日本バ
イオテスト研究所、リポ多糖はSigma社（L6511）から購
入した。動物は対照群およびフラクトオリゴ糖群の2群
（1群5匹）に分けた。購入した日から試験終了日まで、
対照群には基本飼料（表２）を、フラクトオリゴ糖群に
は基本飼料にフラクトオリゴ糖を5%（w/w）添加した実
験飼料を自由摂取させた。飲水は水道水を自由摂取させ
た。

【００１２】

【表２】

【００１３】(1) 糞便中のIgA測定試料の調製試験開始27〜28日目にマウスを個別ケージに入れ24時間
分の糞便を集め凍結乾燥した。凍結乾燥した糞便に、50
倍量の0.01M リン酸緩衝液〔（50mMのEDTAおよび100μg
/mlの大豆トリプシンインヒビターを添加したもの(pH
7.4)〕を加え、ホモゲナイザーにより均質化した。遠心
処理（1800×g、15分間）して上清を回収し、IgA測定用
サンプルとした。 (2) パイエル板リンパ球からのIgA測定試料の調製飼育31日目にマウスを屠殺し、小腸（幽門部から回腸-
盲腸接合部まで）および大腸（盲腸-結腸接合部から肛
門まで）を摘出した。小腸からパイエル板を回収し（各
群5匹分）、Suzukiらの方法（Bifidobacteria Microflo
ra, 9: 87-98, 1990）によりリンパ細胞を調製した。リ
ンパ細胞はRPMI 1640で洗浄後、10%FBS、100μg/mlスト
レプトマイシン、100 U/mlペニシリンを含むRPMI 1640
に懸濁し、96ウェルマイクロプレート（Falcon 3072）
に1ウェル当たり5×10⁵個播種した。さらに、リポ多糖
（LPS）を0、または0.5μg/mlの濃度で培地に添加し
た。培養は1サンプルにつき4ウェルで行い、5% CO₂存在
下37℃で7日間培養した。7日目の培養上清を回収し、Ig
A測定用サンプルとした。 (3) 腸管組織中のIgA測定試料の調製摘出した大腸は縦に切り開いたのち、氷冷したPBSで十
分に洗浄し、-80℃で保存した。凍結した大腸に、プロ
テアーゼ阻害剤（1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid
e、5 mM EDTA、100μg/ml 大豆トリプシンインヒビタ
ー、100μg/ml ロイペプチン、100 KIU/ml アプロチニ
ン、以上和光純薬）を添加した20倍量の50 mMトリス塩
酸緩衝液 (pH 6.8) を加え、ホモゲナイザーで均質化
し、均質液をIgA測定用サンプルとした。 (4) IgAの測定糞便、パイエル板リンパ細胞の培養上清、大腸の上記測
定試料のIgAを、Pharmingen社の試薬カタログに記載さ
れている酵素免疫測定法にしたがって測定した。ラット
抗マウスIgAモノクローナル抗体（Pharmingen 556969)
を0.15M リン酸緩衝溶液（PBS）で500倍希釈し、96ウェ
ルマイクロプレート（Nunc 439454）の各ウェルに100μ
l入れ4℃で一晩静置した。各ウェルを0.1% Tweenを含む
0.01M PBS（以下の希釈や洗浄にはこのPBSを用いた）で
洗浄後、1% BSA溶液でブロッキングした。サンプルまた
はマウスIgA抗体の標準品（ICN社 643341）を適当な濃
度に希釈したものを各ウェルに100μl添加し4℃で一晩
インキュベートした。ウェルを洗浄後、ビオチン標識ラ
ット抗マウスIgAモノクローナル抗体(Pharmingen55697
8)を1万倍に希釈（0.1% Tweenを含む0.01M PBS）したも
のを100μl添加し、2時間インキュベートした（室
温）。洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプ
トアビジン(ZYMED 43-4322、1mg/ml)を1000倍に希釈
し、100μlを添加し１時間インキュベートした（室
温）。洗浄後、4-ニトロフェニルリン酸(東京化成工業
NO241)をジエタノールアミンバッファーで1mg/mlに溶
解し、100μlをウェルに添加し30分反応させた。5N Na
OH 25μlで反応を停止させた。測定波長405nm、対照波
長495nmにおける吸光度を測定した。各群間の有意差検
定はStudent's t-testにより、危険率5%以下で有意差の
有無を判定した。糞便中および大腸組織中のIgA含量を
表３に、パイエル板リンパ球のLPS非存在下における培
養上清中のIgA含量を図１に、そしてLPS存在下における
IgA含量を図（２）にそれぞれ示した。

【００１４】

【表３】

【００１５】〈結果および考察〉フラクトオリゴ糖摂取
群では、24時間当たりの糞便中IgA含量、および凍結乾
燥重量当たりの糞便中のIgA抗体が対照群に比較してい
ずれも顕著に増加した（表３）。また、大腸組織中のIg
A含量も有意に増加した（表３）。さらに、フラクトオ
リゴ糖群では、LPS（B細胞のマイトジェン）非存在下、
あるいは存在下（0.5μg/mL）でパイエル板リンパ細胞
のIgAの産生が顕著に増加した（図1および２）。これら
の結果から、フラクトオリゴ糖は、腸管の代表的な粘膜
関連リンパ組織であるパイエル板においてIgA産生を誘
導し腸管免疫を賦活することが明かとなった。２．離乳前のマウスにおけるIgA抗体産生生後２日目からマウスに対してフラクトオリゴ糖を与え
た場合のフラクトオリゴ糖のIgA抗体の産生に対する影
響を調べた。〈材料および方法〉実験動物は、SLC社のBALB/cマウス
を用いた。マウスはSLC社にて繁殖および飼育した。フ
ラクトオリゴ糖は、実施例１と同様のものを用いた。出
産後2日目に母および仔マウスを2群（1群あたり母マウ
ス1匹、仔マウス4〜6匹）に分け、対照母仔群には基本
飼料（実施例１と同じ）を、フラクトオリゴ糖母仔群に
は基本飼料にフラクトオリゴ糖を5%（w/w）添加した実
験飼料（実施例１と同じ）を自由摂取させた。飲水は水
道水を自由摂取させた。

【００１６】出産後23日目に当研究所の飼育施設にマウ
スを搬入し、同時に仔マウスを母マウスより離乳させ
た。仔マウスは離乳前と同じ飼料で引き続き飼育した。
23、30、38、および44日齢の仔マウスから小腸（幽門部
から回腸-盲腸接合部まで）および大腸（盲腸-結腸接合
部から肛門まで）を摘出した。摘出した小腸および大腸
は縦に切り開いたのち、氷冷したPBSで十分に洗浄し、-
80℃で保存した。さらに、30、38、および44日齢の仔マ
ウスについては屠殺2日前に24時間分の糞便を採取し凍
結乾燥した。また、35日齢の仔マウスの小腸からパイエ
ル板を個別に回収しリンパ細胞を調製した。 (1) パイエル板リンパ細胞におけるIgA産生測定実施例１の方法にしたがい、パイエル板リンパ細胞から
のIgA測定試料を調製し、培養上中のIgAを測定した（図
３および４）。 (2) 糞便中のIgA測定実施例１の方法にしたがい糞便中のIgAを測定した（図
５）。 (３) 腸管組織におけるIgA産生測定実施例１の方法にしたがい、腸組織中の総IgAを測定し
た。小腸組織中の総IgA含量を図６に、大腸組織中のそ
れを図７に、小腸組織重量当たりのそれを図８に、大腸
組織重量当たりのそれを図９にそれぞれ示した。（４）大腸組織中のpIgR発現量測定 30、38、および44日齢の仔マウスの小腸（二等分し空腸
および回腸とした）および大腸のpIgR含量をウェスタン
ブロッティング法により測定した。IgA測定用に調製し
た試料からD.J.Ahnenらの方法(J. Clin. Invest. 1986,
77: 1841-1848)により細胞膜画分を調製した。細胞膜
画分のタンパク質濃度を5mg/mlに調整した。該画分とバ
ッファー（6g/ml尿素、0.4g/ml Sodium dodecylsulfat
e、4mg/ml Bromo Phenol Blue、1M Tris-HCl(pH6.8)〕
とを等量ずつ混合し、100℃、5分間加熱処理後冷却し、
1/100量の2-Mercapto ethanolを添加したものをSDS-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用試料とし
た。ポリアクリルアミドゲル（BIO-RAD社、READY GELS
J、7.5%、No.161-J310）の各ウェルに、適当な濃度に希
釈した上記試料、または分子量マーカー（BIORAD社、16
1-0318、M.W. 7200〜203000）を10μl分注し、200Vで40
〜60分間、泳動を行った。泳動終了後、メタノールで活
性化させたPVDFメンブレン（ミリポア社、IPVH304FO）
にゲルを重ね転写装置にセットし、低温室にて50Vで2〜
3時間、または30Vで一晩の転写を行った。転写終了後、
メンブレンをブロッキング液（2%卵白アルブミン溶液）
につけ、振とう機で１時間反応させた。次にメンブレン
をウサギ抗マウス-pIgR抗体（日本大学歯学部茂呂周
教授より供与、J. Immunol. Methods. 1998, 214: 131-
139）と反応させた（室温2時間、または4℃一晩）。0.1
%のTriton X-100を含むトリス緩衝液でメンブレンを洗
浄後、パーオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体（Cappel
社、No.55676、ブロッキング液で5000倍に希釈）と反応
させた（室温2時間、または4℃一晩）。0.1%のTriton X
-100を含むトリス緩衝液でメンブレンを洗浄後、0.2mg/
ml ジアミノベンジジン、0.006% 過酸化水素水を含むト
リス塩酸緩衝液にメンブレンを入れ、5〜10分間発色さ
せた。メンブレンを蒸留水に入れ発色を停止した後、自
然乾燥させ保存した。メンブレン上に発色したバンドを
画像取り込み装置（Microtek社、ScanMakerII XE）によ
り画像データに変換し、画像解析ソフト（NIH Image、N
ational Institutes of Health, USA）を用いて各試料
のバンドの濃さを数値化した。対照群のバンドの濃さの
平均値を100とした時のフラクトオリゴ糖群の相対値と
して示した。空腸におけるpIgR発現量を図１０に、回腸
におけるそれを図１１に、そして大腸におけるそれを図
１２にそれぞれ示した。

【００１７】〈結果および考察〉離乳前の仔マウスにフ
ラクトオリゴ糖を投与したところ、仔マウスの消化管組
織におけるIgA抗体含量の増加およびpIgRの発現増強が
確認された。すなわち、小腸および大腸粘膜におけるIg
A抗体含量は、対照群に対してフラクトオリゴ糖群の方
が大きく、小腸では38および44日齢に、大腸では30、3
8、および44日齢において有意な差が確認された（図６
および７）。さらに、組織重量当たりのIgA抗体含量に
ついても、小腸では38および44日齢に、大腸では30およ
び38日齢において有意な増加が確認された（図８および
９）。一方、pIgRの発現については38および44日齢の回
腸、および38日齢の大腸において対照群に対してフラク
トオリゴ糖群で有意な増加が確認された（図１１および
１２）。さらに糞便中のIgA抗体含量もフラクトオリゴ
糖の投与により増加し、36日齢において有意な増加が確
認された（図５）。フラクトオリゴ糖の投与による糞便
中IgA抗体含量の増加が最大となる時期は、消化管組織
のIgA抗体含量およびpIgR発現量の増加が最大となる時
期とほぼ一致していた。したがって、フラクトオリゴ糖
の投与は消化管組織のIgA抗体含量およびIgA抗体の分泌
因子であるpIgRの発現増強を介して、消化管内へのIgA
抗体分泌を促進すると考えられた。さらに、フラクトオ
リゴ糖群では、LPS（B細胞のマイトジェン）非存在下、
あるいは存在下（0.5μg/mL）でパイエル板リンパ細胞
のIgAの産生が有意に増加した（図３および４）。［実施例２］プロピオン酸によるIgA抗体の産生誘導〈材料および方法〉実験動物は、SLC社の雄性BALB/cマ
ウスを用いた。マウスはSLC社にて繁殖および飼育し
た。プロピオン酸、酪酸、酢酸はいずれもナトリウム塩
を関東化学株式会社より購入した。基本飼料（実施例１
と同じ）を自由摂取させた7〜8週齢のマウスを実験に供
した。

【００１８】マウスの小腸からパイエル板を回収してリ
ンパ細胞を調製し、群毎にプールした。すなわち、10%
のウシ胎仔血清（FBS、日本バイオテスト研究所）を含
むRPMI1640（Gibco 11875-093）に4〜12匹のマウス小腸
から切り出したパイエル板を回収してひとつにまとめ、
Suzukiらの方法（Bifidobacteria Microflora, 9: 87-9
8, 1990）により、リンパ細胞を得た。得られたリンパ
細胞はRPMI 1640で洗浄後、10%FBS、100μg/mlストレプ
トマイシン、100 U/mlペニシリンを含むRPMI 1640に懸
濁し、96ウェルマイクロプレート（Falcon 3072）に1ウ
ェル当たり5×10⁵個を播種した。さらに、プロピオン
酸、酪酸、酢酸のナトリウム塩を300μMの濃度で培地に
添加した。対照には前述のFBS添加培地を用いた。培養
は1サンプルにつき4ウェルで行い、5% CO₂存在下37℃で
7日間培養した。7日目の培養上清を回収し、IgA濃度を
測定し、Tukey-Kramer検定により５％水準で有意差を検
討した。〈結果および考察〉プロピオン酸によりパイエル板から
のIgAの産生が有意に増加した（図13）。一方、同濃度
の酪酸および酢酸にはIgAの産生促進効果は無かった。
従って、フラクトオリゴ糖の投与によるパイエル板リン
パ細胞の活性化にはフラクトオリゴ糖の発酵産物である
プロピオン酸が関与すると考えられた。［実施例3］ 3週齢の離乳マウスを用いたフラクトオリ
ゴ糖によるコレラトキシン特異IgA抗体の産生誘導〈材料および方法〉実験動物は、雄性BALB/cマウスを3
週齢で購入（SLC社）したものを用いた。フラクトオリ
ゴ糖は、実施例1と同様のものを用いた。動物は対照群
およびフラクトオリゴ糖群の2群（1群7匹）に分けた。
購入した日から試験終了日まで、対照群には基本飼料
（表２）を、フラクトオリゴ糖群には基本飼料にフラク
トオリゴ糖を5%（w/w）添加した実験飼料を自由摂取さ
せた。飲水は水道水を自由摂取させた。コレラトキシン
の投与方法に関しては二川らの方法（J. Nutr. 1999, 1
29: 934-941）を参考にした。試験開始後14日目および2
8日目にコレラトキシン（LBL社、No.100）を胃ゾンデを
用いてマウス1匹当たり20μgを経口投与した。試験開始
34-35日目に24時間分の糞便を採取し、実施例１と同じ
方法でコレラトキシン特異IgA抗体の測定用サンプルを
調製した。〈コレラトキシン特異IgA抗体の測定〉コレ
ラトキシン（LBL社、No.100）を0.1M炭酸緩衝溶液(pH9.
6)で1μg/mlに稀釈し、96ウェルマイクロプレート（Nun
c 439454）の各ウェルに100μl入れ4℃で一晩静置し
た。各ウェルを0.1% Tweenを含む0.01M PBSで洗浄後、
1.5% BSA溶液でブロッキングした。サンプルを100倍に
稀釈したものを各ウェルに100μl添加し4℃で一晩イン
キュベートした。ウェルを洗浄後、ビオチン標識ラット
抗マウスIgAモノクローナル抗体(Pharmingen 556978)
を1万倍希釈したものを100μl添加し、2時間インキュベ
ートした（室温）。洗浄後（0.1% Tweenを含む0.01M PB
S）、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジ
ン(ZYMED 43-4322、1mg/ml)を1000倍希釈し、100μlを
添加し１時間インキュベートした（室温）。洗浄後、4-
ニトロフェニルリン酸(東京化成工業 NO241)をジエタ
ノールアミンバッファーで1mg/mlに溶解し、100μlをウ
ェルに添加し30分反応させた。5N NaOH 25μlを添加し
て反応を停止させたのち、測定波長405nm、対照波長495
nmで吸光度を測定した。群間の有意差検定はStudent's
t-testにより実施した。糞便中のコレラトキシン特異Ig
A抗体価を図14に示した。

【００１９】〈結果および考察〉対照群に対してフラク
トオリゴ糖群では、コレラトキシン特異IgA抗体価が増
加した（p=0.07）。したがって、フラクトオリゴ糖の摂
取は、抗原特異的なIgA抗体の産生を促進することが示
唆された。

【００２０】

【発明の効果】本発明により新たな免疫賦活組成物が提
供された。該免疫賦活組成物は乳児用調製粉乳、高齢者
用食品、保健機能食品（特定保健用食品および栄養機能
食品）、栄養補助食品または病者用食品にその有効量を
添加することにより免疫賦活飲食品を提供することを可
能とした。

【００２１】

【図面の簡単な説明】

【図１】フラクトオリゴ糖を摂取した生後３週齢のBA
LB/cマウスのパイエル板リンパ細胞をLPS非存在下5% CO
₂存在下37℃で7日間培養後の、培養上清中の総IgA濃度
を示す。

【図２】同上のLPS存在下におけるパイエル板リンパ
細胞培養上清中の総IgA量を示す。

【図３】フラクトオリゴ糖を離乳前から摂取したマウ
スの、LPS非存在下におけるパイエル板リンパ細胞培養
上清中の総IgA量を示す。有意差検定はStudent's t 検
定により５％水準で実施した。

【図４】同上のLPS存在下におけるパイエル板リンパ
球培養上清中の総IgA濃度を示す。

【図５】フラクトオリゴ糖を離乳前から摂取したマウ
スの、糞便中の総IgA含量示す。図中の符号（*）はStud
ent's t検定により対照群に対し5%水準で有意差がある
ことを示す。数値は平均値±SDで表示した。

【図６】フラクトオリゴ糖を離乳前から摂取した仔マ
ウスの小腸における総IgA量を示す。図中の符号（*）は
Student's t検定により対照群に対し5%水準で有意差が
あることを示す。数値は平均値±SDで表示した。

【図７】同上の大腸における総IgA量を示す。

【図８】フラクトオリゴ糖を離乳前から摂取した仔マ
ウスの小腸における組織重量当たりのIgA量を示す。図
中の符号（*）はStudent's t検定により対照群に対し5
%水準で有意差があることを示す。数値は平均値±SDで
表示した。

【図９】同上の大腸における組織重量当たりのIgA量
を示す。

【図１０】フラクトオリゴ糖を離乳前から摂取した仔
マウスの空腸におけるpIgR発現量を示す。図中の符号
（*）はStudent's t検定により対照群に対し5%水準で
有意差があることを示す。数値は対照群の平均値を100
としたときのフラクトオリゴ糖群の相対値で表し、平均
値±SDを表示した。

【図１１】同上の回腸におけるpIgR発現量を示す。

【図１２】同上の大腸におけるpIgR発現量を示す。

【図１３】７〜８週齢のBALB/cマウスのパイエル板リ
ンパ細胞を、300μMの濃度のプロピオン酸、酪酸、ある
いは酢酸のナトリウム塩の存在下、5% CO₂存在下37℃で
7日間培養後の培養上清中のIgA濃度を示す。図中の符号
はTukey-Kramer検定により異符号間で有意差（５％）が
あることを示す。

【図１４】フラクトオリゴ糖を摂取した３週齢のBALB
/cマウスの糞便中のコレラトキシン特異的IgA産生量を
示す。マウスは実験開始後14および28日目に20μgのコ
レラトキシンを経口投与した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 37/04 37/04 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｈ 3/06 Ｃ０７Ｈ 3/06 Ａ２３Ｌ 2/00 ＦＦターム(参考） 4B001 AC03 EC05 4B017 LC03 LK13 4B018 LB07 LB08 MD31 ME14 4C057 BB04 4C086 AA01 AA02 EA01 MA01 MA04 MA52 NA14 ZB09 ZB32 ZB35 ZC02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の一般式(I)で表されるフラクトオリ
ゴ糖を有効成分とする粘膜免疫賦活組成物。 Glucosyl(1→2)(fructosyl)_nβ(2→1)fructose (I)（式
中、nは、１〜３である。）
【請求項２】フラクトオリゴ糖がGlucosyl(1→2)fructo
sylβ(2→1)fructose(1-ケストース)、Glucosyl(1→2)
(fructosyl)₂β(2→1)fructose(ニストース)およびGluc
osyl(1→2)(fructosyl)₃β(2→1)fructose(1^F-β-フラ
クトフラノシルニストース)の混合物である請求項１記
載の粘膜免疫賦活組成物。
【請求項３】腸管上皮細胞におけるpolymeric Ig recep
tor（pIgR）の産生増強作用を有する請求項１または２
記載の粘膜免疫賦活組成物。
【請求項４】腸管粘膜における抗原特異的分泌型IgA産
生増強作用を有する請求項１または２記載の粘膜免疫賦
活組成物。
【請求項５】感染症による感染を防御する作用を有する
請求項１〜４のいずれか１項記載の粘膜免疫賦活組成
物。
【請求項６】感染症が大腸菌感染症である請求項５記載
の粘膜免疫賦活組成物。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項記載の粘膜免
疫賦活組成物の有効量を含有せしめた粘膜免疫賦活飲食
品。
【請求項８】乳児用調製粉乳、高齢者用食品、保健機能
食品、栄養補助食品、または病者用食品である請求項７
記載の粘膜免疫賦活飲食品。
【請求項９】有効量が0.5〜70重量%である請求項７記載
または８の粘膜免疫賦活飲食品。
【請求項10】有効量が１〜30g/日である請求項７または
８記載の粘膜免疫賦活飲食品。
【請求項11】請求項７〜10のいずれか１項記載の粘膜免
疫賦活飲食品を製造するための請求項１〜６のいずれか
１項記載の粘膜免疫賦活組成物の使用。