JP2018158895A - 制御性t細胞増加剤、食品、及び医薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分に制御性T細胞を増加することができる、制御性T細胞増加剤を提供することを目的とする。
【解決手段】ブチリル置換度が0.3以上2.6以下であり、総置換度が0.5以上2.8以下であるセルロース誘導体を有効成分とする制御性T細胞増加剤。
【選択図】なし
【解決手段】ブチリル置換度が0.3以上2.6以下であり、総置換度が0.5以上2.8以下であるセルロース誘導体を有効成分とする制御性T細胞増加剤。
【選択図】なし
Description
本発明は、制御性T細胞増加剤、食品、及び医薬に関する。
ヒトを含む動物は、口、食道、胃、小腸、大腸、盲腸、結腸、直腸、膣、皮膚、鼻腔、耳、及び肺を含む解剖学的部位に多くの微生物叢を有しており、ヒトの微生物叢は、免疫系の発生;糖質、タンパク質、及び生体異物の代謝;上皮の形成及び再生;脂肪の貯蔵;ホルモン及びビタミンの産生;並びに病原体感染の防御等に関与している。
そして、何らかの要因によって生じ得るヒト微生物叢の改変は、感染性疾患;潰瘍性大腸炎、クローン病、1型糖尿病、食物アレルギー、喘息、及び関節リウマチ等の炎症性疾患、自己免疫疾患及びアレルギー疾患;並びに2型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、栄養失調等の代謝性疾患等に関連する。
このように、ヒト微生物叢の改変はヒトの病状の進行に重要な役割を果たすため、ヒト微生物叢の改変を利用した種々の治療が存在する。このような治療方法の例として、抗生物質の投与、プレバイオティクスの利用、プロバイオティクスの投与、及び糞便移植等が挙げられる。
特許文献1には、自己免疫疾患、炎症性疾患又は感染症の治療用組成物であって、下記(a)〜(b)からなる群より選択される2以上の物質を有効成分とする、制御性T細胞の増殖または集積を誘導する組成物が記載されている。
(a)ヒト由来のクロストリジウム クラスター14aに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
(b)ヒト由来のクロストリジウム クラスター4に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
(a)ヒト由来のクロストリジウム クラスター14aに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
(b)ヒト由来のクロストリジウム クラスター4に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
また、特許文献1の図18によれば、無菌マウスに対してクロストリジウムを定着させることでCD4リンパ球のうち制御性T細胞に分化誘導されたものは約30%であって、無菌マウス群の約10%に対して増加している。
非特許文献1には、クロストリジウムクラスター4及びクロストリジウムクラスター14aに属する細菌等、特定の細菌を経口投与することで、制御性T細胞(Treg)を増殖することが記載されている。
非特許文献2には、クロストリジウム網に属する細菌が誘導した酪酸が制御性T細胞の分化を制御することが記載されている。
非特許文献2および3には、酪酸化でんぷんをマウスに食べさせることで大腸の制御性T細胞の割合が増加することが記載されている。
Nature, Vol. 500, p. 232-236 (2013)
Nature, Vol. 504, p. 446-450 (2013)
大野 博司、他2名、"腸内細菌が作る酪酸が制御性T細胞への分化誘導のカギ"、[online]、2013年11月14日、独立行政法人理化学研究所、[2014年2月17日検索]、インターネット(URL: http://www.riken.jp/pr/press/2013/20131114_1/)
特許文献1に記載の組成物を用いる方法は、非特許文献2の記載を踏まえれば、酪酸を誘導する細菌を直接的に投与し、酪酸濃度を高めて、制御性T細胞の増殖または集積を誘導する、いわばプロバイオティクス的アプローチである。
このような従来の特定の細菌を用いる方法では、例えばヨーグルトなどの保存・輸送のように、意図した細菌を生存させ、当該細菌以外の他の雑菌の繁殖を抑制するために、当該細菌を密閉し、冷蔵し、数週間程度の比較的短い保存期限を設ける必要がある等保存条件や給与形態の制約が多い、また、腸内環境によっては制御性T細胞の増加効果を示さない。
また、非特許文献2のFigure 4(f)によれば、大腸炎の病態モデルマウスにおいて、酪酸化でんぷんを与えることで、CD4リンパ球のうち制御性T細胞に分化誘導されたものは3.7%と、Control群の1.62%に対して増加しているが、酪酸化でんぷんの飼料中含有量は15%(w/w)と相当に高い用量を要する。このような高い用量が必要となれば、ヒトが一日に接種する量としては30g程度となる。これは、例えば乾麺一食が80g程度であることを考えるとこれは相当な量であり、医薬品として経口摂取するには苦痛を伴う量であり、また、食品として摂取する場合には通常の食事の楽しみを損なう量である。
本発明は、保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分に制御性T細胞を増加することができる、制御性T細胞増加剤を提供することを目的とする。
本発明の第一は、ブチリル置換度が0.3以上2.6以下であり、総置換度が0.5以上2.8以下であるセルロース誘導体を有効成分とする制御性T細胞増加剤に関する。
前記制御性T細胞増加剤は、前記セルロース誘導体のブチリル置換度が0.3以上1.5以下であり、総置換度が0.5以上1.5以下であってよい。
前記制御性T細胞増加剤は、前記セルロース誘導体のアセチル置換度が0を超え2.5以下であってよい。
前記制御性T細胞増加剤は、前記セルロース誘導体のアセチル置換度が0であってよい。
前記制御性T細胞増加剤は、前記セルロース誘導体が酪酸セルロースまたは酢酸酪酸セルロースであってよい。
本発明の第二は、前記制御性T細胞増加剤を含有する食品に関する。
前記制御性T細胞増加剤を含有し、前記セルロース誘導体は1重量%以上5重量%以下である食品であってよい。
本発明の第三は、前記制御性T細胞増加剤を含有する医薬に関する。
本発明の第四は、前記制御性T細胞増加剤を含有する炎症性腸疾患の予防及び/又は治療用医薬に関する。
本発明によれば、保存条件や給与形態の制約を低減し、より低い用量で十分に制御性T細胞を増加することができる、制御性T細胞増加剤を提供することができる。
以下、好ましい実施の形態の一例を具体的に説明する。
本開示に係る制御性T細胞増加剤は、ブチリル置換度が0.3以上2.6以下であり、総置換度が0.5以上2.8以下であるセルロース誘導体を有効成分とするものである。
本開示に係る制御性T細胞増加剤は、ブチリル置換度が0.3以上2.6以下であり、総置換度が0.5以上2.8以下であるセルロース誘導体を有効成分とするものである。
[セルロース誘導体]
本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度が0.3以上2.6以下であるところ、0.3以上1.5以下であることが好ましく、0.5以上1.5以下であることがより好ましく、0.7以上1.4以下であることが更に好ましく、0.8以上1.3以下であることが最も好ましい。ブチリル置換度が0.3未満であると、用量にもよるが一般に消化管内で遊離する酪酸が少なくなり、所望の制御性T細胞の増加効果が得られ難い。また、ブチリル置換度が2.6を超えると、おそらく疎水性が高すぎることを理由として、消化管内で腸内細菌などの細菌による分解が抑制され、遊離する酪酸が少なくなる傾向がある。
本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度が0.3以上2.6以下であるところ、0.3以上1.5以下であることが好ましく、0.5以上1.5以下であることがより好ましく、0.7以上1.4以下であることが更に好ましく、0.8以上1.3以下であることが最も好ましい。ブチリル置換度が0.3未満であると、用量にもよるが一般に消化管内で遊離する酪酸が少なくなり、所望の制御性T細胞の増加効果が得られ難い。また、ブチリル置換度が2.6を超えると、おそらく疎水性が高すぎることを理由として、消化管内で腸内細菌などの細菌による分解が抑制され、遊離する酪酸が少なくなる傾向がある。
次に、本開示のセルロース誘導体は、総置換度が0.5以上2.8以下であるところ、0.5以上2.0以下であることが好ましく、0.5以上1.5以下であることがより好ましく、1.0以上1.5以下であることが更に好ましい。総置換が0.5未満であると、用量にもよるが一般に消化管内で遊離する酪酸が少なくなり、所望の制御性T細胞の増加効果が得られ難い。また、総置換度が2.8を超えると、おそらく疎水性が高すぎることを理由として消化管内で腸内細菌などの細菌による分解が抑制され、遊離する酪酸が少なくなる傾向がある。
ここで、ブチリル置換度とは、セルロースの繰り返し単位(グルコピラノース単位)あたりの2位、3位、及び6位の水酸基の水素原子を置換するブチリル基の数の和をいう。アセチル置換度等その他の置換基による置換度も同様である。また、総置換度とは、ブチリル置換度及びその他の置換基による置換度の和をいう。
本開示のセルロース誘導体の置換基は、大腸など消化管への酪酸送達の観点からは、ブチリル基のみ、言い換えれば、本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度及び総置換度の値が等しいことが好ましいが、ブチリル基以外の置換基により置換されていてもよい。ブチリル基以外の置換基としては、例えば、アセチル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、2−ヒドロキシエチル基、2−ヒドロキシプロピル基、及びメチル基等が挙げられる。上記の通り、セルロースの6位(ヒドロキシメチル基)の一部を酸化してカルボキシル基にしてもよい。消化管内で腸内細菌などの細菌による分解を促進し、遊離する酪酸を多くする観点からは、セルロース誘導体に親水性を付与するのがよく、この観点からはこれらの置換基の中でも、ブチリル基に比して疎水性が低いアセチル基、カルボキシメチル基、カルボキシル基の導入は有効である。ブチリル基以外の置換基のうち1種または2種以上により置換されていてもよい。
特に、ブチリル基以外の置換基として、ブチリル基に比して疎水性が低いアセチル基により置換されている場合について述べる。本開示のセルロース誘導体を結晶性が高いなどの理由で比較的ブチリル化が難しいセルロースを原料として用いて製造する場合には、前処理として行うセルロースの活性化処理剤やアシル化反応の媒体等として酢酸を使うのがよく、その結果得られるセルロース誘導体はアセチル基が導入されたものとなる。
あるいは、市販のセルロースアセテートブチレート(酢酸酪酸セルロース)を原料として用い、そのブチリル基およびアセチル基の一部を加水分解して本開示のセルロース誘導体を得る場合には、そのような加水分解反応の媒体等として酢酸を使った結果、得られるセルロース誘導体にアセチル基が残存したり、導入されたものとなる。
上記の通り、本開示のセルロース誘導体は、ブチリル置換度及び総置換度の値が等しいことが好ましく、アセチル置換度は0であることが好ましいが、セルロース誘導体がアセチル基で置換されている場合、そのアセチル置換度は、0を超え2.5以下であることが好ましく、0.1以上1.0以下であることがより好ましい。
ここで、セルロース誘導体がブチリル基のみで置換されている場合、そのセルロース誘導体を酪酸セルロース(または酪酸化セルロース)といい、また、セルロース誘導体の置換基が、ブチリル基以外にアセチル基でも置換されている場合、そのセルロース誘導体を酢酸酪酸セルロース(または酢酸酪酸化セルロース、酢酸化酪酸化セルロース)という。
セルロース誘導体の置換度は、以下の方法により測定することができる。例えば、手塚(Tezuka, Carbonydr. Res. 273, 83(1995))の方法に従いNMR法で測定できる。すなわち、セルロース誘導体の遊離水酸基をピリジン中でカルボン酸無水物によりアシル化する。ここで使用するカルボン酸無水物の種類は分析目的に応じて選択すべきであり、例えば酪酸セルロースのブチリル置換度を分析する場合は、無水酢酸がよい。その他、例えば酢酸酪酸セルロースのブチリル置換度を分析する場合は無水酢酸が良く、アセチル置換度を分析する場合は無水酪酸がよい。得られた試料を重クロロホルムに溶解し、13C−NMRスペクトルを測定する。置換基がアセチル基またはブチリル基である場合を例に挙げれば、アセチル基の炭素シグナルは169ppmから171ppmの領域に高磁場から2位、3位、6位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、171ppmから173ppmの領域に同様に高磁場側から2位、3位、6位の順序で現れる。他の例を挙げれば、プロピオニル基を有するセルロース誘導体か、または、プロピオニル基を有しないセルロース誘導体を分析目的で無水プロピオン酸で処理し、プロピオニル置換度を分析する場合は、プロピオニル基のカルボニル炭素のシグナルは、172ppmから174ppmの領域に同じ順序で現れる。手塚の方法やそれに準じる方法で無水カルボン酸で処理したセルロース誘導体の総置換度は3.0なので、セルロース誘導体がもともと有するアシル基のカルボニル炭素シグナルと、無水カルボン酸処理で導入したアシル基のカルボニルシグナルの面積の総和を3.0と規格化し、それぞれ対応する位置でのアセチル基、ブチリル基、及びプロピオニル基の存在比(言い換えれば、各シグナルの面積比)を求めれば、これをセルロース誘導体におけるグルコース環の2位、3位、6位の各アセチル、ブチリルまたはプロピオニル置換度とできる。なお、言うまでもなく、この方法で分析できるアシル基を含む置換基は、分析目的の処理に用いる無水カルボン酸に対応しない置換基のみである。また、13C−NMRのほか、1H−NMRで分析することもできる。
ただし、試料であるセルロース誘導体のグルコース環の2位、3位及び6位の総置換度が3.0であり、かつその置換基が全てアセチル基及びブチリル基等の限定的な置換基であることが予め把握される場合には、プロピオニル化の工程を除き、試料を直接重クロロホルムに溶解してNMRスペクトルを測定することもできる。置換基が全てアセチル基及びブチリル基であれば、プロピル化の工程を含む場合と同様に、アセチル基の炭素シグナルは169ppmから171ppmの領域に高磁場から2位、3位、6位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、171ppmから173ppmの領域に同じ順序で現れるので、それぞれ対応する位置でのアセチル基及びブチリル基の存在比(言い換えれば、各シグナルの面積比)から、セルロース誘導体におけるグルコース環の2位、3位、6位の各アセチル及びブチリル置換度等の置換度を求めることができる。
本開示のセルロース誘導体の製造方法は特に限定されないが、例えば、次のようにして製造することができる。第一に、セルロース、ブチリル基以外の脂肪族アシル基もしくはその他の置換基のみで置換されたセルロース誘導体、またはブチリル基を有する他のセルロース誘導体を原料として、有機溶媒中、触媒の存在下、原料セルロースまたはセルロース誘導体を無水酪酸または酪酸塩化物と反応させることにより行うことができる。有機溶媒としては、例えば、酢酸、アセトン、ピリジン、N,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)、及び塩化リチウムのDMAc溶液、並びにこれらの混合溶媒などが挙げられる。これらの中でも、酢酸を少なくとも含む溶媒が好ましい。触媒としては、硫酸、ピリジン、N,N−ジメチル−4−アミノピリジン等が挙げられる。
第二に、天然セルロースを原料として、必要によりセルロースを活性化処理した後、硫酸触媒の存在下、当該セルロースをアシル化剤でアシル化した後、必要により部分中和し、脱アシル化(加水分解又は熟成)することにより製造できる。より詳細には、通常、酢酸、プロピオン酸及び酪酸等のセルロースをアシル基に対応する有機カルボン酸(ブチリル基により置換する場合は酪酸)により活性化処理を施した後、硫酸触媒を用いて無水酢酸、無水プロピオン酸、及び無水酪酸等のアシル化剤(ブチル化の場合は無水酪酸)によりトリアシルエステルを調製し、酸無水物を分解しカルボン酸/水系で加水分解又は熟成によりアシル化度を調整することにより製造できる。
原料となる天然セルロースとしては、一般的には木材パルプまたはコットンリンターが挙げられる。これら天然セルロースの重量平均重合度はそれぞれ1,500〜3,000または3,000〜6,000程度である。上記のように天然セルロースを原料として、本開示のセルロース誘導体を調製する場合、その調整過程で重量平均重合度は低下し、50〜1,500程度となり得る。本開示のセルロース誘導体の重量平均重合度は特に制限されないが、例えば、セルロース誘導体を調製する際の各種反応操作における攪拌負荷や、熟成工程の後の沈殿化操作における沈殿化剤使用量の観点からは、重量平均重合度は100〜400程度が好ましい。
[制御性T細胞増加剤]
本開示の制御性T細胞増加剤における、制御性T細胞とは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容に関与するT細胞を指す。制御性T細胞は、典型的には、転写因子Foxp3陽性CD4陽性のT細胞である。
本開示の制御性T細胞増加剤における、制御性T細胞とは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容に関与するT細胞を指す。制御性T細胞は、典型的には、転写因子Foxp3陽性CD4陽性のT細胞である。
本開示の制御性T細胞増加剤における、増加は、未成熟T細胞の制御性T細胞への分化、該分化により誘導される制御性T細胞の増殖及び/又は蓄積のいずれの意味も含む。そして、当該増加は、インビボ、インビトロ、及びエックスビボのいずれの系における増加も含む。
当該制御性T細胞増加剤の投与により、腸内の制御性T細胞が増加する。そして、当該制御性T細胞増加剤投与の効果は、以下のようにして評価することができる。当該制御性T細胞増加剤を経口投与されたマウス等の実験動物から単離されたリンパ球のうち、Foxp3を発現するCD4陽性の細胞を本開示における制御性T細胞として標識し、フローサイトメトリーによって、その制御性T細胞の比率を、単離されたリンパ球の全数を100として測定することができる。
当該制御性T細胞増加剤の投与、特に経口投与により腸内の制御性T細胞が増加する機構は以下のとおりである。当該制御性T細胞増加剤の有効成分である本開示のセルロース誘導体は、哺乳類の消化酵素では分解されず、腸内細菌によって一部あるいは全てが発酵・分解される。この腸内細菌による当該セルロース誘導体の発酵・分解における産物としては、ブチリル基に由来する酪酸;並びにグルコース残基に由来する酢酸、プロピオン酸、及び酪酸:などの短鎖脂肪酸(SCFA)が考えられる。このうち、特に酪酸が優先的に増加する。
本開示のセルロース誘導体は腸内細菌によって分解され、腸内で酪酸を遊離し酪酸濃度を高める効果を有する。本開示のセルロース誘導体を摂取することにより腸内のバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌が増加することから、この酪酸の遊離にはバクテロイデス門細菌の関与が考えられる。バクテロイデス門細菌には、アセチル基や3−フェニルプロピオニル基などのアシル基を有する多糖のアシル基を加水分解するものも比較的多く知られている(Dylan Dodd et al, ”Xylan degradation, a metabolic property shared by rumen and human colonic Bacteroidetes”, Mol Microbiol., 2011 January, Vol. 79(2), p. 292-304)。そして、非特許文献2によれば、腸内での酪酸の増加により、未熟なT細胞の制御性T細胞への分化が誘導され、腸内の制御性T細胞が増加する。
特許文献1に記載されるような、特定の細菌を直接投与するようなプロバイオティクス的アプローチに対し、本開示の制御性T細胞増加剤を投与することは、腸内で酪酸を与えるよう食物繊維としてのセルロースに関して創意工夫を行うものであり、腸内細菌に対する環境側にアドレスする、いわばプレバイオティクス的アプローチである。
ここで、プロバイオティクスとプレバイオティクスとは対立するものではなく、相乗的に効果を発揮することや、一方が効果を示さない状況で他方が有効に作用するなど相補的に効果を発揮することが期待されるものである。
上記のとおり、特許文献1に記載されるようなプロバイオティクス的アプローチに対して、本開示の制御性T細胞増加剤は、プレバイオティクス的アプローチをとることができる。そして、本開示の制御性T細胞増加剤は、有効成分の保存が容易であったり、給与形態の選択肢が広いとの特徴がある。例えば、本開示の制御性T細胞増加剤は室温で1年程度保存することが出来る上、パン、ケーキ、ビスケット等の200℃を下回る温度で焼いた食品の成分として使うことが出来る。
本開示の制御性T細胞増加剤は、食品または医薬に含有されていてもよく、以下のように各種食品または医薬の構成要素として使うことが出来、その投与方法としては、特に経口投与が挙げられる。形態は種々のものを選択できる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤及び乳剤等の通常の医薬品の形態、並びに飲料;ガム、チョコレート、飴、羊羹、及びゼリー等の糖菓製品;麺類;パン、ケーキ、ビスケット等の焼いた食品;缶詰;レトルト食品;畜肉食品;水産練食品;マーガリン、ドレッシング、及びマヨネーズ等の食用油組成物;栄養補助食品;バター、アイスクリーム、ヨーグルト等の牛乳製品;等の通常の食品の形態を採用することができる。これらの中でも、ヒトにおいて効果を得るための用量としては1日あたり1g〜10gの摂取が好ましく、比較的多量の摂取が可能となることから、糖衣錠剤;麺類;ビスケット等の焼いた食品等が好ましい。また、本開示の制御性T細胞増加剤は、医薬品の形態または食品の形態に増粘剤として組み込むこともできる。
本開示の制御性T細胞増加剤を含有する食品について、セルロース誘導体の含有量としては、食品のうち0.5重量%以上であることが好ましく、1重量%以上5重量%以下であることがより好ましく、1.5重量%以上3%重量以下であることがさらに好ましい。食品中の制御性T細胞増加剤の量を上記の範囲とすることで、食品の味や食感を損なうことなく制御性T細胞を増加させることができる。
本開示の制御性T細胞増加剤が食品または医薬に含有されている場合の予防及び/又は治療(有害作用の軽減又は予防)に有用な対象疾患の具体的な例としては、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染性疾患、及び臓器移植における拒絶反応である以下のものが挙げられる。炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、クローン病、スプルー、自己免疫性関節炎、リウマチ性関節炎、1型糖尿病、多発性硬化症、骨髄移植に続く移植片対宿主拒絶反応、変形性関節症、若年性慢性関節炎、ライム病関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、ぜんそく、乾癬、強皮症皮膚炎(dermatitis scleroderma)、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主拒絶反応、臓器移植に関連した急性又は慢性の免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病(パセドゥ病)、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーライン紫斑病、腎臓における顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症候群、悪液質、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変症、溶血性貧血、多腺性機能不全症候群1型及び多腺性機能不全症候群2型、シュミット症候群、成人(急性)呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、クラミジア感染症、エルシニア・サルモネラ感染関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患/動脈硬化、アレルギー性大腸炎、アトピー性アレルギー、食物アレルギー(ピーナッツアレルギー、ナッツアレルギー、卵アレルギー、乳アレルギー、大豆アレルギー、小麦アレルギー、魚介アレルギー、貝アレルギー又はゴマアレルギー等)、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状IgA病、自己免疫性溶血性貧血、クームス試験陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋肉脊髄炎/ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、C型肝炎、分類不能型免疫不全症(分類不能型低ガンマグロブリン血症)、拡張型心筋症、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺炎、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織関連疾患肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺(1ung)疾患、皮膚筋炎/多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺炎、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、1型自己免疫性肝炎(古典的自己免疫性又はルポイド肝炎)、2型自己免疫性肝炎(抗LKM1抗体肝炎)、自己免疫性低血糖、黒色表皮腫によるB型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連した急性免疫疾患、臓器移植に関連した慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患NOS、糸球体腎炎、腎臓における顕微鏡的血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性男子不妊症又はNOS、精子自己免疫、多発性硬化症(全てのサブタイプに関する)、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、肺高血圧症による結合組織病、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、高安病/動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫甲状腺機能低下症(橋本病)、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、アレルギー性鼻炎(花粉アレルギー)、アナフィラキシー、ペットアレルギー、ラテックスアレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎結膜炎、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、皮膚エリテマトーデス、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、並びに下痢等が挙げられる。
小腸、大腸、盲腸、結腸、直腸等の腸内、特に大腸の粘膜固有層(lamina propria)における制御性T細胞が増加することにより、クーロン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患や食物アレルギー等のアレルギーの予防及び/又は治療に有用である。
本開示の制御性T細胞増加剤の投与量は、所望の制御性T細胞増加の効果をもたらすのに十分な量で、個体に投与される。具体的には、個体の年齢、体重、性別、健康状態、並びに胃、小腸、及び大腸等の状態等の投与される個体に関する条件、投与方法、及び製剤形態等を考慮して経験的に決定され得る。投与1回における量は、例えば、12.5mg/kg体重〜125mg/kg体重であってよく、25mg/kg体重〜75mg/kg体重であってよい。また、個体に1回投与されてもよいし、1回を超えて投与されてもよい。1回を超えて投与される場合は、定期的に、不定期に、または必要に応じて投与され得る。適切な投与回数は、投与量と同様に、個体に関する条件、投与方法、及び製剤形態等を考慮して経験的に決定され得る。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
[セルロース誘導体の調製]
(再生セルロースの調製(酢酸酪酸セルロースの塩基触媒脱エステル化))
1.5kgの水酸化ナトリウムを29.0Lの脱イオン水に添加し溶解した。この容器内の気相部を窒素雰囲気とし、原料として2.0kgの酢酸酪酸セルロース(Sigma−Aldrich製、製品番号419060;以下、「原料酢酸酪酸セルロース」と称する。)を加え、つづいて7.0Lのメタノールをゆっくり添加した。この混合物を攪拌しながら30℃で72時間保持した。その後、酢酸を添加してpHを6.2〜7とした。得られた固形物をろ別し、75Lの脱イオン水を使って洗浄した後、80℃で減圧乾燥し、880.0gの白色粉末を得た。これをCell−WSCBとする。なお、後に示す「置換度の測定」に示すとおり、原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度は0.1、ブチリル置換度は2.5、及び総置換度は2.6であり、Cell−WSCBは、アセチル基、ブチリル基を有さない再生セルロースである。
(再生セルロースの調製(酢酸酪酸セルロースの塩基触媒脱エステル化))
1.5kgの水酸化ナトリウムを29.0Lの脱イオン水に添加し溶解した。この容器内の気相部を窒素雰囲気とし、原料として2.0kgの酢酸酪酸セルロース(Sigma−Aldrich製、製品番号419060;以下、「原料酢酸酪酸セルロース」と称する。)を加え、つづいて7.0Lのメタノールをゆっくり添加した。この混合物を攪拌しながら30℃で72時間保持した。その後、酢酸を添加してpHを6.2〜7とした。得られた固形物をろ別し、75Lの脱イオン水を使って洗浄した後、80℃で減圧乾燥し、880.0gの白色粉末を得た。これをCell−WSCBとする。なお、後に示す「置換度の測定」に示すとおり、原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度は0.1、ブチリル置換度は2.5、及び総置換度は2.6であり、Cell−WSCBは、アセチル基、ブチリル基を有さない再生セルロースである。
(Cell−WSCB(再生セルロース)の溶解)
850.0gのCell−WSCB(再生セルロース)を脱イオン水/メタノール混合物(3.4L/1.7L)に懸濁し、30分静置した後、液相をろ別した。得られた湿潤した再生セルロースを5.7Lのジメチルアセタミド(DMAc)に懸濁し、30分静置した後、液相をろ別するという操作を4回繰り返し、再生セルロースの湿潤物から水分を除いた。得られた再生セルロース湿潤物に1.2kgの塩化リチウムと15.0LのDMAcを加え、窒素雰囲気下で100℃に昇温し、1時間保持した。この混合物を室温付近まで冷却し、さらにドライアイスを使ってマイナス20℃まで冷却し1時間保持し、その後室温付近まで昇温させた。透明な再生セルロース溶液が得られた。
850.0gのCell−WSCB(再生セルロース)を脱イオン水/メタノール混合物(3.4L/1.7L)に懸濁し、30分静置した後、液相をろ別した。得られた湿潤した再生セルロースを5.7Lのジメチルアセタミド(DMAc)に懸濁し、30分静置した後、液相をろ別するという操作を4回繰り返し、再生セルロースの湿潤物から水分を除いた。得られた再生セルロース湿潤物に1.2kgの塩化リチウムと15.0LのDMAcを加え、窒素雰囲気下で100℃に昇温し、1時間保持した。この混合物を室温付近まで冷却し、さらにドライアイスを使ってマイナス20℃まで冷却し1時間保持し、その後室温付近まで昇温させた。透明な再生セルロース溶液が得られた。
(酪酸セルロース(WSCB)の調製)
得られた再生セルロース溶液に窒素雰囲気下、1.1Lのピリジンを加え、さらに1.221Lの無水酪酸をゆっくり加えた。そして、90℃に昇温し、5時間保持した。その後、50℃に降温し、1.0Lのエタノールをゆっくり添加し、反応混合物を得た。このとき、無水物の分解に基づく昇温によって混合物の温度が上昇したが、温度は常に75℃以下となるようエタノールの添加速度を調整した。得られた反応混合物を110Lのテトラヒドロフラン(TFH)と脱イオン水の混合物(容積比1/1)にゆっくり添加し、沈殿物を形成させた。沈殿物は、30Lの脱イオン水と30Lのエタノールで順次洗浄した。80℃で減圧乾燥し、925.0gの生成物を得た。これをWSCBとする。なお、後の「置換度の測定」に示すとおり、WSCBは、アセチル置換度0.0、ブチリル置換度1.3、総置換度1.3の酪酸セルロースである。
得られた再生セルロース溶液に窒素雰囲気下、1.1Lのピリジンを加え、さらに1.221Lの無水酪酸をゆっくり加えた。そして、90℃に昇温し、5時間保持した。その後、50℃に降温し、1.0Lのエタノールをゆっくり添加し、反応混合物を得た。このとき、無水物の分解に基づく昇温によって混合物の温度が上昇したが、温度は常に75℃以下となるようエタノールの添加速度を調整した。得られた反応混合物を110Lのテトラヒドロフラン(TFH)と脱イオン水の混合物(容積比1/1)にゆっくり添加し、沈殿物を形成させた。沈殿物は、30Lの脱イオン水と30Lのエタノールで順次洗浄した。80℃で減圧乾燥し、925.0gの生成物を得た。これをWSCBとする。なお、後の「置換度の測定」に示すとおり、WSCBは、アセチル置換度0.0、ブチリル置換度1.3、総置換度1.3の酪酸セルロースである。
[置換度の測定]
(原料酢酸酪酸セルロースの置換度の測定)
(1)原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化
1.2gの原料酢酸酪酸セルロースを12mLのDMAcに溶解した。この溶液に12mLのピリジン、90mgのN,N−ジメチルアミノピリジン、12mLの無水酢酸を加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら100℃に昇温し、1時間保持した。この反応混合物を室温付近まで冷却し、600mLのメタノール/脱イオン水混合溶媒(容積比1/1)に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、60mLの同じ組成の混合溶媒で3回洗浄した。沈殿物は、30mLのアセトンに溶解した。沈殿物のアセトン溶液を600mLのメタノール/脱イオン水混合溶媒(容積比1/1)に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、60mLの同じ組成の混合溶媒で3回洗浄した。そして、80℃で減圧乾燥し粉末状の試料を得た。得られた試料は、原料酢酸酪酸セルロースをアセチル化したものである。これをAN020とする。
(原料酢酸酪酸セルロースの置換度の測定)
(1)原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化
1.2gの原料酢酸酪酸セルロースを12mLのDMAcに溶解した。この溶液に12mLのピリジン、90mgのN,N−ジメチルアミノピリジン、12mLの無水酢酸を加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら100℃に昇温し、1時間保持した。この反応混合物を室温付近まで冷却し、600mLのメタノール/脱イオン水混合溶媒(容積比1/1)に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、60mLの同じ組成の混合溶媒で3回洗浄した。沈殿物は、30mLのアセトンに溶解した。沈殿物のアセトン溶液を600mLのメタノール/脱イオン水混合溶媒(容積比1/1)に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、60mLの同じ組成の混合溶媒で3回洗浄した。そして、80℃で減圧乾燥し粉末状の試料を得た。得られた試料は、原料酢酸酪酸セルロースをアセチル化したものである。これをAN020とする。
AN020のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度は3.0である。アセチル基およびブチリル基の合計の置換度が3.0であること、言い換えれば、未置換水酸基が含まれないことは、アシル化(アセチル化)により得られた試料をもう一度同じ条件で2回目のアシル化(アセチル化)をしたときに、この2回目のアシル化の前後でアセチル基とブチリル基の比率(あるいは、合計の置換度が3.0であるとの前提で算出したアセチル基およびブチリル基のそれぞれの置換度)が変化しないことによって検証した。
得られたAN020を重クロロホルムに溶解し、13C−NMRスペクトルを測定した。結果は、図1に示す。グルコース残基2位、3位、及び6位のアセチル基およびブチリル基シグナルをそれぞれAc2、Ac3、Ac6、Bu2、Bu3、Bu6と称する。アセチル基の炭素シグナルは169ppmから171ppmの領域に高磁場から2位、3位、6位の順序で、ブチリル基の炭素シグナルは、171ppmから173ppmの領域に同じ順序で、現れるからAc2、Ac3、Ac6、Bu2、Bu3、Bu6は、それぞれ図1に示すとおりのシグナルである。これらシグナルの面積の総和を3.0とし、この総和におけるAc2、Ac3、Ac6の面積の和及びBu2、Bu3、Bu6の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。その結果、ブチリル置換度は2.5であった。
(2)原料酢酸酪酸セルロースのブチリル化
12mLの無水酢酸を18mLの無水酪酸に代えた以外は、上記(1)原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化と同様にして、粉末状の試料を得た。これをAN021とする。AN021は、原料酢酸酪酸セルロースをブチリル化したものである。
12mLの無水酢酸を18mLの無水酪酸に代えた以外は、上記(1)原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化と同様にして、粉末状の試料を得た。これをAN021とする。AN021は、原料酢酸酪酸セルロースをブチリル化したものである。
AN021のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度も3.0である。アセチル基およびブチリル基の合計の置換度が3.0であること、言い換えれば、未置換水酸基が含まれないことは、アシル化(ブチリル化)により得られた試料をもう一度同じ条件でアシル化(ブチリル化)したときに、この2回目のアシル化の前後でアセチル基とブチリル基の比率(あるいは、合計の置換度が3.0であるとの前提で算出したアセチル基およびブチリル基のそれぞれの置換度)が変化しないことによって検証した。
AN021についても、AN020と同様に、13C−NMRスペクトルを測定した。結果は、図1に示す。Ac2、Ac3、Ac6、Bu2、Bu3、Bu6のシグナルの面積の総和を3.0とし、この総和におけるAc2、Ac3、Ac6の面積の和及びBu2、Bu3、Bu6の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。その結果、アセチル置換度は0.1であった。
(3)アセチル置換度及びブチリル置換度
原料酪酸酢酸セルロースはアセチル基とブチリル基を有し、さらに未置換の水酸基を有するものであるため、この未置換水酸基をアセチル化することで得られたAN020について求めたブチリル置換度は、原料酢酸酪酸セルロースのブチリル置換度と等しい。また、AN021について、求めたアセチル置換度も原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度と等しい。したがって、原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度は0.1、ブチリル置換度は2.5であり、総置換度は2.6である。
原料酪酸酢酸セルロースはアセチル基とブチリル基を有し、さらに未置換の水酸基を有するものであるため、この未置換水酸基をアセチル化することで得られたAN020について求めたブチリル置換度は、原料酢酸酪酸セルロースのブチリル置換度と等しい。また、AN021について、求めたアセチル置換度も原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度と等しい。したがって、原料酢酸酪酸セルロースのアセチル置換度は0.1、ブチリル置換度は2.5であり、総置換度は2.6である。
(Cell−WSCBの置換度の測定)
(1)Cell−WSCBのアセチル化
1.6gのCell−WSCBを100mLの脱イオン水に懸濁し、室温で30分静置し、ガラスフィルター(G3)で脱液し、湿潤したCell−WSCBを得た。この湿潤したCell−WSCBを60mLのDMAcに懸濁し、室温で30分静置し、ガラスフィルター(G3)で脱液する一連の操作を5回行い、得られた湿潤したCell−WSCBに24mLのDMAc及び2.4gの塩化リチウムを加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら100℃に昇温し、1時間保持した。この混合物を室温付近まで冷却し、さらにドライアイスを使ってマイナス20℃まで冷却し1時間保持し、その後室温付近まで昇温させたところ、透明な溶液が得られた。この溶液に24mlのピリジン、180mgのN,N−ジメチルアミノピリジン、24mLの無水酢酸を加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら100℃に昇温して8時間保持し、その後室温付近まで放冷した。この反応混合物を1,200mLのメタノール/脱イオン水混合溶媒(容積比1/1)に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、120mLの同じ組成の混合溶媒で3回洗浄した。得られた沈殿物は、60mLのアセトンに溶解した。なお、この溶解処理においては、マイナス20℃への冷却と室温付近までの昇温を行った。沈殿物のアセトン溶液を1,200mLのメタノール/脱イオン水混合溶媒(容積比1/1)に添加して沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、120mLの同じ組成の混合溶媒で3回洗浄した後、80℃で減圧乾燥し粉末状の試料を得た。これをAN009とする。
(1)Cell−WSCBのアセチル化
1.6gのCell−WSCBを100mLの脱イオン水に懸濁し、室温で30分静置し、ガラスフィルター(G3)で脱液し、湿潤したCell−WSCBを得た。この湿潤したCell−WSCBを60mLのDMAcに懸濁し、室温で30分静置し、ガラスフィルター(G3)で脱液する一連の操作を5回行い、得られた湿潤したCell−WSCBに24mLのDMAc及び2.4gの塩化リチウムを加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら100℃に昇温し、1時間保持した。この混合物を室温付近まで冷却し、さらにドライアイスを使ってマイナス20℃まで冷却し1時間保持し、その後室温付近まで昇温させたところ、透明な溶液が得られた。この溶液に24mlのピリジン、180mgのN,N−ジメチルアミノピリジン、24mLの無水酢酸を加え、窒素雰囲気下、攪拌しながら100℃に昇温して8時間保持し、その後室温付近まで放冷した。この反応混合物を1,200mLのメタノール/脱イオン水混合溶媒(容積比1/1)に添加し、沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、120mLの同じ組成の混合溶媒で3回洗浄した。得られた沈殿物は、60mLのアセトンに溶解した。なお、この溶解処理においては、マイナス20℃への冷却と室温付近までの昇温を行った。沈殿物のアセトン溶液を1,200mLのメタノール/脱イオン水混合溶媒(容積比1/1)に添加して沈殿物を形成させ、脱液した。沈殿物は、120mLの同じ組成の混合溶媒で3回洗浄した後、80℃で減圧乾燥し粉末状の試料を得た。これをAN009とする。
得られたAN009を重クロロホルムに溶解し、AN020と同様に、13C−NMRスペクトルを測定した。結果は、図2に示す。AN009のスペクトルにおいて、ブチリル基に相当するシグナルは認められなかった。
(2)Cell−WSCBのブチリル化
24mLの無水酢酸を38mlの無水酪酸にした以外は、上記(1)Cell−WSCBのアセチル化と同様にして、粉末状の試料を得た。これをAN013とする。AN013は、Cell−WSCB(再生セルロース)をブチリル化したものである。
24mLの無水酢酸を38mlの無水酪酸にした以外は、上記(1)Cell−WSCBのアセチル化と同様にして、粉末状の試料を得た。これをAN013とする。AN013は、Cell−WSCB(再生セルロース)をブチリル化したものである。
得られたAN013を重クロロホルムに溶解し、AN020と同様に、13C−NMRスペクトルを測定した。結果は、図2に示す。AN013のスペクトルにおいて、アセチル基に相当するシグナルは認められなかった。
(3)アセチル置換度及びブチリル置換度
得られたAN009について求めたブチリル置換度は0である。CELL−WSCBからAN009を得る一連の処理においてブチリル基を付加あるいは脱離させる処理は含まれないため、得られたAN009について求めたブチリル置換度は、Cell−WSCB(再生セルロース)のブチリル置換度と等しい。すなわち、Cell−WSCB(再生セルロース)のブチリル置換度は0である。
得られたAN009について求めたブチリル置換度は0である。CELL−WSCBからAN009を得る一連の処理においてブチリル基を付加あるいは脱離させる処理は含まれないため、得られたAN009について求めたブチリル置換度は、Cell−WSCB(再生セルロース)のブチリル置換度と等しい。すなわち、Cell−WSCB(再生セルロース)のブチリル置換度は0である。
また、得られたAN013について求めたアセチル置換度は0である。AN013について求めたアセチル置換度もCell−WSCBのアセチル置換度と等しい。したがって、Cell−WSCBのアセチル置換度は0である。したがって、原料酢酸酪酸セルロースの塩基触媒脱エステル化で得られたCell−WSCBのアセチル置換度は0、ブチリル置換度は0である。つまり、Cell−WSCBは再生セルロースであることが確認できた。
(酪酸セルロース(WSCB)の置換度の測定)
原料酢酸酪酸セルロースを酪酸セルロース(WSCB)に代えた以外は、上記(1)原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化と同じ方法で、酪酸セルロース(WSCB)をアセチル化し、粉末状の試料を得た。これをAN004とする。
原料酢酸酪酸セルロースを酪酸セルロース(WSCB)に代えた以外は、上記(1)原料酢酸酪酸セルロースのアセチル化と同じ方法で、酪酸セルロース(WSCB)をアセチル化し、粉末状の試料を得た。これをAN004とする。
得られたAN004を重クロロホルムに溶解し、AN020と同様に、13C−NMRスペクトルを測定した。結果は、図3に示す。AN020において、アセチル基に相当するシグナルは認められなかった。
Cell−WSCBはアセチル基を有しないことから、AN004のスペクトルが示すアセチル基はすべて後のアセチル化で導入されたものと考えられる。他方、AN004のスペクトルが示すブチリル基はすべてWSCBに由来するものと考えられる。AN004のアセチル基およびブチリル基の合計の置換度も、3.0である。Ac2、Ac3、Ac6、Bu2、Bu3、Bu6のシグナルの面積の総和を3.0とし、この総和におけるAc2、Ac3、Ac6の面積の和及びBu2、Bu3、Bu6の面積の和の比を求め、それぞれをアセチル置換度及びブチリル置換度とした。ブチリル置換度は1.3であった。
WSCBからAN004を得る一連の処理においてブチリル基を付加あるいは脱離させる処理は含まれないため、得られたAN004について求めたブチリル置換度は酪酸セルロース(WSCB)のブチリル置換度と等しい。したがって酪酸セルロース(WSCB)のブチリル置換度は1.3である。
(酪酸セルロース(WSCB)の重合度の測定)
上記の方法でWSCBをアセチル化することで得たAN004のポリスチレン換算分子量(重量平均分子量および数平均分子量)をGPC(SEC)で測定し、さらに次の式に基づき重合度(重量平均重合度および数平均重合度)を求め、これをWSCBの重合度とした。
重合度=分子量÷(162.14+ブチリル置換度×70.091+(3−ブチリル置換度)×42.037)
分子量:重量平均分子量または数平均分子量
上記の方法でWSCBをアセチル化することで得たAN004のポリスチレン換算分子量(重量平均分子量および数平均分子量)をGPC(SEC)で測定し、さらに次の式に基づき重合度(重量平均重合度および数平均重合度)を求め、これをWSCBの重合度とした。
重合度=分子量÷(162.14+ブチリル置換度×70.091+(3−ブチリル置換度)×42.037)
分子量:重量平均分子量または数平均分子量
GPCの測定は次の条件で行った。
溶媒:テトラヒドロフラン
試料濃度:0.2%(wt/vol)
カラム:Shodex KF−804およびKF−805
温度:30℃
流速:1ml/min
試料注入量:50μl
検出:示差屈折率検出器
標準ポリスチレン:Shodex SM−105(分子量2,700,000、1,390,000、661,000、323,000、124,000、47,200、18,300、6,940、2,980、および、1,220)
溶媒:テトラヒドロフラン
試料濃度:0.2%(wt/vol)
カラム:Shodex KF−804およびKF−805
温度:30℃
流速:1ml/min
試料注入量:50μl
検出:示差屈折率検出器
標準ポリスチレン:Shodex SM−105(分子量2,700,000、1,390,000、661,000、323,000、124,000、47,200、18,300、6,940、2,980、および、1,220)
このようにして求めたWSCBの重量平均重合度は254、数平均重合度は128であった。
[制御性T細胞増加の評価]
(飼料の調製)
精製飼料AIN−93G(REEVEら、Journal of Nutrition, 123, 1939-1951(1993))、およびAIN−93Gには5重量%のセルロースが含まれるところ、このセルロースを全てWSCBに置き換えたもの(以下、WSCB−AIN−93Gと称することがある)を用いた。
(飼料の調製)
精製飼料AIN−93G(REEVEら、Journal of Nutrition, 123, 1939-1951(1993))、およびAIN−93Gには5重量%のセルロースが含まれるところ、このセルロースを全てWSCBに置き換えたもの(以下、WSCB−AIN−93Gと称することがある)を用いた。
(実験動物)
4週齢のC57BL/6J系雄性マウスを用いた。
4週齢のC57BL/6J系雄性マウスを用いた。
(飼育実験)
10個体のマウスに精製飼料AIN−93Gを与えて1週間飼育した(予備飼育)。その後、マウスを2群各5個体にグループ分けし、さらに4週間飼育した。このとき、1群には精製飼料AIN−93Gを与え、これをControl群とした。残り1群にはWSCB−AIN−93を与え、これをButyrate群とした。飼料はいずれも自由摂取とした。
10個体のマウスに精製飼料AIN−93Gを与えて1週間飼育した(予備飼育)。その後、マウスを2群各5個体にグループ分けし、さらに4週間飼育した。このとき、1群には精製飼料AIN−93Gを与え、これをControl群とした。残り1群にはWSCB−AIN−93を与え、これをButyrate群とした。飼料はいずれも自由摂取とした。
(細胞分離及びフローサイトメトリー)
飼育したマウスの大腸及び小腸粘膜固有層からリンパ球を単離するために、大腸を採取し、長手方向に開裂して中の糞便等を洗浄し除去した。そして、洗浄した大腸を37℃で30分間、20mM EDTA含有HBSS中にて振盪した。上皮細胞及び脂肪組織を除去した後、腸組織を細かく小切片にし、RPMI 1640培地(2%ウシ胎児血清(FBS)、400単位/ml(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製) コラゲナーゼD、0.25単位/mlディスパーゼ(コーニング社製)、及び0.1mg/ml DNaseI(和光純薬工業株式会社製)含有)を添加し、37℃の水浴中で30時間振盪した。消化した組織をRPMI 1640培地(2%ウシ胎児血清(FBS)含有)で洗浄し、10ml 35%パーコール(GE Healthcare)に再懸濁し、15mlファルコンチューブ中の2.5ml 70%パーコールの上に重層した。そして、室温下にて2000rpmで20分間遠心し、パーコール密度勾配による細胞分離を行った。境界面の細胞を回収して粘膜固有層リンパ球として使用した。回収した細胞は染色バッファー(PBS、2% FBS、2mM EDTA、及び0.09%NaN3)に懸濁し、APC−eFlour780で標識された抗CD4抗体(RM4−5、eBioscience)、BV421で標識された抗CD3e抗体(145-2C11、BD Biosciences)を用いて染色した。その後、細胞内Foxp3の染色は、Foxp3 Staining Buffer Set(eBioscience)及びPEで標識された抗Foxp3抗体(FJK−16s、eBioscience)を用いて行った。
飼育したマウスの大腸及び小腸粘膜固有層からリンパ球を単離するために、大腸を採取し、長手方向に開裂して中の糞便等を洗浄し除去した。そして、洗浄した大腸を37℃で30分間、20mM EDTA含有HBSS中にて振盪した。上皮細胞及び脂肪組織を除去した後、腸組織を細かく小切片にし、RPMI 1640培地(2%ウシ胎児血清(FBS)、400単位/ml(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製) コラゲナーゼD、0.25単位/mlディスパーゼ(コーニング社製)、及び0.1mg/ml DNaseI(和光純薬工業株式会社製)含有)を添加し、37℃の水浴中で30時間振盪した。消化した組織をRPMI 1640培地(2%ウシ胎児血清(FBS)含有)で洗浄し、10ml 35%パーコール(GE Healthcare)に再懸濁し、15mlファルコンチューブ中の2.5ml 70%パーコールの上に重層した。そして、室温下にて2000rpmで20分間遠心し、パーコール密度勾配による細胞分離を行った。境界面の細胞を回収して粘膜固有層リンパ球として使用した。回収した細胞は染色バッファー(PBS、2% FBS、2mM EDTA、及び0.09%NaN3)に懸濁し、APC−eFlour780で標識された抗CD4抗体(RM4−5、eBioscience)、BV421で標識された抗CD3e抗体(145-2C11、BD Biosciences)を用いて染色した。その後、細胞内Foxp3の染色は、Foxp3 Staining Buffer Set(eBioscience)及びPEで標識された抗Foxp3抗体(FJK−16s、eBioscience)を用いて行った。
そして、フローサイトメトリーはFACScant IIを使用して行い、データはFlowJo ソフトウェア(TreeStar Inc.)により解析した。
(フローサイトメトリー結果)
フローサイトメトリーに基づく結果の一例を図4(a)に示す。フローサイトメトリーで解析した試料のうち、CD3e陽性リンパ球をゲートして選択した後、Control群において、CD3e陽性かつCD4陽性であって制御性T細胞への分化を促進するFoxp3遺伝子を発現しているもの(CD4+Foxp3+)は全体の9.59%であった(CD4+Foxp3−は全体の28.0%)。一方、Butyrate群ではCD4+Foxp3+は全体の17.5%であった(CD4+Foxp3−は全体の27.8%)であった。
Butyrate群、Control群の各群におけるリンパ球に占めるCD3e陽性CD4陽性Foxp3陽性細胞(CD3+CD4+Foxp3+)の割合の平均値を比較した結果、Control群では1.76%であったところ、Butyrate群では2.96%と、有意にCD3+CD4+Foxp3+細胞の占める割合が増加していることが示された(図4(b))。
フローサイトメトリーに基づく結果の一例を図4(a)に示す。フローサイトメトリーで解析した試料のうち、CD3e陽性リンパ球をゲートして選択した後、Control群において、CD3e陽性かつCD4陽性であって制御性T細胞への分化を促進するFoxp3遺伝子を発現しているもの(CD4+Foxp3+)は全体の9.59%であった(CD4+Foxp3−は全体の28.0%)。一方、Butyrate群ではCD4+Foxp3+は全体の17.5%であった(CD4+Foxp3−は全体の27.8%)であった。
Butyrate群、Control群の各群におけるリンパ球に占めるCD3e陽性CD4陽性Foxp3陽性細胞(CD3+CD4+Foxp3+)の割合の平均値を比較した結果、Control群では1.76%であったところ、Butyrate群では2.96%と、有意にCD3+CD4+Foxp3+細胞の占める割合が増加していることが示された(図4(b))。
以上のとおり、精製飼料のうち5重量%を本開示の制御性T細胞増加剤に置き換えただけで、十分な制御性T細胞増加効果を示した。
[腸内短鎖脂肪酸(SCFA)の評価]
実験動物を8週齢のC57BL/6Jマウスとし、4週間に渡って5重量%のセルロースを含む精製飼料AIN−93Gを与えたControl群を4個体、精製飼料AIN−93Gに含まれる5重量%のセルロースのうち40%に相当する2重量%分のみWSCBに置き換えたWSCB−AIN−93を与えたButyrate群を4個体、予備飼育1週間の後、飼育実験した以外は上記制御性T細胞増加の評価と同じ方法で飼育実験を行った。Osmanらの文献(Dig Dis Sci. 2008 Sep;53(9):2464‐73)の方法で、腸内の酢酸、プロピオン酸、及びn−酪酸の濃度を分析し、各群の平均値を求めた。分析結果は図5に示す。
実験動物を8週齢のC57BL/6Jマウスとし、4週間に渡って5重量%のセルロースを含む精製飼料AIN−93Gを与えたControl群を4個体、精製飼料AIN−93Gに含まれる5重量%のセルロースのうち40%に相当する2重量%分のみWSCBに置き換えたWSCB−AIN−93を与えたButyrate群を4個体、予備飼育1週間の後、飼育実験した以外は上記制御性T細胞増加の評価と同じ方法で飼育実験を行った。Osmanらの文献(Dig Dis Sci. 2008 Sep;53(9):2464‐73)の方法で、腸内の酢酸、プロピオン酸、及びn−酪酸の濃度を分析し、各群の平均値を求めた。分析結果は図5に示す。
図5に示す通り、Control群の腸内の各平均濃度は、酢酸では39.24μmol/g、プロピオン酸濃度では4.69μmol/g及びn−酪酸濃度では2.01μmol/gとなり、Butyrate群の腸内の各平均濃度は、酢酸濃度では32.96μmol/g、プロピオン酸濃度では3.17μmol/g及びn−酪酸濃度では50.47μmol/gである。Butyrate群の腸内における酢酸及びプロピオン酸濃度は、Control群に対しいずれも低下したが、Butyrate群の腸内におけるn−酪酸濃度はControl群に対して約25倍となった。このように、短鎖脂肪酸の中でも特に酪酸が優先的に増加することが示された。
[腸内細菌叢の評価]
実験動物を8週齢のC57BL/6J雄性マウスとし、6個体を2群3個体にグループ分けした以外は制御性T細胞増加の評価と同じ方法で飼育実験を行った。Kimらの文献(DNA Res. 2013 Jun;20(3):241‐53)ならびにKozichらの文献(Appl Environ Microbiol. 2013 Sep;79(17):5112−20.)の方法で、腸内細菌叢を構成する細菌の種類を門レベルで分類し(Verrucomicrobia、Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、及びその他(Others))、それぞれの比率を評価した。評価結果は図6に示す。図6に示す通り、Control群の3個体のバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌比率の平均は1.2%、及びButyrate群の3個体のバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌の比率の平均は41.5%であり、Butyrate群のマウスの腸内細菌叢はバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌の比率が増加した。このようにバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌の比率が高まることが示され、腸内における酪酸濃度の増加には、バクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌が関与することが示された。
実験動物を8週齢のC57BL/6J雄性マウスとし、6個体を2群3個体にグループ分けした以外は制御性T細胞増加の評価と同じ方法で飼育実験を行った。Kimらの文献(DNA Res. 2013 Jun;20(3):241‐53)ならびにKozichらの文献(Appl Environ Microbiol. 2013 Sep;79(17):5112−20.)の方法で、腸内細菌叢を構成する細菌の種類を門レベルで分類し(Verrucomicrobia、Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、及びその他(Others))、それぞれの比率を評価した。評価結果は図6に示す。図6に示す通り、Control群の3個体のバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌比率の平均は1.2%、及びButyrate群の3個体のバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌の比率の平均は41.5%であり、Butyrate群のマウスの腸内細菌叢はバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌の比率が増加した。このようにバクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌の比率が高まることが示され、腸内における酪酸濃度の増加には、バクテロイデス門(Bacteroidetes)細菌が関与することが示された。
Claims (9)
- ブチリル置換度が0.3以上2.6以下であり、総置換度が0.5以上2.8以下であるセルロース誘導体を有効成分とする制御性T細胞増加剤。
- 前記セルロース誘導体のブチリル置換度が0.3以上1.5以下であり、総置換度が0.5以上1.5以下である請求項1に記載の制御性T細胞増加剤。
- 前記セルロース誘導体のアセチル置換度が0を超え2.5以下である請求項1に記載の制御性T細胞増加剤。
- 前記セルロース誘導体のアセチル置換度が0である請求項1または2に記載の制御性T細胞増加剤。
- 前記セルロース誘導体が酪酸セルロースまたは酢酸酪酸セルロースである請求項1〜4のいずれか1項に記載の制御性T細胞増加剤。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の制御性T細胞増加剤を含有する食品。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の制御性T細胞増加剤を含有し、前記セルロース誘導体は1重量%以上5重量%以下である食品。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の制御性T細胞増加剤を含有する医薬。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の制御性T細胞増加剤を含有する炎症性腸疾患の予防及び/又は治療用医薬。
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