WO2018174141A1 - 制御性ｔ細胞増加剤、食品、及び医薬 - Google Patents

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WO2018174141A1
WO2018174141A1 PCT/JP2018/011341 JP2018011341W WO2018174141A1 WO 2018174141 A1 WO2018174141 A1 WO 2018174141A1 JP 2018011341 W JP2018011341 W JP 2018011341W WO 2018174141 A1 WO2018174141 A1 WO 2018174141A1
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regulatory
degree
substitution
group
cell
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PCT/JP2018/011341
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周 島本
修二 吉岡
大野　博司
直志 竹内
栄治 宮内
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株式会社ダイセル
国立研究開発法人理化学研究所
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    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid

Definitions

  • the present invention relates to a regulatory T cell increasing agent, food, and medicine.
  • microbiota in anatomical sites including mouth, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, cecum, colon, rectum, vagina, skin, nasal cavity, ears, and lungs.
  • the microbiota is involved in immune system development; carbohydrate, protein and xenobiotic metabolism; epithelial formation and regeneration; fat storage; hormone and vitamin production;
  • human microbiota that may be caused by any factor is infectious diseases; ulcerative colitis, Crohn's disease, type 1 diabetes, food allergies, asthma, rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases, autoimmune diseases and allergic diseases As well as metabolic diseases such as type 2 diabetes, metabolic syndrome, obesity and malnutrition.
  • Patent Document 1 discloses a composition for the treatment of autoimmune diseases, inflammatory diseases or infectious diseases, wherein two or more substances selected from the group consisting of the following (a) to (b) are used as active ingredients: Compositions that induce proliferation or accumulation of regulatory T cells have been described.
  • A Bacteria belonging to human-derived clostridial cluster 14a or physiologically active substance derived from the bacterium
  • Non-Patent Document 1 describes that regulatory T cells (T reg ) are proliferated by orally administering specific bacteria such as bacteria belonging to Clostridium cluster 4 and Clostridium cluster 14a.
  • Non-Patent Document 2 describes that butyric acid induced by bacteria belonging to the Clostridium network controls the differentiation of regulatory T cells.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 describe that the ratio of regulatory T cells in the large intestine is increased by feeding mice with butyrated starch.
  • Patent Document 2 Based on the description in Non-Patent Document 2, the method using the composition described in Patent Document 1 directly administers a bacterium that induces butyric acid, increases the butyric acid concentration, and increases the proliferation or accumulation of regulatory T cells. It is a probiotic approach to induce.
  • the bacterium is hermetically sealed in order to keep the intended bacterium alive and to suppress the propagation of other bacteria other than the bacterium, such as preservation and transportation of yogurt and the like.
  • it is refrigerated and there are many restrictions on the storage conditions and the form of feeding, such as the necessity of providing a relatively short storage period of several weeks, and the effect of increasing regulatory T cells is not shown depending on the intestinal environment.
  • Non-Patent Document 2 in CD4 lymphocytes, those induced to differentiate into regulatory T cells by giving butyrated starch in colitis pathological model mice. Although it is 7%, which is increased from 1.62% in the Control group, the content of butyrated starch in the feed requires 15% (w / w) and a considerably high dose. If such a high dose is required, the amount of human inoculation per day is about 30 g. This is a considerable amount considering, for example, about 80 g of dry noodles, and is a painful amount when taken orally as a pharmaceutical product. The amount that detracts from the enjoyment.
  • An object of the present invention is to provide a regulatory T cell-increasing agent capable of reducing regulatory conditions and the form of feeding, and sufficiently increasing regulatory T cells at a lower dose.
  • the first of the present invention relates to a regulatory T cell increasing agent comprising a cellulose derivative having a butyryl substitution degree of 0.3 or more and 2.6 or less and a total substitution degree of 0.5 or more and 2.8 or less as an active ingredient. .
  • the regulatory T cell increasing agent may have a butyryl substitution degree of 0.3 to 1.5 and a total substitution degree of 0.5 to 1.5 in the cellulose derivative.
  • the regulatory T cell increasing agent may have a degree of acetyl substitution of the cellulose derivative of more than 0 and 2.5 or less.
  • the regulatory T cell increasing agent may have a degree of acetyl substitution of the cellulose derivative of 0.
  • the cellulose derivative may be cellulose butyrate or cellulose acetate butyrate.
  • the second of the present invention relates to a food containing the regulatory T cell increasing agent.
  • the food may contain 1% by weight or more and 5% by weight or less of the cellulose derivative, containing the regulatory T cell increasing agent.
  • the third of the present invention relates to a medicament containing the regulatory T cell increasing agent.
  • the fourth aspect of the present invention relates to a preventive and / or therapeutic drug for inflammatory bowel disease comprising the regulatory T cell increasing agent.
  • a regulatory T cell-increasing agent that can reduce restrictions on storage conditions and form of feeding, and can sufficiently increase regulatory T cells at a lower dose.
  • FIG. 3 is a diagram showing a 13 C-NMR spectrum of acetylated or butyryl cellulose acetate butyrate.
  • FIG. 3 shows a 13 C-NMR spectrum of acetylated or butyrylated regenerated cellulose. It is a figure which shows the 13 C-NMR spectrum of acetylated cellulose butyrate. It is a figure which shows the result of flow cytometry. It is a figure which shows the analysis result of the density
  • SCFA intestinal short chain fatty acid
  • the regulatory T cell increasing agent according to the present disclosure comprises a cellulose derivative having a butyryl substitution degree of 0.3 or more and 2.6 or less and a total substitution degree of 0.5 or more and 2.8 or less as an active ingredient. is there.
  • the cellulose derivative of the present disclosure has a butyryl substitution degree of 0.3 or more and 2.6 or less, preferably 0.3 or more and 1.5 or less, and more preferably 0.5 or more and 1.5 or less. Preferably, it is 0.7 or more and 1.4 or less, and more preferably 0.8 or more and 1.3 or less. If the degree of butyryl substitution is less than 0.3, depending on the dose, butyric acid generally released in the gastrointestinal tract decreases, and it is difficult to obtain the desired effect of increasing regulatory T cells. On the other hand, if the degree of butyryl substitution exceeds 2.6, decomposition by bacteria such as enteric bacteria tends to be suppressed in the digestive tract, possibly because the hydrophobicity is too high, and free butyric acid tends to decrease.
  • the cellulose derivative of the present disclosure has a total substitution degree of 0.5 or more and 2.8 or less, preferably 0.5 or more and 2.0 or less, and 0.5 or more and 1.5 or less. More preferably, it is 1.0 or more and 1.5 or less. If the total substitution is less than 0.5, although generally depending on the dose, butyric acid released in the digestive tract generally decreases, and it is difficult to obtain the desired effect of increasing regulatory T cells. On the other hand, if the total degree of substitution exceeds 2.8, decomposition by bacteria such as intestinal bacteria is suppressed in the digestive tract, possibly because the hydrophobicity is too high, and free butyric acid tends to decrease.
  • the degree of butyryl substitution refers to the sum of the number of butyryl groups substituting the hydrogen atoms of the 2-, 3- and 6-position hydroxyl groups per cellulose repeating unit (glucopyranose unit). The same applies to the degree of substitution with other substituents such as the degree of acetyl substitution.
  • the total degree of substitution refers to the sum of the degree of butyryl substitution and the degree of substitution with other substituents.
  • the substituent of the cellulose derivative of the present disclosure is only a butyryl group from the viewpoint of butyric acid delivery to the digestive tract such as the large intestine.
  • the cellulose derivative of the present disclosure may have the same butyryl substitution value and total substitution value.
  • it may be substituted with a substituent other than a butyryl group.
  • substituent other than the butyryl group include an acetyl group, a carboxyl group, a carboxymethyl group, a 2-hydroxyethyl group, a 2-hydroxypropyl group, and a methyl group.
  • a part of the 6-position (hydroxymethyl group) of cellulose may be oxidized to a carboxyl group.
  • a butyryl group is preferred. Introduction of an acetyl group, a carboxymethyl group, or a carboxyl group, which is less hydrophobic than that, is effective. It may be substituted with one or more of substituents other than butyryl group.
  • cellulose acetate butyrate cellulose acetate butyrate
  • acetyl group remains or is introduced into the obtained cellulose derivative.
  • the cellulose derivative of the present disclosure preferably has the same butyryl substitution value and total substitution value, and the acetyl substitution degree is preferably 0, but when the cellulose derivative is substituted with an acetyl group,
  • the degree of acetyl substitution is preferably more than 0 and 2.5 or less, and more preferably 0.1 or more and 1.0 or less.
  • the cellulose derivative when a cellulose derivative is substituted only with a butyryl group, the cellulose derivative is called cellulose butyrate (or cellulose butyrate), and the substituent of the cellulose derivative is also substituted with an acetyl group in addition to the butyryl group.
  • the cellulose derivative is referred to as cellulose acetate butyrate (or cellulose acetate butyrate or acetated butyrate).
  • the degree of substitution of the cellulose derivative can be measured by the following method. For example, it can be measured by the NMR method according to the method of Tezuka (Tetsuka, Carbondr. Res. 273, 83 (1995)). That is, the free hydroxyl group of the cellulose derivative is acylated with carboxylic acid anhydride in pyridine.
  • the kind of carboxylic acid anhydride to be used here should be selected according to the purpose of analysis. For example, when analyzing the degree of butyryl substitution of cellulose butyrate, acetic anhydride is preferable.
  • the carbon signal of the acetyl group is in the range of 169 ppm to 171 ppm in the order of the 2nd, 3rd and 6th positions from the high magnetic field
  • the carbon signal of the butyryl group is , 171 ppm to 173 ppm similarly appear in the order of 2nd, 3rd and 6th from the high magnetic field side.
  • the carbonyl carbon of the propionyl group is analyzed.
  • the signal appears in the same order in the region from 172 ppm to 174 ppm.
  • the carbonyl carbon signal of the acyl group originally possessed by the cellulose derivative and the carbonyl of the acyl group introduced by the carboxylic anhydride treatment When the total sum of signal areas is normalized to 3.0, and the abundance ratio of acetyl groups, butyryl groups, and propionyl groups at the corresponding positions (in other words, the area ratio of each signal) is obtained, Each acetyl, butyryl or propionyl substitution degree at the 2-position, 3-position and 6-position of the glucose ring can be used.
  • the substituents containing an acyl group that can be analyzed by this method are only those substituents that do not correspond to the carboxylic anhydride used in the treatment for the purpose of analysis. In addition to 13 C-NMR, it can also be analyzed by 1 H-NMR.
  • the total substitution degree of the 2-position, 3-position and 6-position of the glucose ring of the cellulose derivative as a sample is 3.0, and all the substituents are limited substituents such as an acetyl group and a butyryl group. If it is known in advance, the NMR spectrum can be measured by dissolving the sample directly in deuterated chloroform except for the step of propionylation. If the substituents are all acetyl and butyryl groups, the carbon signal of the acetyl group is in the order of 2nd, 3rd, and 6th positions from a high magnetic field in the region of 169 ppm to 171 ppm as in the case of including the propylation step.
  • the glucose in the cellulose derivative is determined from the abundance ratio of the acetyl group and the butyryl group at the corresponding positions (in other words, the area ratio of each signal).
  • the degree of substitution such as the degree of substitution of acetyl and butyryl at the 2-position, 3-position and 6-position of the ring can be determined.
  • the manufacturing method of the cellulose derivative of the present disclosure is not particularly limited, but can be manufactured as follows, for example. First, using cellulose, a cellulose derivative substituted only with an aliphatic acyl group other than butyryl group or other substituents, or another cellulose derivative having a butyryl group as a raw material, in the presence of a catalyst in an organic solvent, the raw material This can be done by reacting cellulose or cellulose derivatives with butyric anhydride or butyric acid chloride.
  • the organic solvent include acetic acid, acetone, pyridine, N, N-dimethylacetamide (DMAc), a DMAc solution of lithium chloride, and a mixed solvent thereof. Among these, a solvent containing at least acetic acid is preferable.
  • the catalyst include sulfuric acid, pyridine, N, N-dimethyl-4-aminopyridine and the like.
  • the cellulose is activated, then acylated with an acylating agent in the presence of a sulfuric acid catalyst, and then partially neutralized and deacylated (hydrolyzed if necessary).
  • a sulfuric acid catalyst in the presence of a sulfuric acid catalyst
  • cellulose such as acetic acid, propionic acid and butyric acid is activated with an organic carboxylic acid corresponding to an acyl group (butyric acid when substituted with a butyryl group), and then anhydrous with a sulfuric acid catalyst.
  • the natural cellulose used as a raw material generally includes wood pulp or cotton linter. These natural celluloses have a weight average polymerization degree of about 1,500 to 3,000 or 3,000 to 6,000, respectively. As described above, when the cellulose derivative of the present disclosure is prepared using natural cellulose as a raw material, the weight average degree of polymerization decreases during the adjustment process, and may be about 50 to 1,500.
  • the weight average polymerization degree of the cellulose derivative of the present disclosure is not particularly limited. For example, from the viewpoint of the stirring load in various reaction operations when preparing the cellulose derivative and the amount of the precipitating agent used in the precipitation operation after the aging step.
  • the weight average degree of polymerization is preferably about 100 to 400.
  • the regulatory T cell in the regulatory T cell increasing agent of the present disclosure refers to a T cell that suppresses an abnormal or excessive immune response and participates in immune tolerance. Regulatory T cells are typically transcription factor Foxp3 positive CD4 positive T cells.
  • Increase in the regulatory T cell increasing agent of the present disclosure includes any meaning of differentiation of immature T cells into regulatory T cells, proliferation and / or accumulation of regulatory T cells induced by the differentiation.
  • the increase includes an increase in any of in vivo, in vitro, and ex vivo systems.
  • the administration of the regulatory T cell increasing agent increases the regulatory T cells in the intestine.
  • the effect of the said regulatory T cell increasing agent administration can be evaluated as follows.
  • the lymphocytes isolated from experimental animals such as mice orally administered with the regulatory T cell increasing agent, CD4 positive cells expressing Foxp3 are labeled as regulatory T cells in the present disclosure, and flow cytometry
  • the ratio of the regulatory T cells can be measured with the total number of isolated lymphocytes as 100.
  • the mechanism by which the regulatory T cells in the intestine increase by administration of the regulatory T cell increasing agent, particularly oral administration, is as follows.
  • the cellulose derivative of the present disclosure which is an active ingredient of the regulatory T cell increasing agent, is not degraded by mammalian digestive enzymes, but is partly or wholly fermented and degraded by enteric bacteria.
  • enteric bacteria As products of fermentation and degradation of the cellulose derivative by the enteric bacteria, butyric acid derived from a butyryl group; and short chain fatty acids (SCFA) such as acetic acid, propionic acid, and butyric acid derived from a glucose residue are considered. . Of these, butyric acid increases preferentially.
  • the cellulose derivative of the present disclosure is decomposed by intestinal bacteria and has an effect of increasing butyric acid concentration by releasing butyric acid in the intestine.
  • Ingestion of the cellulose derivative of the present disclosure increases Bacteroidetes bacteria in the intestine. Therefore, Bacteroides bacteria may be involved in the release of butyric acid.
  • a relatively large number of Bacteroides bacteria are known to hydrolyze acyl groups of polysaccharides having acyl groups such as acetyl and 3-phenylpropionyl (DylanyDodd et al, ”Xylan degradation, a metabolic property shared by rumen and human colonic Bacteroidetes ”, Mol Microbiol., 2011 January, Vol. 79 (2), p. 292-304).
  • Non-Patent Document 2 differentiation of immature T cells into regulatory T cells is induced by an increase in butyric acid in the intestine, and regulatory T cells in the intestine increase.
  • administration of the regulatory T cell increasing agent of the present disclosure provides food to give butyric acid in the intestine. It is a creative approach to cellulose as a fiber, and it is a so-called prebiotic approach to address the environmental side against intestinal bacteria.
  • probiotics and prebiotics are not at odds, but show synergistic effects, or show complementary effects such that one of them does not show any effect and the other works effectively. That is expected.
  • the regulatory T cell increasing agent of the present disclosure can take a prebiotic approach.
  • the regulatory T cell increasing agent of this indication has the characteristics that the preservation
  • the regulatory T cell increasing agent of the present disclosure can be stored at room temperature for about 1 year, and can be used as a component of foods baked at temperatures below 200 ° C. such as bread, cakes, biscuits and the like.
  • the regulatory T cell increasing agent of the present disclosure may be contained in foods or medicines and can be used as a constituent of various foods or medicines as follows, and the administration method includes oral administration in particular. It is done.
  • Various forms can be selected. For example, powders, granules, tablets, sugar-coated tablets, capsules, syrups, pills, suspensions, liquids and emulsions, and other conventional pharmaceutical forms, and beverages; gums, chocolates, strawberries, sheep goats, jelly, etc.
  • the content of the cellulose derivative is preferably 0.5% by weight or more, preferably 1% by weight or more and 5% by weight or less of the food. More preferably, it is 1.5 to 3% by weight.
  • target diseases useful for prevention and / or treatment (reduction or prevention of adverse effects) when the regulatory T cell increasing agent of the present disclosure is contained in food or medicine include autoimmune diseases, Examples include allergic diseases, infectious diseases, and rejection in organ transplantation. Inflammatory bowel disease (IBD), ulcerative colitis, Crohn's disease, sprue, autoimmune arthritis, rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, multiple sclerosis, graft versus host rejection following bone marrow transplantation, degenerative joint Disease, juvenile chronic arthritis, Lyme disease arthritis, psoriatic arthritis, reactive arthritis, spondyloarthritis, systemic lupus erythematosus, insulin-dependent diabetes mellitus, thyroiditis, asthma, psoriasis, dermatosis dermatoderma, atopy Dermatitis, graft-versus-host rejection, acute or chronic immune disease related to organ transplantation, sarcoidosis, atherosclerosis, disseminated intravascular coagulation syndrome
  • Increased regulatory T cells in the intestines such as the small intestine, large intestine, cecum, colon, and rectum, especially in the lamina intestinal of the large intestine, can cause inflammatory bowel diseases such as Coulomb disease and ulcerative colitis and food It is useful for the prevention and / or treatment of allergies such as allergies.
  • the dose of the regulatory T cell increasing agent of the present disclosure is administered to an individual in an amount sufficient to bring about the desired effect of increasing regulatory T cells. Specifically, it is determined empirically in consideration of the condition, administration method, formulation form, etc. of the administered individual, such as the individual's age, weight, sex, health status, and conditions such as stomach, small intestine, and large intestine. Can be done.
  • the amount in one administration may be, for example, 12.5 mg / kg body weight to 125 mg / kg body weight, or 25 mg / kg body weight to 75 mg / kg body weight.
  • it may be administered to an individual once or more than once. If administered more than once, it may be administered periodically, irregularly, or as needed.
  • the appropriate number of administrations can be determined empirically in consideration of individual conditions, administration methods, formulation forms, etc., as well as the dosage.
  • the raw material cellulose acetate butyrate has an acetyl substitution degree of 0.1, a butyryl substitution degree of 2.5, and a total substitution degree of 2.6.
  • Cell-WSCB is , A regenerated cellulose having no acetyl group or butyryl group.
  • WSCB cellulose butyrate having an acetyl substitution degree of 0.0, a butyryl substitution degree of 1.3, and a total substitution degree of 1.3, as shown later in “Measurement of substitution degree”.
  • the reaction mixture was cooled to near room temperature and added to 600 mL of a methanol / deionized water mixed solvent (volume ratio 1/1) to form a precipitate and the liquid was drained.
  • the precipitate was washed three times with 60 mL of a mixed solvent having the same composition.
  • the precipitate was dissolved in 30 mL acetone.
  • the acetone solution of the precipitate was added to 600 mL of a methanol / deionized water mixed solvent (volume ratio of 1/1) to form a precipitate and drained.
  • the precipitate was washed three times with 60 mL of a mixed solvent having the same composition. And it dried under reduced pressure at 80 degreeC and obtained the powdery sample.
  • the obtained sample is an acetylated raw material cellulose acetate butyrate. This is designated as AN020.
  • the total substitution degree of AN020 acetyl group and butyryl group is 3.0.
  • acylated (acetylated) the ratio of acetyl group to butyryl group before or after the second acylation (or acetyl group and butyryl calculated on the premise that the total degree of substitution is 3.0) This was verified by the fact that the degree of substitution of each group) did not change.
  • AN020 was dissolved in deuterated chloroform and the 13 C-NMR spectrum was measured.
  • the results are shown in FIG.
  • the sum total of the areas of these signals is set to 3.0, and the ratio of the sum of the areas of Ac 2 , Ac 3 , Ac 6 and the sum of the areas of Bu 2 , Bu 3 , Bu 6 in this sum is obtained. And the degree of butyryl substitution. As a result, the degree of butyryl substitution was 2.5.
  • the total substitution degree of AN021 acetyl group and butyryl group is also 3.0.
  • cellulose acetate butyrate has an acetyl group and a butyryl group, and further has an unsubstituted hydroxyl group
  • AN020 obtained by acetylating this unsubstituted hydroxyl group
  • the butyryl substitution degree determined for is equal to the butyryl substitution degree of the raw material cellulose acetate butyrate.
  • the degree of acetyl substitution determined for AN021 is equal to the degree of acetyl substitution of the raw material cellulose acetate butyrate. Therefore, the raw material cellulose acetate butyrate has an acetyl substitution degree of 0.1, a butyryl substitution degree of 2.5, and a total substitution degree of 2.6.
  • This reaction mixture was added to 1,200 mL of a methanol / deionized water mixed solvent (volume ratio 1/1) to form a precipitate and drained.
  • the precipitate was washed three times with 120 mL of a mixed solvent having the same composition.
  • the resulting precipitate was dissolved in 60 mL of acetone.
  • the acetone solution of the precipitate was added to 1,200 mL of a methanol / deionized water mixed solvent (volume ratio 1/1) to form a precipitate, and the solution was drained.
  • the precipitate was washed three times with 120 mL of a mixed solvent having the same composition, and then dried under reduced pressure at 80 ° C. to obtain a powdery sample. This is designated as AN009.
  • AN009 was dissolved in deuterated chloroform, and the 13 C-NMR spectrum was measured in the same manner as AN020. The results are shown in FIG. In the spectrum of AN009, no signal corresponding to the butyryl group was observed.
  • AN013 was dissolved in deuterated chloroform, and the 13 C-NMR spectrum was measured in the same manner as AN020. The results are shown in FIG. In the spectrum of AN013, no signal corresponding to the acetyl group was observed.
  • the degree of acetyl substitution determined for the obtained AN013 is 0.
  • the degree of acetyl substitution determined for AN013 is also equal to that of Cell-WSCB. Therefore, the degree of acetyl substitution of Cell-WSCB is 0. Therefore, Cell-WSCB obtained by base-catalyzed deesterification of raw material cellulose acetate butyrate has a degree of acetyl substitution of 0 and a degree of butyryl substitution of 0. That is, Cell-WSCB was confirmed to be regenerated cellulose.
  • the cellulose butyrate (WSCB) was acetylated by the same method as the acetylation of the raw material cellulose acetate butyrate (1) except that the raw material cellulose acetate butyrate was replaced with cellulose butyrate (WSCB) to obtain a powdery sample. This is designated as AN004.
  • AN004 was dissolved in deuterated chloroform, and the 13 C-NMR spectrum was measured in the same manner as AN020. The results are shown in FIG. In AN020, no signal corresponding to the acetyl group was observed.
  • Cell-WSCB does not have an acetyl group, it is considered that all acetyl groups shown in the spectrum of AN004 were introduced by the subsequent acetylation.
  • all butyryl groups shown in the spectrum of AN004 are considered to be derived from WSCB.
  • the total degree of substitution of the acetyl group and butyryl group of AN004 is also 3.0.
  • the sum of signal areas of Ac 2 , Ac 3 , Ac 6 , Bu 2 , Bu 3 , Bu 6 is 3.0, and the sum of the areas of Ac 2 , Ac 3 , Ac 6 and Bu 2 , Bu 3 in this sum.
  • the ratio of the sum of the areas of Bu 6 was determined, and each was defined as the acetyl substitution degree and the butyryl substitution degree.
  • the degree of butyryl substitution was 1.3.
  • the degree of butyryl substitution determined for the obtained AN004 is equal to the degree of butyryl substitution of cellulose butyrate (WSCB). Therefore, the butyryl substitution degree of cellulose butyrate (WSCB) is 1.3.
  • the weight average degree of polymerization of WSCB thus determined was 254, and the number average degree of polymerization was 128.
  • mice 4-week-old C57BL / 6J male mice were used.
  • mice were given purified feed AIN-93G and raised for 1 week (preliminary breeding). Thereafter, the mice were grouped into 5 groups each of 2 groups and further bred for 4 weeks. At this time, one group was given purified feed AIN-93G, which was designated as the Control group. WSCB-AIN-93 was given to the remaining one group, which was designated as the Butyrate group. All feeds were freely consumed.
  • lymphocyte separation and flow cytometry In order to isolate lymphocytes from the large intestine and the lamina intestinal of the small intestine of the bred mouse, the large intestine was collected, cleaved in the longitudinal direction, and feces etc. therein were washed and removed. The washed large intestine was shaken at 37 ° C. for 30 minutes in 20 mM EDTA-containing HBSS.
  • the intestinal tissue was finely divided into small sections and RPMI 1640 medium (2% fetal bovine serum (FBS), 400 units / ml (Roche Diagnostics Inc.) collagenase D, 0 .25 units / ml dispase (manufactured by Corning) and 0.1 mg / ml DNase I (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added, and the mixture was shaken in a 37 ° C. water bath for 30 hours.
  • FBS fetal bovine serum
  • 400 units / ml Roche Diagnostics Inc.
  • collagenase D 0 .25 units / ml dispase
  • 0.1 mg / ml DNase I manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the digested tissue was washed with RPMI 1640 medium (containing 2% fetal bovine serum (FBS)), resuspended in 10 ml 35% Percoll (GE Healthcare) and overlaid on 2.5 ml 70% Percoll in a 15 ml Falcon tube. did. And it centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes under room temperature, and performed the cell separation by a Percoll density gradient. The cells at the interface were collected and used as lamina intestinal lymphocytes.
  • RPMI 1640 medium containing 2% fetal bovine serum (FBS)
  • FBS fetal bovine serum
  • the collected cells were suspended in a staining buffer (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA, and 0.09% NaN 3 ) and labeled with an APC-eFlour780-labeled anti-CD4 antibody (RM4-5, eBioscience), BV421. And anti-CD3e antibody (145-2C11, BD Biosciences). Subsequently, intracellular Foxp3 staining was performed using Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience) and an anti-Foxp3 antibody labeled with PE (FJK-16s, eBioscience).
  • a staining buffer PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA, and 0.09% NaN 3
  • the average concentrations in the intestine of the Control group were 39.24 ⁇ mol / g for acetic acid, 4.69 ⁇ mol / g for propionic acid concentration and 2.01 ⁇ mol / g for n-butyric acid concentration.
  • Each average concentration in the intestine is 32.96 ⁇ mol / g for the acetic acid concentration, 3.17 ⁇ mol / g for the propionic acid concentration, and 50.47 ⁇ mol / g for the n-butyric acid concentration.
  • the average ratio of Bacteroides bacteria of 3 individuals in the Control group is 1.2%, and the average ratio of Bacteroides bacteria of 3 individuals in the Butyrate group is 41.5%.
  • the intestinal flora of the Butyrate group mice had an increased proportion of Bacteroidetes bacteria.
  • the ratio of Bacteroides (Bacteroides) bacteria increased, and it was shown that Bacteroides (Bacteroides) bacteria are involved in the increase of the butyric acid concentration in the intestine.

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Abstract

保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分に制御性Ｔ細胞を増加することができる、制御性Ｔ細胞増加剤を提供することを目的とする。　ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であり、総置換度が０．５以上２．８以下であるセルロース誘導体を有効成分とする制御性Ｔ細胞増加剤。

Description

制御性Ｔ細胞増加剤、食品、及び医薬
　本発明は、制御性Ｔ細胞増加剤、食品、及び医薬に関する。
　ヒトを含む動物は、口、食道、胃、小腸、大腸、盲腸、結腸、直腸、膣、皮膚、鼻腔、耳、及び肺を含む解剖学的部位に多くの微生物叢を有しており、ヒトの微生物叢は、免疫系の発生；糖質、タンパク質、及び生体異物の代謝；上皮の形成及び再生；脂肪の貯蔵；ホルモン及びビタミンの産生；並びに病原体感染の防御等に関与している。
　そして、何らかの要因によって生じ得るヒト微生物叢の改変は、感染性疾患；潰瘍性大腸炎、クローン病、１型糖尿病、食物アレルギー、喘息、及び関節リウマチ等の炎症性疾患、自己免疫疾患及びアレルギー疾患；並びに２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、栄養失調等の代謝性疾患等に関連する。
　このように、ヒト微生物叢の改変はヒトの病状の進行に重要な役割を果たすため、ヒト微生物叢の改変を利用した種々の治療が存在する。このような治療方法の例として、抗生物質の投与、プレバイオティクスの利用、プロバイオティクスの投与、及び糞便移植等が挙げられる。
　特許文献１には、自己免疫疾患、炎症性疾患又は感染症の治療用組成物であって、下記（ａ）～（ｂ）からなる群より選択される２以上の物質を有効成分とする、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する組成物が記載されている。
（ａ）ヒト由来のクロストリジウム　クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）ヒト由来のクロストリジウム　クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
　また、特許文献１の図１８によれば、無菌マウスに対してクロストリジウムを定着させることでＣＤ４リンパ球のうち制御性Ｔ細胞に分化誘導されたものは約３０％であって、無菌マウス群の約１０％に対して増加している。
　非特許文献１には、クロストリジウムクラスター４及びクロストリジウムクラスター１４ａに属する細菌等、特定の細菌を経口投与することで、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増殖することが記載されている。
　非特許文献２には、クロストリジウム網に属する細菌が誘導した酪酸が制御性Ｔ細胞の分化を制御することが記載されている。
　非特許文献２および３には、酪酸化でんぷんをマウスに食べさせることで大腸の制御性Ｔ細胞の割合が増加することが記載されている。
特開２０１６－１２８４０８号公報
Nature, Vol. 500, p. 232-236 (2013) Nature, Vol. 504, p. 446-450 (2013) 大野 博司、他2名、"腸内細菌が作る酪酸が制御性T細胞への分化誘導のカギ"、［online］、2013年11月14日、独立行政法人理化学研究所、［2014年2月17日検索］、インターネット（URL: http://www.riken.jp/pr/press/2013/20131114_1/）
　特許文献１に記載の組成物を用いる方法は、非特許文献２の記載を踏まえれば、酪酸を誘導する細菌を直接的に投与し、酪酸濃度を高めて、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する、いわばプロバイオティクス的アプローチである。
　このような従来の特定の細菌を用いる方法では、例えばヨーグルトなどの保存・輸送のように、意図した細菌を生存させ、当該細菌以外の他の雑菌の繁殖を抑制するために、当該細菌を密閉し、冷蔵し、数週間程度の比較的短い保存期限を設ける必要がある等保存条件や給与形態の制約が多い、また、腸内環境によっては制御性Ｔ細胞の増加効果を示さない。
　また、非特許文献２のＦｉｇｕｒｅ　４（ｆ）によれば、大腸炎の病態モデルマウスにおいて、酪酸化でんぷんを与えることで、ＣＤ４リンパ球のうち制御性Ｔ細胞に分化誘導されたものは３．７％と、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の１．６２％に対して増加しているが、酪酸化でんぷんの飼料中含有量は１５％（ｗ／ｗ）と相当に高い用量を要する。このような高い用量が必要となれば、ヒトが一日に接種する量としては３０ｇ程度となる。これは、例えば乾麺一食が８０ｇ程度であることを考えるとこれは相当な量であり、医薬品として経口摂取するには苦痛を伴う量であり、また、食品として摂取する場合には通常の食事の楽しみを損なう量である。
　本発明は、保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分に制御性Ｔ細胞を増加することができる、制御性Ｔ細胞増加剤を提供することを目的とする。
　本発明の第一は、ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であり、総置換度が０．５以上２．８以下であるセルロース誘導体を有効成分とする制御性Ｔ細胞増加剤に関する。
　前記制御性Ｔ細胞増加剤は、前記セルロース誘導体のブチリル置換度が０．３以上１．５以下であり、総置換度が０．５以上１．５以下であってよい。
　前記制御性Ｔ細胞増加剤は、前記セルロース誘導体のアセチル置換度が０を超え２．５以下であってよい。
　前記制御性Ｔ細胞増加剤は、前記セルロース誘導体のアセチル置換度が０であってよい。
　前記制御性Ｔ細胞増加剤は、前記セルロース誘導体が酪酸セルロースまたは酢酸酪酸セルロースであってよい。
　本発明の第二は、前記制御性Ｔ細胞増加剤を含有する食品に関する。
　前記制御性Ｔ細胞増加剤を含有し、前記セルロース誘導体は１重量％以上５重量％以下である食品であってよい。
　本発明の第三は、前記制御性Ｔ細胞増加剤を含有する医薬に関する。
　本発明の第四は、前記制御性Ｔ細胞増加剤を含有する炎症性腸疾患の予防及び／又は治療用医薬に関する。
　本発明によれば、保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分に制御性Ｔ細胞を増加することができる、制御性Ｔ細胞増加剤を提供することができる。
アセチル化またはブチリル化した酢酸酪酸セルロースの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 アセチル化またはブチリル化した再生セルロースの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 アセチル化した酪酸セルロースの１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 フローサイトメトリーの結果を示す図である。 腸内短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の濃度の分析結果を示す図である。 腸内細菌叢の評価結果を示す図である。
　以下、好ましい実施の形態の一例を具体的に説明する。
　本開示に係る制御性Ｔ細胞増加剤は、ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であり、総置換度が０．５以上２．８以下であるセルロース誘導体を有効成分とするものである。
　［セルロース誘導体］
　本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であるところ、０．３以上１．５以下であることが好ましく、０．５以上１．５以下であることがより好ましく、０．７以上１．４以下であることが更に好ましく、０．８以上１．３以下であることが最も好ましい。ブチリル置換度が０．３未満であると、用量にもよるが一般に消化管内で遊離する酪酸が少なくなり、所望の制御性Ｔ細胞の増加効果が得られ難い。また、ブチリル置換度が２．６を超えると、おそらく疎水性が高すぎることを理由として、消化管内で腸内細菌などの細菌による分解が抑制され、遊離する酪酸が少なくなる傾向がある。
　次に、本開示のセルロース誘導体は、総置換度が０．５以上２．８以下であるところ、０．５以上２．０以下であることが好ましく、０．５以上１．５以下であることがより好ましく、１．０以上１．５以下であることが更に好ましい。総置換が０．５未満であると、用量にもよるが一般に消化管内で遊離する酪酸が少なくなり、所望の制御性Ｔ細胞の増加効果が得られ難い。また、総置換度が２．８を超えると、おそらく疎水性が高すぎることを理由として消化管内で腸内細菌などの細菌による分解が抑制され、遊離する酪酸が少なくなる傾向がある。
　ここで、ブチリル置換度とは、セルロースの繰り返し単位（グルコピラノース単位）あたりの２位、３位、及び６位の水酸基の水素原子を置換するブチリル基の数の和をいう。アセチル置換度等その他の置換基による置換度も同様である。また、総置換度とは、ブチリル置換度及びその他の置換基による置換度の和をいう。
　本開示のセルロース誘導体の置換基は、大腸など消化管への酪酸送達の観点からは、ブチリル基のみ、言い換えれば、本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度及び総置換度の値が等しいことが好ましいが、ブチリル基以外の置換基により置換されていてもよい。ブチリル基以外の置換基としては、例えば、アセチル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、２－ヒドロキシエチル基、２－ヒドロキシプロピル基、及びメチル基等が挙げられる。上記の通り、セルロースの６位（ヒドロキシメチル基）の一部を酸化してカルボキシル基にしてもよい。消化管内で腸内細菌などの細菌による分解を促進し、遊離する酪酸を多くする観点からは、セルロース誘導体に親水性を付与するのがよく、この観点からはこれらの置換基の中でも、ブチリル基に比して疎水性が低いアセチル基、カルボキシメチル基、カルボキシル基の導入は有効である。ブチリル基以外の置換基のうち１種または２種以上により置換されていてもよい。
　特に、ブチリル基以外の置換基として、ブチリル基に比して疎水性が低いアセチル基により置換されている場合について述べる。本開示のセルロース誘導体を結晶性が高いなどの理由で比較的ブチリル化が難しいセルロースを原料として用いて製造する場合には、前処理として行うセルロースの活性化処理剤やアシル化反応の媒体等として酢酸を使うのがよく、その結果得られるセルロース誘導体はアセチル基が導入されたものとなる。
　あるいは、市販のセルロースアセテートブチレート（酢酸酪酸セルロース）を原料として用い、そのブチリル基およびアセチル基の一部を加水分解して本開示のセルロース誘導体を得る場合には、そのような加水分解反応の媒体等として酢酸を使った結果、得られるセルロース誘導体にアセチル基が残存したり、導入されたものとなる。
　上記の通り、本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度及び総置換度の値が等しいことが好ましく、アセチル置換度は０であることが好ましいが、セルロース誘導体がアセチル基で置換されている場合、そのアセチル置換度は、０を超え２．５以下であることが好ましく、０．１以上１．０以下であることがより好ましい。
　ここで、セルロース誘導体がブチリル基のみで置換されている場合、そのセルロース誘導体を酪酸セルロース（または酪酸化セルロース）といい、また、セルロース誘導体の置換基が、ブチリル基以外にアセチル基でも置換されている場合、そのセルロース誘導体を酢酸酪酸セルロース（または酢酸酪酸化セルロース、酢酸化酪酸化セルロース）という。
　セルロース誘導体の置換度は、以下の方法により測定することができる。例えば、手塚（Ｔｅｚｕｋａ，　Ｃａｒｂｏｎｙｄｒ．　Ｒｅｓ.　２７３,　８３（１９９５））の方法に従いＮＭＲ法で測定できる。すなわち、セルロース誘導体の遊離水酸基をピリジン中でカルボン酸無水物によりアシル化する。ここで使用するカルボン酸無水物の種類は分析目的に応じて選択すべきであり、例えば酪酸セルロースのブチリル置換度を分析する場合は、無水酢酸がよい。その他、例えば酢酸酪酸セルロースのブチリル置換度を分析する場合は無水酢酸が良く、アセチル置換度を分析する場合は無水酪酸がよい。得られた試料を重クロロホルムに溶解し、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを測定する。置換基がアセチル基またはブチリル基である場合を例に挙げれば、アセチル基の炭素シグナルは１６９ｐｐｍから１７１ｐｐｍの領域に高磁場から２位、３位、６位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、１７１ｐｐｍから１７３ｐｐｍの領域に同様に高磁場側から２位、３位、６位の順序で現れる。他の例を挙げれば、プロピオニル基を有するセルロース誘導体か、または、プロピオニル基を有しないセルロース誘導体を分析目的で無水プロピオン酸で処理し、プロピオニル置換度を分析する場合は、プロピオニル基のカルボニル炭素のシグナルは、１７２ｐｐｍから１７４ｐｐｍの領域に同じ順序で現れる。手塚の方法やそれに準じる方法で無水カルボン酸で処理したセルロース誘導体の総置換度は３．０なので、セルロース誘導体がもともと有するアシル基のカルボニル炭素シグナルと、無水カルボン酸処理で導入したアシル基のカルボニルシグナルの面積の総和を３．０と規格化し、それぞれ対応する位置でのアセチル基、ブチリル基、及びプロピオニル基の存在比（言い換えれば、各シグナルの面積比）を求めれば、これをセルロース誘導体におけるグルコース環の２位、３位、６位の各アセチル、ブチリルまたはプロピオニル置換度とできる。なお、言うまでもなく、この方法で分析できるアシル基を含む置換基は、分析目的の処理に用いる無水カルボン酸に対応しない置換基のみである。また、１３Ｃ－ＮＭＲのほか、１Ｈ－ＮＭＲで分析することもできる。
　ただし、試料であるセルロース誘導体のグルコース環の２位、３位及び６位の総置換度が３．０であり、かつその置換基が全てアセチル基及びブチリル基等の限定的な置換基であることが予め把握される場合には、プロピオニル化の工程を除き、試料を直接重クロロホルムに溶解してＮＭＲスペクトルを測定することもできる。置換基が全てアセチル基及びブチリル基であれば、プロピル化の工程を含む場合と同様に、アセチル基の炭素シグナルは１６９ｐｐｍから１７１ｐｐｍの領域に高磁場から２位、３位、６位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、１７１ｐｐｍから１７３ｐｐｍの領域に同じ順序で現れるので、それぞれ対応する位置でのアセチル基及びブチリル基の存在比（言い換えれば、各シグナルの面積比）から、セルロース誘導体におけるグルコース環の２位、３位、６位の各アセチル及びブチリル置換度等の置換度を求めることができる。
　本開示のセルロース誘導体の製造方法は特に限定されないが、例えば、次のようにして製造することができる。第一に、セルロース、ブチリル基以外の脂肪族アシル基もしくはその他の置換基のみで置換されたセルロース誘導体、またはブチリル基を有する他のセルロース誘導体を原料として、有機溶媒中、触媒の存在下、原料セルロースまたはセルロース誘導体を無水酪酸または酪酸塩化物と反応させることにより行うことができる。有機溶媒としては、例えば、酢酸、アセトン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、及び塩化リチウムのＤＭＡｃ溶液、並びにこれらの混合溶媒などが挙げられる。これらの中でも、酢酸を少なくとも含む溶媒が好ましい。触媒としては、硫酸、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン等が挙げられる。
　第二に、天然セルロースを原料として、必要によりセルロースを活性化処理した後、硫酸触媒の存在下、当該セルロースをアシル化剤でアシル化した後、必要により部分中和し、脱アシル化（加水分解又は熟成）することにより製造できる。より詳細には、通常、酢酸、プロピオン酸及び酪酸等のセルロースをアシル基に対応する有機カルボン酸（ブチリル基により置換する場合は酪酸）により活性化処理を施した後、硫酸触媒を用いて無水酢酸、無水プロピオン酸、及び無水酪酸等のアシル化剤（ブチル化の場合は無水酪酸）によりトリアシルエステルを調製し、酸無水物を分解しカルボン酸／水系で加水分解又は熟成によりアシル化度を調整することにより製造できる。
　原料となる天然セルロースとしては、一般的には木材パルプまたはコットンリンターが挙げられる。これら天然セルロースの重量平均重合度はそれぞれ１，５００～３，０００または３，０００～６，０００程度である。上記のように天然セルロースを原料として、本開示のセルロース誘導体を調製する場合、その調整過程で重量平均重合度は低下し、５０～１，５００程度となり得る。本開示のセルロース誘導体の重量平均重合度は特に制限されないが、例えば、セルロース誘導体を調製する際の各種反応操作における攪拌負荷や、熟成工程の後の沈殿化操作における沈殿化剤使用量の観点からは、重量平均重合度は１００～４００程度が好ましい。
　［制御性Ｔ細胞増加剤］
　本開示の制御性Ｔ細胞増加剤における、制御性Ｔ細胞とは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容に関与するＴ細胞を指す。制御性Ｔ細胞は、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４陽性のＴ細胞である。
　本開示の制御性Ｔ細胞増加剤における、増加は、未成熟Ｔ細胞の制御性Ｔ細胞への分化、該分化により誘導される制御性Ｔ細胞の増殖及び／又は蓄積のいずれの意味も含む。そして、当該増加は、インビボ、インビトロ、及びエックスビボのいずれの系における増加も含む。
　当該制御性Ｔ細胞増加剤の投与により、腸内の制御性Ｔ細胞が増加する。そして、当該制御性Ｔ細胞増加剤投与の効果は、以下のようにして評価することができる。当該制御性Ｔ細胞増加剤を経口投与されたマウス等の実験動物から単離されたリンパ球のうち、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４陽性の細胞を本開示における制御性Ｔ細胞として標識し、フローサイトメトリーによって、その制御性Ｔ細胞の比率を、単離されたリンパ球の全数を１００として測定することができる。
　当該制御性Ｔ細胞増加剤の投与、特に経口投与により腸内の制御性Ｔ細胞が増加する機構は以下のとおりである。当該制御性Ｔ細胞増加剤の有効成分である本開示のセルロース誘導体は、哺乳類の消化酵素では分解されず、腸内細菌によって一部あるいは全てが発酵・分解される。この腸内細菌による当該セルロース誘導体の発酵・分解における産物としては、ブチリル基に由来する酪酸；並びにグルコース残基に由来する酢酸、プロピオン酸、及び酪酸：などの短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）が考えられる。このうち、特に酪酸が優先的に増加する。
　本開示のセルロース誘導体は腸内細菌によって分解され、腸内で酪酸を遊離し酪酸濃度を高める効果を有する。本開示のセルロース誘導体を摂取することにより腸内のバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）細菌が増加することから、この酪酸の遊離にはバクテロイデス門細菌の関与が考えられる。バクテロイデス門細菌には、アセチル基や３－フェニルプロピオニル基などのアシル基を有する多糖のアシル基を加水分解するものも比較的多く知られている（Dylan Dodd et al, ”Xylan degradation, a metabolic property shared by rumen and human colonic Bacteroidetes”, Mol Microbiol., 2011 January, Vol. 79(2), p. 292-304）。そして、非特許文献２によれば、腸内での酪酸の増加により、未熟なＴ細胞の制御性Ｔ細胞への分化が誘導され、腸内の制御性Ｔ細胞が増加する。
　特許文献１に記載されるような、特定の細菌を直接投与するようなプロバイオティクス的アプローチに対し、本開示の制御性Ｔ細胞増加剤を投与することは、腸内で酪酸を与えるよう食物繊維としてのセルロースに関して創意工夫を行うものであり、腸内細菌に対する環境側にアドレスする、いわばプレバイオティクス的アプローチである。
　ここで、プロバイオティクスとプレバイオティクスとは対立するものではなく、相乗的に効果を発揮することや、一方が効果を示さない状況で他方が有効に作用するなど相補的に効果を発揮することが期待されるものである。
　上記のとおり、特許文献１に記載されるようなプロバイオティクス的アプローチに対して、本開示の制御性Ｔ細胞増加剤は、プレバイオティクス的アプローチをとることができる。そして、本開示の制御性Ｔ細胞増加剤は、有効成分の保存が容易であったり、給与形態の選択肢が広いとの特徴がある。例えば、本開示の制御性Ｔ細胞増加剤は室温で１年程度保存することが出来る上、パン、ケーキ、ビスケット等の２００℃を下回る温度で焼いた食品の成分として使うことが出来る。
　本開示の制御性Ｔ細胞増加剤は、食品または医薬に含有されていてもよく、以下のように各種食品または医薬の構成要素として使うことが出来、その投与方法としては、特に経口投与が挙げられる。形態は種々のものを選択できる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤及び乳剤等の通常の医薬品の形態、並びに飲料；ガム、チョコレート、飴、羊羹、及びゼリー等の糖菓製品；麺類；パン、ケーキ、ビスケット等の焼いた食品；缶詰；レトルト食品；畜肉食品；水産練食品；マーガリン、ドレッシング、及びマヨネーズ等の食用油組成物；栄養補助食品；バター、アイスクリーム、ヨーグルト等の牛乳製品；等の通常の食品の形態を採用することができる。これらの中でも、ヒトにおいて効果を得るための用量としては１日あたり１ｇ～１０ｇの摂取が好ましく、比較的多量の摂取が可能となることから、糖衣錠剤；麺類；ビスケット等の焼いた食品等が好ましい。また、本開示の制御性Ｔ細胞増加剤は、医薬品の形態または食品の形態に増粘剤として組み込むこともできる。
　本開示の制御性Ｔ細胞増加剤を含有する食品について、セルロース誘導体の含有量としては、食品のうち０．５重量％以上であることが好ましく、１重量％以上５重量％以下であることがより好ましく、１．５重量％以上３％重量以下であることがさらに好ましい。食品中の制御性Ｔ細胞増加剤の量を上記の範囲とすることで、食品の味や食感を損なうことなく制御性Ｔ細胞を増加させることができる。
　本開示の制御性Ｔ細胞増加剤が食品または医薬に含有されている場合の予防及び／又は治療（有害作用の軽減又は予防）に有用な対象疾患の具体的な例としては、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染性疾患、及び臓器移植における拒絶反応である以下のものが挙げられる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、スプルー、自己免疫性関節炎、リウマチ性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、骨髄移植に続く移植片対宿主拒絶反応、変形性関節症、若年性慢性関節炎、ライム病関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、ぜんそく、乾癬、強皮症皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ　ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主拒絶反応、臓器移植に関連した急性又は慢性の免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病（パセドゥ病）、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーライン紫斑病、腎臓における顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症候群、悪液質、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変症、溶血性貧血、多腺性機能不全症候群１型及び多腺性機能不全症候群２型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、クラミジア感染症、エルシニア・サルモネラ感染関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化、アレルギー性大腸炎、アトピー性アレルギー、食物アレルギー（ピーナッツアレルギー、ナッツアレルギー、卵アレルギー、乳アレルギー、大豆アレルギー、小麦アレルギー、魚介アレルギー、貝アレルギー又はゴマアレルギー等）、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス試験陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋肉脊髄炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺炎、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織関連疾患肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺（１ｕｎｇ）疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺炎、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性又はルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ１抗体肝炎）、自己免疫性低血糖、黒色表皮腫によるＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連した急性免疫疾患、臓器移植に関連した慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓における顕微鏡的血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性男子不妊症又はＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（全てのサブタイプに関する）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、肺高血圧症による結合組織病、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、アレルギー性鼻炎（花粉アレルギー）、アナフィラキシー、ペットアレルギー、ラテックスアレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎結膜炎、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、皮膚エリテマトーデス、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、並びに下痢等が挙げられる。
　小腸、大腸、盲腸、結腸、直腸等の腸内、特に大腸の粘膜固有層（lamina propria）における制御性Ｔ細胞が増加することにより、クーロン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患や食物アレルギー等のアレルギーの予防及び／又は治療に有用である。
　本開示の制御性Ｔ細胞増加剤の投与量は、所望の制御性Ｔ細胞増加の効果をもたらすのに十分な量で、個体に投与される。具体的には、個体の年齢、体重、性別、健康状態、並びに胃、小腸、及び大腸等の状態等の投与される個体に関する条件、投与方法、及び製剤形態等を考慮して経験的に決定され得る。投与１回における量は、例えば、１２．５ｍｇ／ｋｇ体重～１２５ｍｇ／ｋｇ体重であってよく、２５ｍｇ／ｋｇ体重～７５ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。また、個体に１回投与されてもよいし、１回を超えて投与されてもよい。１回を超えて投与される場合は、定期的に、不定期に、または必要に応じて投与され得る。適切な投与回数は、投与量と同様に、個体に関する条件、投与方法、及び製剤形態等を考慮して経験的に決定され得る。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
　［セルロース誘導体の調製］
　（再生セルロースの調製（酢酸酪酸セルロースの塩基触媒脱エステル化））
　１．５ｋｇの水酸化ナトリウムを２９．０Ｌの脱イオン水に添加し溶解した。この容器内の気相部を窒素雰囲気とし、原料として２．０ｋｇの酢酸酪酸セルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製、製品番号４１９０６０；以下、「原料酢酸酪酸セルロース」と称する。）を加え、つづいて７．０Ｌのメタノールをゆっくり添加した。この混合物を攪拌しながら３０℃で７２時間保持した。その後、酢酸を添加してｐＨを６．２～７とした。得られた固形物をろ別し、７５Ｌの脱イオン水を使って洗浄した後、８０℃で減圧乾燥し、８８０．０ｇの白色粉末を得た。これをＣｅｌｌ－ＷＳＣＢとする。なお、後に示す「置換度の測定」に示すとおり、原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度は０．１、ブチリル置換度は２．５、及び総置換度は２．６であり、Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢは、アセチル基、ブチリル基を有さない再生セルロースである。
　（Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢ（再生セルロース）の溶解）
　８５０．０ｇのＣｅｌｌ－ＷＳＣＢ（再生セルロース）を脱イオン水／メタノール混合物（３．４Ｌ／１．７Ｌ）に懸濁し、３０分静置した後、液相をろ別した。得られた湿潤した再生セルロースを５．７Ｌのジメチルアセタミド（ＤＭＡｃ）に懸濁し、３０分静置した後、液相をろ別するという操作を４回繰り返し、再生セルロースの湿潤物から水分を除いた。得られた再生セルロース湿潤物に１．２ｋｇの塩化リチウムと１５．０ＬのＤＭＡｃを加え、窒素雰囲気下で１００℃に昇温し、１時間保持した。この混合物を室温付近まで冷却し、さらにドライアイスを使ってマイナス２０℃まで冷却し１時間保持し、その後室温付近まで昇温させた。透明な再生セルロース溶液が得られた。
　（酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）の調製）
　得られた再生セルロース溶液に窒素雰囲気下、１．１Ｌのピリジンを加え、さらに１．２２１Ｌの無水酪酸をゆっくり加えた。そして、９０℃に昇温し、５時間保持した。その後、５０℃に降温し、１．０Ｌのエタノールをゆっくり添加し、反応混合物を得た。このとき、無水物の分解に基づく昇温によって混合物の温度が上昇したが、温度は常に７５℃以下となるようエタノールの添加速度を調整した。得られた反応混合物を１１０Ｌのテトラヒドロフラン（ＴＦＨ）と脱イオン水の混合物（容積比１／１）にゆっくり添加し、沈殿物を形成させた。沈殿物は、３０Ｌの脱イオン水と３０Ｌのエタノールで順次洗浄した。８０℃で減圧乾燥し、９２５．０ｇの生成物を得た。これをＷＳＣＢとする。なお、後の「置換度の測定」に示すとおり、ＷＳＣＢは、アセチル置換度０．０、ブチリル置換度１．３、総置換度１．３の酪酸セルロースである。
　［置換度の測定］
　（原料酢酸酪酸セルロースの置換度の測定）
　（１）原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化
　１．２ｇの原料酢酸酪酸セルロースを１２ｍＬのＤＭＡｃに溶解した。この溶液に１２ｍＬのピリジン、９０ｍｇのＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン、１２ｍＬの無水酢酸を加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら１００℃に昇温し、１時間保持した。この反応混合物を室温付近まで冷却し、６００ｍＬのメタノール／脱イオン水混合溶媒（容積比１／１）に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、６０ｍＬの同じ組成の混合溶媒で３回洗浄した。沈殿物は、３０ｍＬのアセトンに溶解した。沈殿物のアセトン溶液を６００ｍＬのメタノール／脱イオン水混合溶媒（容積比１／１）に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、６０ｍＬの同じ組成の混合溶媒で３回洗浄した。そして、８０℃で減圧乾燥し粉末状の試料を得た。得られた試料は、原料酢酸酪酸セルロースをアセチル化したものである。これをＡＮ０２０とする。
　ＡＮ０２０のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度は３．０である。アセチル基およびブチリル基の合計の置換度が３．０であること、言い換えれば、未置換水酸基が含まれないことは、アシル化（アセチル化）により得られた試料をもう一度同じ条件で２回目のアシル化（アセチル化）をしたときに、この２回目のアシル化の前後でアセチル基とブチリル基の比率（あるいは、合計の置換度が３．０であるとの前提で算出したアセチル基およびブチリル基のそれぞれの置換度）が変化しないことによって検証した。
　得られたＡＮ０２０を重クロロホルムに溶解し、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図１に示す。グルコース残基２位、３位、及び６位のアセチル基およびブチリル基シグナルをそれぞれＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６、Ｂｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６と称する。アセチル基の炭素シグナルは１６９ｐｐｍから１７１ｐｐｍの領域に高磁場から２位、３位、６位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、１７１ｐｐｍから１７３ｐｐｍの領域に同じ順序で、現れるからＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６、Ｂｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６は、それぞれ図１に示すとおりのシグナルである。これらシグナルの面積の総和を３．０とし、この総和におけるＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６の面積の和及びＢｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。その結果、ブチリル置換度は２．５であった。
　（２）原料酢酸酪酸セルロースのブチリル化
　１２ｍＬの無水酢酸を１８ｍＬの無水酪酸に代えた以外は、上記（１）原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化と同様にして、粉末状の試料を得た。これをＡＮ０２１とする。ＡＮ０２１は、原料酢酸酪酸セルロースをブチリル化したものである。
　ＡＮ０２１のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度も３．０である。アセチル基およびブチリル基の合計の置換度が３．０であること、言い換えれば、未置換水酸基が含まれないことは、アシル化（ブチリル化）により得られた試料をもう一度同じ条件でアシル化（ブチリル化）したときに、この２回目のアシル化の前後でアセチル基とブチリル基の比率（あるいは、合計の置換度が３．０であるとの前提で算出したアセチル基およびブチリル基のそれぞれの置換度）が変化しないことによって検証した。
　ＡＮ０２１についても、ＡＮ０２０と同様に、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図１に示す。Ａｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６、Ｂｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６のシグナルの面積の総和を３．０とし、この総和におけるＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６の面積の和及びＢｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。その結果、アセチル置換度は０．１であった。
　（３）アセチル置換度及びブチリル置換度
　原料酪酸酢酸セルロースはアセチル基とブチリル基を有し、さらに未置換の水酸基を有するものであるため、この未置換水酸基をアセチル化することで得られたＡＮ０２０について求めたブチリル置換度は、原料酢酸酪酸セルロースのブチリル置換度と等しい。また、ＡＮ０２１について、求めたアセチル置換度も原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度と等しい。したがって、原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度は０．１、ブチリル置換度は２．５であり、総置換度は２．６である。
　（Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢの置換度の測定）
　（１）Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢのアセチル化
　１．６ｇのＣｅｌｌ－ＷＳＣＢを１００ｍＬの脱イオン水に懸濁し、室温で３０分静置し、ガラスフィルター（Ｇ３）で脱液し、湿潤したＣｅｌｌ－ＷＳＣＢを得た。この湿潤したＣｅｌｌ－ＷＳＣＢを６０ｍＬのＤＭＡｃに懸濁し、室温で３０分静置し、ガラスフィルター（Ｇ３）で脱液する一連の操作を５回行い、得られた湿潤したＣｅｌｌ－ＷＳＣＢに２４ｍＬのＤＭＡｃ及び２．４ｇの塩化リチウムを加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら１００℃に昇温し、１時間保持した。この混合物を室温付近まで冷却し、さらにドライアイスを使ってマイナス２０℃まで冷却し１時間保持し、その後室温付近まで昇温させたところ、透明な溶液が得られた。この溶液に２４ｍｌのピリジン、１８０ｍｇのＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン、２４ｍＬの無水酢酸を加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら１００℃に昇温して８時間保持し、その後室温付近まで放冷した。この反応混合物を１，２００ｍＬのメタノール／脱イオン水混合溶媒（容積比１／１）に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、１２０ｍＬの同じ組成の混合溶媒で３回洗浄した。得られた沈殿物は、６０ｍＬのアセトンに溶解した。なお、この溶解処理においては、マイナス２０℃への冷却と室温付近までの昇温を行った。沈殿物のアセトン溶液を１，２００ｍＬのメタノール／脱イオン水混合溶媒（容積比１／１）に添加して沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、１２０ｍＬの同じ組成の混合溶媒で３回洗浄した後、８０℃で減圧乾燥し粉末状の試料を得た。これをＡＮ００９とする。
　得られたＡＮ００９を重クロロホルムに溶解し、ＡＮ０２０と同様に、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図２に示す。ＡＮ００９のスペクトルにおいて、ブチリル基に相当するシグナルは認められなかった。
　（２）Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢのブチリル化
　２４ｍＬの無水酢酸を３８ｍｌの無水酪酸にした以外は、上記（１）Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢのアセチル化と同様にして、粉末状の試料を得た。これをＡＮ０１３とする。ＡＮ０１３は、Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢ（再生セルロース）をブチリル化したものである。
　得られたＡＮ０１３を重クロロホルムに溶解し、ＡＮ０２０と同様に、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図２に示す。ＡＮ０１３のスペクトルにおいて、アセチル基に相当するシグナルは認められなかった。
　（３）アセチル置換度及びブチリル置換度
　得られたＡＮ００９について求めたブチリル置換度は０である。ＣＥＬＬ－ＷＳＣＢからＡＮ００９を得る一連の処理においてブチリル基を付加あるいは脱離させる処理は含まれないため、得られたＡＮ００９について求めたブチリル置換度は、Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢ（再生セルロース）のブチリル置換度と等しい。すなわち、Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢ（再生セルロース）のブチリル置換度は０である。
　また、得られたＡＮ０１３について求めたアセチル置換度は０である。ＡＮ０１３について求めたアセチル置換度もＣｅｌｌ－ＷＳＣＢのアセチル置換度と等しい。したがって、Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢのアセチル置換度は０である。したがって、原料酢酸酪酸セルロースの塩基触媒脱エステル化で得られたＣｅｌｌ－ＷＳＣＢのアセチル置換度は０、ブチリル置換度は０である。つまり、Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢは再生セルロースであることが確認できた。
　（酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）の置換度の測定）
　原料酢酸酪酸セルロースを酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）に代えた以外は、上記（１）原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化と同じ方法で、酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）をアセチル化し、粉末状の試料を得た。これをＡＮ００４とする。
　得られたＡＮ００４を重クロロホルムに溶解し、ＡＮ０２０と同様に、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを測定した。結果は、図３に示す。ＡＮ０２０において、アセチル基に相当するシグナルは認められなかった。
　Ｃｅｌｌ－ＷＳＣＢはアセチル基を有しないことから、ＡＮ００４のスペクトルが示すアセチル基はすべて後のアセチル化で導入されたものと考えられる。他方、ＡＮ００４のスペクトルが示すブチリル基はすべてＷＳＣＢに由来するものと考えられる。ＡＮ００４のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度も、３．０である。Ａｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６、Ｂｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６のシグナルの面積の総和を３．０とし、この総和におけるＡｃ２、Ａｃ３、Ａｃ６の面積の和及びＢｕ２、Ｂｕ３、Ｂｕ６の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。ブチリル置換度は１．３であった。
　ＷＳＣＢからＡＮ００４を得る一連の処理においてブチリル基を付加あるいは脱離させる処理は含まれないため、得られたＡＮ００４について求めたブチリル置換度は酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）のブチリル置換度と等しい。したがって酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）のブチリル置換度は１．３である。
　（酪酸セルロース（ＷＳＣＢ）の重合度の測定）
　上記の方法でＷＳＣＢをアセチル化することで得たＡＮ００４のポリスチレン換算分子量（重量平均分子量および数平均分子量）をＧＰＣ（ＳＥＣ）で測定し、さらに次の式に基づき重合度（重量平均重合度および数平均重合度）を求め、これをＷＳＣＢの重合度とした。
重合度＝分子量÷（１６２．１４＋ブチリル置換度×７０．０９１＋（３－ブチリル置換度）×４２．０３７）
分子量：重量平均分子量または数平均分子量
　ＧＰＣの測定は次の条件で行った。
溶媒：テトラヒドロフラン
試料濃度：０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＫＦ－８０４およびＫＦ－８０５
温度：３０℃
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
試料注入量：５０μｌ
検出：示差屈折率検出器
標準ポリスチレン：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＭ－１０５（分子量２，７００，０００、１，３９０，０００、６６１，０００、３２３，０００、１２４，０００、４７，２００、１８，３００、６，９４０、２，９８０、および、１，２２０）
　このようにして求めたＷＳＣＢの重量平均重合度は２５４、数平均重合度は１２８であった。
　［制御性Ｔ細胞増加の評価］
　（飼料の調製）
　精製飼料ＡＩＮ－９３Ｇ（REEVEら、Journal of Nutrition, 123, 1939-1951(1993）)、およびＡＩＮ－９３Ｇには５重量％のセルロースが含まれるところ、このセルロースを全てＷＳＣＢに置き換えたもの（以下、ＷＳＣＢ－ＡＩＮ－９３Ｇと称することがある）を用いた。
　（実験動物）
　４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウスを用いた。
　（飼育実験）
　１０個体のマウスに精製飼料ＡＩＮ－９３Ｇを与えて１週間飼育した（予備飼育）。その後、マウスを２群各５個体にグループ分けし、さらに４週間飼育した。このとき、１群には精製飼料ＡＩＮ－９３Ｇを与え、これをＣｏｎｔｒｏｌ群とした。残り１群にはＷＳＣＢ－ＡＩＮ－９３を与え、これをＢｕｔｙｒａｔｅ群とした。飼料はいずれも自由摂取とした。
　（細胞分離及びフローサイトメトリー）
　飼育したマウスの大腸及び小腸粘膜固有層からリンパ球を単離するために、大腸を採取し、長手方向に開裂して中の糞便等を洗浄し除去した。そして、洗浄した大腸を３７℃で３０分間、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳ中にて振盪した。上皮細胞及び脂肪組織を除去した後、腸組織を細かく小切片にし、ＲＰＭＩ　１６４０培地（２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４００単位／ｍｌ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）　コラゲナーゼＤ、０．２５単位／ｍｌディスパーゼ（コーニング社製）、及び０．１ｍｇ／ｍｌ　ＤＮａｓｅＩ（和光純薬工業株式会社製）含有）を添加し、３７℃の水浴中で３０時間振盪した。消化した組織をＲＰＭＩ　１６４０培地（２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有）で洗浄し、１０ｍｌ　３５％パーコール（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に再懸濁し、１５ｍｌファルコンチューブ中の２．５ｍｌ　７０％パーコールの上に重層した。そして、室温下にて２０００ｒｐｍで２０分間遠心し、パーコール密度勾配による細胞分離を行った。境界面の細胞を回収して粘膜固有層リンパ球として使用した。回収した細胞は染色バッファー（ＰＢＳ、２％　ＦＢＳ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び０．０９％ＮａＮ３）に懸濁し、ＡＰＣ－ｅＦｌｏｕｒ７８０で標識された抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４－５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、BV421で標識された抗ＣＤ３ｅ抗体（145-2C11、BD Biosciences）を用いて染色した。その後、細胞内Ｆｏｘｐ３の染色は、Ｆｏｘｐ３　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰＥで標識された抗Ｆｏｘｐ３抗体（ＦＪＫ－１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。
　そして、フローサイトメトリーはＦＡＣＳｃａｎｔ　ＩＩを使用して行い、データはＦｌｏｗＪｏ　ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ　Ｉｎｃ．）により解析した。
　（フローサイトメトリー結果）
　フローサイトメトリーに基づく結果の一例を図４（ａ）に示す。フローサイトメトリーで解析した試料のうち、ＣＤ３ｅ陽性リンパ球をゲートして選択した後、Ｃｏｎｔｒｏｌ群において、ＣＤ３ｅ陽性かつＣＤ４陽性であって制御性Ｔ細胞への分化を促進するＦｏｘｐ３遺伝子を発現しているもの（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）は全体の９．５９％であった（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－は全体の２８．０％）。一方、Ｂｕｔｙｒａｔｅ群ではＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋は全体の１７．５％であった（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－は全体の２７．８％）であった。
　Ｂｕｔｙｒａｔｅ群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の各群におけるリンパ球に占めるＣＤ３ｅ陽性ＣＤ４陽性Ｆｏｘｐ３陽性細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）の割合の平均値を比較した結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では１．７６％であったところ、Ｂｕｔｙｒａｔｅ群では２．９６％と、有意にＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の占める割合が増加していることが示された（図４（ｂ））。
　以上のとおり、精製飼料のうち５重量％を本開示の制御性Ｔ細胞増加剤に置き換えただけで、十分な制御性Ｔ細胞増加効果を示した。
　［腸内短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の評価］
　実験動物を８週齢のＣ５７ＢＬ/６Ｊマウスとし、４週間に渡って５重量％のセルロースを含む精製飼料ＡＩＮ－９３Ｇを与えたＣｏｎｔｒｏｌ群を４個体、精製飼料ＡＩＮ－９３Ｇに含まれる５重量％のセルロースのうち４０％に相当する２重量％分のみＷＳＣＢに置き換えたＷＳＣＢ－ＡＩＮ－９３を与えたＢｕｔｙｒａｔｅ群を４個体、予備飼育１週間の後、飼育実験した以外は上記制御性Ｔ細胞増加の評価と同じ方法で飼育実験を行った。Ｏｓｍａｎらの文献（Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ. ２００８ Ｓｅｐ；５３（９）：２４６４‐７３）の方法で、腸内の酢酸、プロピオン酸、及びｎ－酪酸の濃度を分析し、各群の平均値を求めた。分析結果は図５に示す。
　図５に示す通り、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腸内の各平均濃度は、酢酸では３９．２４μｍｏｌ／ｇ、プロピオン酸濃度では４．６９μｍｏｌ／ｇ及びｎ－酪酸濃度では２．０１μｍｏｌ／ｇとなり、Ｂｕｔｙｒａｔｅ群の腸内の各平均濃度は、酢酸濃度では３２．９６μｍｏｌ／ｇ、プロピオン酸濃度では３．１７μｍｏｌ／ｇ及びｎ－酪酸濃度では５０．４７μｍｏｌ／ｇである。Ｂｕｔｙｒａｔｅ群の腸内における酢酸及びプロピオン酸濃度は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対しいずれも低下したが、Ｂｕｔｙｒａｔｅ群の腸内におけるｎ－酪酸濃度はＣｏｎｔｒｏｌ群に対して約２５倍となった。このように、短鎖脂肪酸の中でも特に酪酸が優先的に増加することが示された。
　［腸内細菌叢の評価］
　実験動物を８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスとし、６個体を２群３個体にグループ分けした以外は制御性Ｔ細胞増加の評価と同じ方法で飼育実験を行った。Ｋｉｍらの文献（ＤＮＡ Ｒｅｓ. ２０１３ Ｊｕｎ；２０（３）：２４１‐５３）ならびにＫｏｚｉｃｈらの文献（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２０１３ Ｓｅｐ；７９（１７）：５１１２－２０.）の方法で、腸内細菌叢を構成する細菌の種類を門レベルで分類し（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、及びその他（Ｏｔｈｅｒｓ））、それぞれの比率を評価した。評価結果は図６に示す。図６に示す通り、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の３個体のバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）細菌比率の平均は１．２％、及びＢｕｔｙｒａｔｅ群の３個体のバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）細菌の比率の平均は４１．５％であり、Ｂｕｔｙｒａｔｅ群のマウスの腸内細菌叢はバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）細菌の比率が増加した。このようにバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）細菌の比率が高まることが示され、腸内における酪酸濃度の増加には、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）細菌が関与することが示された。

Claims (9)

  1. 　ブチリル置換度が０．３以上２．６以下であり、総置換度が０．５以上２．８以下であるセルロース誘導体を有効成分とする制御性Ｔ細胞増加剤。
  2. 　前記セルロース誘導体のブチリル置換度が０．３以上１．５以下であり、総置換度が０．５以上１．５以下である請求項１に記載の制御性Ｔ細胞増加剤。
  3. 　前記セルロース誘導体のアセチル置換度が０を超え２．５以下である請求項１に記載の制御性Ｔ細胞増加剤。
  4. 　前記セルロース誘導体のアセチル置換度が０である請求項１または２に記載の制御性Ｔ細胞増加剤。
  5. 　前記セルロース誘導体が酪酸セルロースまたは酢酸酪酸セルロースである請求項１～４のいずれか１項に記載の制御性Ｔ細胞増加剤。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を含有する食品。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を含有し、前記セルロース誘導体は１重量％以上５重量％以下である食品。
  8. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を含有する医薬。
  9. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を含有する炎症性腸疾患の予防及び／又は治療用医薬。
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