KR20090116517A

KR20090116517A - 이눌린 및 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아를 포함하는우유

Info

Publication number: KR20090116517A
Application number: KR1020080042507A
Authority: KR
Inventors: 박건영; 정지강; 전정태
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2008-05-07
Filing date: 2008-05-07
Publication date: 2009-11-11

Abstract

본 발명은 이눌린 및 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 우유에 관한 것이다. 본 발명에 의한 우유는 비피도박테리아가 이중 미세캡슐로 보호되어 안전하게 대장까지 도달할 수 있으며, 이눌린에 의해 상기 비피도박테리아의 증식 및 활성이 증가하므로 섭취자의 대장환경의 개선에 유익한 효과를 줄 수 있다.

우유, 프로바이오틱스, 이눌린, 이중 미세캡슐

Description

이눌린 및 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아를 포함하는 우유{Milk comprising inulin and double-microencapsulated bifidobacteria}

본 발명은 이눌린 및 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 우유에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비피도박테리아가 안전하게 대장까지 도달할 수 있으며, 우유에 포함된 이눌린에 의해 대장에 도달한 비피도박테리아의 증식 및 활성이 증가되어 섭취자의 대장환경 개선에 유익한 효과를 나타내는 우유에 관한 것이다.

우유는 전통적으로 가장 완전한 자연식품으로 알려져 왔고, 영양적, 기호적인 목적으로 세계적으로도 가장 많이 소비되고 있는 식품 중 하나이다. 우유의 주성분은 수분, 단백질, 지방, 탄수화물이며 그 외에도 각종 비타민과 미네랄을 포함하고 있다. 우유에 있는 각종 영양소의 함유량은 많은 편은 아니지만, 필요한 영양소가 골고루 균형있게 들어있고 특히 칼슘의 함유량이 매우 많으며, 또한 우유 단백질에는 양질의 필수 아미노산이 풍부하게 함유되어 있다.

무엇보다 우유에 가장 큰 장점은 우유에 함유되어 있는 이러한 영양 성분들의 소화, 흡수율이 매우 높다는 것이다. 이 외에도 우유 중에는 면역 글로불린, 락 토페린, 각종 효소류, 칼슘 흡수 촉진, 위산 분비 억제, 대식세포 활성 펩타이드 등 많은 기능성 물질들이 100 여종 이상 존재하는 것으로 알려져 있다.

그러나 이러한 우유를 섭취하는 경우 나타나는 유당 불내증 등에 대한 건강상의 문제점은 항시 제기되어져 왔다. 유당은 우유를 비롯한 포유동물의 젖에만 들어있는 탄수화물로서 glucose와 galactose로 구성된 이당류이며, 유당의 양은 우유의 경우 대략 4~5% 정도이다. 인간이 유당을 섭취하면 소장에서 분비되는 유당분해 효소에 의해 유당이 분해되는데, 이 효소는 β-galactosidase로 미생물에서 포유동물에 이르기까지 여러 곳에서 발견된다.

유당 불내증이란 유당이 함유된 우유나 유제품을 섭취했을 때 오심, 복부 팽만, 복통, 설사, 소화불량 등을 일으키는 증상으로, 이것은 소장 상부에서 유당 분해 효소가 분비되지 않아 유당이 glucose와 galactose로 분해되지 못하고 맹장 또는 대장으로 그대로 내려간 후 높아진 삼투압에 의해 수분을 끌어올려 장 내용물에 수분의 양이 증가하게 되고 , 또한 이곳에 서식하는 미생물에 의해 발효됨에 따라 이산화탄소, 수소, 메탄가스 등을 생성함으로서 일어나는 것이다.

이러한 유당 불내증의 발생 원인은 나이와 인종적 배경에 따라 매우 다양하다. 일반적으로 태어날 때부터 유당 분해 효소를 분비하는 세포가 발달하지 않은 선천적 요인과 이유(離乳)와 더불어 유당의 자극이 없어지면서 유당 분비세포가 자연히 퇴화하여 유당의 분비가 적어지게 되는 후천적 요인이 있으며, 서양인에 비해 동양인의 경우가 유당 불내증을 가지고 있는 비율이 높다.

앞에서 말한 것과 같이 유당 불내증 증상이 발현되면, 소화되지 못한 유당으 로 인해 장내 삼투압이 높아져 설사와 복통을 일으키며, 이상 발효된 유당으로 인해 이산화탄소, 수소, 메탄가스, 단쇄 지방산 등을 생성하게 된다. 이때 생성된 수소 이온은 일부 혈액으로 흡수되어 활성산소를 발생시킬 수 있고, 단쇄 지방산은 산성도가 강하여 장내 점막에 염증을 일으킬 수 있으며, 설사, 소화불량 등으로 인한 각종 영양성분의 손실이 일어나며 특히 칼슘의 흡수와 관련하여 그 중요성이 강조되어 왔다.

또한 우유 섭취 후에 일어나는 이러한 불편한 위·장관 증상으로 인해 우유의 소비적인 측면에서 볼 때에도 좋지 못한 영향을 미치게 된다. 따라서 이러한 유당 불내증 발현의 억제를 위해 유당을 미리 분해시킨 우유 등이 시판되고 있고, 그 밖의 제품의 개발도 계속해서 이루어지고 있는 실정이다.

한편 1908년 Mechnikoff가 대장 내 세균총에 의한 유해한 발효로 인해 인체에 유해한 독성물질이 생성되며, 이런 물질들의 축적이 여러 가지 질병과 노화의 원인이 된다고 주장한 이래 대장 내 세균총에 의한 발효, 그 중 특히 유익한 발효에 관한 중요성이 대두되었다.

대장 내 세균총 중에는 이러한 유익한 발효에 관계되는 속(genus)이 존재하며, 이들은 여러 가지 건강상의 유익한 효과를 가져다주는 것으로 연구되었다. 유익한 발효에 관계되는 세균총 중 가장 대표적인 것이 비피도박테리아(Bifidobacteria)과 락토바실러스(Lactobacillus) 등이며, 이중 비피도박테리아는 나뭇가지 모양을 하고 있는 그람 양성의 절대 혐기성균으로, 장내 유해균을 억제하고 유익균의 증식을 촉진시키며, 면역 체계를 조절하고, 설사와 변비를 개선해 주며, 소화 작용을 돕는 등 인체에서 여러 가지 유익한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 비피도박테리아는 일반 유산균들과 함께 유제품이나, 생균제 등에 첨가되는 프로바이오틱스(probiotics)로 많이 사용되어 왔는데, 프로바이오틱스란 살아있는 미생물로 적정량을 섭취하였을 때 유익한 건강기능상의 효과를 가져다주는 미생물을 말하며, 주로 이용되는 비피도박테리아의 종류로는 B. bifidum , B. breve, B. infant, B. longum , B. adolescentis 등이 있다.

유제품들에 첨가되어 있는 일반적인 유산균의 초기 균수는 10⁷~10⁸ CFU/mL 정도이다. 그러나 비피도박테리아는 산이나 산소, 온도, 담즙과 같은 인체 내 소화효소 등의 주변 환경에 매우 민감하여 일반 유산균보다 배양 조건이 까다롭고 가격이 비싸, 보통 유제품에 함유되어 있는 양이 10⁵~10⁶ CFU/mL 정도에 지나지 않는데다가 섭취 후 인체 위장관을 지나면서 그 생존율이 현저히 감소한다. 인간의 건강상에 이로운 효과를 가져다주기 위한 비피도박테리아의 수는 최소 10⁵~10⁷ CFU/mL 이상 되어야 한다.

미세캡슐화 공법(microencapsulation)이란 이러한 비피도박테리아와 같은 미생물들을 주위 환경으로부터 보호하기 위한 것으로, 인체 위장관 환경으로부터 비피도박테리아를 보호하여 생존률을 높이기 위한 미세캡슐화 공법에 관한 많은 시도와 연구가 이루어져 왔다. 이중 미세캡슐화 공법(Double-microemcapsulation)은 일반 캡슐화 공법보다 그 보호 효과가 더욱 크며, 이것은 위산과 담즙산에 내산성을 가진 이중층으로 이루어져 있으며, 소장 하부에서 소화효소인 리파아제(lipase)에 의해 분해되어 살아있는 비피도박테리아가 대장까지 이를 수 있도록 해준다.

최근에는 프로바이오틱스에 대한 연구와 함께 프리바이오틱스(prebiotics)에 대한 관심도 높아지고 있는데, 프리바이오틱스란 비소화성 다당류로 인체에 섭취되었을 때 소화 효소에 의해 소화되지 않고 대장이 이르러 장내 미생물들에 의해 분해되는 물질로, 장내 유익균들의 수와 활성을 증대시켜주는 역할을 한다. 대부분의 식이섬유와 올리고당류가 이런 프리바이오틱스에 속한다. 이중 이눌린(inulin)은 식물 유래의 수용성 식이섬유로서 치커리, 양파, 아스파라거스 등에 함유되어 있으며, 권장 섭취량은 1~4 g/day이다. 이것은 장내 유익균에 의해 분해되어 이들의 증식을 돕고, 그 밖에도 무기질의 소화, 흡수율을 높여주고, 혈당과 혈중 지질 농도를 저하시키는데 도움을 주는 등 여러 가지 건강상의 이점을 가져다준다.

본 발명의 목적은 섭취자의 대장환경 개선에 유익한 효과를 줄 수 있도록, 프리바이오틱스로서 이눌린과 프로바이오틱스로서 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아를 포함하고 있는 기능성 우유를 제공하는 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 우유는 이눌린 및 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아 균주를 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 상기 이중 미세캡슐의 안쪽층은 코코넛 오일로 이루어져 있고 바깥층은 전분 및 젤라틴으로 이루어져 있는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 이중 미세캡슐화는 (a) 전분, 젤라틴 및 검(gum)을 물과 섞어 가열, 교반하면서 혼합액을 제조하고, (b) 폴리글리세린지방산에스테 및 코코넛 오일의 혼합액에 비피도박테리아 균주를 부가하여 균질화한 후, (c) 상기 (b)에서 균질화된 혼합액을 상기 (a)에서 제조된 혼합액에 넣고 다시 균질화한 후 살균 냉각수 속으로 고압 분무시킴으로써 이루어질 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아 균주는 비피도박테리움 브레베 CBG-C2(Bifidobacterium breve CBG - C2)일 수 있으며, 상기 이눌린은 우유 총중량에 대하여 0.5%가 포함되어 있을 수 있다.

본 발명에 의한 우유는 비피도박테리아가 이중 미세캡슐로 보호되어 안전하게 대장까지 도달할 수 있으며, 이눌린에 의해 상기 비피도박테리아의 증식 및 활성이 증가하므로 섭취자의 대장환경의 개선에 유익한 효과를 줄 수 있다.

본 발명의 발명자들은 이중 미세 캡슐화 비피도박테리아의 인체 위장관 환경에서의 안정성을 시중의 유산균 첨가 발효유 제품들과 비교·검증한 후, 본 발명에 따른 우유를 섭취한 후 대장까지 생존하여 도달한 비피도박테리아가 장내 환경 개선 및 유당 불내증 완화 등에 주는 효과를 관찰하고, 또한 비피도박테리아가 실제적으로 유당을 분해하여 유당 불내증의 발현 억제에 직접적인 효과를 가져다주는지를 검증하기 위한 in vitro 실험도 함께 실시함으로써 완성하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시하나, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 이눌린 및 이중 미세캡슐화 비피도박테리아를 포함하는 우유의 준비

이중 미세캡슐화 비피도박테리아를 포함하는 우유(Double-microencapsulated Bifidobacteria supplemented milk, DMB 우유)는 (주)비락으로부터 제공받아 사용하였다. DMB 우유에는 이중 미세캡슐화 공법으로 코팅한 비피도박테리움 브레베 CBG-C2(Bifidobacterium breve CBG - C2 )가 0.3중량% 첨가되었고, 이중 미세캡슐의 구조는 도 1과 같다.

도 1에 나타나 있듯이 이중 미세캡슐의 바깥층은 전분(starch)과 젤라 틴(gelatin)으로 이루어져 위와 소장을 통과하는 동안 안정성을 가질 수 있도록 만들어졌고, 안쪽 층은 코코넛 오일 등과 같은 하드 오일(hard oil)로 이루어져 소장 하부에서 소화효소인 리파아제(lipase)에 의해 분해될 수 있도록 설계되었다.

이중 미세캡슐화 공정은, 먼저 전분, 젤라틴, 검(gum)을 물과 섞어 가열, 교반하면서 혼합액을 제조하고, 폴리글리세린지방산에스테르와 하드 오일의 혼합액에 비피도박테리움 브레베 CBG-C2 균을 부가하여 균질화한 후, 이것을 처음의 혼합액에 넣고 다시 균질화한 후 최종 혼합액을 살균 냉각수 속으로 고압 분무시켜 이중 미세캡슐을 제조하게 된다(도 2 참조).

상기에서 준비된 DMB 우유에 프리바이오틱스로서 수용성 식이섬유인 이눌린(inulin)을 우유 총 중량에 대하여 0.5%로 첨가하여 본 발명에 따른 우유를 제조하였다.

[실험예 1] in vitro 위장관 환경에서의 안정성 검증

(1) 시판 중인 발효유 제품의 준비

6 종류의 시판 중인 유산균 첨가 발효유 제품(Commercial yogurt products, CP)을 구입하여 사용하였다. 6 종류의 CP는 모두 단일 균주가 아닌 혼합 균주를 사용하고 있는데, 6 종류 모두 비피도박테리아를 함유하고 있고, 각각 다른 종류의 일반 유산균을 사용하고 있다. 6 종류의 발효유 제품에 사용된 일반 유산균의 종류는 표 1과 같다.

시판 중인 유산균 첨가 발효유 제품(CP)	Strains of lactic acid bacteria
CP1	L. acidophilus
CP2	L. bulgaricus
CP3	LGG
CP4	5 complex lactic acid bacteria
CP5	L. delbruckii subsp ., L. bulgaricus , S. thermophilus
CP6	L. acidophilus, L. casei , S. thermophilus

(2) 인공 위장관 환경의 조성

인공 위장관 환경을 조성하기 위해 인공 위액과 인공 소장액을 조제하여 사용하였다. 인공 위액은 증류수에 pepsin(Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 1 mg/mL 비율로 혼합한 다음 1N HCl을 사용하여 pH 2.0으로 적정하여 조제하였다. 인공 소장액은 증류수에 cholic acid 0.02M, deoxycholic acid 0.02M, lipase 0.05 mg/mL, pancreatin 0.2 mg/mL (Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA) 을 각각 혼합한 다음 1N HCl과 1N NaOH로 pH 8.0으로 적정하여 조제하였다(도 3 참조).

(3) 안정성 실험

1)시료 제조

DMB 우유와 6 종류의 유산균 첨가 발효유 제품을 각각 1 mL씩 취해서 9 mL의 인공 위액이 들어있는 테스트 튜브에 각각 분주한 후 20 초 동안 균질화하였다. 이것을 37℃ 인큐베이터에 0, 1, 2, 3 시간 동안 보관하면서 각 시간별로 샘플을 채취해 관찰하였다. 인공 위액에 0~3 시간 보관되었던 샘플들을 각각 1 mL 씩 취해서 9 mL의 인공 소장액이 들어있는 테스트 튜브에 각각 분주한 후 20 초 동안 균질화하였다. 이것을 37℃ 인큐베이터에 0, 2, 4, 6 시간 동안 보관하면서 각 시간별로 샘플을 취해 관찰하였다.

2) 비피도박테리아 및 젖산 박테리아(Lactic acid bacteria) 수의 측정

비피도박테리아 및 일반 lactic acid bacteria 수의 측정은 평판 계수법을 이용하였다. 즉 샘플이 분주된 인공 위액과 인공 소장액을 설정된 시간대 별로 1 mL씩 취하여 멸균 생리식염수에 단계적으로 희석한 다음, 이것을 미리 petri dish에 만들어 둔 배지 위에 분주하여 도말한 후 37℃ incubator에서 72 시간 배양한 다음 나타난 colony 수를 계수하여 나타내었다. 이때 Bifidobacteria의 경우에는 Anaerogen(Oxid Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, England)와 함께 anaerobig package(Nicepack Co., Korea)에 넣어 절대 혐기적 조건으로 배양하였다.

비피도박테리아의 계수용 선택배지는 BS(Bifidobacteria selective) 배지(표 2 참조)에 부어 냉각, 경화시킨 다음 사용하였다. Lactic acid bacteria의 계수용 배지는 증류수 1,000 mL에 BCP plate count agar 24.6 g을 넣어 잘 교반한 다음, 115℃에서 20 분간 autoclaving하여 멸균된 petri dish에 부어 냉각, 경화시킨 다음 사용하였다.

성분	양(g/L)
BL agar	58
Sodium propionate	15
Lithium chloride	3
Paromomycin sulfate	0.05
Neomycin	0.1
Bromocresol purple	0.04

(4) 시험결과

1)인공 위액에서의 안정성

도 4의 (A)에는 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 비피도박테리아와 CP에 들어 있는 free Bifidobacteria를 각각 인공 위액에서 0, 1, 2, 3 시간 동안 정치시킨 후 채취한 시료에서 각 시간대별로 이들의 생존량을 나타낸 것이다. 일반적으로 CP에는 Bifidobacteria(~10⁶ CFU/mL)보다는 일반 lactic acid bacteria(~10¹⁰ CFU/mL)가 더 다량 함유되어 있다. 따라서 도 4의 (B)에는 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria와 CP에 들어 있는 일반 lactic acid bacteria의 시간대별 생존량도 비교하여 나타내었다.

인공 위액에 노출시켰을 때, DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria는 CP에 들어 있는 free Bifidobacteria보다 더 안정적인 것으로 나타났다. 초기 균수가 약 10⁶ CFU/mL 수준이었던 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria는 인공 위액에 최대 3 시간 노출시켰을 때, 약 10⁵ CFU/mL 수준으로 소량 감소하였다. 6종류의 CP에 들어 있는 free Bifidobacteria는 낮은 안정성을 보이며 인공 위액에 최대 3 시간 노출시, 초기 균수에서 그 감소량이 10²~10³ CFU/mL에 이르는 것으로 나타났다. 6 종류의 CP에 들어 있는 일반 lactic acid bacteria의 경우에는 초기 균수가 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria보다 훨씬 높기 때문에(10⁹~10¹⁰ CFU/mL), 3 시간 동안 인공 위액에 노출된 후에도 생존량에 있어서는 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria보다 높은 수준을 보인다. 그러나 감소량에 있어서는 이 역시 10²~10³ CFU/mL 수준으로, 생존률에 있어서는 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria가 더 높은 것으로 나타났다.

따라서 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria는 인공 위액에 노출시켰을 때, 그 생존률에 있어서 CP에 들어 있는 Bifidobacteria나 lactic acid bacteria보다 더 높다고 할 수 있다.

2) 인공 소장액에서의 안정성

비교적 단시간인 0, 1 시간 동안 인공 위액에 노출시킨 후, 다시 인공 소장액에 0, 2, 4, 6 시간을 노출시킨 bacteria의 생존 곡선을 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다. 도 5 및 도 6의 (A)에서 보듯이 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria에 비해서 CP에 들어 있는 free Bifidobacteria는 눈에 띄게 감소하는 경향을 나타내었다. 인공 위액에 0 시간 노출 당시 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria와 CP에 들어 있는 free Bifidobacteria의 생존량은 각각 10⁶ CFU/mL 과 10⁵~10⁷ CFU/mL 수준이었다. 그러나 이것을 인공 소장액에 노출시킨 지 4 시간 후에 CP에 들어 있는 free Bifidobacteria의 생존량은 약 10³~10⁴ CFU/mL 까지 감소하게 된다. 이에 비해 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria의 생존량은 약 10⁵ CFU/mL로 비교적 안정함을 보여준다. 또한 이것을 인공 소장액에 노출시킨 후 6 시간이 지나면, CP에 들어 있는 free Bifidobacteria의 생존량은 10² CFU/mL 이하로 줄어들게 되고, 이에 반해 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria의 생존량은 10⁵ CFU/mL를 계속 유지한다. CP에 들어 있는 lactic acid bacteria는 free Bifidobacteria에 비해서는 조금 더 안정된 생존곡선을 보여준다(도 5 및 6 (B)). 그러나 CP에 들어 있는 lactic acid bacteria 역시 인공 소장액에 노출된 지 6시간이 지나면 그 생존량이 10³ CFU/mL 정도로 줄어들게 되며, 결국에는 DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria가 더 안정하게 그들의 생존량을 유지하는 것으로 나타났다.

장시간(2, 3 시간) 동안 인공 위액에 노출시킨 후 다시 인공 소장액에 0, 2, 4, 6 시간 동안 노출시킨 bacteria의 생존 곡선이 도 7 및 8에 나타나 있다. 이들 역시 비슷한 양상을 보이는데, CP에 들어 있는 free Bifidobacteria나 lactic acid bacteria의 경우 더욱 현저한 감소의 추이를 보이며, DMB 우유에 들어 있는 이중 미세캡슐화 Bifidobacteria는 상대적으로 매우 안정성을 가지는 것으로 나타난다.

특히 인공 위액에 3 시간 노출된 후에는 그 숫자가 이미 상당히 줄어든 상태이므로 이 경우 CP에 들어 있는 free Bifidobacteria는 인공 소장액에 노출된 지 약 2시간 안에 그 생존량이 10² CFU/mL 이하로 줄어들며, 6 시간이 경과하면 거의 발견되지 않게 된다. CP에 들어 있는 lactic acid bacteria의 경우에도 그 감소율이 현저하여, 인공 위액에 3 시간 노출 후 10^7~10⁸ CFU/mL 이었던 생존량이 다시 인공 소장액에 노출된 지 6 시간이 지나면 10²~10³ CFU/mL 정도까지 줄어들게 된다. 따라서 인공 위액에 노출된 시간이 길수록 인공 소장액의 노출에 더욱 큰 영향을 받는 것을 알 수 있다.

[실험예 2] 대장 환경개선 여부의 임상실험

(1) 실험 대상자

본 인체 실험은 부산 시내에 거주하는 20~30 대의 건강한 성인 8 명을 대상으로 실시하였다.

(2) DMB 우유 섭취

실험 기간은 2 주 간격으로 DMB 우유 섭취 기간과 비섭취 기간을 반복하여 8 주간 실시하였다. 섭취 기간에는 180 mL의 DMB 우유를 하루 2 개씩 마시도록 하였다. 생균제, 항생제, 유산균 발효 제품 등 장내 환경에 직접적으로 영향을 줄 수 있는 식품은 제한하였고, 그 외에는 실험 실시 기간 동안 일상생활과 차이가 없도록 하였다.

(3) 분변에서의 균수 및 장내 유해효소 활성 측정

1) 분변의 수거

DMB 우유의 섭취 기간과 비섭취 기간이 반복될 때마다 그 마지막 날에 실험 대상자들로부터 분변을 채취하였고, 실험 전까지 혐기적 상태로 냉장 보관하였다.

2) pH측정

분변을 시료로 사용하여, 시료에 4 배의 증류수를 가하여 이를 잘 균질화한 후 원심 분리하여 상층액의 pH를 측정하였다.

3) 비피도박테리아 수의 측정

시료 1 g 을 취해 멸균 생리 식염수에 넣고 잘 균질화 한 다음 이를 순차적으로 희석하여 희석한 시료를 미리 petri dish에 만들어 둔 배지 위에 분주하여 도말한 후 37℃ incubator에서 72 시간 배양한 다음 나타난 colony수를 계수하였다. 배양시에는 Anaerogen(Oxid Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, England)와 함께 anaerobig package(Nicepack Co., Korea)에 넣어 절대 혐기적 조건으로 배양하였다.

4) β-glucosidase 와 β-glucuronidase 활성 측정

효소의 활성은 다음과 같은 방법에 의하여 측정하였다. 먼저 시료를 10배의 0.1 M Sodium phosphate buffer(pH 6.0) 로 희석한 후 β-glucosidase는 10 μM의 para-Nitrophenyl(PNP)-β-D-Glucoside(Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA) 40 ㎕를 기질로 사용하여 효소액 20 ㎕와 45℃에서 5 분간 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 800 ㎕ 0.5 M Na₂CO₃을 첨가한 후 입자 물질을 제거하기 위해 4,000 × g에서 원심분리를 한 후 400 nm에서 흡광도를 측정하였다.

β-glucuronidase는 10 ㎕ Phenolphtalein-β-D-glucuronic acid(Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA) 25 ㎕를 기질로 사용해 효소액 37.5 ㎕와 45℃ 에서 15 분간 반응을 시켰다. 1.25 mL 0.2 M Glycine-NaOH Buffer를 첨가하여 반응을 중지시키고 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 효소 역가 1 unit는 1분당 1 μmol의 PNP 또는 Phenolphtalein을 생산하는 효소의 양으로 정하였다.

(4) 실험 결과

1) 분변의 pH 변화

DMB 우유의 섭취기와 비섭취기를 2주 동안 반복하여 8주간 실험한 결과, DMB 우유 섭취기 동안 분변의 pH는 아주 큰 차이를 보이지는 않았지만, 감소되는 경향을 나타냈다(도 9 참조). 이는 DMB 우유의 섭취로 인하여 장내 Bifidobacteria의 수가 증가하게 되며, 또한 증가된 Bifidobacteria에 의해 장내 유익균 번식이 활성화되어, 이들의 분해산물 들로 인해 분변 pH의 저하 효과를 보이는 것으로 사료된다. 그러나 Bifidobacteria가 성인의 대장 내에서는 우세 균주에 속한다고 볼 수 없기 때문에 그 효과가 경미한 것으로 보인다.

2) 분변의 비피도박테리아 계측

DMB 우유의 섭취기 동안 분변 속의 Bifidobacteria의 수는 상당이 증가한 것으로 나타났다(도 10 참조). 분변 속의 Bifidobacteria는 비섭취기에는 108~109 CFU/mL 수준이었으나, 섭취기에는 10¹⁰~10¹¹ CFU/mL 까지 증가되는 양상을 나타내었다. 특히 섭취기와 비섭취기 동안 그 증가와 감소 양상이 비교적 뚜렷하게 나타나 이것이 DMB 우유 섭취의 효과임을 검증해 준다.

3) 분변의 β-glucosidase 와 β-glucuronidase 활성 측정

β-glucosidase 와 β-glucuronidase는 인간의 몸에서 합성되어 여러 가지 질병 발생 원인물질을 생성하는 유해성 유도 효소의 일종으로 알려져 있다. Bifidobacteria를 비롯한 장내 유익균들은 이런 효소의 생성을 억제할 뿐 아니라, 생성된 유해물질을 체외로 배출시키거나 분해하는 역할을 한다. β-glucosidase는 배당체를 분해하는 효소로 배당체는 분해되어 당과 비배당체 부분으로 나누어지게 되는데, 섭취된 식품중의 배당체는 분해되면 반응성이 증가하고 체내흡수가 증가되는 것으로 알려져 있다. 특히 아미그달린(amygdalin)과 같은 청산 배당체과 쿠마린 배당체 및 페놀 배당체는 분해 후 이들의 독성기가 유리되어, 너무 많은 양이 생성되면 좋지 않은 것으로 알려져 있다. β-glucuronidase는 장간 순환 물질의 탈포합에 주로 관여한다. 즉 간에서는 지용성 물질에 글루큐론산이나 황산 등의 친수성 그룹을 포합시켜 수용성을 증가시킴으로써 장이나 소변으로의 배설을 촉진한다. 그러나 이들 β-glucuronidase가 장내에 존재하면 포합된 독성물질이 다시 탈포합되어 지용성이 증가되고 결과적으로 상피 세포를 통한 체내 흡수가 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 실험예에서 DMB 우유의 섭취기 동안에 β-glucosidase와 β-glucuronidase 활성이 상당히 감소함을 알 수 있다. 이 역시 섭취기와 비섭취기 동안 증가와 감소의 양상이 뚜렷이 나타나 이것이 DMB 우유 섭취 효과에 기인한 것임을 설명할 수 있다(도 11 참조).

상기한 실험예를 통하여 확인한 바와 같이, 분변 내 Bifidobacteria의 수가 DMB 우유 섭취 동안 매우 증가하는 것으로 볼 때, DMB 우유에 들어 있는 Bifidobacteria가 이중 미세캡슐로 보호되어 안전히 대장까지 도달함을 알 수 있다. 또한 이는 DMB 우유 속의 이눌린에 의한 이들의 증식과 활성화 작용 때문인 것으로 판단된다. 또한 DMB 우유의 섭취로 분변의 pH와 장내 유해효소 저하 작용도 나타나는 것으로 보아 DMB 우유의 섭취는 대장환경의 개선에 유익한 효과를 준다는 것을 확인할 수 있다.

도 1은 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아의 구조를 나타내는 모식도이다.

도 2는 비피도박테리움 브레베의 이중 미세캡슐화 공정을 나타내는 모식도이다.

도 3은 인공 위장관 환경을 조성하기 위한 인공 위액 및 인공 소장액의 조제 조건을 나타내는 그림이다.

도 4는 DMB 우유에 들어있는 이중 미세캡슐화 비피도박테리아와 CP에 들어있는 프리 비피도박테리아(A) 및 일반 젖산 박테리아(B)의 시간대별 생존량을 나타낸 그래프이다.

도 5 및 6은 단시간(0, 1 시간) 동안 인공 위액에 노출시킨 후 다시 인공 소장액에 0, 2, 4, 6 시간 동안 노출시킨 박테리아의 생존 곡선을 나타내는 그래프이다.

도 7 및 8은 장시간(2, 3 시간) 동안 인공 위액에 노출시킨 후 다시 인공 소장액에 0, 2, 4, 6 시간 동안 노출시킨 박테리아의 생존 곡선을 나타내는 그래프이다.

도 9는 DMB 우유의 섭취기와 비섭취기를 2주 동안 반복하여 8주간 실험하고 분변의 pH 변화를 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 10은 DMB 우유의 섭취기 동안 분변 속의 Bifidobacteria의 수의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 11은 DMB 우유의 섭취기 동안에 β-glucosidase 와 β-glucuronidase 활 성 변화를 나타내는 그래프이다.

Claims

이눌린; 및 이중 미세캡슐화된 비피도박테리아 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 우유.
청구항 1에 있어서, 상기 이중 미세캡슐의 안쪽층은 코코넛 오일로 이루어져 있고, 바깥층은 전분 및 젤라틴으로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 우유.
청구항 1에 있어서, 상기 이중 미세캡슐화는 (a) 전분, 젤라틴 및 검(gum)을 물과 섞어 가열, 교반하면서 혼합액을 제조하고, (b) 폴리글리세린지방산에스테 및 코코넛 오일의 혼합액에 비피도박테리아 균주를 부가하여 균질화한 후, (c) 상기 (b)에서 균질화된 혼합액을 상기 (a)에서 제조된 혼합액에 넣고 다시 균질화한 후 살균 냉각수 속으로 고압 분무시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 우유.
청구항 1에 있어서, 상기 비피도박테리아 균주는 비피도박테리움 브레베 CBG-C2(Bifidobacterium breve CBG - C2)인 것을 특징으로 하는 우유.
청구항 1에 있어서, 상기 이눌린은 우유 총중량에 대하여 0.5%가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 우유.