KR20200051016A - 장관 면역 항진제, 식품, 및 의약 - Google Patents
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Abstract
저용량으로, 장관에 있어서의 IgA 를 충분히 증가시킴과 함께, 증가한 IgA 의 양을 장기간 유지할 수 있는, 장관 면역 항진제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 아세틸 총 치환도가 0.4 이상 1.1 이하인 아세트산셀룰로오스를 함유하는, 장관 면역 항진제.
Description
본 발명은, 장관 면역 항진제, 식품, 및 의약에 관한 것이다.
당단백질의 일종인 면역 글로불린 (Immunoglobulin, Ig) 에는, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 등의 클래스가 있다. 그 중, IgA 는 포유류 및 조류에 존재한다. 특히, 타액, 누액, 콧물, 기도 점액, 소화관 분비액, 유즙 등의 외분비액 중에 함유되는 IgA 는, 분비형 IgA 로 여겨지고, 항원이나 미생물로부터 점막면을 방어하는 면역 기구의 최전선으로서 기능하고 있다.
소화관은, 항상 항원이나 미생물을 함유하는 많은 물질과 접하고 있어, 이들 항원이나 미생물이 생체 내에 침입하는 것을 방지할 필요가 있는 바, 특히 장관에서 분비되는 IgA 는, 점막면에 대한 세균이나 바이러스의 부착 방지, 및 외래 항원을 포착하여 체외로 배출하는 이물질 배제 등, 점막 면역 기능에 있어서 중요한 기능을 담당하고 있다. 장관에 있어서, IgA 의 분비를 촉진시키는 것은, 점막 면역 기능을 증강시키고, 감염증이나 알레르기 질환을 예방하는 등의 효과를 기대할 수 있는 점에서, IgA 분비 촉진 작용을 갖는 식품 등의 개발이 요망되고 있다.
비특허문헌 1 에는, 다음의 기재가 있다 (요지). 「난소화성 올리고당의 일종인 갈락토올리고당이 마우스의 면역계에 주는 영향을 검토하였다. 갈락토올리고당을 함유하는 사료를 자유 섭취시켜 BALB/c 마우스를 사육한 결과, 대변에 함유되는 총 IgA 의 양은 섭취 2 주일 후에 유의하게 증가하고, 그 후 컨트롤군과 동일한 정도로 저하되었다. 섭취 4 주일 후에 해부하여, 조제한 파이에르판 세포 배양액 및 대장 조직 추출액의 총 IgA 는, 갈락토올리고당군에서 증가하는 경향이 있었다.」
비특허문헌 2 에는, 다음의 취지의 기재가 있다 (Abstract). 락토수크로오스 (4G-β-D-갈락토실수크로오스, 이하 LS) 가, 장관 내에 있어서의 비피도박테리아 (Bifidobacteria) 의 증가를 위한 올리고당으로서 제안된다. 마우스에 LS 2 ％ 또는 5 ％ 첨가 사료를 4 일간 섭취시키고, 소장 점막의 면역 응답성을 조사한 결과, LS 2 ％ 또는 5 ％ 섭취군에서, 대변 및 맹장 내용물 중의 IgA 양이 유의하게 증가하였다.
특허문헌 1 에는, 난소화성의 올리고당의 일종인 프룩토올리고당이 장관 점막에 있어서 IgA 및 pIgR 산생을 증강시키는 것을 알아낸 것이 기재되어 있다.
특허문헌 2 에는, 난소화성 덱스트린을 경구 투여함으로써 유의한 IgA 분비 촉진 작용이 확인된 것이 기재되어 있다.
특허문헌 3 에는, 아세틸 총 치환도가 0.4 ∼ 1.1 인 아세트산셀룰로오스를 함유하는 것을 특징으로 하는 영양 조성물, 가축 사료, 지질 대사 개선제, 염증성 장질환 및/또는 면역 이상의 예방 및/또는 치료제, 암의 예방 및/또는 치료제, 비알코올성 지방성 간염의 예방 및/또는 치료제, 비만 및/또는 당뇨병의 예방 및/또는 치료제, 그리고 고콜레스테롤 혈증의 예방 및/또는 치료제가 기재되어 있다.
사토, 외 2 명,「갈락토올리고당이 마우스의 면역계에 주는 영향」, 일본 영양·식량 학회지, 2008년, 제61권, 제2호, p.79-88
Hino Keiko, 외 6 명,「Effect of Dietary Lactosucrose (4G-.BETA.-D-Galactosylsucrose) on the Intestinal Immune Functions in Mice」, Journal of Applied Glycoscience, 2007년, 제54권, 제3호, p.169-172
비특허문헌 1 에는, 갈락토올리고당을 함유하는 사료의 섭취에 의해, 마우스의 대장 조직 추출액 등의 총 IgA 가 증가하는 경향에 있었던 것이 기재되어 있지만, 그 사료 중에 갈락토올리고당이 5 중량％ 나 함유되는 용량을 요하고 있다 (p.80 우측란, Table 2). 또, 갈락토올리고당을 함유하는 사료의 섭취 2 주일째에 있어서, 그 사료를 섭취한 시험군의 분변 중 총 IgA 는 최대로 대상군의 2 배 정도가 되어, 유의차가 되고 있는 경우도 있지만, 섭취 3 주일째에서는, 대조군과 동일한 정도로 저하되어, 유의차가 되지 않았다 (p.81 우측란, Figure 1). 또한, 대장 조직 추출액 등을 분석하여, 총 IgA 가 많아지는 경향을 확인한 취지가 보고되어 있지만, 이들 효과는 유의차가 아닌 취지가 명기되어 있다 (p.81 우측란, Figure 2 및 3).
비특허문헌 2는, 락토수크로오스 첨가 사료의 섭취에 의해, 1 주일 후에는 마우스의 분변 중의 IgA 의 양이 대조의 군의 2 배 정도가 되었지만, 2 주일 후에는 크게 감소하고, 그 후에도 크게 증가하지 않는다 (Fig.1). 특히, 2 ％ 의 락토수크로오스 첨가 사료의 경우에는, 2 주일 후에 IgA 의 양이 크게 감소한 후, 거의 증가하지 않는다 (Fig.1).
특허문헌 1 에 있어서도, 프룩토올리고당을 5 ％ (w/w) 나 첨가한 실험 사료를 마우스에 섭취시켰던 것이 기재되어 있다. 그 사료를 섭취한 시험군의 36 일령의 마우스의 분변 중의 IgA 항체 함량은 대상군의 2 배 정도가 되어, 유의차가 되고 있지만 (도 5), 동일한 실험의 사육일수 28 일령 및 42 일령에서는 유의차가 되지 않았다 (도 5). 또, 시험군의 대장 전체의 IgA 항체 함량은 44 일령으로 대조군의 1.5 배 정도가 되어 유의차가 되고 있지만 (도 7), 대장 조직 중량당의 IgA 항체량은 유의차가 되지 않았다 (도 9). 또한, 프로테오박테리아문에 속하는 콜레라균에 대한 항콜레라톡신 특이 IgA 양을 조사한 결과로서 (도 14), 시험군과 대상군의 p 값은 0.07 로 위험률 5 ％ 이며 유의차는 되지 않았다.
특허문헌 2 에 있어서도, 컨트롤 사료에 난소화성 덱스트린을 5 질량％ 및 7.5 질량％ 나 배합한 사료로 마우스를 사육한 것이 기재되어 있다. 소화관 내용물 중 (도 1) 및 분변 중 (도 2) 의 IgA 가 증가한 것이 나타나 있지만, 실험에 사용한 마우스의 개체수는 나타나 있지 않고, 또, 유의차 검정의 결과도 나타나 있지 않고, 일부의 도면에서는 에러 바도 나타나 있지 않다 (도 1 ∼ 4). 또한, 에러 바가 나타난 도면에서는 오차 범위는 크다고 판독할 수 있고, 검정의 결과로서 유의차는 없었던 점에서 아무런 기재도 되지 않았던 것이 살펴진다. 따라서, 애당초 IgA 를 증가시키는 기술인지 아닌지 확률 통계적인 검증이 이루어져 있지 않다. 또한, IgA 의 기질 특이성도 조사되어 있지 않다.
특허문헌 3 에는, 아세틸 총 치환도가 0.4 ∼ 1.1 인 아세트산셀룰로오스가 기재되어 있지만, 장관 면역 항진제에 대해서는 기재도 시사도 되어 있지 않다.
종래의 갈락토올리고당, 락토수크로오스, 프룩토올리고당, 및 난소화성 덱스트린 등을 사용하는 방법에서는, 대장 등에 있어서의 IgA 를 증가시키기 위해, 상당히 높은 용량을 요한다. 높은 용량이 필요해지면, 인간이 하루에 접종하는 양으로 환산하면, 의약품으로서 경구 섭취하기에는 고통을 수반하는 것이나, 식품으로서 섭취하는 경우에는 통상적인 식사의 즐거움을 저해하는 것 등이 염려된다. 또, 종래의 방법에서는, 증가한 IgA 의 양을 장기간 유지할 수 없다. 또한, IgA 의 병원성 세균에 대한 친화성 (기질 특이성) 에 관한 설계가 되어 있지 않아, 병원성 세균에 대한 특이성이 낮다.
본 발명은, 저용량으로, 장관에 있어서의 IgA 를 충분히 증가시킴과 함께, 증가한 IgA 의 양을 장기간 유지할 수 있는, 장관 면역 항진제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 첫 번째는, 아세틸 총 치환도가 0.4 이상 1.1 이하인 아세트산셀룰로오스를 함유하는, 장관 면역 항진제에 관한 것이다.
상기 장관 면역 항진제에 있어서, 상기 아세트산셀룰로오스는, 하기 식으로 정의되는 조성 분포 지수 (CDI) 가 2.0 이하인 것이 바람직하다.
CDI ＝ (조성 분포 반치폭의 실측값)/(조성 분포 반치폭의 이론값)
조성 분포 반치폭의 실측값 : 아세트산셀룰로오스 (시료) 의 잔존 수산기를 모두 프로피오닐화하여 얻어지는 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 HPLC 분석하여 구한 조성 분포 반치폭
DS : 아세틸 총 치환도
DPw : 중량 평균 중합도 (아세트산셀룰로오스 (시료) 의 잔존 수산기를 모두 프로피오닐화하여 얻어지는 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 사용하여 GPC-광 산란법에 의해 구한 값)
본 발명의 두 번째는, 상기 장관 면역 항진제를 함유하는, 식품에 관한 것이다.
상기 식품에 있어서의 상기 아세트산셀룰로오스의 함유량이 0.1 중량％ 이상 5 중량％ 미만인 것이 바람직하다.
본 발명의 세 번째는, 상기 장관 면역 항진제를 함유하는, 의약에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 저용량으로, 장관에 있어서의 IgA 를 충분히 증가시킴과 함께, 증가한 IgA 의 양을 장기간 유지할 수 있는, 장관 면역 항진제를 제공할 수 있다.
도 1 은, 야생형 마우스의 분변 중의 IgA 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 4 주간 사육한 야생형 마우스의 분변 중의 IgA 결합 세균의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은, 4 주간 사육한 야생형 마우스의 장관의 각 부위에 있어서의 IgA 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 4 주간 사육한 야생형 마우스의 대장 점막 고유층의 IgA 산생 형질 세포의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 4 주간 사육한 단균 정착 마우스의 맹장 및 분변의 IgA 결합 세균의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 4 주간 사육한 야생형 마우스의 분변 중의 IgA 결합 세균의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은, 4 주간 사육한 야생형 마우스의 장관의 각 부위에 있어서의 IgA 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 4 주간 사육한 야생형 마우스의 대장 점막 고유층의 IgA 산생 형질 세포의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 4 주간 사육한 단균 정착 마우스의 맹장 및 분변의 IgA 결합 세균의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
[장관 면역 항진제]
본 개시에 관련된 장관 면역 항진제는, 아세틸 총 치환도가 0.4 이상 1.1 이하인 아세트산셀룰로오스를 함유하는 것이다. 여기서, 장관이란, 십이지장, 공장, 회장 등을 포함하는 소장, 그리고 맹장, 근위 결장, 원위 대장 등을 포함하는 대장을 의미한다. 또, 면역 항진으로는, IgA 를 증가시키는 것 등을 들 수 있고, 그 IgA 의 증가는, IgA 산생 형질 세포의 증가에 의한 것 등이 포함된다.
본 개시의 장관 면역 항진제를 섭취 또는 투여 (특히 경구) 함으로써, 장관 (특히 대장의 점막 고유층) 의 면역 글로불린 A (IgA) 산생 형질 세포가 증가하거나, 장관의 IgA 가 증가하거나, 증가한 IgA 의 양을 장기간 유지할 수 있는, 및/또는 IgA 의 프로테오박테리아문 세균에 대한 항원 항체 반응 특이성이 증대하는 점에서 장관 점막의 프로테오박테리아문 세균이 감소하는 등의 효과가 얻어진다. 프로테오박테리아문은 병원성 대장균, 살모넬라균, 비브리오균 등의 병원성 세균을 많이 포함하는 문이며, 대장 점막의 이들 세균이 감소함으로써, 장관이 병원성 세균으로부터 보호된다. 또한, 본 개시의 장관 면역 항진제는, 종래보다 저용량이어도 당해 효과가 얻어진다.
(아세트산셀룰로오스의 아세틸 총 치환도)
본 개시의 아세트산셀룰로오스는, 아세틸 총 치환도 (평균 치환도) 가 0.4 이상 1.1 이하이다. 아세틸 총 치환도가 이 범위이면 물에 대한 용해성이 우수하고, 이 범위를 벗어나면 물에 대한 용해성이 저하되는 경향이 된다. 아세트산셀룰로오스는 장내 세균에 의해 소화관 내에서 아세트산과 셀룰로오스로 분해되고, 셀룰로오스는 다시 올리고당이나 단당을 경유하여 아세트산 등의 단사슬 지방산으로 분해되는 것으로 생각된다. 이와 같은 과정에서 생성되는 아세트산 등의 대사 산물이나, 이와 같은 과정에서 아세트산셀룰로오스를 자화시키는 장내 세균이 IgA 산생 세포의 증가와 IgA 의 증가로 이어지는 것으로 생각된다. 아세트산셀룰로오스의 아세트산과 셀룰로오스로의 분해는 균체외 효소에 의해 발생하는 것으로 생각되므로, 물에 대한 용해성이 높은 아세트산셀룰로오스 쪽이 분해되기 쉽고, IgA 산생 세포의 증가와 IgA 의 증가를 촉진시키는 효과가 높다. 나아가서는 장관 면역 항진 효과가 높아지는 것으로 이어진다. 이와 같은 관점에서, 상기 아세틸 총 치환도의 바람직한 범위는 0.5 이상 1.0 이하이고, 더욱 바람직하다 범위는 0.6 이상 0.95 이하이다.
아세틸 총 치환도는, 아세트산셀룰로오스를 물에 용해시켜, 아세트산셀룰로오스의 치환도를 구하는 공지된 적정법에 의해 측정할 수 있다. 구체적으로는 다음과 같다.
아세틸 총 치환도는, ASTM : D-817-91 (셀룰로오스아세테이트 등의 시험 방법) 에 있어서의 아세트화도의 측정법에 준하여 구한 아세트화도를 다음 식으로 환산함으로써 구해진다. 이것은, 가장 일반적인 셀룰로오스아세테이트의 치환도의 구하는 방법이다.
DS ＝ 162.14 × AV × 0.01/(60.052 － 42.037 × AV × 0.01)
DS : 아세틸 총 치환도
AV : 아세트화도 (％)
먼저, 건조된 아세트산셀룰로오스 (시료) 500 ㎎ 를 정밀 칭량하고, 초순수와 아세톤의 혼합 용매 (용량비 4 : 1) 50 ㎖ 에 용해시킨 후, 0.2N-수산화나트륨 수용액 50 ㎖ 를 첨가하고, 25 ℃ 에서 2 시간 비누화시킨다. 다음으로, 0.2N-염산 50 ㎖ 를 첨가하고, 페놀프탈레인을 지시약으로 하여, 0.2N-수산화나트륨 수용액 (0.2N-수산화나트륨 규정액) 으로, 탈리된 아세트산량을 적정한다. 또, 동일한 방법에 의해 블랭크 시험 (시료를 사용하지 않는 시험) 을 실시한다. 그리고, 하기 식에 따라 AV (아세트화도) (％) 를 산출한다.
AV (％) ＝ (A － B) × F × 1.201/시료 중량 (g)
A : 0.2N-수산화나트륨 규정액의 적정량 (㎖)
B : 블랭크 테스트에 있어서의 0.2N-수산화나트륨 규정액의 적정량 (㎖)
F : 0.2N-수산화나트륨 규정액의 팩터
상기 외에, 아세틸 총 치환도는, 아세트산셀룰로오스의 수산기를 프로피오닐화한 다음, 중클로로포름에 용해시켜, NMR 에 의해 측정할 수도 있다. 아세트산셀룰로오스의 수산기의 프로피오닐화는, 피리딘/N,N-디메틸아세트아미드 혼합 용매 중에서 N,N-디메틸아미노피리딘을 촉매로 하고, 무수 프로피온산을 작용시키는, 후술하는 아세트산셀룰로오스의 완전 유도체화의 방법으로 실시할 수 있다.
(아세트산셀룰로오스의 조성 분포 지수 (CDI))
본 개시에 있어서, 상기 아세트산셀룰로오스의 조성 분포 지수 (CDI) 는 특별히 한정되지 않는다. 조성 분포 지수 (CDI) 는, 예를 들어 1.0 이상 3.0 이하여도 된다. 조성 분포 지수 (CDI) 는, 2.0 이하가 바람직하고, 1.0 이상 2.0 이하가 보다 바람직하고, 1.0 이상 1.8 이하가 더욱 바람직하고, 1.0 이상 1.6 이하가 보다 더 바람직하고, 1.0 이상 1.5 이하가 특히 바람직하다.
조성 분포 지수 (CDI) 의 하한치는 0 이지만, 이것은 예를 들어 100 ％ 의 선택성으로 글루코오스 잔기의 6 위치만을 아세틸화하고, 다른 위치는 아세틸화하지 않는 등의 특별한 합성 기술로 실현되는 것이며, 그와 같은 합성 기술은 알려져 있지 않다. 글루코오스 잔기의 수산기의 전부가 동일한 확률로 아세틸화 및 탈아세틸화되는 상황에 있어서, CDI 는 1.0 이 되지만, 실제의 셀룰로오스의 반응에 있어서는 이와 같은 이상 상태에 가깝게 하기 위해서는 상당한 연구를 요한다. 상기 조성 분포 지수 (CDI) 가 작을수록, 조성 분포 (분자간 치환도 분포) 가 균일해진다. 조성 분포가 균일하면, 아세틸 총 치환도가 통상보다 넓은 범위에서 수용성을 확보할 수 있어, 균일한 용해가 이루어지고, 구조 점성이 발현되지 않으므로 섭취 또는 투여하기 쉽고, 분해되기 쉽고, 장관 면역 항진의 효과를 발현하기 쉬운 등의 이점이 있다.
여기서, 조성 분포 지수 (Compositional Distribution Index, CDI) 란, 조성 분포 반치폭의 이론값에 대한 실측값의 비율 [(조성 분포 반치폭의 실측값)/(조성 분포 반치폭의 이론값)] 로 정의된다. 조성 분포 반치폭은「분자간 치환도 분포 반치폭」또는 간단히「치환도 분포 반치폭」이라고도 한다.
아세트산셀룰로오스의 아세틸 총 치환도의 균일성을 평가하는 데에, 아세트산셀룰로오스의 분자간 치환도 분포 곡선의 최대 피크의 반치폭 (「반가폭」이라고도 한다) 의 크기를 지표로 할 수 있다. 또한, 반치폭은, 아세틸 총 치환도를 가로축 (x 축) 으로, 이 치환도에 있어서의 존재량을 세로축 (y 축) 으로 하였을 때, 차트의 피크의 높이의 절반의 높이에 있어서의 차트의 폭으로서, 분포의 편차의 기준을 나타내는 지표이다. 치환도 분포 반치폭은, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해 구할 수 있다. 또한, HPLC 에 있어서의 셀룰로오스에스테르의 용출 곡선의 가로축 (용출 시간) 을 치환도 (0 ∼ 3) 로 환산하는 방법에 대해서는, 일본 공개특허공보 2003-201301호 (단락 0037 ∼ 0040) 에 설명되어 있다.
(조성 분포 반치폭의 이론값)
조성 분포 반치폭 (치환도 분포 반치폭) 은 확률론적으로 이론값을 산출할 수 있다. 즉, 조성 분포 반치폭의 이론값은 이하의 식 (1) 로 구해진다.
m : 아세트산셀룰로오스 1 분자 중의 수산기와 아세틸기의 전체수
p : 아세트산셀룰로오스 1 분자 중의 수산기가 아세틸 치환되어 있을 확률
q ＝ 1 － p
DPw : 중량 평균 중합도 (GPC-광 산란법에 의함)
또한, 중량 평균 중합도 (DPw) 의 측정법은 후술한다.
식 (1) 은, 셀룰로오스의 모든 수산기가 동일한 확률로 아세틸화 및 탈아세틸화되었을 때에 필연적으로 발생하는 조성 분포 반치폭으로서, 소위 이항 정리에 따라 도출되는 것이다. 또한, 조성 분포 반치폭의 이론값을 치환도와 중합도로 나타내면, 이하와 같이 나타내어진다. 하기 식 (2) 를 조성 분포 반치폭의 이론값을 구하는 정의식으로 한다.
DS : 아세틸 총 치환도
DPw : 중량 평균 중합도 (GPC-광 산란법에 의함)
또한, 중량 평균 중합도 (DPw) 의 측정법은 후술한다.
그런데, 식 (1) 및 식 (2) 에 있어서는, 보다 엄밀하게는 중합도 분포를 고려에 넣어야 하며, 이 경우에는 식 (1) 및 식 (2) 의「DPw」는, 중합도 분포 함수로 치환하여, 식 전체를 중합도 0 에서 무한대까지로 적분해야 한다. 그러나, DPw 를 사용하는 한, 식 (1) 및 식 (2) 는 근사적으로 충분한 정밀도의 이론값을 부여한다. DPn (수평균 중합도) 을 사용하면, 중합도 분포의 영향을 무시할 수 없게 되므로, DPw 를 사용해야 한다.
(조성 분포 반치폭의 실측값)
본 개시에 있어서, 조성 분포 반치폭의 실측값이란, 아세트산셀룰로오스 (시료) 의 잔존 수산기 (미치환 수산기) 를 모두 프로피오닐화하여 얻어지는 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 HPLC 분석하여 구한 조성 분포 반치폭이다.
일반적으로, 아세틸 총 치환도 2 ∼ 3 의 아세트산셀룰로오스에 대해서는, 전처리 없이 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석을 실시할 수 있고, 그것에 의해 조성 분포 반치폭을 구할 수 있다. 예를 들어, 일본 공개특허공보 2011-158664호에는, 치환도 2.27 ∼ 2.56 의 아세트산셀룰로오스에 대한 조성 분포 분석법이 기재되어 있다.
한편, 본 개시의 아세트산셀룰로오스에 있어서의 조성 분포 반치폭 (치환도 분포 반치폭) 의 실측값은, HPLC 분석 전에 전처리로서 아세트산셀룰로오스의 분자 내 잔존 수산기의 유도체화를 실시하고, 그 후에 HPLC 분석을 실시하여 구한다. 이 전처리의 목적은, 저치환도 아세트산셀룰로오스 (예를 들어, 아세틸 총 치환도 1.1 이하의 아세트산셀룰로오스) 를 유기 용제에 용해되기 쉬운 유도체로 변환하여 HPLC 분석 가능하게 하는 것이다. 즉, 분자 내의 잔존 수산기를 완전히 프로피오닐화하고, 그 완전 유도체화 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트 (CAP) 를 HPLC 분석하여 조성 분포 반치폭 (실측값) 을 구한다. 여기서, 유도체화는 완전히 실시되어, 분자 내에 잔존 수산기는 없고, 아세틸기와 프로피오닐기만 존재하고 있어야 한다. 즉, 아세틸 총 치환도 (DSac) 와 프로피오닐 총 치환도 (DSpr) 의 합은 3 이다. 이것은, CAP 의 HPLC 용출 곡선의 가로축 (용출 시간) 을 아세틸 총 치환도 (0 ∼ 3) 로 변환하기 위한 교정 곡선을 작성하기 위해 관계식 : DSac ＋ DSpr ＝ 3 을 사용하기 때문이다.
아세트산셀룰로오스의 완전 유도체화는, 피리딘/N,N-디메틸아세트아미드 혼합 용매 중에서 N,N-디메틸아미노피리딘을 촉매로 하고, 무수 프로피온산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 보다 구체적으로는, 용매로서 혼합 용매 [피리딘/N,N-디메틸아세트아미드 ＝ 1/1 (v/v)] 를 아세트산셀룰로오스 (시료) 에 대해 20 중량부, 프로피오닐화제로서 무수 프로피온산을 그 아세트산셀룰로오스의 수산기에 대해 6.0 ∼ 7.5 당량, 촉매로서 N,N-디메틸아미노피리딘을 그 아세트산셀룰로오스의 수산기에 대해 6.5 ∼ 8.0 mol％ 사용하여, 온도 100 ℃, 반응 시간 1.5 ∼ 3.0 시간의 조건에서 프로피오닐화를 실시한다. 그리고, 반응 후, 침전 용매로서 메탄올을 사용하여 침전시킴으로써, 완전 유도체화 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 얻는다. 보다 상세하게는, 예를 들어, 실온에서, 반응 혼합물 1 중량부를 메탄올 10 중량부에 투입하여 침전시키고, 얻어진 침전물을 메탄올로 5 회 세정하고, 60 ℃ 에서 진공 건조를 3 시간 실시함으로써, 완전 유도체화 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트 (CAP) 를 얻을 수 있다. 또한, 후술하는 분산도 (다분산성, Mw/Mn) 및 중량 평균 중합도 (DPw) 도, 아세트산셀룰로오스 (시료) 를 이 방법에 의해 완전 유도체화 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트 (CAP) 로 하여 측정한 것이다.
상기 HPLC 분석에서는, 상이한 아세틸 총 치환도를 갖는 복수의 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 표준 시료로서 사용하여 소정의 측정 장치 및 측정 조건에서 HPLC 분석을 실시하고, 이들 표준 시료의 분석값을 사용하여 작성한 교정 곡선 [셀룰로오스아세테이트프로피오네이트의 용출 시간과 아세틸 총 치환도 (0 ∼ 3) 의 관계를 나타내는 곡선, 통상적으로 3 차 곡선] 로부터, 아세트산셀룰로오스 (시료) 의 조성 분포 반치폭 (실측값) 을 구할 수 있다. HPLC 분석으로 구해지는 것은 용출 시간과 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트의 아세틸 총 치환도 분포의 관계이다. 이것은, 시료 분자 내의 잔존 하이드록시기의 전부가 프로피오닐옥시기로 변환된 물질의 용출 시간과 아세틸 총 치환도 분포의 관계이기 때문에, 본 개시의 아세트산셀룰로오스의 아세틸 총 치환도 분포를 구하고 있는 것과 본질적으로는 다르지 않다.
상기 HPLC 분석의 조건은 이하와 같다.
장치 : Agilent 1100 Series
칼럼 : Waters Nova-Pak phenyl 60 Å 4 ㎛ (150 ㎜ × 3.9 ㎜Φ) ＋ 가드 칼럼
칼럼 온도 : 30 ℃
검출 : Varian 380-LC
주입량 : 5.0 ㎕ (시료 농도 : 0.1 ％ (wt/ol))
용리액 : A 액 : MeOH/H2O ＝ 8/1 (v/v), B 액 : CHCl3/MeOH ＝ 8/1 (v/v)
그라디언트 : A/B ＝ 80/20 → 0/100 (28 분) ; 유량 : 0.7 ㎖/분
교정 곡선으로부터 구한 치환도 분포 곡선 [셀룰로오스아세테이트프로피오네이트의 존재량을 세로축으로 하고, 아세틸 총 치환도를 가로축으로 하는 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트의 치환도 분포 곡선] (「분자간 치환도 분포 곡선」이라고도 한다) 에 있어서, 평균 치환도에 대응하는 최대 피크 (E) 에 관하여, 이하와 같이 하여 치환도 분포 반치폭을 구한다. 피크 (E) 의 저치환도측의 기부 (A) 와, 고치환도측의 기부 (B) 에 접하는 베이스 라인 (A-B) 를 긋고, 이 베이스 라인에 대해, 최대 피크 (E) 로부터 가로축에 수선을 내린다. 수선과 베이스 라인 (A-B) 의 교점 (C) 를 결정하고, 최대 피크 (E) 와 교점 (C) 의 중간점 (D) 를 구한다. 중간점 (D) 를 지나, 베이스 라인 (A-B) 와 평행한 직선을 긋고, 분자간 치환도 분포 곡선과의 두 개의 교점 (A', B') 를 구한다. 2 개의 교점 (A', B') 로부터 가로축까지 수선을 내려, 가로축 상의 두 개의 교점 사이의 폭을, 최대 피크의 반치폭 (즉, 치환도 분포 반치폭) 으로 한다.
이와 같은 치환도 분포 반치폭은, 시료 중의 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트의 분자 사슬에 대해, 그 구성하는 고분자 사슬 하나하나의 글루코오스 고리의 수산기가 어느 정도 아세틸화되어 있는지에 따라, 유지 시간 (리텐션 타임) 이 상이한 것을 반영하고 있다. 따라서, 이상적으로는, 유지 시간의 폭이, (치환도 단위의) 조성 분포의 폭을 나타내게 된다. 그러나, HPLC 에는 분배에 기여하지 않는 관부 (칼럼을 보호하기 위한 가드 칼럼 등) 가 존재한다. 그러므로, 측정 장치의 구성에 의해, 조성 분포의 폭에서 기인하지 않는 유지 시간의 폭이 오차로서 내포되는 경우가 많다. 이 오차는, 상기와 같이, 칼럼의 길이, 내경, 칼럼에서 검출기까지의 길이나 배치 등에 영향을 받으며, 장치 구성에 따라 상이하다. 이 때문에, 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트의 치환도 분포 반치폭은, 통상적으로, 하기 식으로 나타내는 보정식에 기초하여, 보정값 Z 로서 구할 수 있다. 이와 같은 보정식을 사용하면, 측정 장치 (및 측정 조건) 가 상이해도, 동일한 (거의 동일한) 값으로서, 보다 정확한 치환도 분포 반치폭 (실측값) 을 구할 수 있다.
Z ＝ (X2 － Y2)1/2
[식 중, X 는 소정의 측정 장치 및 측정 조건에서 구한 치환도 분포 반치폭 (미보정값) 이다. Y ＝ (a － b)x/3 ＋ b (0 ≤ x ≤ 3) 이다. 여기서, a는 상기 X 와 동일한 측정 장치 및 측정 조건에서 구한 총 치환도 3 의 셀룰로오스아세테이트의 외관의 치환도 분포 반치폭 (실제로는 총 치환도 3 이므로, 치환도 분포는 존재하지 않는다), b 는 상기 X 와 동일한 측정 장치 및 측정 조건에서 구한 총 치환도 3 의 셀룰로오스프로피오네이트의 외관의 치환도 분포 반치폭이다. x 는 측정 시료의 아세틸 총 치환도 (0 ≤ x ≤ 3) 이다]
또한, 상기 총 치환도 3 의 셀룰로오스아세테이트 (혹은 셀룰로오스프로피오네이트) 란, 셀룰로오스의 하이드록실기의 전부가 에스테르화된 셀룰로오스에스테르를 나타내고, 실제로는 (이상적으로는) 치환도 분포 반치폭을 갖지 않는 (즉, 치환도 분포 반치폭 0 의) 셀룰로오스에스테르이다.
상기 아세트산셀룰로오스의 조성 분포 반치폭 (치환도 분포 반치폭) 의 실측값으로는, 바람직하게는 0.12 ∼ 0.34 이고, 보다 바람직하게는 0.13 ∼ 0.31 이고, 더욱 바람직하게는 0.13 ∼ 0.25 이다.
앞서 설명한 치환도 분포 이론식은, 모든 아세틸화와 탈아세틸화가 독립 또한 균등하게 진행되는 것을 가정한 확률론적 계산값이다. 즉, 이항 분포에 따른 계산값이다. 이와 같은 이상적인 상황은 현실적으로는 있을 수 없다. 아세트산셀룰로오스의 가수 분해 반응이 이상적인 랜덤 반응에 가까워지는, 및/또는, 반응 후의 후처리에 대해 조성에 대해 분획이 발생하는 특별한 연구를 하지 않는 한, 셀룰로오스에스테르의 치환도 분포는 확률론적으로 이항 분포로 정해지는 것보다 대폭 넓어진다.
반응의 특별한 연구의 하나로는, 예를 들어, 탈아세틸화와 아세틸화가 평형하는 조건에서 계를 유지하는 것을 생각할 수 있다. 그러나, 이 경우에는 산 촉매에 의해 셀룰로오스의 분해가 진행되므로 바람직하지 않다. 다른 반응의 특별한 연구로는, 탈아세틸화 속도가 저치환도물에 대해 느려지는 반응 조건을 채용하는 것이다. 그러나, 종래, 그와 같은 구체적인 방법은 알려져 있지 않다. 요컨대, 셀룰로오스에스테르의 치환도 분포를 반응 확률론대로 이항 분포에 따르도록 제어하는 반응의 특별한 연구는 알려져 있지 않다. 또한, 아세트화 과정 (셀룰로오스의 아세틸화 공정) 의 불균일성이나, 숙성 과정 (아세트산셀룰로오스의 가수 분해 공정) 에서 단계적으로 첨가하는 물에 의한 부분적, 일시적인 침전의 발생 등의 여러 가지 사정은, 치환도 분포를 이항 분포보다 넓게 하는 방향으로 작용하며, 이들을 모두 회피하여 이상 조건을 실현하는 것은, 현실적으로는 불가능하다. 이것은, 이상 기체가 어디까지나 이상의 산물이며, 실재하는 기체의 거동은 그것과는 많든 적든 상이한 것과 유사하다.
종래의 저치환도 아세트산셀룰로오스의 합성과 후처리에 있어서는, 이와 같은 치환도 분포의 문제에 대해 대부분 관심이 기울여지고 있지 않고, 치환도 분포의 측정이나 검증, 고찰이 실시되어 있지 않았다. 예를 들어, 문헌 (섬유 학회지, 42, p25 (1986)) 에 의하면, 저치환도 아세트산셀룰로오스의 용해성은, 글루코오스 잔기 2, 3, 6 위치에 대한 아세틸기의 분배로 정해진다고 논해지고 있으며, 조성 분포는 전혀 고려되어 있지 않다.
본 발명자들의 검토에 의하면, 후술하는 바와 같이, 아세트산셀룰로오스의 치환도 분포는, 놀랍게도 아세트산셀룰로오스의 가수 분해 공정 후의 후처리 조건의 연구로 제어할 수 있다. 문헌 (CiBment, L., and Rivibre, C., Bull. SOC.chim., (5) 1, 1075 (1934), Sookne, A.M., Rutherford, H.A., Mark, H., and Harris, M.J.Research Natl.Bur.Standards, 29, 123 (1942), A.J.Rosenthal, B.B.White Ind.Eng.Chem., 1952, 44 (11), pp 2693-2696.) 에 의하면, 총 치환도 2.3 의 아세트산셀룰로오스의 침전 분별에서는, 분자량에 의존한 분획과 치환도 (화학 조성) 에 수반하는 미미한 분획이 일어난다고 되어 있고, 본 발명자들이 알아낸 바와 같은 치환도 (화학 조성) 로 현저한 분획을 할 수 있다는 보고는 없다. 또한, 저치환도 아세트산셀룰로오스에 대해, 용해 분별이나 침전 분별로 치환도 분포 (화학 조성) 를 제어할 수 있는 것은 검증되어 있지 않았다.
본 발명자들이 알아낸 치환도 분포를 좁게 하는 다른 하나의 연구는, 아세트산셀룰로오스의 90 ℃ 이상의 (또는 90 ℃ 를 초과하는) 고온에서의 가수 분해 반응 (숙성 반응) 이다. 종래, 고온 반응으로 얻어진 생성물의 중합도에 대해 상세한 분석이나 고찰이 이루어져 오지 않았음에도 불구하고, 90 ℃ 이상의 고온 반응에서는 셀룰로오스의 분해가 우선한다고 여겨져 왔다. 이 생각은, 점도에 관한 고찰에만 기초를 둔 고정 관념 (스테레오 타입) 이라고 할 수 있다. 본 발명자들은, 아세트산셀룰로오스를 가수 분해하여 저치환도 아세트산셀룰로오스를 얻을 때에, 90 ℃ 이상의 (또는 90 ℃ 를 초과하는) 고온하, 바람직하게는 황산 등의 강산의 존재하, 다량의 아세트산 중에서 반응시키면, 중합도의 저하는 보이지 않는 한편으로, CDI 의 감소에 수반하여 점도가 저하되는 것을 알아내었다. 즉, 고온 반응에 수반하는 점도 저하는, 중합도의 저하에서 기인하는 것이 아니라, 치환도 분포가 좁아지는 것에 의한 구조 점성의 감소에 기초하는 것인 것을 해명하였다. 상기의 조건에서 아세트산셀룰로오스의 가수 분해를 실시하면, 정반응뿐만 아니라 역반응도 일어나기 때문에, 생성물 (저치환도 아세트산셀룰로오스) 의 CDI 가 매우 작은 값이 되고, 물에 대한 용해성도 현저하게 향상된다. 이에 반해, 역반응이 일어나기 어려운 조건에서 아세트산셀룰로오스의 가수 분해를 실시하면, 치환도 분포는 여러 가지 요인으로 넓어져, 물에 녹기 어려운 아세틸 총 치환도 0.4 미만의 아세트산셀룰로오스 및 아세틸 총 치환도 1.1 을 초과하는 아세트산셀룰로오스의 함유량이 증대되고, 전체적으로 물에 대한 용해성이 저하된다.
(2, 3, 6 위치의 치환도의 표준 편차)
상기 아세트산셀룰로오스의 글루코오스 고리의 2, 3, 6 위치의 각 아세틸 총 치환도는, 테즈카 (Tezuka, Carbonydr.Res.273, 83 (1995)) 의 방법에 따라 NMR 법으로 측정할 수 있다. 즉, 아세트산셀룰로오스 시료의 유리 수산기를 피리딘 중에서 무수 프로피온산에 의해 프로피오닐화한다. 얻어진 시료를 중클로로포름에 용해시키고, 13C-NMR 스펙트럼을 측정한다. 아세틸기의 탄소 시그널은 169 ppm 내지 171 ppm 의 영역에 고자장으로부터 2 위치, 3 위치, 6 위치의 순서로, 그리고, 프로피오닐기의 카르보닐탄소의 시그널은, 172 ppm 내지 174 ppm 의 영역에 동일한 순서로 나타난다. 각각 대응하는 위치에서의 아세틸기와 프로피오닐기의 존재비로부터, 원래의 셀룰로오스아세테이트에 있어서의 글루코오스 고리의 2, 3, 6 위치의 각 아세틸 치환도를 구할 수 있다. 또한, 이와 같이 구한 2, 3, 6 위치의 각 아세틸 치환도의 합은 아세틸 총 치환도이며, 이 방법으로 아세틸 총 치환도를 구할 수도 있다. 또한, 아세틸 총 치환도는, 13C-NMR 외에, 1H-NMR 로 분석할 수도 있다.
2, 3, 6 위치의 치환도의 표준 편차 σ 는, 다음의 식으로 정의된다.
아세트산셀룰로오스의 글루코오스 고리의 2, 3 및 6 위치의 아세틸 치환도의 표준 편차가 0.08 이하 (0 ∼ 0.08) 인 것이 바람직하다. 그 표준 편차가 0.08 이하인 아세트산셀룰로오스는, 글루코오스 고리의 2, 3, 6 위치가 균등하게 치환되어 있고, 물에 대한 용해성이 우수하다.
(분산도 (다분산성, Mw/Mn))
분자량 분포 (중합도 분포) 의 분산도 (다분산성, Mw/Mn) 는, 아세트산셀룰로오스 (시료) 의 잔존 수산기를 모두 프로피오닐화하여 얻어지는 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 사용하여 GPC-광 산란법에 의해 구한 값이다.
본 개시의 아세트산셀룰로오스의 분산도 (다분산성, Mw/Mn) 는, 1.2 ∼ 2.5 의 범위인 것이 바람직하다. 분산도 Mw/Mn 이 상기의 범위에 있는 아세트산셀룰로오스는, 분자의 크기가 고르게 되어 있고, 물에 대한 용해성이 우수하다. 아세트산셀룰로오스는 장내 세균에 의해 소화관 내에서 아세트산과 셀룰로오스로 분해되고, 셀룰로오스는 다시 올리고당이나 단당을 경유하여 아세트산 등의 단사슬 지방산으로 분해되는 것으로 생각된다. 이와 같은 과정에서 생성되는 아세트산 등의 대사 산물이나, 이와 같은 과정에서 아세트산셀룰로오스를 자화시키는 장내 세균이 IgA 산생 세포의 증가와 IgA 의 증가로 이어지는 것으로 생각된다. 아세트산셀룰로오스의 아세트산과 셀룰로오스에 대한 분해는 균체외 효소에 의해 발생하는 것으로 생각되므로, 물에 대한 용해성이 높은 아세트산셀룰로오스 쪽이 분해되기 쉽고, IgA 산생 세포의 증가와 IgA 의 증가를 촉진시키는 효과가 높다. 나아가서는 장관 면역 항진 효과가 높아지는 것으로 이어진다.
아세트산셀룰로오스의 수평균 분자량 (Mn), 중량 평균 분자량 (Mw) 및 분산도 (다분산성, Mw/Mn) 는, HPLC 를 사용한 공지된 방법으로 구할 수 있다. 아세트산셀룰로오스의 분산도 (다분산성, Mw/Mn) 는, 측정 시료를 유기 용제에 가용으로 하기 위해, 상기 조성 분포 반치폭의 실측값을 구하는 경우와 동일한 방법으로, 아세트산셀룰로오스 (시료) 를 완전 유도체화 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트 (CAP) 로 한 후, 이하의 조건에서 사이즈 배제 크로마토그래피 분석을 실시함으로써 결정된다 (GPC-광 산란법).
장치 : Shodex 제조 GPC「SYSTEM-21H」
용매 : 아세톤
칼럼 : GMHxl (토소) 2 개, 가드 칼럼 (토소 제조 TSKgel guardcolumn HXL-H)
유속 : 0.8 ㎖/분
온도 : 29 ℃
시료 농도 : 0.25 ％ (wt/ol)
주입량 : 100 ㎕
검출 : MALLS (다각도 광 산란 검출기) (Wyatt 제조,「DAWN-EOS」)
MALLS 보정용 표준 물질 : PMMA (분자량 27600)
(중량 평균 중합도 (DPw))
중량 평균 중합도 (DPw) 는, 아세트산셀룰로오스 (시료) 의 잔존 수산기를 모두 프로피오닐화하여 얻어지는 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 사용하여 GPC-광 산란법에 의해 구한 값이다.
본 개시의 아세트산셀룰로오스의 중량 평균 중합도 (DPw) 는, 50 ∼ 800 의 범위인 것이 바람직하다. 중량 평균 중합도 (DPw) 가 지나치게 높으면, 물에 대한 용해성이 나빠지기 쉽다. 상기 중량 평균 중합도 (DPw) 는, 바람직하게는 55 ∼ 700, 더욱 바람직하게는 60 ∼ 600 이다. 아세트산셀룰로오스는 장내 세균에 의해 소화관 내에서 아세트산과 셀룰로오스로 분해되고, 셀룰로오스는 다시 올리고당이나 단당을 경유하여 아세트산 등의 단사슬 지방산으로 분해되는 것으로 생각된다. 이와 같은 과정에서 생성되는 아세트산 등의 대사 산물이나, 이와 같은 과정에서 아세트산셀룰로오스를 자화시키는 장내 세균이 IgA 산생 세포의 증가와 IgA 의 증가로 이어지는 것으로 생각된다. 아세트산셀룰로오스의 아세트산과 셀룰로오스에 대한 분해는 균체외 효소에 의해 발생하는 것으로 생각되므로, 물에 대한 용해성이 높은 아세트산셀룰로오스 쪽이 분해되기 쉽고, IgA 산생 세포의 증가와 IgA 의 증가를 촉진시키는 효과가 높다. 나아가서는 장관 면역 항진 효과가 높아지는 것으로 이어진다.
상기 중량 평균 중합도 (DPw) 는, 상기 분산도 (다분산성, Mw/Mn) 와 동일하게, 상기 조성 분포 반치폭의 실측값을 구하는 경우와 동일한 방법으로, 아세트산셀룰로오스 (시료) 를 완전 유도체화 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트 (CAP) 로 한 후, 사이즈 배제 크로마토그래피 분석을 실시함으로써 구할 수 있다 (GPC-광 산란법).
상기 서술한 바와 같이, 아세트산셀룰로오스의 분자량 (중합도), 분산도 (다분산성, Mw/Mn) 는 GPC-광 산란법 (GPC-MALLS, GPC-LALLS 등) 에 의해 측정된다. 또한, 광 산란의 검출은, 일반적으로 수계 용매에서는 곤란하다. 이것은 수계 용매는 일반적으로 이물질이 많아, 일단 정제해도 2 차 오염되기 쉬운 것에 의한다. 또, 수계 용매에서는, 미량으로 존재하는 이온성 해리기의 영향 때문에 분자 사슬의 확대가 안정되지 않는 경우가 있고, 그것을 억제하기 위해 수용성 무기염 (예를 들어 염화나트륨) 을 첨가하거나 하면, 용해 상태가 불안정해지고, 수용액 중에서 회합체를 형성하거나 하는 경우가 있다. 이 문제를 회피하기 위한 유효한 방법 중 하나는, 아세트산셀룰로오스를 유도체화하여, 이물질이 적고, 2 차 오염되기 어려운 유기 용매에 용해시키도록 하여, 유기 용매로 GPC-광 산란 측정을 실시하는 것이다. 이 목적의 아세트산셀룰로오스의 유도체화로는 프로피오닐화가 유효하고, 구체적인 반응 조건 및 후처리는 상기 조성 분포 반치폭의 실측값의 설명 지점에서 기재한 바와 같다.
(아세트산셀룰로오스의 제조)
상기 아세트산셀룰로오스 (아세트산셀룰로오스) 는, 예를 들어, (A) 중 내지 고치환도 아세트산셀룰로오스의 가수 분해 공정 (숙성 공정), (B) 침전 공정, 및, 필요에 따라 실시하는 (C) 세정, 중화 공정에 의해 제조할 수 있다. 또한, 중 내지 고치환도 아세트산셀룰로오스의 아세틸 총 치환도는, 예를 들어, 1.5 이상 3 이하, 바람직하게는 2 이상 3 이하이다.
[(A) 가수 분해 공정 (숙성 공정)]
가수 분해 반응은, 유기 용매 중, 촉매 (숙성 촉매) 의 존재하, 원료 아세트산셀룰로오스와 물을 반응시킴으로써 실시할 수 있다. 유기 용매로는, 예를 들어, 아세트산, 아세톤, 알코올 (메탄올 등), 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 아세트산을 적어도 함유하는 용매가 바람직하다. 촉매로는, 일반적으로 탈아세틸화 촉매로서 사용되는 촉매를 사용할 수 있다. 촉매로는, 특히 황산이 바람직하다.
유기 용매 (예를 들어, 아세트산) 의 사용량은, 원료 아세트산셀룰로오스 1 중량부에 대해, 예를 들어, 0.5 ∼ 50 중량부, 바람직하게는 1 ∼ 20 중량부, 더욱 바람직하게는 3 ∼ 10 중량부이다.
촉매 (예를 들어, 황산) 의 사용량은, 원료 아세트산셀룰로오스 1 중량부에 대해, 예를 들어, 0.005 ∼ 1 중량부, 바람직하게는 0.01 ∼ 0.5 중량부, 더욱 바람직하게는 0.02 ∼ 0.3 중량부이다. 촉매의 양이 지나치게 적으면, 가수 분해의 시간이 지나치게 길어져, 아세트산셀룰로오스의 분자량의 저하를 일으키는 경우가 있다. 한편, 촉매의 양이 지나치게 많으면, 가수 분해 온도에 대한 해중합 속도의 변화의 정도가 커지고, 가수 분해 온도가 어느 정도 낮아도 해중합 속도가 커져, 분자량이 어느 정도 큰 아세트산셀룰로오스가 얻어지기 어려워진다.
가수 분해 공정에 있어서의 물의 양은, 원료 아세트산셀룰로오스 1 중량부에 대해, 예를 들어, 0.5 ∼ 20 중량부, 바람직하게는 1 ∼ 10 중량부, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 7 중량부이다. 또, 그 물의 양은, 유기 용매 (예를 들어, 아세트산) 1 중량부에 대해, 예를 들어, 0.1 ∼ 5 중량부, 바람직하게는 0.3 ∼ 2 중량부, 더욱 바람직하게는 0.5 ∼ 1.5 중량부이다. 물은, 반응 개시시에 있어서 모든 양을 계 내에 존재시켜도 되는데, 아세트산셀룰로오스의 침전을 방지하기 위해, 사용하는 물의 일부를 반응 개시시에 계 내에 존재시키고, 나머지 물을 1 ∼ 수회로 나누어 계 내에 첨가해도 된다.
가수 분해 공정에 있어서의 반응 온도는, 예를 들어, 40 ∼ 130 ℃, 바람직하게는 50 ∼ 120 ℃, 더욱 바람직하게는 60 ∼ 110 ℃ 이다. 특히, 반응 온도를 90 ℃ 이상 (혹은 90 ℃ 를 초과하는 온도) 으로 하는 경우에는, 정반응 (가수 분해 반응) 에 대한 역반응 (아세틸화 반응) 의 속도가 증가하는 방향으로 반응의 평형이 기우는 경향이 있고, 그 결과, 치환도 분포가 좁아져, 후처리 조건을 특별히 연구하지 않아도, 조성 분포 지수 CDI 가 매우 작은 아세트산셀룰로오스를 얻을 수 있다. 이 경우, 촉매로서 황산 등의 강산을 사용하는 것이 바람직하고, 또, 반응 용매로서 아세트산을 과잉으로 사용하는 것이 바람직하다. 또, 반응 온도를 90 ℃ 이하로 하는 경우여도, 후술하는 바와 같이, 침전 공정에 있어서, 침전 용매로서 2 종 이상의 용매를 함유하는 혼합 용매를 사용하여 침전시키거나, 침전 분별 및/또는 용해 분별을 실시함으로써, 조성 분포 지수 CDI 가 매우 작은 아세트산셀룰로오스를 얻을 수 있다.
[(B) 침전 공정]
이 공정에서는, 가수 분해 반응 종료 후, 반응계의 온도를 실온까지 냉각시키고, 침전 용매를 첨가하여 아세트산셀룰로오스를 침전시킨다. 침전 용매로는, 물과 혼화되는 유기 용제 혹은 물에 대한 용해도가 큰 유기 용제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤 ; 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올 등의 알코올 ; 아세트산에틸 등의 에스테르 ; 아세토니트릴 등의 함질소 화합물 ; 테트라하이드로푸란 등의 에테르 ; 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있다.
침전 용매로서 2 종 이상의 용매를 함유하는 혼합 용매를 사용하면, 후술하는 침전 분별과 동일한 효과가 얻어지고, 조성 분포 (분자간 치환도 분포) 가 좁아, 조성 분포 지수 (CDI) 가 작은 아세트산셀룰로오스를 얻을 수 있다. 바람직한 혼합 용매로서, 예를 들어, 아세톤과 메탄올의 혼합 용매, 이소프로필알코올과 메탄올의 혼합 용매 등을 들 수 있다.
또, 침전시켜 얻어진 아세트산셀룰로오스에 대해, 추가로 침전 분별 (분별 침전) 및/또는 용해 분별 (분별 용해) 을 실시함으로써, 조성 분포 (분자간 치환도 분포) 가 좁아, 조성 분포 지수 CDI 가 매우 작은 아세트산셀룰로오스를 얻을 수 있다.
침전 분별은, 예를 들어, 침전시켜 얻어진 아세트산셀룰로오스 (고형물) 를 물에 용해시키고, 적당한 농도 (예를 들어, 2 ∼ 10 중량％, 바람직하게는 3 ∼ 8 중량％) 의 수용액으로 하고, 이 수용액에 빈용매를 첨가하고 (또는, 빈용매에 상기 수용액을 첨가하고), 적절한 온도 (예를 들어, 30 ℃ 이하, 바람직하게는 20 ℃ 이하) 로 유지하여, 아세트산셀룰로오스를 침전시키고, 침전물을 회수함으로써 실시할 수 있다. 빈용매로는, 예를 들어, 메탄올 등의 알코올, 아세톤 등의 케톤 등을 들 수 있다. 빈용매의 사용량은, 상기 수용액 1 중량부에 대해, 예를 들어 1 ∼ 10 중량부, 바람직하게는 2 ∼ 7 중량부이다.
용해 분별은, 예를 들어, 상기 침전시켜 얻어진 아세트산셀룰로오스 (고형물) 혹은 상기 침전 분별로 얻어진 아세트산셀룰로오스 (고형물) 에, 물과 유기 용매 (예를 들어, 아세톤 등의 케톤, 에탄올 등의 알코올 등) 의 혼합 용매를 첨가하고, 적절한 온도 (예를 들어, 20 ∼ 80 ℃, 바람직하게는 25 ∼ 60 ℃) 에서 교반 후, 원심 분리에 의해 농후상과 희박상으로 분리하고, 희박상에 침전 용제 (예를 들어, 아세톤 등의 케톤, 메탄올 등의 알코올 등) 를 첨가하고, 침전물 (고형물) 을 회수함으로써 실시할 수 있다. 상기 물과 유기 용매의 혼합 용매에 있어서의 유기 용매의 농도는, 예를 들어, 5 ∼ 50 중량％, 바람직하게는 10 ∼ 40 중량％ 이다.
[(C) 세정, 중화 공정]
침전 공정 (B) 에서 얻어진 침전물 (고형물) 은, 메탄올 등의 알코올, 아세톤 등의 케톤 등의 유기 용매 (빈용매) 로 세정하는 것이 바람직하다. 또, 염기성 물질을 함유하는 유기 용매 (예를 들어, 메탄올 등의 알코올, 아세톤 등의 케톤 등) 로 세정, 중화하는 것도 바람직하다. 또한, 중화 공정은 가수 분해 공정 직후에 마련해도 되고, 그 경우에는 염기성 물질 또는 그 수용액을 가수 분해 반응욕에 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 염기성 물질로는, 예를 들어, 알칼리 금속 화합물 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리 금속 수산화물 ; 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 알칼리 금속 탄산염 ; 탄산수소나트륨 등의 알칼리 금속 탄산수소염 ; 아세트산나트륨, 아세트산칼륨 등의 알칼리 금속 카르복실산염 ; 나트륨메톡시드, 나트륨에톡시드 등의 나트륨알콕시드 등), 알칼리 토금속 화합물 (예를 들어, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 등의 알칼리 토금속 수산화물, 탄산마그네슘, 탄산칼슘 등의 알칼리 토금속 탄산염 ; 아세트산마그네슘, 아세트산칼슘 등의 알칼리 토금속 카르복실산염 ; 마그네슘에톡시드 등의 알칼리 토금속 알콕시드 등) 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서도, 특히, 아세트산칼륨 등의 알칼리 금속 화합물이 바람직하다.
세정, 중화에 의해, 가수 분해 공정에서 사용한 촉매 (황산 등) 등의 불순물을 효율적으로 제거할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 아세트산셀룰로오스는, 필요에 따라 분쇄, 체 분급 또는 조립하여, 특정 입도의 범위로 조정할 수 있다.
[식품, 의약]
본 개시의 장관 면역 항진제는, 식품 또는 의약에 함유되어 있어도 되고, 아세틸 총 치환도가 0.4 이상 1.1 이하인 아세트산셀룰로오스만을 식품 또는 의약으로 해도 되지만, 이하와 같이 각종 식품 또는 의약의 구성 요소로서 사용할 수 있다.
그 식품 또는 의약의 섭취 또는 투여 방법으로는, 특히 경구에 의한 섭취 또는 투여를 들 수 있다. 형태는 여러 가지의 것을 선택할 수 있다. 예를 들어, 산제, 과립제, 정제, 당의정제, 캡슐제, 시럽제, 환제, 현탁제, 액제 및 유제 등의 통상적인 의약품의 형태, 그리고 음료 ; 껌, 초콜릿, 엿, 양갱, 및 젤리 등의 당과 제품 ; 면류 ; 빵, 케이크, 비스킷 등의 구운 식품 ; 통조림 ; 레토르트 식품 ; 축육 식품 ; 수산련 식품 ; 마가린, 드레싱, 및 마요네즈 등의 식용유 조성물 ; 영양 보조 식품 ; 버터, 아이스크림, 요구르트 등의 우유 제품 ; 등의 통상적인 식품의 형태를 채용할 수 있다.
본 개시의 식품 또는 의약은, 인간에 한정되지 않고, 가축 (소, 돼지, 말, 양 등), 가금 (닭, 집오리 등), 펫 (개, 고양이, 원숭이, 마우스, 래트, 모르모트 등) 등의 동물에도 적용할 수 있다. 이들 중에서도, 인간에 있어서 효과를 얻기 위한 용량은, 아세트산셀룰로오스의 섭취량으로서 1 일당 1 g ∼ 10 g 이 바람직하고, 비교적 다량의 섭취가 가능해지는 점에서, 당의정제 ; 면류 ; 비스킷 등의 구운 식품 등이 바람직하다. 또, 본 개시의 장관 면역 항진제는, 의약품의 형태 또는 식품의 형태에 증점제로서 도입할 수도 있다.
본 개시의 식품에 있어서의, 아세틸 총 치환도가 0.4 이상 1.1 이하인 아세트산셀룰로오스의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 식품 중 0.1 중량％ 이상인 것이 바람직하다. 당해 식품의 하루의 섭취로, 유효한 양의 아세트산셀룰로오스를 섭취할 수 있기 때문이다. 식품의 맛이나 식감을 저해하지 않고, 장관에 있어서의 IgA 를 충분히 증가시킴과 함께, 증가한 IgA 의 양을 장기간 (예를 들어, 2 주일 ∼ 4 주일, 또는 4 주일 이상) 유지하는 관점에서, 0.1 중량％ 이상 5 중량％ 미만이 바람직하고, 1.5 중량％ 이상 3 중량％ 미만이 보다 바람직하다.
본 개시의 장관 면역 항진제가 식품 또는 의약에 함유되어 있는 경우의 예방 및/또는 치료 (유해 작용의 경감 또는 예방) 에 유용한 대상 질환의 구체적인 예로는, 프로테오박테리아문에 속하는 병원균에 의한 감염증이며, 살모네라균 감염증, 콜레라, 장염 비브리오 등을 들 수 있다. 장관 중, 특히 대장의 점막 고유층 (lamina propria) 에 있어서의 IgA 산생 형질 세포가 증가함으로써, IgA 를 증가시키고, 점막 면역 기능을 증강시켜, 감염증이나 알레르기 질환을 예방하는 등의 효과를 기대할 수 있다.
본 개시의 장관 면역 항진제의 섭취 또는 투여량은, 원하는 장관 면역 항진의 효과를 가져오는 데에 충분한 양이면 된다. 구체적으로는, 개체의 연령, 체중, 성별, 건강 상태, 그리고 위, 소장, 및 대장 등의 상태 등의 개체에 관한 조건, 섭취 또는 투여 방법, 및 제제 형태 등을 고려하여 경험적으로 결정될 수 있다. 1 회당의 섭취 또는 투여량은, 예를 들어, 5 ㎎/㎏ 체중 ∼ 60 ㎎/㎏ 체중이어도 되고, 10 ㎎/㎏ 체중 ∼ 40 ㎎/㎏ 체중이어도 된다. 또, 개체가 섭취, 또는 개체에 투여되는 횟수는, 1 회여도 되고, 1 회를 초과해도 된다. 1 회를 초과하는 경우에는, 정기적으로, 부정기적으로, 또는 필요에 따라 투여될 수 있다. 적절한 횟수는, 섭취 또는 투여량과 마찬가지로, 개체에 관한 조건, 섭취 또는 투여 방법, 및 제제 형태 등을 고려하여 경험적으로 결정될 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은, 이들 실시예에 의해 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
[아세트산셀룰로오스의 조제]
아세트산셀룰로오스 (다이셀사 제조, 상품명「L-70」, 아세틸 총 치환도 2.43, 6 ％ 점도 : 145 mPa·s) 1 중량부에 대해, 4.4 중량부의 아세트산 및 1.9 중량부의 물을 첨가하고, 혼합물을 3 시간 교반하여 아세트산셀룰로오스를 용해시켰다. 이 용액에 0.58 부의 아세트산과 0.13 중량부의 황산의 혼합물을 첨가하고, 얻어진 용액을 70 ℃ 로 유지하고, 가수 분해를 실시하였다. 가수 분해 동안에 아세트산셀룰로오스가 침전되는 것을 방지하기 위해, 계에 대한 물의 첨가를 2 회로 나누어 실시하였다. 즉, 반응을 개시하여 1 시간 후에 0.65 중량부의 물을 5 분간에 걸쳐 계에 첨가하였다. 다시 2 시간 후, 1.29 중량부의 물을 10 분간에 걸쳐 계에 첨가하고, 다시 4 시간 반응시켰다. 합계의 가수 분해 시간은 7 시간이다. 또한, 반응 개시시부터 1 회째의 물의 첨가까지를 제 1 가수 분해 공정 (제 1 숙성 공정), 1 회째의 물의 첨가로부터 2 회째의 물의 첨가까지를 제 2 가수 분해 공정 (제 2 숙성 공정), 2 회째의 물의 첨가로부터 반응 종료까지를 제 3 가수 분해 공정 (제 3 숙성 공정) 이라고 한다.
가수 분해를 실시한 후, 황산에 대해 1.1 당량의 아세트산마그네슘을 함유하는 24 ％ 아세트산마그네슘 수용액을 반응 혼합물에 첨가하여 반응을 정지하였다. 이 반응 혼합물에 대해 3.6 배 중량의 아세톤 중에 반응 혼합물을 교반하에서 60 분을 소요하여 적하시켜, 침전을 형성시켰다. 여과에 의해 고형분 15 중량％ 의 웨트 케이크로서 침전을 회수하였다. 얻어진 침전물의 고형분 1 중량부에 대해, 16 중량부의 아세톤/물의 혼합 용제 (아세톤 농도 20 중량％) 를 첨가하고, 40 ℃ 에서 8 시간 교반 후, 여과에 의해 고형분 15 중량％ 의 웨트 케이크로서 고형물을 회수하였다. 얻어진 웨트 케이크의 고형분 1 중량부에 대해, 16 중량부의 메탄올을 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 교반 후, 여과에 의해 고형분 15 중량％ 의 웨트 케이크로서 고형물을 회수하는 조작을 5 회 반복하고, 건조시켜 저치환도 아세트산셀룰로오스를 얻었다.
얻어진 아세트산셀룰로오스의 아세틸 총 치환도, 중량 평균 중합도 (DPw), 분산도 (다분산성, Mw/Mn), 조성 분포 반치폭의 실측값, 및 조성 분포 지수 (CDI) 를 상기 방법으로 측정하였다. 그 결과, 아세트산셀룰로오스의 아세틸 총 치환도는 0.78, 중량 평균 중합도 (DPw) 는 124, 분산도 (다분산성, Mw/Mn) 는 2.0, 조성 분포 반치폭의 실측값은 0.305, 조성 분포 지수 (CDI) 는 1.90 이었다.
[장관 면역 항진제의 평가]
＜사료의 조제＞
정제 사료 AIN-93G (REEVE 등, Journal of Nutrition, 123, 1939-1951 (1993)), 및 AIN-93G 에는 5 중량％ 의 셀룰로오스가 함유되는 바, 2 중량％ 의 셀룰로오스를 상기 얻어진 아세트산셀룰로오스로 치환한 것 (이하, AIN-93G-아세테이트 (AIN-93G-acetate) 라고 칭하는 경우가 있다) 을 사용하였다.
＜사육 실험＞
(실험 동물)
·야생형 마우스
7 주령의 C57BL/6J 계 웅성 마우스를 사용하였다.
·단균 정착 마우스
수컷의 C57BL/6N 계 무균 마우스를 아이솔레이터 중, 대장균 (Escherichia coli) K-12 주 (E.coli) 를 투여하여 사육함으로써 E.coli 단균 정착 마우스를 제조하였다. 또, 동일한 방법으로, 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) 단균 정착 마우스를 제조하였다.
·AID KO 마우스
AID KO 마우스 (바꿔 말하면, Activation-induced cytidine deaminase 를 결손 (녹아웃) 시킨 마우스) 는, Muramatsu 등의 방법 (Cell,102,553-563 (2000)) 으로 제조하였다. 또한, AID KO 마우스는, IgA 를 산생하지 않는다.
(사육 방법)
후술하는 실험에서 사용한 마우스는, 다음의 방법으로 사육하였다. 8 개체의 마우스에 AIN-93G 를 부여하여 1 주일 사육하였다. 사료는 자유 섭취로 하였다. 그 후, 마우스를 2 군 각 4 개체로 그룹 나누기하고, 다시 4 주간 사육하였다. 이 4 주간 사육 중에는, 1 군에는 AIN-93G 를 부여하고, 이것을 컨트롤 (Control) 군으로 하였다. 나머지 1 군에는 AIN-93G-아세테이트를 부여하고, 이것을 아세테이트 (Acetate) 군으로 하였다. 단, AID KO 마우스 및 E.coli 단균 정착 마우스는, 그 밖의 마우스와 개체수가 상이하고, 10 개체의 마우스를, 2 군 각 5 개체로 그룹 나누기하여 사육하였다.
＜분변 중의 IgA 정량＞
AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 0 일째, 1 주째, 2 주째, 3 주째 및 4 주째의 분변을 채취하고, 분변 중의 IgA 농도 (㎍/㎖) 를 정량하였다. 정량은, 마우스 IgA ELISA 정량 세트 (Mouse IgA ELISA Quantitation Set, 미국 Bethyl Laboratories Inc. 제조) 를 사용하여 실시하였다. 결과는 도 1 에 나타낸다.
AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 1 주째 이후, 아세테이트군은, 컨트롤군에 대해 높은 값을 나타내고, 2 주째에서는, 플래토에 도달하여 4 주째까지 유의하게 IgA 농도의 상승이 확인되었다.
＜IgA 결합 세균 (IgA-coated bacteria) 의 정량＞
AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 4 주간 사육한 야생형 마우스의 분변의 세균총을, PE 표지된 항 IgA 항체 (Rat anti-mouse IgA, clone 11-44-2, SouthernBiotech 사) 그리고 4,6-디아미노-2-페닐인돌 (DAPI) 로 염색하고, 플로 사이토메트리에 의해 분석을 실시하여, 플로 사이토메트리 1 차 데이터를 얻었다. 그리고, DAPI 로 염색되는 DAPI 양성 세포를 게이팅하고 (Gated on DAPI positive cells), 그 중 IgA 양성의 부분을 IgA 결합 세균으로서 정량하였다. 플로 사이토메트리는 FACS AriaII 를 사용하여 실시하고, 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar Inc.) 에 의해 해석하였다. 결과는 도 2 에 나타낸다. 도 2(a) 는, 플로 사이토메트리 1 차 데이터, 도 2(b) 는, DAPI 양성 세포에 있어서의 IgA 결합 세균의 수의 비율 (％) (％DAPI positive cells) 을 나타낸다.
DAPI 양성 세포에 있어서의 IgA 결합 세균의 수의 비율 (％) (％DAPI positive cells) 에 있어서, 아세테이트군 쪽이, 컨트롤군에 대해 높은 값을 나타내었다. 바꿔 말하면, 아세테이트군에 있어서 보다 많은 세균에 대해 친화성을 갖는 IgA 가 증가한 결과, IgA 결합 세균이 증가하였다. 본 개시의 아세트산셀룰로오스의 섭식에 의해, 장관이 특정한 세균으로부터 보호되는 등의 면역 항진 작용이 기대된다.
＜분변 중 IgA 결합 세균의 세균총 분석＞
AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 4 주간 사육한 야생형 마우스의 분변을 세균총 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 로 현탁·원심하여 상청을 얻었다. 이 상청에 포함되는 세균을 IgA-PE 항체 (Rat anti-mouse IgA, clone 11-44-2, SouthernBiotech 사) 그리고 DAPI 로 염색하고, 자기 세포 분리 (Miltenyi Biotec) 를 실시하여 IgA 음성의 세균을 채취한 후, FACS Aria II 를 사용하여 IgA 양성의 세균을 채취하였다. 이들 시료를 사용하여 16S rRNA 유전자 해석에 의해 세균을 동정하였다. 4 주간 사육한 야생형 마우스 아세테이트군의 분변의 세균총 분석 결과를 표 1 에, 4 주간 사육한 야생형 마우스 컨트롤군의 분변의 세균총 분석 결과를 표 2 에 나타낸다.
표 1 에 나타내는 바와 같이, 4 주간 사육한 야생형 마우스 아세테이트군의 분변에서는, 액티노박테리아문 (Actinobacteria), 박테로이데스문 (Bacteroidetes), 피르미쿠테스문 (Firmicutes), 프로테오박테리아문 (Proteobacteria), 테네리쿠테스문 (Tenericutes), 및 베루코미크로비움문 (Verrucomicrobia) 중에서도, 프로테오박테리아문의 세균이 다른 분류의 세균과 비교하여, 유의하게 IgA 양성을 나타내고, IgA 와의 친화성이 높다. 또한, 프로테오박테리아문에는, 대장균, 살모네라균, 비브리오, 헬리코박터 등 병원이 될 수 있는 세균이 포함된다.
표 2 에 나타내는 바와 같이, 4 주간 사육한 야생형 마우스 컨트롤군의 분변에서는, 액티노박테리아문 (Actinobacteria), 박테로이데스문 (Bacteroidetes), 피르미쿠테스문 (Firmicutes), 프로테오박테리아문 (Proteobacteria), 테네리쿠테스문 (Tenericutes), 및 베루코미크로비움문 (Verrucomicrobia) 중에서, 특히 프로테오박테리아문의 세균이 다른 분류의 세균과 비교하여, IgA 양성을 나타내는 것이 아니고, IgA 와의 친화성이 높은 것은 아니다.
＜장관의 각 부위의 IgA 농도의 정량＞
장관 내의 어느 부위에서 IgA 농도가 증가하고 있는지 조사하기 위해 부위로 나누어 IgA 농도를 정량하였다. 그 방법은 다음과 같다.
AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 4 주간 사육한 야생형 마우스에 대해, 십이지장 (Duodenum), 공장 (Jejunum), 회장 (Ileum), 맹장 (Cecum), 근위 결장 (Proximal colon), 및 원위 결장 (Distal colon) 의 각 조직을 채취하고, 컴플리트 EDTA 프리 프로테아제 인히비터 칵테일정 (Roche 사) 를 첨가한 PBS 에 보존 후, 스테인리스 비즈로 파쇄하였다. BCA 단백질 어세이 (Thermo Fisher Scientific 사) 를 이용하여 단백질 농도를 측정하고, 각 조직의 농도를 통일한 후, IgA 농도를 정량하였다. 정량은, 마우스 IgA ELISA 정량 세트 (Mouse IgA ELISA Quantitation Set, 미국 Bethyl Laboratories Inc. 제조) 를 사용하여 실시하였다. 결과는, 도 3(a) 및 (b) 에 나타낸다.
십이지장 (Duodenum), 맹장 (Cecum), 근위 결장 (Proximal colon), 및 원위 결장 (Distal colon) 에 있어서, 아세테이트군의 조직 IgA 농도는, 컨트롤군에 대해 높은 값을 나타내었다. 특히, 맹장에서 결장에 걸쳐 큰 증가가 확인되었다.
＜대장 점막 고유층의 IgA 산생 형질 세포의 정량＞
AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 4 주간 사육한 야생형 마우스의 대장 점막 고유층으로부터 임파구를 단리하기 위해, 대장을 채취하고, 길이 방향으로 개열하여 속의 분변 등을 세정하여 제거하였다. 그리고, 세정한 대장을 37 ℃ 에서 30 분간, 20 mM EDTA 함유 HBSS 중에서 진탕하였다. 상피 세포 및 지방 조직을 제거한 후, 장 조직을 잘게 소절편으로 하고, RPMI 1640 배지 (2 ％ 소 태아 혈청 (FBS), 400 단위/㎖ (로슈·다이어그노스틱스 주식회사 제조) 콜라게나아제 D, 0.25 단위/㎖ 디스파아제 (코닝사 제조), 및 0.1 ㎎/㎖ DNaseI (와코 순약 공업 주식회사 제조) 함유) 를 첨가하고, 37 ℃ 의 수욕 중에서 30 시간 진탕하였다. 소화한 조직을 RPMI 1640 배지 (2 ％ 소 태아 혈청 (FBS) 함유) 에서 세정하고, 10 ㎖ 35 ％ 퍼콜 (GE Healthcare) 에 재현탁하고, 15 ㎖ 팔콘 튜브 중의 2.5 ㎖ 70 ％ 퍼콜 상에 중층하였다. 그리고, 실온하에서 2000 rpm 으로 20 분간 원심하여, 퍼콜 밀도 구배에 의한 세포 분리를 실시하였다. 경계면의 세포를 회수하여 점막 고유층 임파구로서 사용하였다.
단리된 점막 고유층 임파구를 염색 버퍼 (PBS, 2 ％ FBS) 에 현탁하고, IgA-PE 항체 (Clone : 11-44-1, SouthernBiotech 사) 및 B220-APC 항체 (Clone : RA3-6B2, BioLegend 사) 로 염색하였다.
이와 같이 처리한 점막 고유층 임파구는 플로 사이토메트리로 분석하였다. 게이팅하고, IgA-PE 항체로 염색되지만 B220-APC 항체로 염색되지 않는 것을 IgA 산생 형질 세포 (IgA+ Plasma cells) 로서 정량하였다. 또, IgA-PE 항체 B220-APC 항체의 양방으로 염색되는 것을 B 세포 (IgA+ B cells) 로서 정량하였다.
여기서, B 세포는 임파구의 일종이며, 성숙·분화가 진행되면 항체 산생에 특화된 형질 세포가 된다. 1 개의 B 세포는, 1 종류의 항체밖에 산출할 수 없기 때문에, 그 항체 타입에 알맞은 항원 또는 세균 항원이 출현한 경우에만, 그 항체를 산출하는 B 세포가 활성화되어 항체 산생을 개시하게 된다.
플로 사이토메트리는 FACScant II 를 사용하여 실시하고, 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar Inc.) 에 의해 해석하였다. 결과는 도 4 에 나타낸다. 도 4(a) 는, 플로 사이토메트리 1 차 데이터, 도 4(b) 는, 각 세균의 수 (absolute cell number) (× 104) 를 나타낸다.
아세테이트군의 대장 점막 고유층에 있어서의 IgA 산생 형질 세포의 수가, 컨트롤군에 대해 유의하게 증가하였다. 이로써, 본 개시의 아세트산셀룰로오스의 섭취에 의해 IgA 의 증가가 기대된다.
＜맹장 내용물 및 분변의 IgA 결합 세균의 정량＞
AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 4 주간 사육한 박테로이데스 테타이오타오미크 (Bacteroides thetaitaomicron) 단균 정착 마우스 그리고 E.coli 단균 정착 마우스의 맹장 내용물 그리고 분변의 세균총을, PE 표지된 항 IgA 항체 (Rat anti-mouse IgA, clone 11-44-2, SouthernBiotech 사) 그리고 4,6-디아미노-2-페닐인돌 (DAPI) 로 염색하고, 플로 사이토메트리에 의해 분석을 실시하여, 플로 사이토메트리 1 차 데이터를 얻었다. 그리고, DAPI 로 염색되는 DAPI 양성 세포를 게이팅하고 (Gated on DAPI positive cells), 그 중 IgA 양성의 부분을 IgA 결합 세균으로서 정량하였다. 플로 사이토메트리는 FACS AriaII 를 사용하여 실시하고, 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar Inc.) 에 의해 해석하였다.
결과는 도 5 에 나타낸다. 도 5(a) 는, 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) 단균 정착 마우스의 맹장 (좌 : Cecal) 및 분변 (우 : Fecal) 의 DAPI 양성 세포에 있어서의 IgA 결합 세균의 수의 비율 (％) (％DAPI positive cells), 도 5(b) 는 프로테오박테리아문 (Proteobacteria) 에 속하는 E.coli 단균 정착 마우스의 맹장 (좌 : Cecal) 및 분변 (우 : Fecal) 의 DAPI 양성 세포에 있어서의 IgA 결합 세균의 수의 비율 (％) (％DAPI positive cells) 이다.
도 5(a) 에 나타내는 바와 같이, 아세테이트군은, 컨트롤군에 대해, 박테로이데스 테타이오타오미크론 단균 정착 마우스의 맹장 및 분변에 있어서의 IgA 결합 세균의 비율이 감소하고 있지만, 도 5(b) 에 나타내는 바와 같이, E.coli 단균 정착 마우스의 맹장 및 분변에 있어서의 IgA 결합 세균의 비율이 증가하였다. 요컨대, 아세테이트군에 있어서의 IgA 는 특히 프로테오박테리아문에 속하는 Escherichia coli K-12 주에 대해 친화성이 높아졌다. 전술한 바와 같이 프로테오박테리아문에는 병원이 될 수 있는 대장균, 살모네라균, 비브리오, 헬리코박터등의 세균이 포함되는 바, 본 개시의 아세트산셀룰로오스에 의해 유도되는 IgA 에 의해, 장관이 이들 세균으로부터 보호되는 것 (장관 보호 작용) 이 기대된다.
＜장관 관강 내용물 및 장관 점액층 내의 세균총의 평가＞
(세균총 분석)
AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 4 주간 사육한 야생형 마우스, 및 AIN-93G 또는 AIN-93G-아세테이트의 투여 개시부터 4 주간 사육한 AID KO 마우스의 대장 관강 내용물 및 대장 장관 점액층 내의 세균총은, Gong 등의 방법 (FEMS Microbiol Ecol.2007 Jan ; 59 (1) : 147-57.) 으로 채취하고, 다시 16S rRNA 유전자 해석에 의해 세균을 동정하였다.
4 주간 사육한 야생형 마우스 아세테이트군의 대장 관강 내용물과 대장 점액층 내의 세균총 분석 결과를 표 3 에, 4 주간 사육한 야생형 마우스 컨ㅌ롤군의 관강 내용물과 점액층 내의 세균총 분석 결과를 표 4 에 나타낸다. 또한, 4 주간 사육한 AID KO 마우스 아세테이트군의 관강 내용물과 대장 점액층 내의 세균총 분석 결과를 표 5 에, 4 주간 사육한 AID KO 마우스 컨트롤군의 관강 내용물과 대장 점액층 내의 세균총 분석 결과를 표 6 에 나타낸다.
야생형 마우스 아세테이트군은, 표 3 에 나타내는 바와 같이, 프로테오박테리아문의 세균이 관강 내용물에서는 2.1 ％, 점액층 내에서는 0.7 ％ 로 관강에 비해 점액층 내에 정착하기 어렵다. 이에 반해, 야생형 마우스 컨트롤군은, 표 4 에 나타내는 바와 같이, 프로테오박테리아문의 세균이 관강 내용물에서는 0.0 ％, 점액층 내에서도 0.0 ％ 로 관강에 비해 점액층 내에 정착하기 어렵다고는 할 수 없다.
IgA 를 산생하지 않는 AID KO 마우스는, 아세테이트군이어도, 표 5 에 나타내는 바와 같이, 프로테오박테리아문의 세균이 관강 내용물에서는 1.8 ％, 점액층 내에서는 32.3 ％ 로 관강에 비해 점액층 내에 매우 정착하기 쉽다. 또, AID KO 마우스 컨트롤군에서도, 표 6 에 나타내는 바와 같이, 프로테오박테리아문의 세균이 관강 내용물에서는 1.4 ％, 점액층 내에서는 22.2 ％ 로 관강에 비해 점액층 내에 매우 정착하기 쉽다. 이상으로부터, IgA 의 증가는, 대장 점액층 내에 있어서의 프로테오박테리아문 (Proteobacteria) 의 감소를 유도함으로써, 장관 보호에 기여하는 것으로 생각된다.
Claims (5)
- 아세틸 총 치환도가 0.4 이상 1.1 이하인 아세트산셀룰로오스를 함유하는, 장관 면역 항진제.
- 제 1 항에 있어서,
상기 아세트산셀룰로오스는, 하기 식으로 정의되는 조성 분포 지수 (CDI) 가 2.0 이하인, 장관 면역 항진제.
CDI ＝ (조성 분포 반치폭의 실측값)/(조성 분포 반치폭의 이론값)
조성 분포 반치폭의 실측값 : 아세트산셀룰로오스 (시료) 의 잔존 수산기를 모두 프로피오닐화하여 얻어지는 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 HPLC 분석하여 구한 조성 분포 반치폭
DS : 아세틸 총 치환도
DPw : 중량 평균 중합도 (아세트산셀룰로오스 (시료) 의 잔존 수산기를 모두 프로피오닐화하여 얻어지는 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트를 사용하여 GPC-광 산란법에 의해 구한 값) - 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 장관 면역 항진제를 함유하는, 식품.
- 제 3 항에 있어서,
상기 식품에 있어서의 상기 아세트산셀룰로오스의 함유량이 0.1 중량％ 이상 5 중량％ 미만인, 식품. - 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 장관 면역 항진제를 함유하는, 의약.
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