WO2011102529A1

WO2011102529A1 - 上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤

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Publication number: WO2011102529A1
Application number: PCT/JP2011/053833
Authority: WO
Inventors: 古賀　泰裕; 義充鈴木; 聡槇島; 一雄小笠; 鈴木　雅之; 叔子飯塚
Original assignee: 有限会社東海医学検査研究所; ニチニチ製薬株式会社; 物産フードサイエンス株式会社
Priority date: 2010-02-22
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2011-08-25
Also published as: EP2540300B1; JPWO2011102529A1; CA2790783C; US20120315342A1; EP2540300A1; KR20130043614A; KR101833249B1; ES2545749T3; CA2790783A1; CN102791274B; HK1178433A1; EP2540300A4; CN102791274A

Abstract

【課題】　通常、食品として、あるいは生体内に存在し、生理的濃度の範囲内で生体に対して毒性を有さないイオンとして馴染みあるものであるにもかかわらず、合成ステロイド内服薬と比較して極めて安全かつ効果的にアレルギーの改善、治療または予防、もしくは局所的炎症反応に効果を示す、特定のオリゴ糖および２価の金属陽イオンを含む組成物を提供する。【解決手段】　上皮細胞における細胞間接着増強剤であって、１－ケストースおよび／またはニストースならびに２価の金属陽イオンを有効成分とする。本発明によれば、アレルゲンの体内への侵入の原因となる上皮細胞間タイトジャンクションタンパク質の破壊を抑制する他、上皮細胞間タイトジャンクションタンパク質を修復し、ないし形成を促進することにより、上皮細胞間接着を増強させ、アレルギー症状の効果的な改善、治療および予防が可能となる。

Description

上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤

　本発明は、上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤に関し、特に、アレルゲンに対するバリア機能のひとつである上皮細胞の細胞間接着（上皮細胞間接着）を増強させてアレルギーの改善、治療および予防が可能な上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤に関する。

　アレルギーは、異物に対する免疫系の異常反応によって起こると考えられている。人体において主に外界の異物と接触する器官は表皮、呼吸器、そして消化器である。消化器はその中でも独特の免疫システムを備えており、全身の免疫系にも多大な影響を及ぼす免疫器官として近年着目されている。

　現在、アレルギー治療の第一選択肢は、アレルゲンと核内グルココルチコイド受容体との結合による炎症性サイトカインの発現抑制を機作とする合成ステロイド内服薬によって行われているが、合成ステロイド内服薬は感染症の誘発、動脈硬化病変、副腎不全、消化管障害や女性ならば月経異常といった副作用を起こすことが報告されている。重篤な副作用が認められる場合には他の治療アプローチ、または併用治療なども視野に入れられるべきであると考えられる。

　そして実際に近年、合成ステロイド内服薬のみでなく、腸管の免疫担当細胞のバランスを改善することや、免疫細胞を賦活化する種々の方法と組み合わせることで一定の治療効果が得られたとする報告が数多くなされている。

　従来、アレルギーを予防する方法として、アレルギーを発症した児童の腸内ビフィズス菌が健康児に比べて少ない事実に基づき、腸内細菌叢の構成バランスの改善を図る方法が主流であった。

　腸内細菌叢の構成バランスを整えてアレルギーを改善または予防する着想に基づく方法として、特開平８－１５７３７９（特許文献１）には、フラクトオリゴ糖を含有するアレルギー予防剤を用いた方法が記載されている。特開２００３－２０１２３９（特許文献２）には、フラクトオリゴ糖を含有する免疫賦活食品が記載されている。また、特許第４１６２１４７号（特許文献３）、特開２００８－２８０３５４（特許文献４）にはアレルギーを抑制する方法が記載されている。

　特許文献１には、マグネシウム欠乏によるアレルギーの憎悪に対し、マグネシウム源、フラクトオリゴ糖および難消化性糖アルコールを含有した組成物を摂取する方法が記載されている。本法は、フラクトオリゴ糖により腸内細菌が有機酸を生産し、この有機酸および難消化性糖アルコールによってマグネシウム吸収を促進することでアレルギーの憎悪を予防する方法であるが、この方法ではマグネシウム欠乏によるアレルギーの憎悪を治療することはできるが、その他の原因によるアレルギーを治療することはできず、患者が限定されている。特許文献２には、フラクトオリゴ糖摂取によってパイエル板からのＩｇＡ産生を誘導し、腸管免疫を賦活する方法が記載されている。しかし、この方法では、有効量が非常に多く、毎日摂取することが非常に困難である。

　特許文献３には、フラクトオリゴ糖において１－ケストースが最大組成比率の第１組成物であるアレルギー抑制剤、特許文献４には、フラクトオリゴ糖において１－ケストースが最大組成比率の第１組成物として含有されているアレルギー抑制オリゴ糖がそれぞれ記載されている。これらのアレルギー抑制剤やアレルギー抑制オリゴ糖は、特許文献１～２記載のアレルギーに対する効果と比較しても、アレルギー抑制効果が高いものである。一方、Ｃｌｉｎｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｋｅｓｔｏｓｅ，ａｐｒｅｂｉｏｔｉｃｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｏｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｔｏｐｉｃｄｅｒｍａｔｉｔｉｓｉｎｉｎｆａｎｔｓ．（非特許文献１）には、乳幼児に対して１－ケストースの摂取試験の結果、アレルギー症状の改善とビフィズス菌の増殖との間に強い相関性が認められないとの報告もある。

　近年、アレルゲンと成り得る物質が共通して持つシステイン／セリンプロテアーゼ活性が上皮細胞間のタイトジャンクションタンパク質を分解し、上皮細胞間接着を弱めることが示された（非特許文献２および３）。そこで、上皮細胞間のタイトジャンクションタンパク質を修復し、ないし形成を促進することにより、上皮細胞間接着を増強させ、アレルゲンの体内への侵入を抑制することで、アレルギーを改善、治療または予防する着想に基づく方法が試みられるようになった。

　これまでに、腸管上皮細胞を用いたモデルによって、上皮細胞間接着を増強させる物質の探索が行われており、一例として、魚類の白子あるいは酵母由来の核酸（特許文献５）、セルラーゼ製剤由来ペプチド（特許文献６）、モノアシロガングリオシド３（特許文献７）、乳酸菌由来リポテイコ酸（特許文献８）、ホエータンパク質（特許文献９）などを挙げることができる。これらはいずれも、上皮細胞間タイトジャンクションタンパク質の形成を促進することによるアレルギー抑制効果があることが証明されている。

　しかし、特許文献５～８に記載の物質は、生産工程が煩雑であり、さらに、工業的な大量生産は非常に困難である。また、特許文献９に記載の物質は、生産は容易であるが、効果を得るためには大量に摂取しなければならないため、毎日の摂取が難しい。これらの理由から、上記物質によるアレルギーを改善、治療または予防できる製剤は実現していない。

特開平８－１５７３７９号公報特開２００３－２０１２３９号公報特許第４１６２１４７号公報特開２００８－２８０３５４号公報特許第４０５０７９９号公報特開２００２－２７５１９６号公報特許第４０３４３６４号公報特開２００８－２１２００６号公報特許第４３３００８８号公報

ＳｈｉｂａｔａＲ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２００９Ｓｅｐ，３９（９），Ｐ１３９７－１４０３ＷａｎＨ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９，１０４，Ｐ１２３－１３３ＲｕｎｓｗｉｃｋＳ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｎｏｌ．，２００３，１１１，Ｐ７０４－７１３

　本発明は、上皮細胞間接着を増強させ、アレルゲンの体内への侵入を抑制することで、アレルギーを改善、治療または予防する着想に基づくものである。本発明者らは、２価の金属陽イオンと特定のオリゴ糖を組み合わせたものが、２価の金属陽イオンと比較しても、上皮細胞間の接着をより増強することを見出し、下記の発明を完成した。すなわち本発明は、通常、オリゴ糖は食品として、２価の金属陽イオンは生体内に存在して、生理的濃度の範囲内で生体に対して毒性を有さないものとして馴染みあるものであるにもかかわらず、合成ステロイド内服薬と比較して極めて安全かつ効果的にアレルギーの改善、治療または予防、もしくは局所的炎症反応に効果を示す、特定のオリゴ糖および２価の金属陽イオンを含む組成物を提供することを目的としている。

（１）上皮細胞における細胞間接着増強剤であって、１－ケストースおよび／またはニストースならびに２価の金属陽イオンを有効成分とする前記剤。

（２）１－ケストースおよび２価の金属陽イオンを有効成分とする、（１）に記載の剤。

（３）１－ケストースが純度９５重量％以上の１－ケストース含有オリゴ糖であって、前記１－ケストース含有オリゴ糖１０重量部に対して２価の金属陽イオンが１重量部以上である、（２）に記載の剤。

（４）２価の金属陽イオンがカルシウムイオンである、（１）から（３）の何れかに記載の剤。

（５）上皮細胞が腸管上皮細胞である、（１）から（４）の何れかに記載の剤。
（６）（１）から（５）の何れかに記載の剤を用いたアレルギー改善、治療または予防剤。

　本発明に係る上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤によれば、アレルゲンの体内への侵入の原因となる上皮細胞間タイトジャンクションタンパク質の破壊を抑制する他、上皮細胞間タイトジャンクションタンパク質を修復し、ないし形成を促進することにより、上皮細胞間接着を増強させ、アレルギー症状の効果的な改善、治療および予防が可能となる。

実施例１において、１－ケストース、およびニストース添加によるＴＥＥＲの経時変化を測定した結果を示す図である。実施例２において、１－ケストース添加によるＴＥＥＲの経時変化を測定した結果を示す図である。実施例３において、１－ケストース添加によるＴＥＥＲの経時変化を測定した結果を示す図である。実施例４において、１－ケストース添加によるＴＥＥＲの経時変化を測定した結果を示す図である。実施例４において、１－ケストース添加によるＴＥＥＲの経時変化を測定した結果を示す図である。実施例５において、１－ケストース、およびスクロース、およびニストース添加による物質透過量の変化を測定した結果を示す図である。実施例６において、１－ケストース添加によるＴＥＥＲの変化を測定した結果を示す図である。

　以下、本発明に係る上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤について詳細に説明する。本発明に係る上皮細胞間接着増強剤は、上皮細胞における細胞間接着増強剤であって１－ケストースおよび／またはニストースならびに２価の金属陽イオン、もしくは１－ケストースおよび２価の金属陽イオンを有効成分とする。

　上述のとおり、アレルゲンと成り得る物質が共通して持つシステイン／セリンプロテアーゼ活性が上皮細胞間のタイトジャンクションタンパク質を分解し、上皮細胞間接着を弱めることが知られている（非特許文献２および３）が、本発明に係る上皮細胞間接着増強剤は、上皮細胞間のタイトジャンクションタンパク質を修復し、ないし形成を促進し、その結果上皮細胞間接着を増強させ、アレルゲンの体内への侵入を抑制することができ、本発明に係る上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤は、アレルギーを改善、治療または予防することができる。

　本発明において、上皮細胞としては、例えば、吸収性上皮細胞、ケラチン化上皮細胞、湿性重層バリア上皮細胞(ｗｅｔ－ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄｂａｒｒｉｅｒｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、内層上皮細胞（ｌｉｎｉｎｇｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、外分泌上皮細胞、内分泌上皮細胞、細胞外マトリックス分泌上皮細胞、収縮性上皮細胞などを挙げることができ、具体的には、小腸上皮細胞や大腸上皮細胞、十二指腸上皮細胞などの腸管上皮細胞、胃粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、皮膚上皮細胞、口蓋上皮細胞などを挙げることができる。

　２価の金属陽イオンとしては、生体内に存在して生理的濃度の範囲内で生体に対して毒性を有さない２価の金属陽イオンであればよく、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオンなどの２価イオンを挙げることができる。なお、本実施例においては、カルシウムイオンを好適な２価の金属陽イオンとして用いている。

　カルシウムイオンの細胞外の離脱と添加を行う、いわゆるカルシウムスイッチにより、細胞間接着が可塑性を有していることが従来より示されている（ＳａｒａｈＬ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ａ．，２００８，１７７８，Ｐ２３１８－２３２４；ＧｅｏｒｇｉｎａＣ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌ．，２０１０，２３７，Ｐ１１５－１２３）。近年、カルシウムイオン以外の２価の金属陽イオン、例えばマグネシウムイオンや亜鉛イオンなどの２価の金属陽イオンについても、これらの生理的濃度の範囲内において細胞間接着の形成に正の影響を及ぼすことが示されており（ＳａｒａｈＬ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ａ．，２００８，１７７８，Ｐ２３１８－２３２４；ＧｅｏｒｇｉｎａＣ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌ．，２０１０，２３７，Ｐ１１５－１２３）、これらに共通する細胞機構として、カルシウムイオンと同様の作用を及ぼす２価の金属陽イオンによる細胞機構の存在が示唆されている。従って、本発明において、１－ケストースおよび／またはニストースならびにカルシウムイオン、あるいは１－ケストースおよびカルシウムイオンが細胞間接着の形成を促進することを示すことは、１－ケストースおよび／またはニストースならびに２価の金属陽イオン、あるいは１－ケストースおよび２価の金属陽イオンが細胞間接着の形成を促進することを示すことと同義である。

　本発明において、利用することができるオリゴ糖としては、例えば、ショ糖を除く１－ケストースやニストース、フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ糖を挙げることができる。なお、本実施例においては、１－ケストースやニストースを好適なオリゴ糖として用いている。

　１－ケストースは、１分子のグルコース残基と２分子のフルクトース残基からなるフルクト三糖類である。本発明において利用することができる１－ケストースの好ましい形態としては、例えば、ショ糖を原料とする酵素反応により調製された後、クロマトグラフィー分離法により単糖やショ糖が除去されてその純度が高められて結晶法により製造された、１－ケストースの純度が９５重量％以上の１－ケストース含有オリゴ糖を挙げることができる。このような１－ケストース含有オリゴ糖は溶解性に優れ、難消化性であって低エネルギー物質である。さらに、ＩｇＡ産生増強作用やＩｇＥ産生抑制作用を有している（特許文献３および４）。

　なお、上述のショ糖を原料とする酵素反応により調製する方法については特開昭５８－２０１９８０号公報に、クロマトグラフィー分離法を用いて単糖やショ糖をして純度を高める方法については特願平１１－３４７８７（特開２０００－２３２８７８号公報）に、結晶法については特願平２－２２４３１２（特開平４－２３５１９２号公報）に、それぞれ記載されている方法を用いることができ、特願平１１－３４７８７、特願平２－２２４３１２、特願２００５－３７１００５（引用文献３）および特願２００８－１６６４６３（引用文献４）の内容は本明細書に包含される。

　本発明における１－ケストースの１日当たりの摂取量としては、０．０１５ｇ／ｋｇ体重以上であることが好ましく、乳幼児においては、１－ケストース１０重量部に対して２価の金属イオンが１重量部との換算において、２．５ｇ程度が好ましい。

　また、本発明における上皮細胞間接着は、上皮細胞間タイトジャンクションタンパク質を修復し、ないし形成を促進することにより達成される。

　本発明において「増強」とは、「賦活」、「促進」、「強化」、「増進」などと置換可能に用いられる。

　アレルギーとしては、例えば、アトピー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、蕁麻疹、動物アレルギー、食物アレルギー、金属アレルギー、薬物アレルギー、アナフィラキシーなどを挙げることができ、本発明においては、アトピー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギーを対象とすることが好ましい。

　本発明に係る上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤などの形態を挙げることができるが、皮膚掻痒部または皮膚発疹部への塗布や鼻または目の粘膜への投与が好ましい。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。

　以下、本発明に係る上皮細胞間接着増強剤およびこれを用いたアレルギー改善、治療または予防剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

『実施例１：１－ケストースが示す細胞外カルシウム欠乏による上皮細胞間接着低下からの回復を促進する効果を確認する実験』
　実施例１では、１－ケストースが示す細胞外カルシウム欠乏による上皮細胞間接着低下からの回復を促進する効果を、培養細胞を用いた実験により確認した。

　本実施例１で使用した１－ケストース含有オリゴ糖の組成は、１－ケストースが９８重量％、ニストースが１重量％、ショ糖が１重量％であるオリゴ糖、つまり、１－ケストースの純度が９８重量％のオリゴ糖である。また、培養細胞の細胞間接着強度の指標として上皮細胞間電気抵抗（ＴＥＥＲ）を用いた。これは上皮細胞間接着が強いほど培養細胞上層培地と下層培地間の電気抵抗値が大きくなるという性質を利用した測定法であり、上皮細胞のモデル実験などにも用いられる手法である。

　結腸上皮ガン細胞Ｃａｃｏ－２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で継代培養し、４８代目の培養細胞を凍結保存して以降の実験に用いた。Ｃａｃｏ－２細胞をトランスウェル（ＣｏｒｎｉｎｇＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）の上層に播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地存在下、５％ＣＯ_２、３７℃インキュベーター内で培養した。細胞の培養はトランスウェルの上層と下層間の電気抵抗（ＴＥＥＲ）が４００～５００Ω・ｃｍ^２となるまで行った。

　トランスウェルのＴＥＥＲが４００～５００Ω・ｃｍ^２となるまで培養したＣａｃｏ－２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地をカルシウム欠損ＤＭＥＭ培地に置き換えて２時間培養した。その後、カルシウムを含有するＤＭＥＭ培地に１重量％濃度で１－ケストース含有オリゴ糖、またはニストースを上層に添加し、３０分毎にＴＥＥＲ経時測定を行い、２２時間後まで培養してＴＥＥＲの測定を行った（１％ケストース群、１％ニストース群、ｎ＝３）。対照群として、カルシウム欠損ＤＭＥＭ培地のみで培養した群（ネガティブ・コントロール群、ｎ＝３）とカルシウム欠損ＤＭＥＭ培地で２時間培養後、カルシウム含有ＤＭＥＭ培地に置き換えたのみの群（ポジティブ・コントロール群、ｎ＝３）を作成し、ＴＥＥＲ経時変化の比較を行った。

　以下、実施例１におけるＴＥＥＲ比の測定結果を図１に示す。ネガティブ・コントロール群ではＴＥＥＲの回復は殆ど見られなかったが、１％ケストース群、１％ニストース群、およびポジティブ・コントロール群ではネガティブ・コントロール群に比べ有意なＴＥＥＲの回復が見られた。そして、１％ケストース群、および１％ニストース群はポジティブ・コントロール群に比べ有意な回復促進効果が見られた。具体的には、カルシウム欠損ＤＭＥＭ培地からカルシウム含有ＤＭＥＭ培地に置き換えた３０分後の１％ケストース群では、ポジティブ・コントロール群に比べ平均２．４倍の回復促進効果が認められた。また、１％ニストース群に比べ、１％ケストース群ではより強い回復促進の傾向が見られた。これにより、１－ケストースは低下した上皮細胞間接着の強い回復促進作用を持つことが確認された。

『実施例２：１－ケストースが示す細胞外カルシウム欠乏による上皮細胞間接着低下からの回復を促進する効果がカルシウム依存的であることを確認する実験』
　実施例２では、１－ケストースが示す細胞外カルシウム欠乏による上皮細胞間接着低下からの回復を促進する効果がカルシウム依存的に生じることを、培養細胞を用いた実験により確認した。

　１－ケストース含有オリゴ糖は実施例１で使用した同純度のもの、培養細胞の培養条件は実施例１と同条件で行った。

　トランスウェルのＴＥＥＲが４００～５００Ω・ｃｍ^２となるまで培養したＣａｃｏ－２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地をカルシウム欠損ＤＭＥＭ培地に置き換えて２時間培養した。その後、カルシウムを含有するＤＭＥＭ培地に１重量％濃度で１－ケストース含有オリゴ糖を上層に添加し、３０分毎にＴＥＥＲ経時測定を行い、３時間後まで培養してＴＥＥＲの測定を行った（カルシウム（＋）１％ケストース群、ｎ＝３）。またカルシウム欠損培地のまま１重量％濃度で１－ケストース含有オリゴ糖を上層に添加し、３時間後まで培養してＴＥＥＲの測定を行う群を作成した（カルシウム（－）１％ケストース群、ｎ＝３）。対照群として、カルシウム欠損ＤＭＥＭ培地のみで培養した群（ネガティブ・コントロール群、ｎ＝３）とカルシウム欠損ＤＭＥＭ培地で２時間培養後、カルシウム含有ＤＭＥＭ培地に置き換えたのみの群（ポジティブ・コントロール群、ｎ＝３）を作成し、ＴＥＥＲ経時変化の比較を行った。

　以下、実施例２におけるＴＥＥＲ比の測定結果を図２に示す。ネガティブ・コントロール群およびカルシウム（－）１％ケストース群ではＴＥＥＲの回復は殆ど見られなかった。しかし、実施例１と同様に、カルシウム（＋）１％ケストース群およびポジティブ・コントロール群ではＴＥＥＲの有意な回復が見られ、カルシウム（＋）１％ケストース群では、ポジティブ・コントロール群に対しても実施例１と同様に、ＴＥＥＲの有意な回復促進効果が認められた。これにより、１－ケストースは細胞外カルシウム非存在下ではＴＥＥＲの回復効果を示さず、１－ケストースによる低下した上皮細胞間接着の回復促進効果は、細胞外カルシウム依存的に起こることが確認された。

『実施例３：１－ケストースが示す細胞外カルシウム欠乏による上皮細胞間接着低下からの回復を促進する効果が濃度依存的であることを確認する実験』
　実施例３では、１－ケストースが示す細胞外カルシウム欠乏による上皮細胞間接着低下からの回復を促進する効果が濃度依存的に生じることを、培養細胞を用いた実験により確認した。

　トランスウェルのＴＥＥＲが４００～５００Ω・ｃｍ^２となるまで培養したＣａｃｏ－２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地をカルシウム欠損ＤＭＥＭ培地に置き換えて２時間培養した。その後カルシウムを含有するＤＭＥＭ培地に１重量％濃度、または０．１重量％濃度で１－ケストース含有オリゴ糖を上層に添加し、３０分毎にＴＥＥＲ経時測定を行い、３．５時間後まで培養してＴＥＥＲの測定を行った（１％ケストース群、０．１％ケストース群、ｎ＝３）。対照群として、カルシウム欠損ＤＭＥＭ培地のみで培養した群（ネガティブ・コントロール群、ｎ＝３）とカルシウム欠損ＤＭＥＭ培地で２時間培養後、カルシウム含有ＤＭＥＭ培地に置き換えたのみの群（ポジティブ・コントロール群、ｎ＝３）を作成し、ＴＥＥＲ経時変化の比較を行った。

　以下、実施例３におけるＴＥＥＲ比の測定結果を図３に示す。実施例１と同様に、ネガティブ・コントロール群ではＴＥＥＲの回復は殆ど見られなかった。しかし１％ケストース群、０．１％ケストース群、ポジティブ・コントロール群ではネガティブ・コントロール群に比べ有意なＴＥＥＲの回復が見られた。また、１％ケストース群は０．１％ケストース群よりも強いＴＥＥＲ回復促進の傾向が見られた。以上から、１－ケストースによる低下した上皮細胞間接着の回復促進効果は、濃度依存的に起こることが確認された。

『実施例４：１－ケストースの事前投与による、細胞外カルシウム欠乏での上皮細胞間接着低下抑制効果を調べる実験』
　実施例４では、１－ケストースを事前に投与することで細胞外カルシウム欠乏による上皮細胞間接着の低下抑制が起こりうるかを、培養細胞を用いた実験により確認した。

　トランスウェルのＴＥＥＲが４００～５００Ω・ｃｍ^２となるまで培養したＣａｃｏ－２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地からカルシウム含有ＤＭＥＭ培地に置き換え、１重量％濃度で１－ケストース含有オリゴ糖を上層に添加し、１時間後、または６時間後にカルシウム欠損培地に置き換えて３０分毎のＴＥＥＲ経時測定を３回行った（１時間カルシウム（＋）１％ケストース群、６時間カルシウム（＋）１％ケストース群、ｎ＝３）。対照群として、カルシウム含有ＤＭＥＭ培地で１時間または６時間培養した後、カルシウム欠損ＤＭＥＭ培地で培養した群（１時間カルシウム（＋）ネガティブ・コントロール群、６時間カルシウム（＋）ネガティブ・コントロール群、ｎ＝３）とカルシウム含有ＤＭＥＭ培地で培養したのみの群（ポジティブ・コントロール群、ｎ＝３）を作成し、ＴＥＥＲ経時変化の比較を行った。

　以下、実施例４におけるＴＥＥＲ比の測定結果を図４、図５に示す。図４では１時間カルシウム（＋）１％ケストース群、１時間カルシウム（＋）ネガティブ・コントロール群、およびポジティブ・コントロール群との比較の結果を示している。１時間カルシウム（＋）１％ケストース群はカルシウム欠損ＤＭＥＭ培地に置き換える直前のＴＥＥＲ測定で、１時間カルシウム（＋）ネガティブ・コントロール群およびポジティブ・コントロール群と比較して有意なＴＥＥＲの増加を認めた。また、カルシウム欠損ＤＭＥＭ培地に置き換え、１－ケストースを除去した状態では、１時間カルシウム（＋）１％ケストース群のＴＥＥＲの低下は１時間カルシウム（＋）ネガティブ・コントロール群と比べて抑制される傾向が認められた。

　次に、図５では、６時間カルシウム（＋）１％ケストース群、６時間カルシウム（＋）ネガティブ・コントロール群、およびポジティブ・コントロール群との比較の結果を示している。図４と同様に、６時間カルシウム（＋）１％ケストース群はカルシウム欠損ＤＭＥＭ培地に置き換える直前のＴＥＥＲ測定で、６時間カルシウム（＋）ネガティブ・コントロール群およびポジティブ・コントロール群と比較して有意なＴＥＥＲの増加を認めた。同様に、カルシウム欠損ＤＭＥＭ培地に置き換え１－ケストース含有オリゴ糖を除去した状態では、６時間カルシウム（＋）１％ケストース群のＴＥＥＲの低下は６時間カルシウム（＋）ネガティブ・コントロール群と比べて抑制される傾向が認められた。

　以上から、１－ケストースには事前投与によって上皮細胞間接着低下に対する予防作用が認められ、１－ケストースは、その存在下では上皮細胞間接着促進作用を示すことが確認された。

『実施例５：細胞外カルシウム欠乏による細胞膜透過性亢進に対する物質の透過抑制効果を確認する実験』
　実施例５では、１－ケストースが示す細胞外カルシウム欠乏による細胞膜透過性亢進に対する物質透過性の抑制効果を、他のフラクトオリゴ糖との比較を含めて培養細胞を用いた実験により確認した。

　トランスウェルのＴＥＥＲが４００～５００Ω・ｃｍ^２となるまで培養したＣａｃｏ－２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地からカルシウム欠損無色ＨＢＳＳ培地（ＧＩＢＣＯ）に置き換え２時間培養した後、カルシウム含有無色ＨＢＳＳ培地（ＧＩＢＣＯ）に１重量％濃度で１－ケストース含有オリゴ糖、またはスクロース、またはニストースを上層に添加し、同時に細胞間透過物質としてＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を１００μＭの濃度で上層に添加して３時間培養した後、下層のＨＢＳＳ培地を回収し、蛍光マイクロプレートリーダーにて上層から下層に透過したＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗの残留濃度を測定した（１％ケストース群、１％スクロース群、１％ニストース群、ｎ＝３）。対照群として、カルシウム欠損ＨＢＳＳ培地のみで培養した群（ネガティブ・コントロール群、ｎ＝３）とカルシウム欠損ＨＢＳＳ培地で２時間培養後、カルシウム含有ＨＢＳＳ培地に置き換えたのみの群（ポジティブ・コントロール群、ｎ＝３）を作成し、細胞間透過物質量の比較を行った。

　以下、実施例５におけるＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ下層残留濃度の測定結果を図６に示す。ネガティブ・コントロール群に比べて、１％ケストース群、１％ニストース群、およびポジティブ・コントロール群では有意な残留濃度の低下を認めた。また、ポジティブ・コントロール群に比べ、１％ケストース群、および１％ニストース群はより少ない残留濃度を示す傾向が見られ、１％ケストース群は最も残留濃度が低い傾向が示された。

　以上から、１－ケストースには、上皮細胞間接着促進による、アレルゲンとなるタンパクなどの透過性を抑制する効果があることが確認された。

『実施例６：炎症性サイトカインＩＬ－１βによる上皮細胞間接着低下を抑制する効果を確認する実験』
　実施例６では、１－ケストースが示す炎症性サイトカインによる上皮細胞間接着低下を抑制する効果を、培養細胞を用いた実験により確認した。

　トランスウェルのＴＥＥＲが４００～５００Ω・ｃｍ^２となるまで培養したＣａｃｏ－２細胞のＤＭＥＭ培地上層に１重量％濃度で１－ケストース含有オリゴ糖を添加し、２４時間培養した後、炎症性サイトカインＩＬ－１βを１０ｎｇ／ｍＬ濃度で下層に添加し、４８時間後ＴＥＥＲの測定を行い、最初のＴＥＥＲ測定値との比を算出した（１％ケストース（＋）、ＩＬ－１β（＋）群、ｎ＝３）。対照群として、ＩＬ－１βのみ添加した群（１％ケストース（－）、ＩＬ－１β（＋）群、ｎ＝３）、または１－ケストース含有オリゴ糖およびＩＬ－１β無添加群（１％ケストース（－）、ＩＬ－１β（－）群、ｎ＝３）を作成してＴＥＥＲ比の比較を行った。

　以下、実施例６におけるＴＥＥＲ比の測定結果を図７に示す。１％ケストース（－）、ＩＬ－１β（－）群ではＴＥＥＲ比の平均値が０．９１４、標準偏差０．０３１に対し、１％ケストース（－）、ＩＬ－１β（＋）群ではＴＥＥＲ比の平均値が０．５８５、標準偏差が０．００２、１％ケストース（＋）、ＩＬ－１β（＋）群ではＴＥＥＲ比の平均値が０．８４９、標準偏差が０．０００３となった。この結果から、ＩＬ－１βによって低下するＴＥＥＲが１－ケストース含有オリゴ糖の添加により約２６％抑制されることが示された。これにより、１－ケストースは局所的炎症反応による上皮細胞間接着低下を抑制する効果があることが確かめられた。

　本発明により、アレルギー疾患の原因とされる上皮細胞間タイトジャンクションタンパク質を修復し、ないし形成を促進することにより、アレルギーの改善、治療および予防に資するものである。

Claims

　上皮細胞における細胞間接着増強剤であって、１－ケストースおよび／またはニストースならびに２価の金属陽イオンを有効成分とする前記剤。
　１－ケストースおよび２価の金属陽イオンを有効成分とする、請求項１に記載の剤。
　１－ケストースが純度９５重量％以上の１－ケストース含有オリゴ糖であって、前記１－ケストース含有オリゴ糖１０重量部に対して２価の金属陽イオンが１重量部以上である、請求項２に記載の剤。
　２価の金属陽イオンがカルシウムイオンである、請求項１から請求項３の何れかに記載の剤。
　上皮細胞が腸管上皮細胞である、請求項１から請求項４の何れかに記載の剤。
　請求項１から請求項５の何れかに記載の剤を用いたアレルギー改善、治療または予防剤。