WO2019082897A1 - 腸管免疫亢進剤、食品、及び医薬 - Google Patents

腸管免疫亢進剤、食品、及び医薬

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WO2019082897A1
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iga
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直志 竹内
栄治 宮内
周 島本
松山　彰収
大野　博司
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株式会社ダイセル
国立研究開発法人理化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to intestinal immunity enhancers, foods, and medicines.
  • glycoprotein immunoglobulin, Ig
  • IgA immunoglobulin
  • IgD immunoglobulin
  • IgE immunoglobulin
  • IgG immunoglobulin
  • IgM immunoglobulin M
  • IgA is present in mammals and birds.
  • IgA contained in exocrine fluid such as saliva, tears, nasal discharge, airway mucus, digestive tract secretory fluid, milk is considered as secretory IgA as a frontline of the immune mechanism that protects the mucosal surface from antigens and microorganisms. It is functioning.
  • the digestive tract is always in contact with many substances including antigens and microbes, and it is necessary to prevent these antigens and microbes from invading the living body. It plays an important role in the mucosal immune function, such as preventing adhesion of viruses and eliminating foreign substances that capture foreign antigens and discharge them from the body.
  • promoting IgA secretion enhances mucosal immune function and can be expected to have effects such as preventing infectious diseases and allergic diseases, and therefore development of a food or the like having an IgA secretion promoting action is desired.
  • Non-Patent Document 1 has the following description (summary). "We examined the effect of galactooligosaccharide, which is a type of indigestible oligosaccharide, on the immune system of mice. When we fed a diet containing galactooligosaccharides freely and reared BALB / c mice, total IgA contained in feces was studied. The amount increased significantly after 2 weeks of intake and then decreased to the same level as the control group.Total IgA of Peyer's patch cell cultures and colonic tissue extracts dissected and prepared 4 weeks after intake increased in the galactooligosaccharide group It tended to
  • Non-Patent Document 2 describes the following (Abstract). Lactosucrose (4 G - ⁇ -D-galactosyl sucrose, hereinafter LS) is proposed as an oligosaccharide for the increase of Bifidobacterium in the intestinal tract. As a result of allowing mice to take LS 2% or 5% added diet for 4 weeks and examining the immune responsiveness of the small intestine mucosa, IgA amount in feces and cecal contents significantly increased in the LS 2% or 5% intake group.
  • LS Lactosucrose (4 G - ⁇ -D-galactosyl sucrose
  • Patent Document 1 describes that it has been found that fructo-oligosaccharide, which is a type of non-digestible oligosaccharide, enhances IgA and pIgR production in intestinal mucosa.
  • Patent Document 2 describes that oral administration of indigestible dextrin showed a significant IgA secretion promoting action.
  • Patent Document 3 is a nutritional composition characterized by containing cellulose acetate having a total degree of acetyl substitution of 0.4 to 1.1, livestock feed, a lipid metabolism improving agent, inflammatory bowel disease and / or immunity.
  • Agents for preventing and / or treating abnormalities, agents for preventing and / or treating cancer, agents for preventing and / or treating non-alcoholic steatohepatitis, agents for preventing and / or treating obesity and / or diabetes, and hypercholesterolemia Agents for the prevention and / or treatment of diseases are described.
  • Non-Patent Document 1 describes that intake of feed containing galactooligosaccharides tended to increase total IgA such as mouse colonic tissue extract, but 5 weight of galactooligosaccharides was contained in the feed. % Is also included (p. 80 right column, Table 2).
  • the total amount of fecal IgA in the test group receiving the feed is at most twice as high as that of the control group, which may be a significant difference.
  • the weekly level it decreased to the same level as the control group, with no significant difference (p. 81 right column, Figure 1).
  • a large amount of total IgA tended to be analyzed by analyzing a large intestine tissue extract and the like, but it was clearly stated that these effects were not significant (p. 81 right column, Figure 2 And 3).
  • Non-patent document 2 shows that the amount of IgA in the feces of mice became about twice that of the control group after one week due to the intake of the lactosucrose-supplemented diet, but it decreased significantly after 2 weeks, It does not increase greatly (Fig. 1). In particular, in the case of a 2% lactosucrose-added feed, there is almost no increase after the amount of IgA decreases significantly after 2 weeks (Fig. 1).
  • Patent Document 1 also describes that mice were fed with an experimental diet to which 5% (w / w) of fructooligosaccharide was also added.
  • the IgA antibody content in feces of 36-day-old mice in the test group receiving the diet is about twice that of the control group, which is a significant difference (Fig. 5). There is no significant difference at 42 days of age ( Figure 5).
  • the IgA antibody content of the entire large intestine in the test group is about 1.5 times that in the control group at 44 days of age, which is a significant difference (Fig. 7), but the amount of IgA antibody per large colon tissue weight is a significant difference. Not ( Figure 9).
  • Patent Document 2 also describes that mice were fed with a feed in which 5% by mass and 7.5% by mass of indigestible dextrin were added to a control feed. It is shown that IgA in digestive tract contents (FIG. 1) and feces (FIG. 2) increased, but the solid number of mice used in the experiment is not shown, and a significant difference test The results are also not shown and in some figures no error bars are shown ( Figures 1-4). Furthermore, in the figure in which the error bar is shown, it can be read that the error range is large, and it is clear that no description is given because there is no significant difference as a result of the test. Therefore, probability statistical verification has not been conducted to see if it is a technique to increase IgA in the first place. In addition, the substrate specificity of IgA has not been investigated.
  • Patent Document 3 describes cellulose acetate having a total degree of acetyl substitution of 0.4 to 1.1, but neither describes nor suggests intestinal immune enhancers.
  • the conventional methods using galactooligosaccharides, lactosucrose, fructooligosaccharides, indigestible dextrin and the like require considerably high doses to increase IgA in the large intestine and the like. If high doses are required, it may be painful to take orally as a medicine, or it may impair the enjoyment of normal food when taken as a food, etc. Are concerned. In addition, the conventional method can not maintain the increased amount of IgA for a long time. Furthermore, the affinity (substrate specificity) of IgA to pathogenic bacteria is not designed, and the specificity to pathogenic bacteria is low.
  • An object of the present invention is to provide an intestinal immunity enhancer that can sufficiently increase IgA in the intestinal tract and maintain the increased amount of IgA for a long time at a low dose.
  • the first of the present invention relates to an intestinal immunity enhancer containing cellulose acetate having a total degree of acetyl substitution of 0.4 or more and 1.1 or less.
  • the cellulose acetate preferably has a composition distribution index (CDI) defined by the following formula of 2.0 or less.
  • CDI (measured value of composition distribution half value width) / (theoretical value of composition distribution half value width)
  • Measured value of composition distribution half value width Composition distribution half value width determined by HPLC analysis of cellulose acetate propionate obtained by propionylation of all remaining hydroxyl groups of cellulose acetate (sample)
  • DS total acetyl substitution degree
  • DPw weight average degree of polymerization (value determined by GPC-light scattering method using cellulose acetate propionate obtained by propionylation of all remaining hydroxyl groups of cellulose acetate (sample))
  • the second of the present invention relates to a food comprising the intestinal immunity enhancer.
  • the content of the cellulose acetate in the food is preferably 0.1% by weight or more and less than 5% by weight.
  • the third of the present invention relates to a medicament comprising the intestinal immunity enhancer.
  • an intestinal immunity enhancer that can sufficiently increase IgA in the intestinal tract and maintain the increased amount of IgA for a long time at a low dose.
  • the intestinal tract immune enhancer contains cellulose acetate having a total degree of acetyl substitution of 0.4 or more and 1.1 or less.
  • the intestinal tract means a small intestine including duodenum, jejunum, ileum and the like, and a large intestine including cecum, proximal colon, distal large intestine and the like.
  • examples of immune enhancement include an increase in IgA, and the increase in IgA includes, for example, an increase in IgA-producing plasma cells.
  • Ingestion or administration (in particular, oral) of the intestinal immunity enhancer of the present disclosure increases immunoglobulin A (IgA) -producing plasma cells of the intestinal tract (particularly, the lamina intestinal of the large intestine), increases IgA in the intestinal tract, and increases The amount of IgA can be maintained for a long period of time, and / or the specificity of antigen-antibody reaction of the IgA to Proteobacterium bacteria is increased, whereby effects such as reduction of Proteobacterial bacteria of intestinal mucosa can be obtained.
  • Proteobacteria is a phyla containing many pathogenic bacteria such as pathogenic E. coli, salmonella and vibrio bacteria, and the intestine is protected from pathogenic bacteria by reducing these bacteria in the large intestine mucosa.
  • the intestinal immunity enhancer of the present disclosure can achieve the effect even at a lower dose than conventional.
  • the cellulose acetate of the present disclosure has a total degree of acetyl substitution (average degree of substitution) of 0.4 or more and 1.1 or less.
  • the total degree of acetyl substitution is in this range, the solubility in water is excellent, and when it is outside this range, the solubility in water tends to decrease. It is thought that cellulose acetate is decomposed into acetic acid and cellulose in the digestive tract by intestinal bacteria in the digestive tract, and cellulose is further decomposed into short chain fatty acids such as acetic acid via oligosaccharides and monosaccharides.
  • Metabolites such as acetic acid generated in such a process and enteric bacteria that assimilate cellulose acetate in such a process are considered to lead to an increase in IgA-producing cells and an increase in IgA.
  • Cellulose acetate which is highly soluble in water, is more likely to be degraded because decomposition of cellulose acetate to acetic acid and cellulose is thought to be caused by extracellular enzymes, and it is highly effective in promoting the increase of IgA-producing cells and the increase of IgA. .
  • the preferable range of the total degree of acetyl substitution is 0.5 or more and 1.0 or less, and more preferably 0.6 or more and 0.95 or less.
  • the total degree of acetyl substitution can be measured by a known titration method in which cellulose acetate is dissolved in water and the degree of substitution of cellulose acetate is determined. Specifically, it is as follows.
  • the total degree of acetyl substitution can be determined by converting the degree of acetylation obtained according to the method for measuring the degree of acetylation in ASTM: D-817-91 (test method such as cellulose acetate) according to the following equation. This is the most common way of determining the degree of substitution of cellulose acetate.
  • DS 162.14 ⁇ AV ⁇ 0.01 / (6.052-42.037 ⁇ AV ⁇ 0.01)
  • DS total acetyl substitution degree AV: degree of acetylation (%)
  • AV (degree of acetylation) (%) is calculated according to the following equation.
  • AV (%) (A ⁇ B) ⁇ F ⁇ 1.201 / sample weight (g)
  • the total degree of acetyl substitution can also be measured by NMR after dissolving in deuterated chloroform after propionylation of the hydroxyl group of cellulose acetate.
  • the propionylation of the hydroxyl group of cellulose acetate is carried out by using N, N-dimethylaminopyridine as a catalyst in the mixed solvent of pyridine / N, N-dimethylacetamide and allowing propionic acid to act on the method of fully derivatization of cellulose acetate described later. Can be done.
  • composition distribution index (CDI) of cellulose acetate is not particularly limited.
  • the composition distribution index (CDI) may be, for example, 1.0 or more and 3.0 or less.
  • the composition distribution index (CDI) is preferably 2.0 or less, more preferably 1.0 or more and 2.0 or less, still more preferably 1.0 or more and 1.8 or less, and still more preferably 1.0 or more and 1.6 or less.
  • 1.0 or more and 1.5 or less are particularly preferable.
  • the lower limit value of the composition distribution index (CDI) is 0, which is realized by a special synthesis technique such as acetylation of only the 6th position of the glucose residue with 100% selectivity and no acetylation at other positions. Such synthetic techniques are not known. In the situation where all of the hydroxyl groups of glucose residues are acetylated and deacetylated with the same probability, the CDI will be 1.0, but in actual cellulose reactions it will be considerable to approach such an ideal state. It requires a device. The smaller the composition distribution index (CDI), the more uniform the composition distribution (intermolecular substitution degree distribution).
  • composition distribution is uniform, water solubility can be ensured in a range where the total degree of acetyl substitution is wider than usual, uniform dissolution is achieved, and structural viscosity does not appear, so it is easy to ingest or administer and easily degraded. It is easy to express the effect of
  • composition distribution index is the ratio of the actually measured value to the theoretical value of the composition distribution half width [(measured value of composition distribution half width) / (theoretical value of composition distribution half width)]. It is defined.
  • the composition distribution half value width is also referred to as “intermolecular substitution degree distribution half value width” or simply “substitution degree distribution half value width”.
  • the size of the half width (also referred to as the “half width”) of the maximum peak of the intermolecular substitution degree distribution curve of cellulose acetate is an index.
  • the half width is the height of half the peak height of the chart, where the total degree of acetyl substitution is on the horizontal axis (x axis) and the abundance at this degree of substitution is on the vertical axis (y axis). It is a width, and is an index that represents a measure of distribution variation.
  • the half-value distribution of the degree of substitution distribution can be determined by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis. The method of converting the horizontal axis (elution time) of the elution curve of cellulose ester in HPLC to the degree of substitution (0 to 3) is described in JP-A 2003-201301 (paragraphs 0037 to 0040).
  • composition distribution half-value width substitution degree distribution half-value width
  • m total number of hydroxyl groups and acetyl groups in one cellulose acetate molecule
  • p probability that hydroxyl groups in one cellulose acetate molecule are acetyl-substituted
  • q 1-p
  • DPw Weight average degree of polymerization (by GPC-light scattering method)
  • DPw Weight average degree of polymerization degree
  • Formula (1) is a composition distribution half value width which inevitably arises when all the hydroxyl groups of cellulose are acetylated and deacetylated with the same probability, and is derived according to the so-called binomial theorem. Furthermore, the theoretical value of the composition distribution half value width is represented by the degree of substitution and the degree of polymerization as follows. The following equation (2) is a definition equation for finding the theoretical value of the composition distribution half width.
  • DS total acetyl substitution degree
  • DPw weight average degree of polymerization (by GPC-light scattering method)
  • the measuring method of a weight average polymerization degree (DPw) is mentioned later.
  • the measured value of the composition distribution half value width is the composition distribution half value width obtained by HPLC analysis of cellulose acetate propionate obtained by propionylation of all remaining hydroxyl groups (unsubstituted hydroxyl groups) of cellulose acetate (sample). It is.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-158664 describes a composition distribution analysis method for cellulose acetate having a substitution degree of 2.27 to 2.56.
  • composition distribution half width substitution degree distribution half width
  • derivatization of the residual hydroxyl group in cellulose acetate is performed as pretreatment before HPLC analysis, and then HPLC analysis is performed.
  • Ask. The purpose of this pretreatment is to convert low substituted cellulose acetate (for example, cellulose acetate having a total degree of substitution of acetyl of 1.1 or less) into a derivative that is easily soluble in organic solvents for HPLC analysis.
  • the residual hydroxyl group in the molecule is completely propionylated, and the fully derivatized cellulose acetate propionate (CAP) is subjected to HPLC analysis to determine the composition distribution half value width (measured value).
  • the derivatization is completely carried out, there are no residual hydroxyl groups in the molecule, and only acetyl and propionyl groups must be present. That is, the sum of the total degree of acetyl substitution (DSac) and the total degree of propionyl substitution (DSpr) is 3.
  • Propionylation is carried out under the conditions of a reaction time of 1.5 to 3.0 hours. After the reaction, precipitation is carried out using methanol as a precipitation solvent to obtain a fully derivatized cellulose acetate propionate. More specifically, for example, 1 part by weight of the reaction mixture is precipitated in 10 parts by weight of methanol at room temperature to precipitate, and the resulting precipitate is washed 5 times with methanol and vacuum dried at 60 ° C. for 3 hours. Thus, fully derivatized cellulose acetate propionate (CAP) can be obtained.
  • CAP fully derivatized cellulose acetate propionate
  • the degree of dispersion (polydispersity, Mw / Mn) and the weight average degree of polymerization (DPw) described later were also measured using cellulose acetate (sample) as fully derivatized cellulose acetate propionate (CAP) by this method. It is.
  • HPLC analysis using a plurality of cellulose acetate propionates having different degrees of total acetyl substitution as standard samples, HPLC analysis was performed under a predetermined measurement device and measurement conditions, and analysis values of these standard samples were used to create From the calibration curve [curve showing relationship between elution time of cellulose acetate propionate and degree of total substitution of acetyl (0 to 3), usually cubic curve], half width of composition distribution of cellulose acetate (sample) (measured value) It can be asked. What is required by HPLC analysis is the relationship between the elution time and the acetyl total substitution degree distribution of cellulose acetate propionate.
  • Degree of substitution distribution curve [the degree of substitution of cellulose acetate propionate, with the amount of cellulose acetate propionate as the ordinate and the total degree of acetyl substitution as the abscissa, obtained from the calibration curve]
  • the half degree width of the degree of substitution distribution is determined as follows. Draw a baseline (A-B) in contact with the base (A) on the low substitution degree side of peak (E) and the base (B) on the high substitution degree side, and for this baseline, from the maximum peak (E) Draw a vertical line on the horizontal axis.
  • the point of intersection (C) between the perpendicular and the base line (AB) is determined, and the midpoint (D) between the maximum peak (E) and the point of intersection (C) is determined.
  • a straight line parallel to the baseline (A-B) is drawn through the midpoint (D) to determine two intersection points (A ', B') with the intermolecular substitution degree distribution curve.
  • a vertical line is drawn from the two intersection points (A ', B') to the horizontal axis, and the width between the two intersection points on the horizontal axis is taken as the half width of the maximum peak (i.e., the substitution degree distribution half width).
  • the half-value width of such substitution degree distribution is a retention time depending on the degree to which the hydroxyl group of one glucose ring of the polymer chain constituting the molecular chain of cellulose acetate propionate in the sample is acetylated. It reflects that the (retention time) is different. Therefore, ideally, the width of the retention time indicates the width of the composition distribution (in degree of substitution).
  • the width of the holding time not attributed to the width of the composition distribution is often included as an error.
  • the half value width of the degree of substitution distribution of cellulose acetate propionate can be usually determined as the correction value Z based on the correction equation represented by the following equation.
  • Z (X 2 -Y 2 ) 1/2 [Wherein, X is a substitution degree distribution half value width (uncorrected value) determined on a predetermined measuring device and measuring conditions.
  • Y (ab) x / 3 + b (0 ⁇ x ⁇ 3).
  • a is an apparent substitution degree distribution half value width of cellulose acetate having a total substitution degree of 3 determined under the same measurement apparatus and measurement conditions as the X (in fact, there is no substitution degree distribution because the total substitution degree is 3)
  • b is It is an apparent substitution degree distribution half value width of the cellulose propionate of the total substitution degree 3 calculated
  • x is the total degree of acetyl substitution (0 ⁇ x ⁇ 3) of the measurement sample
  • the cellulose acetate (or cellulose propionate) of the said total substitution degree 3 shows the cellulose ester by which all the hydroxyl groups of cellulose were esterified, and, in fact (ideally) substitution degree distribution half value width A cellulose ester which does not have (ie, a half degree width of substitution degree distribution of 0).
  • the actual measurement value of the composition distribution half width (the substitution degree distribution half value width) of the cellulose acetate is preferably 0.12 to 0.34, more preferably 0.13 to 0.31, and still more preferably 0. 13 to 0.25.
  • the theoretical distribution of degree of substitution described above is a probabilistic calculation value assuming that all acetylation and deacetylation proceed independently and equally. That is, it is a calculated value according to the binomial distribution. Such an ideal situation is practically impossible.
  • the distribution of degree of substitution of the cellulose ester is a probability unless the hydrolysis reaction of cellulose acetate approaches an ideal random reaction and / or special arrangements are made such that fractionation occurs in the composition after post-reaction workup It is much wider than what is theoretically determined by the binomial distribution.
  • One of the special ideas of the reaction is, for example, to maintain the system under conditions in which deacetylation and acetylation are in equilibrium. However, in this case, it is not preferable because decomposition of cellulose proceeds by the acid catalyst.
  • Another special idea of the reaction is to adopt reaction conditions in which the deacetylation rate is low for low-substituted products.
  • such a specific method is not known. That is, no special device for the reaction is known which controls the substitution degree distribution of the cellulose ester according to the binomial distribution according to the reaction probability theory.
  • Another device for narrowing the degree of substitution distribution found by the present inventors is the hydrolysis reaction (aging reaction) of cellulose acetate at a temperature of 90 ° C. or more (or more than 90 ° C.) at high temperature.
  • aging reaction aging reaction
  • decomposition and analysis of the degree of polymerization of the product obtained by the high temperature reaction have not been made in the past, decomposition of cellulose has been given priority in high temperature reactions of 90 ° C. or higher. This idea can be said to be a stereotype based solely on viscosity considerations.
  • the present inventors are in a large amount of acetic acid under high temperature of 90 ° C.
  • the total degree of acetyl substitution at positions 2, 3, and 6 of the glucose ring of the cellulose acetate can be measured by NMR according to the method of Tezuka (Tezuka, Carbonydr. Res. 273, 83 (1995)). That is, the free hydroxyl group of a cellulose acetate sample is propionylated with propionic anhydride in pyridine. The resulting sample is dissolved in deuterated chloroform and the 13 C-NMR spectrum is measured.
  • the carbon signal of the acetyl group appears in the region of 169 ppm to 171 ppm in the order of 2, 3 and 6 from the high magnetic field, and the carbonyl carbon signal of the propionyl group appears in the same sequence in the region of 172 ppm to 174 ppm.
  • the degree of acetyl substitution at positions 2, 3, and 6 of the glucose ring in the original cellulose acetate can be determined from the abundance ratio of the acetyl group to the propionyl group at each corresponding position.
  • the sum of the degree of acetyl substitution at the 2, 3, and 6 positions thus determined is the total degree of acetyl substitution, and the total degree of acetyl substitution can also be determined by this method.
  • the total degree of acetyl substitution can be analyzed by 1 H-NMR as well as 13 C-NMR.
  • the standard deviation ⁇ of the degree of substitution at positions 2, 3 and 6 is defined by the following equation.
  • the standard deviation of the degree of acetyl substitution at the 2, 3 and 6 positions of the glucose ring of cellulose acetate is preferably 0.08 or less (0 to 0.08).
  • Cellulose acetate having a standard deviation of 0.08 or less is uniformly substituted at the 2, 3, and 6 positions of the glucose ring, and is excellent in water solubility.
  • the dispersion degree (polydispersity, Mw / Mn) of the cellulose acetate of the present disclosure is preferably in the range of 1.2 to 2.5.
  • Cellulose acetate having a degree of dispersion Mw / Mn in the above range is uniform in molecular size and excellent in water solubility. It is thought that cellulose acetate is decomposed into acetic acid and cellulose in the digestive tract by intestinal bacteria in the digestive tract, and cellulose is further decomposed into short chain fatty acids such as acetic acid via oligosaccharides and monosaccharides.
  • Metabolites such as acetic acid generated in such a process and enteric bacteria that assimilate cellulose acetate in such a process are considered to lead to an increase in IgA-producing cells and an increase in IgA.
  • Cellulose acetate which is highly soluble in water, is more likely to be degraded because decomposition of cellulose acetate to acetic acid and cellulose is thought to be caused by extracellular enzymes, and it is highly effective in promoting the increase of IgA-producing cells and the increase of IgA. . Furthermore, it leads to the increase in intestinal immune enhancing effect.
  • the number average molecular weight (Mn), weight average molecular weight (Mw) and degree of dispersion (polydispersity, Mw / Mn) of cellulose acetate can be determined by a known method using HPLC.
  • the degree of dispersion (polydispersity, Mw / Mn) of cellulose acetate is cellulose acetate (sample) in the same manner as in the case of obtaining the measured value of the composition distribution half width in order to make the measurement sample soluble in an organic solvent.
  • CAP cellulose acetate propionate
  • the weight average degree of polymerization (DPw) is a value determined by GPC-light scattering method using cellulose acetate propionate obtained by propionylation of all remaining hydroxyl groups of cellulose acetate (sample).
  • the weight average polymerization degree (DPw) of the cellulose acetate of the present disclosure is preferably in the range of 50 to 800. If the weight average degree of polymerization (DPw) is too high, the solubility in water tends to deteriorate.
  • the weight average polymerization degree (DPw) is preferably 55 to 700, more preferably 60 to 600. It is thought that cellulose acetate is decomposed into acetic acid and cellulose in the digestive tract by intestinal bacteria in the digestive tract, and cellulose is further decomposed into short chain fatty acids such as acetic acid via oligosaccharides and monosaccharides.
  • Metabolites such as acetic acid generated in such a process and enteric bacteria that assimilate cellulose acetate in such a process are considered to lead to an increase in IgA-producing cells and an increase in IgA.
  • Cellulose acetate which is highly soluble in water, is more likely to be degraded because decomposition of cellulose acetate to acetic acid and cellulose is thought to be caused by extracellular enzymes, and it is highly effective in promoting the increase of IgA-producing cells and the increase of IgA. . Furthermore, it leads to the increase in intestinal immune enhancing effect.
  • the weight average degree of polymerization is the same as the degree of dispersion (polydispersity, Mw / Mn), and the cellulose acetate (sample) is a complete derivative by the same method as in the case of obtaining the measured value of the composition distribution half width. It is determined by conducting size exclusion chromatography analysis after conversion to cellulose acetate propionate (CAP) (GPC-light scattering method).
  • the molecular weight (degree of polymerization) and dispersion degree (polydispersity, Mw / Mn) of cellulose acetate are measured by GPC-light scattering method (GPC-MALLS, GPC-LALLS, etc.).
  • GPC-MALLS GPC-light scattering method
  • detection of light scattering is difficult in aqueous solvents. This is due to the fact that the aqueous solvent is generally high in foreign matter and easily subjected to secondary contamination even if it is purified once.
  • the spread of molecular chains may not be stable due to the influence of ionic dissociative groups present in a small amount, and if water-soluble inorganic salts (for example, sodium chloride) are added to suppress such dissolution, dissolution will occur. The state becomes unstable and may form an association in an aqueous solution.
  • water-soluble inorganic salts for example, sodium chloride
  • One of the effective methods to avoid this problem is to derivatize cellulose acetate so that it is dissolved in an organic solvent with few foreign substances and is less susceptible to secondary contamination, and perform GPC-light scattering measurement with the organic solvent. is there.
  • Propionylation is effective as a derivatization of cellulose acetate for this purpose, and specific reaction conditions and post treatments are as described in the explanation of the measured values of the composition distribution half value width.
  • the cellulose acetate (cellulose acetate) is, for example, (A) a hydrolysis step (aging step) of cellulose acetate with a high degree of substitution, (B) a precipitation step, and, if necessary, (C) washing, neutralization It can be manufactured by the process.
  • the total degree of acetyl substitution of medium to high substitution degree cellulose acetate is, for example, 1.5 or more and 3 or less, preferably 2 or more and 3 or less.
  • the hydrolysis reaction can be carried out by reacting raw material cellulose acetate and water in the presence of a catalyst (aging catalyst) in an organic solvent.
  • a catalyst aging catalyst
  • an organic solvent an acetic acid, acetone, alcohol (methanol etc.), these mixed solvents etc. are mentioned, for example.
  • a solvent containing at least acetic acid is preferable.
  • a catalyst a catalyst generally used as a deacetylation catalyst can be used.
  • sulfuric acid is particularly preferred.
  • the amount of the organic solvent (for example, acetic acid) used is, for example, 0.5 to 50 parts by weight, preferably 1 to 20 parts by weight, and more preferably 3 to 10 parts by weight, per 1 part by weight of the raw material cellulose acetate. .
  • the amount of the catalyst (eg, sulfuric acid) used is, for example, 0.005 to 1 part by weight, preferably 0.01 to 0.5 parts by weight, and more preferably 0.02 to 1 part by weight with respect to 1 part by weight of the raw material cellulose acetate. It is 0.3 parts by weight. If the amount of catalyst is too low, the hydrolysis time may be too long, which may lead to a decrease in the molecular weight of the cellulose acetate. On the other hand, if the amount of the catalyst is too large, the degree of change in the depolymerization rate with respect to the hydrolysis temperature becomes large, and the depolymerization rate becomes large even if the hydrolysis temperature is low to some extent. Become.
  • the amount of water in the hydrolysis step is, for example, 0.5 to 20 parts by weight, preferably 1 to 10 parts by weight, and more preferably 2 to 7 parts by weight with respect to 1 part by weight of the raw material cellulose acetate.
  • the amount of water is, for example, 0.1 to 5 parts by weight, preferably 0.3 to 2 parts by weight, and more preferably 0.5 to 1 parts by weight with respect to 1 part by weight of the organic solvent (for example, acetic acid). .5 parts by weight.
  • water may be present in the system in all amounts at the start of the reaction, part of the water used is allowed to be present in the system at the start of the reaction to prevent the precipitation of cellulose acetate, and the remaining water is It may be divided into one to several times and added to the system.
  • the reaction temperature in the hydrolysis step is, for example, 40 to 130 ° C., preferably 50 to 120 ° C., and more preferably 60 to 110 ° C.
  • the reaction equilibrium tends to be inclined to increase the rate of the reverse reaction (acetylation reaction) to the forward reaction (hydrolysis reaction)
  • the degree of substitution distribution becomes narrow, and it is possible to obtain cellulose acetate having a very small composition distribution index CDI without particularly devising post-processing conditions.
  • precipitation is performed using a mixed solvent containing two or more solvents as a precipitation solvent, or precipitation fractionation and / or dissolution By performing fractionation, it is possible to obtain cellulose acetate having a very small composition distribution index CDI.
  • a precipitation solvent is added to precipitate cellulose acetate.
  • a precipitation solvent an organic solvent miscible with water or an organic solvent having high solubility in water can be used.
  • ketones such as acetone and methyl ethyl ketone
  • alcohols such as methanol, ethanol and isopropyl alcohol
  • esters such as ethyl acetate
  • nitrogen-containing compounds such as acetonitrile
  • ethers such as tetrahydrofuran
  • mixed solvents thereof for example, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; alcohols such as methanol, ethanol and isopropyl alcohol; esters such as ethyl acetate; nitrogen-containing compounds such as acetonitrile; ethers such as tetrahydrofuran; and mixed solvents thereof.
  • a mixed solvent containing two or more solvents is used as the precipitation solvent, the same effect as precipitation fractionation described later is obtained, the composition distribution (intermolecular substitution degree distribution) is narrow, and the composition distribution index (CDI) is small.
  • a preferable mixed solvent for example, a mixed solvent of acetone and methanol, a mixed solvent of isopropyl alcohol and methanol, and the like can be mentioned.
  • composition distribution is narrow, and composition distribution index Cellulose acetate having a very low CDI can be obtained.
  • cellulose acetate (solid matter) obtained by precipitation is dissolved in water to form an aqueous solution of an appropriate concentration (for example, 2 to 10% by weight, preferably 3 to 8% by weight), and this aqueous solution Add a poor solvent (or add the above aqueous solution to a poor solvent) and maintain it at an appropriate temperature (for example, 30 ° C. or less, preferably 20 ° C. or less) to precipitate cellulose acetate and recover the precipitate.
  • the poor solvent include alcohols such as methanol, and ketones such as acetone.
  • the amount of the poor solvent used is, for example, 1 to 10 parts by weight, preferably 2 to 7 parts by weight, per 1 part by weight of the aqueous solution.
  • the dissolution fractionation may be carried out, for example, by using cellulose acetate (solid substance) obtained by the precipitation or cellulose acetate (solid substance) obtained by the precipitation fractionation, water, an organic solvent (eg, ketone such as acetone, ethanol, etc.)
  • a mixed solvent of alcohol etc. is added, stirred at a suitable temperature (for example, 20 to 80 ° C., preferably 25 to 60 ° C.), centrifuged to separate into a thick phase and a thin phase,
  • the reaction can be performed by adding a ketone such as acetone, an alcohol such as methanol, and the like, and collecting a precipitate (solid).
  • the concentration of the organic solvent in the mixed solvent of water and the organic solvent is, for example, 5 to 50% by weight, preferably 10 to 40% by weight.
  • the precipitate (solid) obtained in the precipitation step (B) is preferably washed with an organic solvent (poor solvent) such as an alcohol such as methanol or a ketone such as acetone. Moreover, it is also preferable to wash
  • the neutralization step may be provided immediately after the hydrolysis step, in which case it is preferable to add a basic substance or an aqueous solution thereof to the hydrolysis reaction bath.
  • alkali metal compounds for example, alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; alkali metal carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate; alkali metal carbonates such as sodium hydrogencarbonate) Hydrogen salts; alkali metal carboxylates such as sodium acetate and potassium acetate; sodium alkoxides such as sodium methoxide and sodium ethoxide; alkaline earth metal compounds (for example, alkaline earths such as magnesium hydroxide and calcium hydroxide) Alkaline earth metal carbonates such as metal hydroxides, magnesium carbonate and calcium carbonate; alkaline earth metal carboxylates such as magnesium acetate and calcium acetate; alkaline earth metal alkoxides such as magnesium ethoxide etc. .
  • alkali metal compounds such as potassium acetate are particularly preferable.
  • Impurities such as a catalyst (such as sulfuric acid) used in the hydrolysis step can be efficiently removed by washing and neutralization.
  • the cellulose acetate thus obtained can be adjusted to a specific particle size range by grinding, sieving or granulation, as required.
  • the intestinal immunity enhancer of the present disclosure may be contained in food or medicine, and only cellulose acetate having a total degree of acetyl substitution of 0.4 or more and 1.1 or less may be used as the food or medicine, but It can be used as a component of various foods or medicines.
  • the method of intake or administration of the food or drug includes, in particular, oral intake or administration.
  • Various forms can be selected.
  • common pharmaceutical forms such as powders, granules, tablets, sugar-coated tablets, capsules, syrups, pills, suspensions, solutions and emulsions, and beverages; gums, chocolates, chewing gum, lamb, jelly, etc.
  • Confectionery products; Noodles; Baked foods such as bread, cakes and biscuits; Canned foods; Retort foods; Livestock foods; Fisheries foods; Edible oil compositions such as margarines, dressings and mayonnaise; Nutritional supplements; Butter, ice cream Normal food forms such as milk products such as yogurt, etc. can be adopted.
  • the food or medicine of the present disclosure is not limited to humans, but includes livestock (such as cows, pigs, horses, sheep, etc.), poultry (such as chickens, ducks, etc.), pets (such as dogs, cats, monkeys, mice, rats, guinea pigs, etc.) It can be applied to animals.
  • livestock such as cows, pigs, horses, sheep, etc.
  • poultry such as chickens, ducks, etc.
  • pets such as dogs, cats, monkeys, mice, rats, guinea pigs, etc.
  • sugar coated tablets such as sugar coated tablets; noodles; baked biscuits etc.
  • Preferred food and the like The intestinal immunity enhancer of the present disclosure can also be incorporated as a thickener in the form of a pharmaceutical product or in the form of a food.
  • the content of cellulose acetate having a total degree of acetyl substitution of 0.4 or more and 1.1 or less in the food of the present disclosure is not particularly limited, but is preferably 0.1% by weight or more of the food. This is because an effective amount of cellulose acetate can be consumed by daily intake of the food. In view of sufficiently increasing IgA in the intestinal tract and maintaining the increased amount of IgA for a long time (for example, 2 weeks to 4 weeks, or 4 weeks or more) without impairing the taste or texture of food, 0. 1% by weight or more and less than 5% by weight is preferable, and 1.5% by weight or more and less than 3% by weight are more preferable.
  • target diseases useful for prevention and / or treatment (reduction or prevention of adverse effects) when the intestinal immunity enhancer of the present disclosure is contained in food or medicine are pathogens belonging to the Proteobacteria department. And infections such as Salmonella infection, cholera, Vibrio parahaemolyticus and the like.
  • IgA-producing plasma cells particularly in the lamina intestinal of the large intestine, of the intestinal tract, it is expected to be effective in increasing IgA, enhancing mucosal immune function, and preventing infections and allergic diseases. it can.
  • the intake or dose of the intestinal immunity enhancer of the present disclosure may be an amount sufficient to produce the desired intestinal immunity enhancing effect. Specifically, it is empirically determined in consideration of the condition, intake or administration method, and formulation form of the individual, such as the individual's age, weight, sex, health status, and conditions such as the stomach, small intestine, and large intestine. obtain.
  • the intake or dose per dose may be, for example, 5 mg / kg body weight to 60 mg / kg body weight, and may be 10 mg / kg body weight to 40 mg / kg body weight.
  • the number of times the individual is ingested or administered to the individual may be one or more than one. If more than once, it may be administered periodically, infrequently, or as needed. The appropriate number of times can be determined empirically in consideration of the condition regarding an individual, the method of intake or administration, the form of preparation and the like as the intake or dose.
  • the first hydrolysis step (first ripening step) from the start of the reaction to the first addition of water, and the second hydrolysis step (second ripening from the first addition of water to the second addition of water) Step), from the second addition of water to the end of the reaction, is referred to as a third hydrolysis step (third ripening step).
  • the reaction was quenched by adding an aqueous solution of 24% magnesium acetate containing 1.1 equivalents of magnesium acetate to sulfuric acid to the reaction mixture.
  • the reaction mixture was dropped into a 3.6-fold weight of acetone with respect to the reaction mixture under stirring for 60 minutes to form a precipitate.
  • the precipitate was recovered by filtration as a wet cake with a solids content of 15% by weight.
  • Add 16 parts by weight of a mixed solvent of acetone / water (acetone concentration: 20% by weight) to 1 part by weight of the solid content of the obtained precipitate, stir at 40 ° C. for 8 hours, and filter by 15% by weight of solid content The solid was collected as a wet cake.
  • the total degree of acetyl substitution, weight average degree of polymerization (DPw), degree of dispersion (polydispersity, Mw / Mn) of the obtained cellulose acetate, measured value of composition distribution half width, and composition distribution index (CDI) It measured by.
  • the total degree of acetyl substitution of cellulose acetate is 0.78
  • the weight average degree of polymerization (DPw) is 124
  • the degree of dispersion (polydispersity, Mw / Mn) is 2.0
  • the measured half value width of composition distribution is 0
  • the composition distribution index (CDI) was 1.90.
  • AID KO mice (in other words, mice in which Activation-induced cytidine deaminase has been deficient (knocked out)) were prepared by the method of Muramatsu et al. (Cell, 102, 553-563 (2000)). In addition, AID KO mice do not produce IgA.
  • mice used in the experiments described below were bred by the following method. Eight mice were fed with AIN-93G and bred for 1 week. Feed was free intake. Thereafter, the mice were divided into 2 groups of 4 individuals and reared for 4 more weeks. During the 4 weeks of breeding, one group was given AIN-93G, which was designated as the Control group. The other group was given AIN-93G-acetate, which was designated as Acetate group. However, AID KO mice and E. coli. E. coli monoclinic colonization mice differ in population from the other mice, and 10 mice were bred in groups of 5 animals each.
  • IgA-bound bacteria IgA-coated bacteria
  • PE-labeled anti-IgA antibody Rabat anti-mouse IgA, clone 11-44-2, SouthernBiotech, Inc.
  • fecal flora of wild type mice reared for 4 weeks from the start of administration of AIN-93G or AIN-93G-acetate And with 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) and analyzed by flow cytometry to obtain primary flow cytometry data. Then, DAPI-positive cells stained with DAPI were gated (Gated on DAPI positive cells), and an IgA-positive portion among them was quantified as an IgA-binding bacterium.
  • FIG. 2 (a) shows primary flow cytometry data
  • FIG. 2 (b) shows the percentage (%) of the number of IgA binding bacteria in DAPI-positive cells (% DAPI positive cells).
  • the Acetate group showed a higher value than the Control group. In other words, increased IgA with affinity to more bacteria in the Acetate group resulted in increased IgA binding bacteria. Feeding of the cellulose acetate of the present disclosure is expected to have an immune enhancing effect such as protection of the intestinal tract from certain bacteria.
  • Table 1 shows the results of bacterial flora analysis of feces of wild type mouse Acetate group reared for 4 weeks
  • Table 2 shows the results of bacterial flora analysis of feces of wild type mouse Control group reared for 4 weeks.
  • feces of wild-type mouse Acetate group reared for 4 weeks include Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, and Tenericutes.
  • Verrucomicrobia the bacteria of the Proteobacteria, among other species of Vercoco Microbia, show significantly IgA-positive and high affinity to IgA compared with bacteria of other classifications.
  • bacteria of Protobacteria include pathogenic bacteria such as Escherichia coli, Salmonella, Vibrio and Helicobacter.
  • feces of wild-type mouse control group reared for 4 weeks include Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, and Tenericutes. And Verrucomicrobia, in particular, bacteria of Proteobacteria do not show IgA positive and do not have high affinity to IgA compared with bacteria of other classifications. .
  • tissue IgA concentrations in the Acetate group showed higher values than in the Control group. In particular, a large increase was observed from the cecum to the colon.
  • the intestinal tissue After removing epithelial cells and adipose tissue, the intestinal tissue is finely divided into small pieces, and RPMI 1640 medium (2% fetal bovine serum (FBS), 400 units / ml (manufactured by Roche Diagnostics KK) collagenase D, 0 25 units / ml dispase (manufactured by Corning) and 0.1 mg / ml DNase I (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added and shaken in a 37 ° C. water bath for 30 hours.
  • FBS fetal bovine serum
  • 400 units / ml manufactured by Roche Diagnostics KK
  • collagenase D 0 25 units / ml dispase
  • 0.1 mg / ml DNase I manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the digested tissue is washed with RPMI 1640 medium (containing 2% fetal bovine serum (FBS)), resuspended in 10 ml 35% percoll (GE Healthcare) and overlaid on 2.5 ml 70% percoll in a 15 ml falcon tube did. And it centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes under room temperature, and performed cell separation by Percoll density gradient. The interface cells were collected and used as lamina intestinal lymphocytes.
  • RPMI 1640 medium containing 2% fetal bovine serum (FBS)
  • FBS fetal bovine serum
  • the isolated mucosal lamina limbal lymphocytes are suspended in a staining buffer (PBS, 2% FBS), an IgA-PE antibody (Clone: 11-44-1, SouthernBiotech) and a B220-APC antibody (Clone: RA3-6B2, It stained with BioLegend.
  • a staining buffer PBS, 2% FBS
  • IgA-PE antibody Clone: 11-44-1, SouthernBiotech
  • B220-APC antibody Clone: RA3-6B2, It stained with BioLegend.
  • the lamina limbal lymphocytes thus treated were analyzed by flow cytometry. Gating was performed, and those stained with an IgA-PE antibody but not stained with a B220-APC antibody were quantified as IgA-producing plasma cells (IgA + Plasma cells). In addition, those stained with both IgA-PE antibody and B220-APC antibody were quantified as B cells (IgA + B cells).
  • B cells are a kind of lymphocytes, and when maturation and differentiation proceed, they become plasma cells specialized for antibody production. Since one B cell can produce only one type of antibody, it is possible to activate the B cell that calculates the antibody and start antibody production only when an antigen or bacterial antigen corresponding to that antibody type appears. Become.
  • FIG. 4 (a) shows flow cytometry primary data
  • FIG. 4 (b) shows the number (absolute cell number) ( ⁇ 10 4 ) of each bacterium.
  • the number of IgA-producing plasma cells in the colon mucosa lamina intestinal in the acetate group was significantly increased relative to the control group. Thereby, the intake of the cellulose acetate of the present disclosure is expected to increase IgA.
  • DAPI-positive cells stained with DAPI were gated (Gated on DAPI positive cells), and an IgA-positive portion among them was quantified as an IgA-binding bacterium.
  • Flow cytometry was performed using FACS Aria II and data were analyzed by FlowJo software (TreeStar Inc.).
  • FIG. Fig. 5 (a) shows the percentage (%) of the number of IgA-binding bacteria in the cecal (left: Cecal) and feces (right: Fecal) of Bacteroides thetaiotaomicron mono-colonized mice (% DAPI positive cells)
  • Fig. 5 (b) is an E. coli strain belonging to the phyla Proteobacteria. It is the ratio (%) of the number of the IgA binding bacteria in the DAPI positive cells of the cecum (left: Cecal) and feces (right: Fecal) of E. coli monoclinic colonized mice (% DAPI positive cells).
  • Table 3 shows the results of analysis of the luminal contents of the colon and mucus layer in the colon of the wild-type mouse Acetate group reared for 4 weeks, and the bacteria in the luminal contents and mucus layer of the wild-type mouse Control group reared for 4 weeks
  • the plexus analysis results are shown in Table 4.
  • the luminal contents of the AID KO mouse Acetate group reared for 4 weeks and the results of analysis of the bacterial flora in the colonic mucus layer are shown in Table 5.
  • the luminal contents and colonic mucous layer of the AID KO mouse Control group reared for 4 weeks The bacterial flora analysis results of are shown in Table 6.
  • bacteria of the Proteobacterium are established in the mucus layer compared to the lumen, with 2.1% in the luminal content and 0.7% in the mucus layer. Hateful.
  • the bacteria of Proteobacterium are 0.0% in the luminal contents and 0.0% in the mucus layer, compared with the mucus layer as compared to the lumen It can not be said that it is difficult to settle inside.

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Abstract

低用量で、腸管におけるＩｇＡを十分に増加すると共に、増加したＩｇＡの量を長期間維持することができる、腸管免疫亢進剤を提供することを目的とする。　アセチル総置換度が０．４以上１．１以下である酢酸セルロースを含有する、腸管免疫亢進剤。

Description

腸管免疫亢進剤、食品、及び医薬
　本発明は、腸管免疫亢進剤、食品、及び医薬に関する。
　糖タンパク質の一種である免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｉｇ）には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ等のクラスがある。そのうち、ＩｇＡは、哺乳類および鳥類に存在する。特に、唾液、涙液、鼻汁、気道粘液、消化管分泌液、乳汁などの外分泌液中に含まれるＩｇＡは、分泌型ＩｇＡとされ、抗原や微生物から粘膜面を防御する免疫機構の最前線として機能している。
　消化管は、常に抗原や微生物を含む多くの物質と接しており、これら抗原や微生物が生体内に侵入するのを防ぐ必要があるところ、特に腸管で分泌されるＩｇＡは、粘膜面への細菌やウイルスの付着防止、及び外来抗原を捕捉して体外に排出する異物排除など、粘膜免疫機能において重要な働きを担っている。腸管において、ＩｇＡの分泌を促進することは、粘膜免疫機能を増強させ、感染症やアレルギー疾患を予防するなどの効果が期待できることから、ＩｇＡ分泌促進作用を有する食品等の開発が望まれている。
　非特許文献１には、次の記載がある（要旨）。「難消化性オリゴ糖の一種であるガラクトオリゴ糖がマウスの免疫系に与える影響を検討した。ガラクトオリゴ糖を含む飼料を自由摂取させてＢＡＬＢ／ｃマウスを飼育したところ，糞に含まれる総ＩｇＡの量は摂取２週間後に有意に増加し，その後コントロール群と同程度に低下した。摂取４週間後に解剖し，調製したパイエル板細胞培養液および大腸組織抽出液の総ＩｇＡは，ガラクトオリゴ糖群で増加する傾向にあった。」
　非特許文献２には、次の旨の記載がある（Ａｂｓｔｒａｃｔ）。ラクトスクロース（４Ｇ－β－Ｄ－ガラクトシルスクロース、以下ＬＳ）が、腸管内におけるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａの増加のためのオリゴ糖として提案される。マウスにＬＳ２％または５％添加飼料を４週間摂取させ、小腸粘膜の免疫応答性を調べた結果、ＬＳ２％または５％摂取群で、糞および盲腸内容物中のＩｇＡ量が有意に増加した。
　特許文献１には、難消化性のオリゴ糖の一種であるフラクトオリゴ糖が腸管粘膜においてＩｇＡおよびｐＩｇＲ産生を増強することを見出したことが記載されている。
　特許文献２には、難消化性デキストリンを経口投与することにより有意なＩｇＡ分泌促進作用が認められたことが記載されている。
　特許文献３には、アセチル総置換度が０．４～１．１である酢酸セルロースを含有することを特徴とする栄養組成物、家畜飼料、脂質代謝改善剤、炎症性腸疾患及び／又は免疫異常の予防及び／又は治療剤、がんの予防及び／又は治療剤、非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療剤、肥満及び／又は糖尿病の予防及び／又は治療剤、並びに高コレステロール血症の予防及び／又は治療剤が記載されている。
特開２００３－２０１２３９号公報 特開２０１４－１５２１２５号公報 国際公開第２０１５／１４６８５３号
佐藤、他２名、「ガラクトオリゴ糖がマウスの免疫系に与える影響」、日本栄養・食糧学会誌、２００８年、第６１巻、第２号、ｐ.７９－８８ Hino Keiko、他６名、「Effect of Dietary Lactosucrose (4G-.BETA.-D-Galactosylsucrose) on the Intestinal Immune Functions in Mice」、Journal of Applied Glycoscience、２００７年、第５４巻、第３号、ｐ．１６９－１７２
　非特許文献１には、ガラクトオリゴ糖を含む飼料の摂取により、マウスの大腸組織抽出液等の総ＩｇＡが増加する傾向にあったことが記載されているが、その飼料中にガラクトオリゴ糖が５重量％も含まれるような用量を要している（ｐ．８０右欄、Ｔａｂｌｅ２）。また、ガラクトオリゴ糖を含む飼料の摂取２週間目において、その飼料を摂取した試験群の糞便中総ＩｇＡは最大で対象群の２倍程度となり、有意差となっている場合もあるが、摂取３週間目では、対照群と同程度に低下し、有意差となっていない（ｐ．８１右欄、Ｆｉｇｕｒｅ　１）。さらに、大腸組織抽出液等を分析し、総ＩｇＡが多くなる傾向を認めた旨が報告されているが、これら効果は有意差では無い旨が明記されている（ｐ．８１右欄、Ｆｉｇｕｒｅ　２及び３）。
　非特許文献２は、ラクトスクロース添加飼料の摂取により、１週間後には、マウスの糞便中のＩｇＡの量が対照の群の２倍程度となったが、２週間後には大きく減少し、その後も大きく増加しない（Ｆｉｇ．　１）。特に、２％のラクトスクロース添加飼料の場合には、２週間後にＩｇＡの量が大きく減少した後、ほとんど増加しない（Ｆｉｇ．　１）。
　特許文献１においても、フラクトオリゴ糖を５％（ｗ／ｗ）も添加した実験飼料をマウスに摂取させたことが記載されている。その飼料を摂取した試験群の３６日齢のマウスの糞便中のＩｇＡ抗体含量は対象群の２倍程度となり、有意差となっているが（図５）、同じ実験の飼育日数２８日齢および４２日齢では有意差となっていない（図５）。また、試験群の大腸全体のＩｇＡ抗体含量は４４日齢で対照群の１．５倍程度となり有意差となっているが（図７）、大腸組織重量あたりのＩｇＡ抗体量は有意差となっていない（図９）。さらに、プロテオバクテリア門に属するコレラ菌に対する抗コレラトキシン特異ＩｇＡ量を調べた結果として（図１４）、試験群と対象群のｐ値は０．０７と危険率５％で有意差とはならなかった。
　特許文献２においても、コントロール飼料に難消化性デキストリンを５質量％及び７．５質量％も配合した飼料でマウスを飼育したことが記載されている。消化管内容物中（図１）及び糞便中（図２）のＩｇＡが増加したことが示されているが、実験に使用したマウスの固体数は示されておらず、また、有意差検定の結果も示されておらず、一部の図ではエラーバーも示されていない（図１～４）。さらに、エラーバーが示された図では誤差範囲は大きいと読み取ることが出来、検定の結果として有意差は無かったことから何らの記載もされなかったことが伺われる。したがって、そもそもＩｇＡを増加させる技術であるのかどうか確率統計的な検証が為されていない。なお、ＩｇＡの基質特異性も調べられていない。
　特許文献３には、アセチル総置換度が０．４～１．１である酢酸セルロースが記載されているが、腸管免疫亢進剤については記載も示唆もされていない。
　従来のガラクトオリゴ糖、ラクトスクロース、フラクトオリゴ糖、及び難消化性デキストリン等を用いる方法では、大腸等におけるＩｇＡを増加させるため、相当に高い用量を要する。高い用量が必要となれば、ヒトが一日に接種する量に換算すれば、医薬品として経口摂取するには苦痛を伴うことや、食品として摂取する場合には通常の食事の楽しみを損なうこと等が懸念される。また、従来の方法では、増加したＩｇＡの量を長期間維持することができない。さらに、ＩｇＡの病原性細菌に対する親和性（基質特異性）に関する設計がされておらず、病原性細菌に対する特異性が低い。
　本発明は、低用量で、腸管におけるＩｇＡを十分に増加すると共に、増加したＩｇＡの量を長期間維持することができる、腸管免疫亢進剤を提供することを目的とする。
　本発明の第一は、アセチル総置換度が０．４以上１．１以下である酢酸セルロースを含有する、腸管免疫亢進剤に関する。
　前記腸管免疫亢進剤において、前記酢酸セルロースは、下記式で定義される組成分布指数（ＣＤＩ）が２．０以下であることが好ましい。
　ＣＤＩ＝（組成分布半値幅の実測値）／（組成分布半値幅の理論値）
　組成分布半値幅の実測値：酢酸セルロース（試料）の残存水酸基をすべてプロピオニル化して得られるセルロースアセテートプロピオネートをＨＰＬＣ分析して求めた組成分布半値幅
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
  
　　ＤＳ：アセチル総置換度
　　ＤＰｗ：重量平均重合度（酢酸セルロース（試料）の残存水酸基をすべてプロピオニル化して得られるセルロースアセテートプロピオネートを用いてＧＰＣ－光散乱法により求めた値）
　本発明の第二は、前記腸管免疫亢進剤を含有する、食品に関する。
　前記食品における前記酢酸セルロースの含有量が０．１重量％以上５重量％未満であることが好ましい。
　本発明の第三は、前記腸管免疫亢進剤を含有する、医薬に関する。
　本発明によれば、低用量で、腸管におけるＩｇＡを十分に増加すると共に、増加したＩｇＡの量を長期間維持することができる、腸管免疫亢進剤を提供することができる。
野生型マウスの糞便中のＩｇＡ定量結果を示す図である。 ４週間飼育した野生型マウスの糞便中のＩｇＡ結合細菌の定量結果を示す図である。 ４週間飼育した野生型マウスの腸管の各部位におけるＩｇＡ定量結果を示す図である。 ４週間飼育した野生型マウスの大腸粘膜固有層のＩｇＡ産生形質細胞の定量結果を示す図である。 ４週間飼育した単菌定着マウスの盲腸および糞便のＩｇＡ結合細菌の定量結果を示す図である。
　［腸管免疫亢進剤］
　本開示に係る腸管免疫亢進剤は、アセチル総置換度が０．４以上１．１以下である酢酸セルロースを含有するものである。ここで、腸管とは、十二指腸、空腸、回腸等を含む小腸、並びに盲腸、近位結腸、遠位大腸等を含む大腸を意味する。また、免疫亢進としては、ＩｇＡを増加すること等が挙げられ、そのＩｇＡの増加は、ＩｇＡ産生形質細胞の増加によるもの等が含まれる。
　本開示の腸管免疫亢進剤を摂取または投与（特に経口）することにより、腸管（特に大腸の粘膜固有層）の免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）産生形質細胞が増加する、腸管のＩｇＡが増加する、増加したＩｇＡの量を長期間維持することができる、及び／またはＩｇＡのプロテオバクテリア門細菌への抗原抗体反応特異性が増大することから腸管粘膜のプロテオバクテリア門細菌が減少する等の効果が得られる。プロテオバクテリア門は病原性大腸菌、サルモネラ菌、ビブリオ菌などの病原性細菌を多く含む門であり、大腸粘膜のこれら細菌が減少することにより、腸管が病原性細菌から保護される。さらに、本開示の腸管免疫亢進剤は、従来よりも低用量であっても当該効果が得られる。
　（酢酸セルロースのアセチル総置換度）
　本開示の酢酸セルロースは、アセチル総置換度（平均置換度）が０．４以上１．１以下である。アセチル総置換度がこの範囲であると水に対する溶解性に優れ、この範囲を外れると水に対する溶解性が低下する傾向となる。酢酸セルロースは腸内細菌によって消化管内で酢酸とセルロースに分解し、セルロースはさらにオリゴ糖や単糖を経由して酢酸等の短鎖脂肪酸に分解されると考えられる。このような過程で生じる酢酸などの代謝産物や、このような過程で酢酸セルロースを資化する腸内細菌がＩｇＡ産生細胞の増加とＩｇＡの増加に繋がると考えられる。酢酸セルロースの酢酸とセルロースへの分解は菌体外酵素によって生じると考えられるので水に対する溶解性の高い酢酸セルロースの方が分解されやすく、ＩｇＡ産生細胞の増加とＩｇＡの増加を促進する効果が高い。さらには腸管免疫亢進効果が高まることにつながる。このような観点から、前記アセチル総置換度の好ましい範囲は０．５以上１．０以下であり、さらに好ましい範囲は０．６以上０．９５以下である。
　アセチル総置換度は、酢酸セルロースを水に溶解し、酢酸セルロースの置換度を求める公知の滴定法により測定できる。具体的には次のとおりである。
　アセチル総置換度は、ＡＳＴＭ：Ｄ－８１７－９１（セルロースアセテートなどの試験方法）における酢化度の測定法に準じて求めた酢化度を次式で換算することにより求められる。これは、最も一般的なセルロースアセテートの置換度の求め方である。
　ＤＳ＝１６２．１４×ＡＶ×０．０１／（６０．０５２－４２．０３７×ＡＶ×０．０１）
　ＤＳ：アセチル総置換度
　ＡＶ：酢化度（％）
　まず、乾燥した酢酸セルロース（試料）５００ｍｇを精秤し、超純水とアセトンとの混合溶媒（容量比４：１）５０ｍｌに溶解した後、０．２Ｎ－水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌを添加し、２５℃で２時間ケン化する。次に、０．２Ｎ－塩酸５０ｍｌを添加し、フェノールフタレインを指示薬として、０．２Ｎ－水酸化ナトリウム水溶液（０．２Ｎ－水酸化ナトリウム規定液）で、脱離した酢酸量を滴定する。また、同様の方法によりブランク試験（試料を用いない試験）を行う。そして、下記式にしたがってＡＶ（酢化度）（％）を算出する。
　ＡＶ（％）＝（Ａ－Ｂ）×Ｆ×１．２０１／試料重量（ｇ）
　Ａ：０．２Ｎ－水酸化ナトリウム規定液の滴定量（ｍｌ）
　Ｂ：ブランクテストにおける０．２Ｎ－水酸化ナトリウム規定液の滴定量（ｍｌ）
　Ｆ：０．２Ｎ－水酸化ナトリウム規定液のファクター
　上記の他、アセチル総置換度は、酢酸セルロースの水酸基をプロピオニル化した上で、重クロロホルムに溶解し、ＮＭＲにより測定することもできる。酢酸セルロースの水酸基のプロピオニル化は、ピリジン／Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド混合溶媒中でＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジンを触媒とし、無水プロピオン酸を作用させる、後述の酢酸セルロースの完全誘導体化の方法にて行うことができる。
　（酢酸セルロースの組成分布指数（ＣＤＩ））
　本開示において、前記酢酸セルロースの組成分布指数（ＣＤＩ）は特に限定されない。組成分布指数（ＣＤＩ）は、例えば１．０以上３．０以下であってよい。組成分布指数（ＣＤＩ）は、２．０以下が好ましく、１．０以上２．０以下がより好ましく、１．０以上１．８以下がさらに好ましく、１．０以上１．６以下がよりさらに好ましく、１．０以上１．５以下が特に好ましい。
　組成分布指数（ＣＤＩ）の下限値は０であるが、これは例えば１００％の選択性でグルコース残基の６位のみをアセチル化し、他の位置はアセチル化しない等の特別な合成技術をもって実現されるものであり、そのような合成技術は知られていない。グルコース残基の水酸基の全てが同じ確率でアセチル化および脱アセチル化される状況において、ＣＤＩは１．０となるが、実際のセルロースの反応においてはこのような理想状態に近付けるためには相当の工夫を要する。前記組成分布指数（ＣＤＩ）が小さいほど、組成分布（分子間置換度分布）が均一となる。組成分布が均一であると、アセチル総置換度が通常よりも広い範囲で水溶性を確保でき、均一な溶解がなされ、構造粘性が発現しないので摂取または投与しやすく、分解されやすく、腸管免疫亢進の効果を発現しやすいなどの利点がある。
　ここで、組成分布指数（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ、ＣＤＩ）とは、組成分布半値幅の理論値に対する実測値の比率［（組成分布半値幅の実測値）／（組成分布半値幅の理論値）］で定義される。組成分布半値幅は「分子間置換度分布半値幅」又は単に「置換度分布半値幅」ともいう。
　酢酸セルロースのアセチル総置換度の均一性を評価するのに、酢酸セルロースの分子間置換度分布曲線の最大ピークの半値幅（「半価幅」ともいう）の大きさを指標とすることができる。なお、半値幅は、アセチル総置換度を横軸（ｘ軸）に、この置換度における存在量を縦軸（ｙ軸）としたとき、チャートのピークの高さの半分の高さにおけるチャートの幅であり、分布のバラツキの目安を表す指標である。置換度分布半値幅は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により求めることができる。なお、ＨＰＬＣにおけるセルロースエステルの溶出曲線の横軸（溶出時間）を置換度（０～３）に換算する方法については、特開２００３-２０１３０１号公報（段落００３７～００４０）に説明されている。
　（組成分布半値幅の理論値）
　組成分布半値幅（置換度分布半値幅）は確率論的に理論値を算出できる。すなわち、組成分布半値幅の理論値は以下の式（１）で求められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
  
　ｍ：酢酸セルロース１分子中の水酸基とアセチル基の全数
　ｐ：酢酸セルロース１分子中の水酸基がアセチル置換されている確率
　ｑ＝１－ｐ
　ＤＰｗ：重量平均重合度（ＧＰＣ－光散乱法による）
　なお、重量平均重合度（ＤＰｗ）の測定法は後述する。
　式（１）は、セルロースの全ての水酸基が同じ確率でアセチル化および脱アセチル化された際に必然的に生じる組成分布半値幅であり、所謂二項定理に従って導かれるものである。さらに、組成分布半値幅の理論値を置換度と重合度で表すと、以下のように表される。下記式（２）を組成分布半値幅の理論値を求める定義式とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
  
　ＤＳ：アセチル総置換度
　ＤＰｗ：重量平均重合度（ＧＰＣ－光散乱法による）
　なお、重量平均重合度（ＤＰｗ）の測定法は後述する。
　ところで、式（１）および式（２）においては、より厳密には重合度分布を考慮に入れるべきであり、この場合には式（１）および式（２）の「ＤＰｗ」は、重合度分布関数に置き換え、式全体を重合度０から無限大までで積分すべきである。しかしながら、ＤＰｗを使う限り、式（１）および式（２）は近似的に十分な精度の理論値を与える。ＤＰｎ（数平均重合度）を使うと、重合度分布の影響が無視できなくなるので、ＤＰｗを使うべきである。
　（組成分布半値幅の実測値）
　本開示において、組成分布半値幅の実測値とは、酢酸セルロース（試料）の残存水酸基（未置換水酸基）をすべてプロピオニル化して得られるセルロースアセテートプロピオネートをＨＰＬＣ分析して求めた組成分布半値幅である。
　一般的に、アセチル総置換度２～３の酢酸セルロースに対しては、前処理なしに高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析を行うことができ、それによって組成分布半値幅を求めることができる。例えば、特開２０１１－１５８６６４号公報には、置換度２．２７～２．５６の酢酸セルロースに対する組成分布分析法が記載されている。
　一方、本開示の酢酸セルロースにおける組成分布半値幅（置換度分布半値幅）の実測値は、ＨＰＬＣ分析前に前処理として酢酸セルロースの分子内残存水酸基の誘導体化を行い、しかる後にＨＰＬＣ分析を行って求める。この前処理の目的は、低置換度酢酸セルロース（例えば、アセチル総置換度１．１以下の酢酸セルロース）を有機溶剤に溶解しやすい誘導体に変換してＨＰＬＣ分析可能とすることである。すなわち、分子内の残存水酸基を完全にプロピオニル化し、その完全誘導体化セルロースアセテートプロピオネート（ＣＡＰ）をＨＰＬＣ分析して組成分布半値幅（実測値）を求める。ここで、誘導体化は完全に行われ、分子内に残存水酸基はなく、アセチル基とプロピオニル基のみ存在していなければいけない。すなわち、アセチル総置換度（ＤＳａｃ）とプロピオニル総置換度（ＤＳｐｒ）の和は３である。これは、ＣＡＰのＨＰＬＣ溶出曲線の横軸（溶出時間）をアセチル総置換度（０～３）に変換するための較正曲線を作成するために関係式：ＤＳａｃ＋ＤＳｐｒ＝３を使用するためである。
　酢酸セルロースの完全誘導体化は、ピリジン／Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド混合溶媒中でＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジンを触媒とし、無水プロピオン酸を作用させることにより行うことができる。より具体的には、溶媒として混合溶媒［ピリジン／Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド＝１／１（ｖ/ｖ）］を酢酸セルロース（試料）に対して２０重量部、プロピオニル化剤として無水プロピオン酸を該酢酸セルロースの水酸基に対して６．０～７．５当量、触媒としてＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジンを該酢酸セルロースの水酸基に対して６．５～８．０ｍｏｌ％使用し、温度１００℃、反応時間１．５～３．０時間の条件でプロピオニル化を行う。そして、反応後、沈殿溶媒としてメタノールを用い、沈殿させることにより、完全誘導体化セルロースアセテートプロピオネートを得る。より詳細には、例えば、室温で、反応混合物１重量部をメタノール１０重量部に投入して沈殿させ、得られた沈殿物をメタノールで５回洗浄し、６０℃で真空乾燥を３時間行うことにより、完全誘導体化セルロースアセテートプロピオネート（ＣＡＰ）を得ることができる。なお、後述の分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）及び重量平均重合度（ＤＰｗ）も、酢酸セルロース（試料）をこの方法により完全誘導体化セルロースアセテートプロピオネート（ＣＡＰ）とし、測定したものである。
　上記ＨＰＬＣ分析では、異なるアセチル総置換度を有する複数のセルロースアセテートプロピオネートを標準試料として用いて所定の測定装置および測定条件でＨＰＬＣ分析を行い、これらの標準試料の分析値を用いて作成した較正曲線［セルロースアセテートプロピオネートの溶出時間とアセチル総置換度（０～３）との関係を示す曲線、通常、三次曲線］から、酢酸セルロース（試料）の組成分布半値幅（実測値）を求めることができる。ＨＰＬＣ分析で求められるのは溶出時間とセルロースアセテートプロピオネートのアセチル総置換度分布の関係である。これは、試料分子内の残存ヒドロキシ基のすべてがプロピオニルオキシ基に変換された物質の溶出時間とアセチル総置換度分布の関係であるから、本開示の酢酸セルロースのアセチル総置換度分布を求めていることと本質的には変わらない。
　上記ＨＰＬＣ分析の条件は以下の通りである。
　装置:　Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００　Ｓｅｒｉｅｓ
　カラム:　Ｗａｔｅｒｓ　Ｎｏｖａ－Ｐａｋ　ｐｈｅｎｙｌ　６０Å ４μｍ（１５０ｍｍ×３．９ｍｍΦ）＋ガードカラム
　カラム温度：３０℃
　検出:　Ｖａｒｉａｎ　３８０－ＬＣ
　注入量:　５．０μＬ（試料濃度：０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ））
　溶離液:　Ａ液：ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝８／１（ｖ／ｖ），Ｂ液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝８／１（ｖ／ｖ）
　グラジェント：Ａ／Ｂ＝８０／２０→０／１００（２８ｍｉｎ）；流量：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
　較正曲線から求めた置換度分布曲線［セルロースアセテートプロピオネートの存在量を縦軸とし、アセチル総置換度を横軸とするセルロースアセテートプロピオネートの置換度分布曲線］（「分子間置換度分布曲線」ともいう）において、平均置換度に対応する最大ピーク（Ｅ）に関し、以下のようにして置換度分布半値幅を求める。ピーク（Ｅ）の低置換度側の基部（Ａ）と、高置換度側の基部（Ｂ）に接するベースライン（Ａ－Ｂ）を引き、このベースラインに対して、最大ピーク（Ｅ）から横軸に垂線をおろす。垂線とベースライン（Ａ－Ｂ）との交点（Ｃ）を決定し、最大ピーク（Ｅ）と交点（Ｃ）との中間点（Ｄ）を求める。中間点（Ｄ）を通って、ベースライン（Ａ－Ｂ）と平行な直線を引き、分子間置換度分布曲線との二つの交点（Ａ’、Ｂ’）を求める。二つの交点（Ａ’、Ｂ’）から横軸まで垂線をおろして、横軸上の二つの交点間の幅を、最大ピークの半値幅（すなわち、置換度分布半値幅）とする。
　このような置換度分布半値幅は、試料中のセルロースアセテートプロピオネートの分子鎖について、その構成する高分子鎖一本一本のグルコース環の水酸基がどの程度アセチル化されているかにより、保持時間（リテンションタイム）が異なることを反映している。したがって、理想的には、保持時間の幅が、（置換度単位の）組成分布の幅を示すことになる。しかしながら、ＨＰＬＣには分配に寄与しない管部（カラムを保護するためのガイドカラムなど）が存在する。それゆえ、測定装置の構成により、組成分布の幅に起因しない保持時間の幅が誤差として内包されることが多い。この誤差は、上記の通り、カラムの長さ、内径、カラムから検出器までの長さや取り回しなどに影響され、装置構成により異なる。このため、セルロースアセテートプロピオネートの置換度分布半値幅は、通常、下式で表される補正式に基づいて、補正値Ｚとして求めることができる。このような補正式を用いると、測定装置（および測定条件）が異なっても、同じ（ほぼ同じ）値として、より正確な置換度分布半値幅（実測値）を求めることができる。
　　　　Ｚ＝（Ｘ２－Ｙ２）１／２
［式中、Ｘは所定の測定装置および測定条件で求めた置換度分布半値幅（未補正値）である。Ｙ＝（ａ－ｂ）ｘ／３＋ｂ（０≦ｘ≦３）である。ここで、ａは前記Ｘと同じ測定装置および測定条件で求めた総置換度３のセルロースアセテートの見掛けの置換度分布半値幅（実際は総置換度３なので、置換度分布は存在しない）、ｂは前記Ｘと同じ測定装置および測定条件で求めた総置換度３のセルロースプロピオネートの見掛けの置換度分布半値幅である。ｘは測定試料のアセチル総置換度（０≦ｘ≦３）である］
　なお、上記総置換度３のセルロースアセテート（もしくはセルロースプロピオネート）とは、セルロースのヒドロキシル基の全てがエステル化されたセルロースエステルを示し、実際には（理想的には）置換度分布半値幅を有しない（すなわち、置換度分布半値幅０の）セルロースエステルである。
　前記酢酸セルロースの組成分布半値幅（置換度分布半値幅）の実測値としては、好ましくは０．１２～０．３４であり、より好ましくは０．１３～０．３１であり、さらに好ましくは０．１３～０．２５である。
　先に説明した置換度分布理論式は、すべてのアセチル化と脱アセチル化が独立かつ均等に進行することを仮定した確率論的計算値である。すなわち、二項分布に従った計算値である。このような理想的な状況は現実的にはあり得ない。酢酸セルロースの加水分解反応が理想的なランダム反応に近づくような、および/または、反応後の後処理について組成について分画が生じるような特別な工夫をしない限り、セルロースエステルの置換度分布は確率論的に二項分布で定まるものよりも大幅に広くなる。
　反応の特別な工夫の一つとしては、例えば、脱アセチル化とアセチル化が平衡する条件で系を維持することが考えられる。しかし、この場合には酸触媒によりセルロースの分解が進行するので好ましくない。他の反応の特別な工夫としては、脱アセチル化速度が低置換度物について遅くなる反応条件を採用することである。しかし、従来、そのような具体的な方法は知られていない。つまり、セルロースエステルの置換度分布を反応確率論通り二項分布にしたがうよう制御するような反応の特別な工夫は知られていない。さらに、酢化過程(セルロースのアセチル化工程）の不均一性や、熟成過程（酢酸セルロースの加水分解工程）で段階的に添加する水による部分的、一時的な沈殿の発生などの様々な事情は、置換度分布を二項分布よりも広くする方向に働き、これらを全て回避し、理想条件を実現することは、現実的には不可能である。これは、理想気体があくまで理想の産物であり、実在する気体の挙動はそれとは多かれ少なかれ異なることと似ている。
　従来の低置換度酢酸セルロースの合成と後処理においては、このような置換度分布の問題について殆ど関心が払われておらず、置換度分布の測定や検証、考察が行われていなかった。例えば、文献（繊維学会誌、42、p25 (1986)）によれば、低置換度酢酸セルロースの溶解性は、グルコース残基２、３、６位へのアセチル基の分配で決まると論じられており、組成分布は全く考慮されていない。
　本発明者らの検討によれば、後述するように、酢酸セルロースの置換度分布は、驚くべきことに酢酸セルロースの加水分解工程の後の後処理条件の工夫で制御することができる。文献（CiBment, L., and Rivibre, C., Bull. SOC. chim., (5) 1, 1075 (1934)、Sookne, A. M., Rutherford, H. A., Mark, H., and Harris, M. J. Research Natl. Bur. Standards, 29, 123 (1942)、A. J. Rosenthal, B. B. White Ind. Eng. Chem., 1952, 44 (11), pp 2693-2696.）によれば、総置換度２．３の酢酸セルロースの沈殿分別では、分子量に依存した分画と置換度（化学組成）に伴う微々たる分画が起こるとされており、本発明者らが見出したような置換度（化学組成）で顕著な分画ができるとの報告はない。さらに、低置換度酢酸セルロースについて、溶解分別や沈殿分別で置換度分布（化学組成）を制御できることは検証されていなかった。
　本発明者らが見出した置換度分布を狭くするもう１つの工夫は、酢酸セルロースの９０℃以上の（又は９０℃を超える）高温での加水分解反応（熟成反応）である。従来、高温反応で得られた生成物の重合度について詳細な分析や考察がなされて来なかったにもかかわらず、９０℃以上の高温反応ではセルロースの分解が優先するとされてきた。この考えは、粘度に関する考察のみに基づいた思い込み（ステレオタイプ）と言える。本発明者らは、酢酸セルロースを加水分解して低置換度酢酸セルロースを得るに際し、９０℃以上の（又は９０℃を超える）高温下、好ましくは硫酸等の強酸の存在下、多量の酢酸中で反応させると、重合度の低下は見られない一方で、ＣＤＩの減少に伴い粘度が低下することを見出した。すなわち、高温反応に伴う粘度低下は、重合度の低下に起因するものではなく、置換度分布が狭くなることによる構造粘性の減少に基づくものであることを解明した。上記の条件で酢酸セルロースの加水分解を行うと、正反応だけでなく逆反応も起こるため、生成物（低置換度酢酸セルロース）のＣＤＩが極めて小さい値となり、水に対する溶解性も著しく向上する。これに対し、逆反応が起こりにくい条件で酢酸セルロースの加水分解を行うと、置換度分布は様々な要因で広くなり、水に溶けにくいアセチル総置換度０．４未満の酢酸セルロース及びアセチル総置換度１．１を超える酢酸セルロースの含有量が増大し、全体として水に対する溶解性が低下する。
　（２，３，６位の置換度の標準偏差）
　前記酢酸セルロースのグルコース環の２，３，６位の各アセチル総置換度は、手塚（Ｔｅｚｕｋａ，Ｃａｒｂｏｎｙｄｒ．Ｒｅｓ．２７３，８３（１９９５））の方法に従いＮＭＲ法で測定できる。すなわち、酢酸セルロース試料の遊離水酸基をピリジン中で無水プロピオン酸によりプロピオニル化する。得られた試料を重クロロホルムに溶解し、１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを測定する。アセチル基の炭素シグナルは１６９ｐｐｍから１７１ｐｐｍの領域に高磁場から２位、３位、６位の順序で、そして、プロピオニル基のカルボニル炭素のシグナルは、１７２ｐｐｍから１７４ｐｐｍの領域に同じ順序で現れる。それぞれ対応する位置でのアセチル基とプロピオニル基の存在比から、元のセルロースアセテートにおけるグルコース環の２，３，６位の各アセチル置換度を求めることができる。なお、このように求めた２，３，６位の各アセチル置換度の和はアセチル総置換度であり、この方法でアセチル総置換度を求めることもできる。なお、アセチル総置換度は、１３Ｃ－ＮＭＲのほか、１Ｈ－ＮＭＲで分析することもできる。
　２，３，６位の置換度の標準偏差σは、次の式で定義される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
  
　酢酸セルロースのグルコース環の２，３及び６位のアセチル置換度の標準偏差が０．０８以下（０～０．０８）であることが好ましい。該標準偏差が０．０８以下である酢酸セルロースは、グルコース環の２，３，６位が均等に置換されており、水に対する溶解性に優れる。
　（分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ））
　分子量分布（重合度分布）の分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）は、酢酸セルロース（試料）の残存水酸基をすべてプロピオニル化して得られるセルロースアセテートプロピオネートを用いてＧＰＣ－光散乱法により求めた値である。
　本開示の酢酸セルロースの分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．２～２．５の範囲であることが好ましい。分散度Ｍｗ／Ｍｎが上記の範囲にある酢酸セルロースは、分子の大きさが揃っており、水に対する溶解性に優れる。酢酸セルロースは腸内細菌によって消化管内で酢酸とセルロースに分解し、セルロースはさらにオリゴ糖や単糖を経由して酢酸等の短鎖脂肪酸に分解されると考えられる。このような過程で生じる酢酸などの代謝産物や、このような過程で酢酸セルロースを資化する腸内細菌がＩｇＡ産生細胞の増加とＩｇＡの増加に繋がると考えられる。酢酸セルロースの酢酸とセルロースへの分解は菌体外酵素によって生じると考えられるので水に対する溶解性の高い酢酸セルロースの方が分解されやすく、ＩｇＡ産生細胞の増加とＩｇＡの増加を促進する効果が高い。さらには腸管免疫亢進効果が高まることにつながる。
　酢酸セルロースの数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）及び分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）は、ＨＰＬＣを用いた公知の方法で求めることができる。酢酸セルロースの分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）は、測定試料を有機溶剤に可溶とするため、前記組成分布半値幅の実測値を求める場合と同様の方法で、酢酸セルロース（試料）を完全誘導体化セルロースアセテートプロピオネート（ＣＡＰ）とした後、以下の条件でサイズ排除クロマトグラフィー分析を行うことにより決定される（ＧＰＣ－光散乱法）。
　装置：Ｓｈｏｄｅｘ製　ＧＰＣ　「ＳＹＳＴＥＭ－２１Ｈ」
　溶媒：アセトン
　カラム：ＧＭＨｘｌ（東ソー）２本、ガードカラム（東ソー製ＴＳＫｇｅｌ　ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ　ＨＸＬ－Ｈ）
　流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
　温度：２９℃
　試料濃度：０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）
　注入量：１００μｌ
　検出：ＭＡＬＬＳ（多角度光散乱検出器）（Ｗｙａｔｔ製、「ＤＡＷＮ－ＥＯＳ」）
　ＭＡＬＬＳ補正用標準物質：ＰＭＭＡ（分子量２７６００）
　（重量平均重合度（ＤＰｗ））
　重量平均重合度（ＤＰｗ）は、酢酸セルロース（試料）の残存水酸基をすべてプロピオニル化して得られるセルロースアセテートプロピオネートを用いてＧＰＣ－光散乱法により求めた値である。
　本開示の酢酸セルロースの重量平均重合度（ＤＰｗ）は、５０～８００の範囲であることが好ましい。重量平均重合度（ＤＰｗ）が高すぎると、水に対する溶解性が悪くなりやすい。前記重量平均重合度（ＤＰｗ）は、好ましくは５５～７００、さらに好ましくは６０～６００である。酢酸セルロースは腸内細菌によって消化管内で酢酸とセルロースに分解し、セルロースはさらにオリゴ糖や単糖を経由して酢酸等の短鎖脂肪酸に分解されると考えられる。このような過程で生じる酢酸などの代謝産物や、このような過程で酢酸セルロースを資化する腸内細菌がＩｇＡ産生細胞の増加とＩｇＡの増加に繋がると考えられる。酢酸セルロースの酢酸とセルロースへの分解は菌体外酵素によって生じると考えられるので水に対する溶解性の高い酢酸セルロースの方が分解されやすく、ＩｇＡ産生細胞の増加とＩｇＡの増加を促進する効果が高い。さらには腸管免疫亢進効果が高まることにつながる。
　上記重量平均重合度（ＤＰｗ）は、前記分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）と同じく、前記組成分布半値幅の実測値を求める場合と同様の方法で、酢酸セルロース（試料）を完全誘導体化セルロースアセテートプロピオネート（ＣＡＰ）とした後、サイズ排除クロマトグラフィー分析を行うことにより求められる（ＧＰＣ－光散乱法）。
　上述のように、酢酸セルロースの分子量（重合度）、分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）はＧＰＣ－光散乱法（ＧＰＣ－ＭＡＬＬＳ、ＧＰＣ－ＬＡＬＬＳなど）により測定される。なお、光散乱の検出は、一般に水系溶媒では困難である。これは水系溶媒は一般的に異物が多く、一旦精製しても二次汚染されやすいことによる。また、水系溶媒では、微量に存在するイオン性解離基の影響のため分子鎖の広がりが安定しない場合があり、それを抑えるために水溶性無機塩（例えば塩化ナトリウム）を添加したりすると、溶解状態が不安定になり、水溶液中で会合体を形成したりすることがある。この問題を回避するための有効な方法の一つは、酢酸セルロースを誘導体化し、異物が少なく、二次汚染されにくい有機溶媒に溶解するようにし、有機溶媒でＧＰＣ－光散乱測定を行うことである。この目的の酢酸セルロースの誘導体化としてはプロピオニル化が有効であり、具体的な反応条件及び後処理は前記組成分布半値幅の実測値の説明箇所で記載した通りである。
　（酢酸セルロースの製造）
　前記酢酸セルロース（酢酸セルロース）は、例えば、（Ａ）中乃至高置換度酢酸セルロースの加水分解工程（熟成工程）、（Ｂ）沈殿工程、及び、必要に応じて行う（Ｃ）洗浄、中和工程により製造できる。なお、中乃至高置換度酢酸セルロースのアセチル総置換度は、例えば、１．５以上３以下、好ましくは２以上３以下である。
　［（Ａ）加水分解工程（熟成工程）］
　加水分解反応は、有機溶媒中、触媒（熟成触媒）の存在下、原料酢酸セルロースと水を反応させることにより行うことができる。有機溶媒としては、例えば、酢酸、アセトン、アルコール（メタノール等）、これらの混合溶媒などが挙げられる。これらの中でも、酢酸を少なくとも含む溶媒が好ましい。触媒としては、一般に脱アセチル化触媒として用いられる触媒を使用できる。触媒としては、特に硫酸が好ましい。
　有機溶媒（例えば、酢酸）の使用量は、原料酢酸セルロース１重量部に対して、例えば、０．５～５０重量部、好ましくは１～２０重量部、さらに好ましくは３～１０重量部である。
　触媒（例えば、硫酸）の使用量は、原料酢酸セルロース１重量部に対して、例えば、０．００５～１重量部、好ましくは０．０１～０．５重量部、さらに好ましくは０．０２～０．３重量部である。触媒の量が少なすぎると、加水分解の時間が長くなりすぎ、酢酸セルロースの分子量の低下を引き起こすことがある。一方、触媒の量が多すぎると、加水分解温度に対する解重合速度の変化の度合いが大きくなり、加水分解温度がある程度低くても解重合速度が大きくなり、分子量がある程度大きい酢酸セルロースが得られにくくなる。
　加水分解工程における水の量は、原料酢酸セルロース１重量部に対して、例えば、０．５～２０重量部、好ましくは１～１０重量部、さらに好ましくは２～７重量部である。また、該水の量は、有機溶媒（例えば、酢酸）１重量部に対して、例えば、０．１～５重量部、好ましくは０．３～２重量部、さらに好ましくは０．５～１．５重量部である。水は、反応開始時において全ての量を系内に存在させてもよいが、酢酸セルロースの沈殿を防止するため、使用する水の一部を反応開始時に系内に存在させ、残りの水を１～数回に分けて系内に添加してもよい。
　加水分解工程における反応温度は、例えば、４０～１３０℃、好ましくは５０～１２０℃、さらに好ましくは６０～１１０℃である。特に、反応温度を９０℃以上（或いは９０℃を超える温度）とする場合には、正反応（加水分解反応）に対する逆反応（アセチル化反応）の速度が増加する方向に反応の平衡が傾く傾向があり、その結果、置換度分布が狭くなり、後処理条件を特に工夫しなくとも、組成分布指数ＣＤＩの極めて小さい酢酸セルロースを得ることができる。この場合、触媒として硫酸等の強酸を用いるのが好ましく、また、反応溶媒として酢酸を過剰に用いるのが好ましい。また、反応温度を９０℃以下とする場合であっても、後述するように、沈殿工程において、沈殿溶媒として２種以上の溶媒を含む混合溶媒を用いて沈殿させたり、沈殿分別及び／又は溶解分別を行うことにより、組成分布指数ＣＤＩが非常に小さい酢酸セルロースを得ることができる。
　［（Ｂ）沈殿工程］
　この工程では、加水分解反応終了後、反応系の温度を室温まで冷却し、沈殿溶媒を加えて酢酸セルロースを沈殿させる。沈殿溶媒としては、水と混和する有機溶剤若しくは水に対する溶解度の大きい有機溶剤を使用できる。例えば、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール；酢酸エチル等のエステル；アセトニトリル等の含窒素化合物；テトラヒドロフラン等のエーテル；これらの混合溶媒などが挙げられる。
　沈殿溶媒として２種以上の溶媒を含む混合溶媒を用いると、後述する沈殿分別と同様の効果が得られ、組成分布（分子間置換度分布）が狭く、組成分布指数（ＣＤＩ）が小さい酢酸セルロースを得ることができる。好ましい混合溶媒として、例えば、アセトンとメタノールの混合溶媒、イソプロピルアルコールとメタノールの混合溶媒などが挙げられる。
　また、沈殿して得られた酢酸セルロースに対して、さらに沈殿分別（分別沈殿）及び／又は溶解分別（分別溶解）を行うことにより、組成分布（分子間置換度分布）が狭く、組成分布指数ＣＤＩが非常に小さい酢酸セルロースを得ることができる。
　沈殿分別は、例えば、沈殿して得られた酢酸セルロース（固形物）を水に溶解し、適当な濃度（例えば、２～１０重量％、好ましくは３～８重量％）の水溶液とし、この水溶液に貧溶媒を加え（又は、貧溶媒に前記水溶液を加え）、適宜な温度（例えば、３０℃以下、好ましくは２０℃以下）に保持して、酢酸セルロースを沈殿させ、沈殿物を回収することにより行うことができる。貧溶媒としては、例えば、メタノール等のアルコール、アセトン等のケトンなどが挙げられる。貧溶媒の使用量は、前記水溶液１重量部に対して、例えば１～１０重量部、好ましくは２～７重量部である。
　溶解分別は、例えば、前記沈殿して得られた酢酸セルロース（固形物）或いは前記沈殿分別で得られた酢酸セルロース（固形物）に、水と有機溶媒（例えば、アセトン等のケトン、エタノール等のアルコールなど）の混合溶媒を加え、適宜な温度（例えば、２０～８０℃、好ましくは２５～６０℃）で撹拌後、遠心分離により濃厚相と希薄相とに分離し、希薄相に沈殿溶剤（例えば、アセトン等のケトン、メタノール等のアルコールなど）を加え、沈殿物（固形物）を回収することにより行うことができる。前記水と有機溶媒の混合溶媒における有機溶媒の濃度は、例えば、５～５０重量％、好ましくは１０～４０重量％である。
　［（Ｃ）洗浄、中和工程］
　沈殿工程（Ｂ）で得られた沈殿物（固形物）は、メタノール等のアルコール、アセトン等のケトンなどの有機溶媒（貧溶媒）で洗浄するのが好ましい。また、塩基性物質を含む有機溶媒（例えば、メタノール等のアルコール、アセトン等のケトンなど）で洗浄、中和することも好ましい。なお、中和工程は加水分解工程の直後に設けても良く、その場合には塩基性物質またはその水溶液を加水分解反応浴に添加するのが好ましい。
　前記塩基性物質としては、例えば、アルカリ金属化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩；炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等のアルカリ金属カルボン酸塩；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド等のナトリウムアルコキシドなど）、アルカリ土類金属化合物（例えば、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム等のアルカリ土類金属炭酸塩；酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム等のアルカリ土類金属カルボン酸塩；マグネシウムエトキシド等のアルカリ土類金属アルコキシドなど）などを使用できる。これらの中でも、特に、酢酸カリウム等のアルカリ金属化合物が好ましい。
　洗浄、中和により、加水分解工程で用いた触媒（硫酸等）などの不純物を効率よく除去することができる。
　このようにして得られた酢酸セルロースは、必要に応じて、粉砕、篩別又は造粒して、特定粒度の範囲に調整することができる。
　［食品、医薬］
　本開示の腸管免疫亢進剤は、食品または医薬に含有されていてもよく、アセチル総置換度が０．４以上１．１以下である酢酸セルロースのみを食品または医薬としてもよいが、以下のように各種食品または医薬の構成要素として使うことが出来る。
　その食品または医薬の摂取または投与方法としては、特に経口による摂取または投与が挙げられる。形態は種々のものを選択できる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤及び乳剤等の通常の医薬品の形態、並びに飲料；ガム、チョコレート、飴、羊羹、及びゼリー等の糖菓製品；麺類；パン、ケーキ、ビスケット等の焼いた食品；缶詰；レトルト食品；畜肉食品；水産練食品；マーガリン、ドレッシング、及びマヨネーズ等の食用油組成物；栄養補助食品；バター、アイスクリーム、ヨーグルト等の牛乳製品；等の通常の食品の形態を採用することができる。
　本開示の食品または医薬は、ヒトに限らず、家畜（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジなど）、家禽（ニワトリ、アヒルなど）、ペット（イヌ、ネコ、サル、マウス、ラット、モルモットなど）などの動物にも適用できる。これらの中でも、ヒトにおいて効果を得るための用量は、酢酸セルロースの摂取量として１日あたり１ｇ～１０ｇが好ましく、比較的多量の摂取が可能となることから、糖衣錠剤；麺類；ビスケット等の焼いた食品等が好ましい。また、本開示の腸管免疫亢進剤は、医薬品の形態または食品の形態に増粘剤として組み込むこともできる。
　本開示の食品における、アセチル総置換度が０．４以上１．１以下である酢酸セルロースの含有量は特に限定されないが、食品のうち０．１重量％以上であることが好ましい。当該食品の一日の摂取で、有効な量の酢酸セルロースを摂取することができるためである。食品の味や食感を損なうことなく、腸管におけるＩｇＡを十分に増加すると共に、増加したＩｇＡの量を長期間（例えば、２週間～４週間、または４週間以上）維持する観点から、０．１重量％以上５重量％未満が好ましく、１．５重量％以上３重量％未満がより好ましい。
　本開示の腸管免疫亢進剤が食品または医薬に含有されている場合の予防及び／又は治療（有害作用の軽減又は予防）に有用な対象疾患の具体的な例としては、プロテオバクテリア門に属する病原菌による感染症であり、サルモネラ感染症、コレラ、腸炎ビブリオ等が挙げられる。腸管のうち、特に大腸の粘膜固有層（ｌａｍｉｎａ　ｐｒｏｐｒｉａ）におけるＩｇＡ産生形質細胞が増加することにより、ＩｇＡを増加し、粘膜免疫機能を増強させ、感染症やアレルギー疾患を予防するなどの効果が期待できる。
　本開示の腸管免疫亢進剤の摂取または投与量は、所望の腸管免疫亢進の効果をもたらすのに十分な量であればよい。具体的には、個体の年齢、体重、性別、健康状態、並びに胃、小腸、及び大腸等の状態等の個体に関する条件、摂取または投与方法、及び製剤形態等を考慮して経験的に決定され得る。１回あたりの摂取または投与量は、例えば、５ｍｇ／ｋｇ体重～６０ｍｇ／ｋｇ体重であってよく、１０ｍｇ／ｋｇ体重～４０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。また、個体が摂取、または個体に投与される回数は、１回でもよいし、１回を超えてもよい。１回を超える場合は、定期的に、不定期に、または必要に応じて投与され得る。適切な回数は、摂取または投与量と同様に、個体に関する条件、摂取または投与方法、及び製剤形態等を考慮して経験的に決定され得る。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
　［酢酸セルロースの調製］
　酢酸セルロース（ダイセル社製、商品名「Ｌ－７０」、アセチル総置換度２．４３、６％粘度：１４５ｍＰａ・ｓ）１重量部に対して、４．４重量部の酢酸および１．９重量部の水を加え、混合物を３時間攪拌して酢酸セルロースを溶解した。この溶液に０．５８部の酢酸と０．１３重量部の硫酸の混合物を加え、得られた溶液を７０℃に保持し、加水分解を行った。加水分解の間に酢酸セルロースが沈殿するのを防止するために、系への水の添加を２回に分けて行った。すなわち、反応を開始して１時間後に０．６５重量部の水を５分間にわたって系に加えた。さらに２時間後、１．２９重量部の水を１０分間にわたって系に加え、さらに４時間反応させた。合計の加水分解時間は７時間である。なお、反応開始時から１回目の水の添加までを第１加水分解工程（第１熟成工程）、１回目の水の添加から２回目の水の添加までを第２加水分解工程（第２熟成工程）、２回目の水の添加から反応終了までを第３加水分解工程（第３熟成工程）という。
　加水分解を実施した後、硫酸に対して１．１当量の酢酸マグネシウムを含む２４％酢酸マグネシウム水溶液を反応混合物に加えて反応を停止した。この反応混合物に対して３．６倍重量のアセトン中に反応混合物を攪拌下で６０分を要して滴下し、沈殿を形成させた。ろ過によって固形分１５重量％のウェットケーキとして沈殿を回収した。得られた沈殿物の固形分１重量部に対し、１６重量部のアセトン／水の混合溶剤（アセトン濃度２０重量％）を加え、４０℃で８時間撹拌後、ろ過によって固形分１５重量％のウェットケーキとして固形物を回収した。得られたウェットケーキの固形分１重量部に対し、１６重量部のメタノールを加え、２５℃で１時間撹拌後、ろ過によって固形分１５重量％のウェットケーキとして固形物を回収する操作を５回繰り返し、乾燥して、低置換度酢酸セルロースを得た。
　得られた酢酸セルロースのアセチル総置換度、重量平均重合度（ＤＰｗ）、分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）、組成分布半値幅の実測値、及び組成分布指数（ＣＤＩ）を前記の方法で測定した。その結果、酢酸セルロースのアセチル総置換度は０．７８、重量平均重合度（ＤＰｗ）は１２４、分散度（多分散性、Ｍｗ／Ｍｎ）は２．０、組成分布半値幅の実測値は０．３０５、組成分布指数（ＣＤＩ）は１．９０であった。
　［腸管免疫亢進剤の評価］
　＜飼料の調製＞
　精製飼料ＡＩＮ－９３Ｇ（REEVEら、Journal of Nutrition, 123, 1939-1951(1993）)、およびＡＩＮ－９３Ｇには５重量％のセルロースが含まれるところ、２重量％のセルロースを上記得られた酢酸セルロースに置き換えたもの（以下、ＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅと称することがある）を用いた。
　＜飼育実験＞
　（実験動物）
　・野生型マウス
　７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系オス性マウスを用いた。
　・単菌定着マウス
　雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系無菌マウスをアイソレーター中、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ－１２株（Ｅ．ｃｏｌｉ）を投与して飼育することでＥ．ｃｏｌｉ単菌定着マウスを作成した。また、同様の方法で、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ単菌定着マウスを作成した。
　・ＡＩＤ　ＫＯマウス
　ＡＩＤ　ＫＯマウス（言い換えれば、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅを欠損（ノックアウト）させたマウス）は、Ｍｕｒａｍａｔｓｕらの方法（Cell,102,553-563 (2000)）で作成した。なお、ＡＩＤ　ＫＯマウスは、ＩｇＡを産生しない。
　（飼育方法）
　後述の実験で用いたマウスは、次の方法で飼育した。８個体のマウスにＡＩＮ－９３Ｇを与えて１週間飼育した。飼料は自由摂取とした。その後、マウスを２群各４個体にグループ分けし、さらに４週間飼育した。この４週間飼育中には、１群にはＡＩＮ－９３Ｇを与え、これをＣｏｎｔｒｏｌ群とした。残り１群にはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅを与え、これをＡｃｅｔａｔｅ群とした。ただし、ＡＩＤ　ＫＯマウス及びＥ．ｃｏｌｉ単菌定着マウスは、その他のマウスと個体数が異なり、１０個体のマウスを、２群各５個体にグループ分けして飼育した。
　＜糞便中のＩｇＡ定量＞
　ＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から０日目、１週目、２週目、３週目及び４週目の糞便を採取し、糞便中のＩｇＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を定量した。定量は、マウスＩｇＡ　ＥＬＩＳＡ定量セット（Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ　ＥＬＩＳＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｓｅｔ、米国Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．製）を用いて行った。結果は図１に示す。
　ＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から１週目以降、Ａｃｅｔａｔｅ群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し高い値を示し、２週目では、プラトーに達して４週目まで有意にＩｇＡ濃度の上昇が認められた。
　＜ＩｇＡ結合細菌（ＩｇＡ－ｃｏａｔｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ）の定量＞
　ＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から４週間飼育した野生型マウスの糞便の細菌叢を、ＰＥ標識された抗ＩｇＡ抗体（Ｒａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ，　ｃｌｏｎｅ　１１－４４－２，　ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）ならびに４，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーにより分析を行い、フローサイトメトリー一次データを得た。そして、ＤＡＰＩで染色されるＤＡＰＩ陽性細胞をゲーティングし（Ｇａｔｅｄ　ｏｎ　ＤＡＰＩ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）、そのうちＩｇＡ陽性の部分をＩｇＡ結合細菌として定量した。フローサイトメトリーはＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩを使用して行い、データはＦｌｏｗＪｏ　ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ　Ｉｎｃ．）により解析した。結果は図２に示す。図２（ａ）は、フローサイトメトリー一次データ、図２（ｂ）は、ＤＡＰＩ陽性細胞におけるＩｇＡ結合細菌の数の割合（％）（％ＤＡＰＩ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）を示す。
　ＤＡＰＩ陽性細胞におけるＩｇＡ結合細菌の数の割合（％）（％ＤＡＰＩ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）において、Ａｃｅｔａｔｅ群の方が、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し高い値を示した。言い換えれば、Ａｃｅｔａｔｅ群においてより多くの細菌に対して親和性を持つＩｇＡが増加した結果、ＩｇＡ結合細菌が増加した。本開示の酢酸セルロースの摂食により、腸管が特定の細菌から保護されるなどの免疫亢進作用が期待される。
　＜糞便中ＩｇＡ結合細菌の細菌叢分析＞
　ＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から４週間飼育した野生型マウスの糞便を細菌叢リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で懸濁・遠心して上清を得た。この上清に含まれる細菌をＩｇＡ‐ＰＥ抗体（Ｒａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ，　ｃｌｏｎｅ　１１－４４－２，　ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）並びにＤＡＰＩで染色し、磁気細胞分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を行いＩｇＡ陰性の細菌を採取した後、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩを使用してＩｇＡ陽性の細菌を採取した。これらの試料を用いて１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子解析により細菌を同定した。４週間飼育した野生型マウスＡｃｅｔａｔｅ群の糞便の細菌叢分析結果を表１に、４週間飼育した野生型マウスＣｏｎｔｒｏｌ群の糞便の細菌叢分析結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　表１に示すように、４週間飼育した野生型マウスＡｃｅｔａｔｅ群の糞便では、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、テネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、及びウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）の中でも、プロテオバクテリア門の細菌が他の分類の細菌に比較し、有意にＩｇＡ陽性を示し、ＩｇＡとの親和性が高い。なお、プロテオバクテリア門には、大腸菌、サルモネラ、ビブリオ、ヘリコバクターなど病原となり得る細菌が含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　表２に示すように、４週間飼育した野生型マウスＣｏｎｔｒｏｌ群の糞便では、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、テネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、及びウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）の中で、特にプロテオバクテリア門の細菌が他の分類の細菌に比較して、ＩｇＡ陽性を示すものではなく、ＩｇＡとの親和性が高いことはない。
　＜腸管の各部位のＩｇＡ濃度の定量＞
　腸管内のどの部位でＩｇＡ濃度が増加しているか調べるため部位に分けてＩｇＡ濃度を定量した。その方法は次のとおりである。
　ＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から４週間飼育した野生型マウスについて、十二指腸（Ｄｕｏｄｅｎｕｍ）、空腸（Ｊｅｊｕｎｕｍ）、回腸（Ｉｌｅｕｍ）、盲腸（Ｃｅｃｕｍ）、近位結腸（Ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｃｏｌｏｎ）、および遠位結腸（Ｄｉｓｔａｌ　ｃｏｌｏｎ）の各組織を採取しコンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル錠（Ｒｏｃｈｅ社）を加えたＰＢＳに保存後、ステンレスビーズで破砕した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を利用してタンパク質濃度を測定し、各組織の濃度を統一した後、ＩｇＡ濃度を定量した。定量は、マウスＩｇＡ　ＥＬＩＳＡ定量セット（Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ　ＥＬＩＳＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｓｅｔ、米国Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．製）を用いて行った。結果は、図３（ａ）および（ｂ）に示す。
　十二指腸（Ｄｕｏｄｅｎｕｍ）、盲腸（Ｃｅｃｕｍ）、近位結腸（Ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｃｏｌｏｎ）、および遠位結腸（Ｄｉｓｔａｌ　ｃｏｌｏｎ）において、Ａｃｅｔａｔｅ群の組織ＩｇＡ濃度は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し高い値を示した。特に、盲腸から結腸にかけて大きな増加が認められた。
　＜大腸粘膜固有層のＩｇＡ産生形質細胞の定量＞
　ＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から４週間飼育した野生型マウスの大腸粘膜固有層からリンパ球を単離するために、大腸を採取し、長手方向に開裂して中の糞便等を洗浄し除去した。そして、洗浄した大腸を３７℃で３０分間、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳ中にて振盪した。上皮細胞及び脂肪組織を除去した後、腸組織を細かく小切片にし、ＲＰＭＩ　１６４０培地（２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４００単位／ｍｌ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）　コラゲナーゼＤ、０．２５単位／ｍｌディスパーゼ（コーニング社製）、及び０．１ｍｇ／ｍｌ　ＤＮａｓｅＩ（和光純薬工業株式会社製）含有）を添加し、３７℃の水浴中で３０時間振盪した。消化した組織をＲＰＭＩ　１６４０培地（２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有）で洗浄し、１０ｍｌ　３５％パーコール（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に再懸濁し、１５ｍｌファルコンチューブ中の２．５ｍｌ　７０％パーコールの上に重層した。そして、室温下にて２０００ｒｐｍで２０分間遠心し、パーコール密度勾配による細胞分離を行った。境界面の細胞を回収して粘膜固有層リンパ球として使用した。
　単離した粘膜固有層リンパ球を染色バッファー（ＰＢＳ、２％　ＦＢＳ）に懸濁し、ＩｇＡ－ＰＥ抗体（Ｃｌｏｎｅ：　１１－４４－１、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）およびＢ２２０－ＡＰＣ抗体（Ｃｌｏｎｅ：　ＲＡ３－６Ｂ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で染色した。
　このように処理した粘膜固有層リンパ球はフローサイトメトリーで分析した。ゲーティングし、ＩｇＡ－ＰＥ抗体で染色されるもののＢ２２０－ＡＰＣ抗体で染色されないものをＩｇＡ産生形質細胞（ＩｇＡ＋　Ｐｌａｓｍａ　ｃｅｌｌｓ）として定量した。また、ＩｇＡ－ＰＥ抗体びＢ２２０－ＡＰＣ抗体の両方で染色されるものをＢ細胞（ＩｇＡ＋　Ｂ　ｃｅｌｌｓ）として定量した。
　ここで、Ｂ細胞はリンパ球の一種であり、成熟・分化が進むと抗体産生に特化した形質細胞となる。１つのＢ細胞は、１種類の抗体しか産出できないため、その抗体タイプに見合った抗原または細菌抗原が出現した場合にのみ、その抗体を算出するＢ細胞が活性化して抗体産生を開始することになる。
　フローサイトメトリーはＦＡＣＳｃａｎｔ　ＩＩを使用して行い、データはＦｌｏｗＪｏ　ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ　Ｉｎｃ．）により解析した。結果は図４に示す。図４（ａ）は、フローサイトメトリー一次データ、図４（ｂ）は、各細菌の数（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｃｅｌｌ　ｎｕｍｂｅｒ）（×１０４）を示す。
　Ａｃｅｔａｔｅ群の大腸粘膜固有層におけるＩｇＡ産生形質細胞の数が、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し、有意に増加した。これにより、本開示の酢酸セルロースの摂取によりＩｇＡの増加が期待される。
　＜盲腸内容物および糞便のＩｇＡ結合細菌の定量＞
　ＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から４週間飼育したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｔａｏｍｉｃｒｏｎ単菌定着マウスならびにＥ．ｃｏｌｉ単菌定着マウスの盲腸内容物ならびに糞便の細菌叢を、ＰＥ標識された抗ＩｇＡ抗体（Ｒａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ，　ｃｌｏｎｅ　１１－４４－２，　ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）ならびに４，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーにより分析を行い、フローサイトメトリー一次データを得た。そして、ＤＡＰＩで染色されるＤＡＰＩ陽性細胞をゲーティングし（Ｇａｔｅｄ　ｏｎ　ＤＡＰＩ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）、そのうちＩｇＡ陽性の部分をＩｇＡ結合細菌として定量した。フローサイトメトリーはＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩを使用して行い、データはＦｌｏｗＪｏ　ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ　Ｉｎｃ．）により解析した。
　結果は図５に示す。図５（ａ）は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ単菌定着マウスの盲腸（左：Ｃｅｃａｌ）および糞便（右：Ｆｅｃａｌ）のＤＡＰＩ陽性細胞におけるＩｇＡ結合細菌の数の割合（％）（％ＤＡＰＩ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）、図５（ｂ）はプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属するＥ．ｃｏｌｉ単菌定着マウスの盲腸（左：Ｃｅｃａｌ）および糞便（右：Ｆｅｃａｌ）のＤＡＰＩ陽性細胞におけるＩｇＡ結合細菌の数の割合（％）（％ＤＡＰＩ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）である。
　図５（ａ）に示すように、Ａｃｅｔａｔｅ群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ単菌定着マウスの盲腸および糞便におけるＩｇＡ結合細菌の割合が減少しているが、図５（ｂ）に示すように、Ｅ．ｃｏｌｉ単菌定着マウスの盲腸および糞便におけるＩｇＡ結合細菌の割合が増加した。つまり、Ａｃｅｔａｔｅ群におけるＩｇＡは特にプロテオバクテリア門に属するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２株に対して親和性が高くなった。前述の通りプロテオバクテリア門には病原となりうる大腸菌、サルモネラ、ビブリオ、ヘリコバクターなどの細菌が含まれるところ、本開示の酢酸セルロースによって誘導されるＩｇＡにより、腸管がこれらの細菌から保護されること（腸管保護作用）が期待される。
　＜腸管管腔内容物および腸管粘液層内の細菌叢の評価＞
　（細菌叢分析）
　ＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から４週間飼育した野生型マウス、及びＡＩＮ－９３ＧまたはＡＩＮ－９３Ｇ－ａｃｅｔａｔｅの投与開始から４週間飼育したＡＩＤ　ＫＯマウスの大腸管腔内容物および大腸腸管粘液層内の細菌叢は、Ｇｏｎｇらの方法（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｅｃｏｌ．　２００７　Ｊａｎ；５９（１）：１４７－５７．）で採取し、さらに１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子解析により細菌を同定した。
　４週間飼育した野生型マウスＡｃｅｔａｔｅ群の大腸管腔内容物と大腸粘液層内の細菌叢分析結果を表３に、４週間飼育した野生型マウスＣｏｎｔｒｏｌ群の管腔内容物と粘液層内の細菌叢分析結果を表４に示す。さらに、４週間飼育したＡＩＤ　ＫＯマウスＡｃｅｔａｔｅ群の管腔内容物と大腸粘液層内の細菌叢分析結果を表５に、４週間飼育したＡＩＤ　ＫＯマウスＣｏｎｔｒｏｌ群の管腔内容物と大腸粘液層内の細菌叢分析結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　野生型マウスＡｃｅｔａｔｅ群は、表３に示すように、プロテオバクテリア門の細菌が管腔内容物では２．１％、粘液層内では０．７％と、管腔に比べ粘液層内に定着しにくい。これに対し、野生型マウスＣｏｎｔｒｏｌ群は、表４に示すように、プロテオバクテリア門の細菌が管腔内容物では０．０％、粘液層内でも０．０％と、管腔に比べ粘液層内に定着しにくいとは言えない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
　ＩｇＡを産生しないＡＩＤ　ＫＯマウスは、Ａｃｅｔａｔｅ群であっても、表５に示すように、プロテオバクテリア門の細菌が管腔内容物では１．８％、粘液層内では３２．３％と、管腔に比べ粘液層内に非常に定着しやすい。また、ＡＩＤ　ＫＯマウスＣｏｎｔｒｏｌ群でも、表６に示すように、プロテオバクテリア門の細菌が管腔内容物では１．４％、粘液層内では２２．２％と、管腔に比べ粘液層内に非常に定着しやすい。以上から、ＩｇＡの増加は、大腸粘液層内におけるＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの減少を導くことで、腸管保護に寄与するものと考えられる。

Claims (5)

  1. 　アセチル総置換度が０．４以上１．１以下である酢酸セルロースを含有する、腸管免疫亢進剤。
  2. 　前記酢酸セルロースは、下記式で定義される組成分布指数（ＣＤＩ）が２．０以下である、請求項１に記載の腸管免疫亢進剤。
    　ＣＤＩ＝（組成分布半値幅の実測値）／（組成分布半値幅の理論値）
    　組成分布半値幅の実測値：酢酸セルロース（試料）の残存水酸基をすべてプロピオニル化して得られるセルロースアセテートプロピオネートをＨＰＬＣ分析して求めた組成分布半値幅
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
      
    　　ＤＳ：アセチル総置換度
    　　ＤＰｗ：重量平均重合度（酢酸セルロース（試料）の残存水酸基をすべてプロピオニル化して得られるセルロースアセテートプロピオネートを用いてＧＰＣ－光散乱法により求めた値）
  3. 　請求項１または２に記載の腸管免疫亢進剤を含有する、食品。
  4. 　前記食品における前記酢酸セルロースの含有量が０．１重量％以上５重量％未満である、請求項３に記載の食品。
  5. 　請求項１または２に記載の腸管免疫亢進剤を含有する、医薬。
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