KR100730719B1

KR100730719B1 - 20-Ｏ-β-Ｄ-글루코피라노실-20(Ｓ)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100730719B1
Application number: KR1020060022220A
Authority: KR
Inventors: 정성현; 최윤숙; 성종환; 이승권
Original assignee: 주식회사 일화
Priority date: 2006-03-09
Filing date: 2006-03-09
Publication date: 2007-06-21

Abstract

본 발명은 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 인삼 사포닌 대사 생산물인 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올 물질을 인슐린 분비 촉진 및 혈당치를 낮추기 위한 항당뇨 의약용도로 사용함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 또는 그 유사물을 유산균, 장내세균, 프레보테라속 S-1 균주, 글루코시다제 효소 중 어느 하나를 이용하여 대사시켜 전환한 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올 물질을 인슐린 분비 촉진 및 혈당치를 낮추기 위한 항당뇨 의약용도로 사용함을 특징으로 한다.

항당뇨 의약용도, 항당뇨 활성 기능, 인삼

Description

20-Ｏ-β-Ｄ-글루코피라노실-20(Ｓ)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceuticul compositions for the prevention and treatment of diabetes comprising 20-0-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol}

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질의 항당뇨 활성을 나타낸 그래프로서,
Protopanaxadiol(PPD) 계열, Protopanaxatriol (PPT) 계열 및 IH-901의 insulin 분비량을 비교한 결과를 나타낸 그래프
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질의 항당뇨 활성을 나타낸 그래프로서,
RIN-m5F cell line과 pancreatic islet에서 용량 의존적으로 insulin 분비를 촉진하는 것을 보여주는 그래프
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질의 항당뇨 활성을 나타낸 그래프
IH-901의 insulin 분비 촉진 기전을 diazoxide를 이용하여 실험한 결과 ATP sensitive K⁺ channel을 차단하는 것으로 추측되는 결과를 보여주는 그래프
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질의 항당뇨 활성을 나타낸 그래프
간세포에서 당 신생과 관련된 효소의 mRNA level을 측정한 결과 그래프
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질의 항당뇨 활성을 나타낸 그래프로서,
db/db 마우스에 IH-901을 2주간 투여한 후 당부하 시험을 실시하여 얻은 결과 그래프

통상적으로, 인삼은 2000여년 전 동양에서 가장 오래된 신농본초경에 상품으로 수재된 이래로 우리나라를 대표하는 자원 생약이라고 할 수 있다. 약성은 맛이 달고 약간 따듯하고 상, 중초 즉 폐화와 비에 작용하는 대보원기요약으로, 죽도로 껍질을 살짝 벗겨서 햇빛에 말린 것을 백삼, 수삼을 쪄서 말린 것을 홍삼이라고 한다.

인삼은 생리 활성 성분으로서 인삼 사포닌(ginsenoside), 폴리아세틸렌(polyacetylene), 항산화 활성을 갖는 페놀계 화합물, 면역조절 작용이 있는 산성다당체, 방사선 방어 작용이 있는 인삼 단백질, 정유 성분으로 향기 성분인 세스키텔펜(sesquiterpene) 화합물 등을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.

인삼의 주요 활성 성분으로 알려진 인삼 사포닌은 4환성의 담마렌(dammarane) 구조를 갖는 물질군으로, protopanaxadiol 그룹과 protopanaxatriol 그룹으로 대별할 수 있다. 지금까지의 연구에 의하면 protopanaxadiol 그룹은 주로 중추신경을 억제적으로 작용하여 최면 작용, 진정 작용, 혈압강하 작용 등의 약리 작용을 나타내며, 혈당강하 작용도 하는 것으로 보고된 바 있다. 반면, protopanaxatriol 그룹은 주로 중추신경에 흥분적으로 작용하여 항피로 작용, 두뇌기능 개선작용 등을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

최근에는 우리 인체의 장내에서 대사된 인삼 사포닌을 통한 혈중에 존재하는 활성 본체에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그중 인삼 사포닌 Rb₁의 장내 미생물 대사체인 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol(20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올)은 protopanaxadiol 그룹의 프로사포게닌(prosapogenin)으로 항암 및 억제 활성이 보고된 바도 있다.

한편, 당뇨병은 인슐린량의 부족으로 혈액 중의 포도당(혈당)이 정상인보다 그 농도가 높아져서 소변에 포도당을 배출하는 만성질환이다. 상기 인슐린은 췌장의 베타세포에서 분비되는 호르몬으로, 혈액 속의 당분(포도당)을 몸속의 여러장기 에서 이용할 수 있도록하여 혈당을 일정하게 유지하는 역할을 할 뿐만아니라 우리가 섭취하는 주요 영양소인 지질과 단백질 대사에도 중요한 역할을 수행한다.

경제발전과 생활양식의 변화로 우리 나라에서도 당뇨병이 점점 증가하고 있는데, 당뇨병 유병률(有病率)은 1970년에 약 1%미만으로 추정되던 것이 2001년 본인인지 당뇨병 유병률이 인구 1,000명당 25.65명(남자 26.72명, 여자 25.02명)으로, 의사진단 당뇨병 유병률이 인구 1,000명 당 25.52명(남자 26.25명, 여자 24.83명)으로 증가하였다. 연령별 유병률을 살펴보면 40세 이후 유병률이 급증하여 60 ∼ 69세에서 가장 높게 나타나고 있다.

상기 당뇨병은 췌장의 베타세포에서 만들어지는 인슐린의 부족과 인슐린의 작용이 장애를 받는 인슐린 저항성의 결과로 생기므로, 당뇨병 환자의 치료를 위해서는 환자의 인슐린 분비를 촉진하기 위한 메카니즘이 요구된다.

본 발명의 목적은 인체 내에 흡수시 인슐린 분비를 촉진하고 혈당 조절능을 발휘하여 당뇨병의 예방 및 치료에 효능을 가지는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 의약용도로 제공함에 있다.

본 발명은 인삼 사포닌 대사 생산물인 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 인슐린 분비 촉진 및 혈당치를 낮추기 위한 항당뇨 의약용도로 사용함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 또는 그 유사물을 유산균, 장내세균, 프레보테라속 S-1 균주, 글루코시다제 효소 중 어느 하나를 이용하여 대사시켜 전환한 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 인슐린 분비 촉진 및 혈당치를 낮추기 위한 항당뇨 의약용도로 사용함을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

<대사 생성물인 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올(이하, IH-901) 물질의 제조>

본 발명에 사용되는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질은 인삼 사포닌 대사 생산물로서, 진세노사이드 또는 그 유사물을 유산균, 장내세균, 프레보테라속 S-1 균주, 글루코시다제 효소 중 어느 하나를 이용하여 대사시켜 전환함으로써 제조할 수 있다.
(1) 진세노사이드 또는 그 유사물

삭제

상기 진세노사이드 또는 그 유사물로는 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야 인삼, 베트남 인삼 등 파낙스(Panax) 속 식물에서 추출된 인삼 추출 물질을 모두 포함한다.
(2) 유산균 또는 장내 세균을 이용한 제조

삭제

상기 진세노사이드 또는 그 유사물을 물에 현탁한 후 유산균 또는 장내세균을 넣고 일정 시간 이상 배양하여 대사 생성물로서 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올을 얻는 방법이다.

상기 유산균으로는 Bifobacterium KK-1, Bifidobacterium KK-2, Biofidobacterium K-103, Biofidobacterium K-506 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 장내 세균으로는 Prevotella oris, Fusobacterium K-60 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
(3) 프레보테라속 S-1 균주를 이용한 제조

삭제

상기 진세노사이드 또는 그 유사물을 첨가한 배지에 프레보테라속 S-1 균주를 배양하여 대사 생성물로서 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올을 얻는 방법이다.

(4) 글루코시다제 효소를 이용한 제조 방법

상기 진세노사이드 또는 그 유사물을 효소인 글루코시다제로 가수분해하여 대사 생성물로서 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올을 얻는 방법이다.

이 제조 방법에 사용되는 글리코시다제 효소는 모든 균주로부터 얻을 수 있으며, 상기 글리코시다제 효소에 의해 IH-901로 전환시키기 위하여 사용되는 출발물질도 모든 종류의 진세노사이드 또는 그 유사물이 이용될 수 있다.

이하, 균주로부터 얻은 글리코시다제 효소의 일종인 퓨조박테리아 베타-글리코시다제(Fusobacterial β-glucosidase) (이하, "β-glucosidase"라 약칭한다.)와 진세노사이드의 일종인 진세노사이드 Rb1을 예를 들어 IH-901을 제조하는 방법에 대하여 설명하기로 한다.

상기 β-glucosidase의 분자량은 4개의 동일한 서브유니트(80 kDa)를 가지며 320 kDa이다. 이 효소의 활성은 Ba⁺⁺, Fe⁺⁺에 의해 억제되며 시스테인(cystein)을 변형시키는 일부 물질에 의해 억제된다. 또한, 이 효소는 소포로즈(sophorose)를 강하게 가수분해하며, 다음으로 파라-니트로페닐 베타-디-글루코피라노시드(p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside: PNG), 세스쿨린(esculin)과 진세노사이드 Rb1이다. 이 효소는 IH-901을 20(S)-프로토파낙사디올[20(S)-protopanaxadiol]로 전환시키지 않고 진세노사이드 Rb1을 IH-901로 전환시킨다.

바람직하게, 이 효소는 다음과 같은 방법으로 얻을 수 있다. 우선 진세노사이드 Rb1을 대사시키는 박테리아인 퓨조박테리아 K-60(Fusobacterium K-60)을 사람 장 배설물로부터 분리하고, 분리된 퓨조박테리아 K-60으로부터 진세노사이드 Rb1 대사효소인 β-glucosidase를 정제하는 것에 의해 얻을 수 있다.

상기 정제에 부틸-T-토요펄(butyl-T-Toyopearl), 하이드록시애퍼타이트 울트라겔(hydroxyapatite ultragel), Q-세파로스(Q-Sepharose) 및 세파크릴 S-300 HR (Sephacryl S-300 HR) 컬럼크로마토그라피(column chromatography)를 이용하면 특이활성(specific activity)이 1.52 μmol/min/mg인 동일성을 갖는 효소를 정제할 수 있다.
<실시예>

삭제

(1) 진세노사이드 Rb1 대사활성 분석

1 mM 진세노사이드 Rb1 100㎕, 효소 100㎕와 50mM 포스페이트 버퍼(pH 7.0) 300㎕의 혼합용액을 37℃에서 1, 5, 12 시간동안 반응시켰다. 반응용액은 염상으로 pH 2가 되도록 조정하고 에틸아세테이트로 추출하여 농축하고 TLC로 분석하였다: TLC 플레이트, 실리카 겔 60F₂₅₄ (Merck Co., USA); 전개용매 CHCl₃-MeOH-H₂O (65:35:10 v/v, 하층). 플레이트에 MeOH-H₂SO₄(95:5 v/v)를 뿌려 염색하고 가열하였다. 염색된 TLC를 TLC 스캐너(Shimadzu model CS-9301PC, 일본)로 분석하였다.
(2) β-glucosidase 활성분석

삭제

1mM p-니트로페놀 β-D-글루코피라노시드(다른 기질들) 100㎕, 50mM 포스페이트 버퍼 300㎕, 효소 100㎕의 혼합용액을 쉐이킹 워터 배스(shaking water bath)에서 37℃에서 15분간 반응시켰다. 0.6N NaOH 500㎕를 넣어 반응을 중지시켰다. UV 스펙트로포토메터(Shimadzu UB-120-02, 일본)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 기질로 젠티오비오스(gentiobiose) (또는 cellobiose, larminarbiose, sophorse, esculin)를 사용한 반응은 끓는 물로 가열하여 반응을 중지시켰고 포도당은 다크비스트(Dahkqvist) 방법을 이용하여 측정하였다. 1 unit 효소활성은 표준분석조건에서 1분당 1.0mumole(p-니트로페놀)의 생산물을 만드는데 필요한 촉매의 양으로 규정하였다. 특이활성은 mg단백질당 unit로 규정하였다.
(3) 단백질 측정

삭제

단백질은 표준으로 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 이용하고 브래포드(Bradford) 방법으로 측정하였다.
(4) 퓨조박테리아 K-60으로부터 β-glucosidase의 정제

삭제

퓨조박테리아 K-60은 0.1% 아스코르빈산과 0.01% 소디움 티오글리콜레이트가 포함된 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth) 10L로 37℃에서 21시간동안 혐기배양하였고, 5000 rpm에서 30분간 원심분리하여 집균하였다. 진균된 세포를 저온의 50mM, pH 7.0 소디움 포스페이트 완충액으로 두 번 세척하고 동일한 완충액 150 ㎖에 부유시켰다. 부유된 세포를 얼음속에서 15분간 초음파 처리하였다(100 watt, 60% pulsed mode). 파괴된 세포를 12,000rpm에서 60분간 원심분리하고 그 상등액을 미정제 효소로 사용하였다. 미정제 효소를 70% 포화 암모늄 설페이트로 침전시켰고 12,000 rpm에서 60분간 원심분리하였다. 침전물을 1.5M 암모늄 설페이트가 포함된 50mM 소디움 포스페이트 완충액(pH 7.0) 70㎖에 부유시키고, 이 완충액과 같은 평형상태로 만든 후에 부틸 토요펄 컬럼(2.8×3.4cm)에 로딩하였다. 컬럼을 같은 완충액 120㎖로 세척하고 1.5M 암모늄 설페이트가 포함된 25mM 소디움 포스페이트 완충액(pH 7.0) 200㎖로 선형구배(linear gradient) 추출하였다. PNG 가수분해 β-glucosidase(52㎖, 8분액의 6.5㎖)가 포함된 활성분액을 모으고 pH 7.0, 50mM 소디움포스페이트 완충액 2L로 18시간 투석을 두 번하였다. 투석물을 pH 7.0, 50mM 소디움포스페이트 완충액과 평형상태로 만들고 하이드록시아파타이트 울트라겔 컬럼(2.8×2cm)으로 정제하였다. 선형구배의 50에서 250mM 소디움포스페이트 완충액 240㎖로 β-glucosidase를 용출하였고 효소분액(8분액의 32㎖)을 모아 pH 7.0의 10mM 소디움포스페이트 완충액 2L로 18시간 투석을 두 번 하였다. 투석물을 pH 7.0, 10mM 소디움포스페이트 완충액과 평형상태로 만들고 Q-세파로스 패스트 플로우 컬럼(3×25cm)에 로딩하여 동일한 완충액으로 세척하였다. 10mM 소디움포스페이트 완충액(pH 7.0) 200㎖와 pH 7.0, 1.5M 포타슘클로라이드(분액부피 3.5㎖) 가 포함된 10mM 소디움포스페이트 완충액으로 선형구배 추출하였다. β-glucosidase가 포함된 활성분액(6 분액. 21㎖)을 모아 PM-10 멤브레인을 갖는 어드반텍 가압여과(Adventec Pressure Filtration)를 이용하여 4℃에서 9psi로 1.5㎖가 되도록 농축하였다. 농축된 용액을 pH 7.0 10mM 소디움포스페이트 완충액과 평형상태로 만들고 세파실 S-300 HR 컬럼(2.6 x 70cm)에 로딩한 후 용울하였다 (유량 0.5 ㎖/분; fraction volume 1.02㎖). 활성 분액(6분액의 6.12㎖)은 천연(native)과 변성(denatured) PAGE를 통해 동일한 β-glucosidase 였음을 확인하였다.
한편, 본 발명에서 20-0-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol 물질이 가지는 항당뇨 활성 및 기전을 검증하기 위하여 실시한 약리활성 실험 결과는 도 1 내지 도 5에 도시된 바와 같다.
<인슐린 분비 관련 실험>
1) RIN-m5F cell culture 방법

삭제

RIN-m5F cell(ATCC, passage number 8)을 10% fetal bovine serum과 1% pencillin/ streptomycin이 첨가된 RPMI-1640(2 mM L-glutamine, 1.5 g/l sodium bicarbonate, 4.5 g/l glucose, 10 mM HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂/O₂조건하에서 배양하였으며 subculture는 4 ~ 5일 간격으로 실시하였다.
2) Rat pancreatic islets 분리와 cell culture

삭제

Pancreatic islets은　Sprague-Dawley rat의 췌장에 collagenas가 포함된 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)을 주입하여 분리하고 37 ℃ water bath에서 10분 동안 incubation을 시켜준 후 차가운 5%의 FBS가 포함된 HBSS에 옮겨 islets을 잘 풀어 주었다. 1.037, 1.069, 1.085, 1.10 Ficol 농도 기울기에 islets을 가하여 2000 rpm, 4 ℃에서 20분 동안 원심분리를 하고 2와 3번째 층을 얻은 후 5%의FBS가 포함된 HBSS에 옮겨 1500 rpm, 4 ℃에서 1분 동안 원심분리를 하여 최종적으로 islets을 얻었다. 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI-1640 배지를 처리하여 37 ℃, 5% CO₂/O₂의 조건으로 1 ~ 2일 동안 incubation 시켰다.
3) 인슐린 분비능 측정

삭제

Pancreatic islets을 Krebs-Ringer buffer(KRB)로 2번 washing한 후 37 ℃에서 30분 동안 preincubation 하고　KRB를 제거한 후 11.1 mM glucose와 농도별 IH-901 (11.1 mM glucose를 포함한 KRB로 희석)을 함께 가한 후 37 ℃에서 60분 동안 incubation 시키고 3000 rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리를 하여 얻은 상등액을 eppendorf tub에 옮겨　rat insulin 측정 kit(Shibayagi, Japan)를 이용하여 ELISA reader로 450 nm에서 측정하였다. 한편 IH-901의 인슐린분비 촉진 기전을 알아보기 위한 실험에서는 ATP sensitive K⁺ channel opener인 diazoxide (0.5 mM)가 IH-901에 의해 촉진된 인슐린 분비가 억제하는지를 살펴보았다.
<간세포에서 당신생 관련 효소 전사에 미치는 영향 평가>
1) 세포배양

삭제

간 세포인 H4IIE 세포는 2.5% fetal calf serum, 2.5% newborn calf serum과 100 U/㎖의 항생제가 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 37 ℃ 온도 유지와 5% CO₂공급 조건하에 배양하였다.

세포는 24 well plate에 well당 4x10⁴씩 분주하며 IH-901을 처리하기 16시간 전부터 serum이 들어있지 않은 배지에서 배양하였다.

Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) 와 glucose 6-phosphatase (G6Pase) 유전자의 발현을 유도하기 위하여 0.1mM cAMP와 500 nM dexamethasone을 처리하였으며 발현량의 억제 활성을 확인 하고자 IH-901을　0.8 uM, 3.2 uM 농도로 첨가하였다.
2) RNA 분리 및 primer 신장

삭제

위의 방법으로 IH-901을 처리한 후 total RNA는 guanidine thiocyanate-water saturated phenol/chroloform 분리 방법을 이용하였다(Chomczynski and Sacchi, 1987). 물 층에 있는 total RNA는 이소프로판올을 이용하여 침전시켜 분리한 RNA는 260nm와 280nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. Total RNA 1㎍을 Moloney murine leukemia virus transcrptase와 random hexamer를 이용하여 역전사하였다.

Primer 종류는 다음과 같다: PEPCK의 주형사 서열은 ATG CCT CCT CAG CTG CAT A 비주형사 서열은 TTA CAT CTG GCT GAT TCT CTG TT, G6Pase (Glucose-6-phosphatase)의 주형사 서열은 ACC CTG GTA GCC CTG TCT TT, 비주형사 서열은 GGG CTT TCT CTT CTG TGT CG, CPN (Cyclophilin)의 주형사 서열은 ATG GTC AAC CCC ACC GTG, 비주형사 서열은 TTA GAG TTG TCC ACA GTC GGA GA 이다. Primer는 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM 각각 dNTP, 5 ㎕ cDNA 그리고 2.5 unit의 Taq DNA polymerase가 포함되어 있는 25 ㎕의 반응 용액에 최종 농도가 0.5 uM이 되도록 첨가하였다.

PCR 조건은 95 ℃에서 1분 동안 변성, 55℃에서 1분 동안 붙임 그리고 72 ℃에서 2분 동안 연장을 하여 총 30 cycle 하였다. RT-PCR은 0.5 ㎍/㎖ ethidium bromide로 염색된 1% agarose gel을 이용하여 100V에서 전기영동 하였다. CPN은 증폭된 유전자들의 대조군으로써 사용되었다. PCR 산물은 GS-700 이미지 농도계를 이용하여 발현 정도를 수치화하여 CPN과의 비로 표현하였다.
<실험용 쥐를 이용한 In vivo experiment>

삭제

9 주령의 db/db 마우스를 일본 SLC사(시즈오카)로부터 구입하여 본 실험실에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험군은 Diabetes control (DC), 5, 10, 20 mg/kg의 농도로 IH-901 투여군, positive control로는 metformin 300 mg/kg , pair fed군으로 나누었다. 약물은 경구 투여로 4주 투여 하였으며 매주 12 시간 절식하여 혈당을 측정하였으며 3일 간격으로 식이량, 음수량 그리고 몸무게를 측정하였다.

<혈액 지표 분석>

혈액 지표 분석을 위한 혈액 채취는 12(9:00 pm ~ 9:00 am) 시간 동안 절식 후 안와 정맥으로부터 혈액을 채취하여 5,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후, 혈장을 분석에 사용하였다. 혈중 포도당 농도는 glucose oxdiase method를 이용한 Trinder kit을 사용하여 측정하였고 혈장 insulin 농도는 anti-rat insulin antibody를 사용한 insulin enzyme immunoassay kit을 이용하여 측정하였다.
<Oral Glucose Tolerance Test(OGTT)>

삭제

4주 투여 후 12시간 동안 절식하여 각 군마다 glucose(1.5 g/kg)를 투여하고, 투여와 동시에 안와 채혈을 하고 계속해서 각각 30, 60, 90, 120분에 안와 채혈을 하여 혈당을 측정해 봄으로써 혈당변화를 관찰하였다.
<실험 결과>

삭제

IH-901의 insulin 분비 효과를 확인 하기 위하여 Protopanaxadiol(PPD) 계열, Protopanaxatriol (PPT) 계열 및 IH-901의 insulin 분비량을 비교한 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 IH-901이 가장 많은 insulin 분비 효과를 보여 주었으며, RIN-m5F cell line과 pancreatic islet에서 용량 의존적으로 insulin 분비를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 이어서 이러한 IH-901의 insulin 분비 촉진 기전을 diazoxide를 이용하여 실험한 결과 ATP sensitive K⁺ channel을 차단하는 것으 로 추측되는 결과를 확인할 수 있었다(도 3).

또한, 간세포에서 당 신생과 관련된 효소의 mRNA level을 측정한 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 IH-901 0.8, 3.2 uM의 농도에서 PEPCK는 각각 31%, 40%의 발현억제 효과를 보였으며, G6Pase는 각 농도에서 9%, 22%의 발현억제 효과를 보였다.

또한, 도 5는 db/db 마우스에 IH-901을 2주간 투여한 후 당부하 시험을 실시하여 얻은 결과로 A, C는 혈당수치를 B, D는 인슐린 수치를 나타낸다. A, B 그림에서 곡선하면적을 계산한 결과가 C, D이다. 도 5에 도시된 바와 같이 IH-901(그림에서 CK)은 인슐린수치는 대조군과 비교 시 큰 차이가 없으나 혈당치는 큰 폭으로 떨어져 혈당 조절능이 뛰어남을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 대사 생성물인 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 인체 내에서 인슐린 분비를 촉진하고 간세포에서 당 신생을 억제하여 혈당치를 큰 폭으로 낮추어 주는 약리활성을 통해, 당뇨병을 예방하거나 치료하는데 탁월한 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

Claims

인삼 사포닌 대사 생산물인 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올 물질을 인슐린 분비 촉진 및 혈당치를 낮추기 위한 항당뇨 의약용도로 사용함을 특징으로 하는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
진세노사이드 또는 그 유사물을 유산균, 장내세균, 프레보테라속 S-1 균주, 글루코시다제 효소 중 어느 하나를 이용하여 대사시켜 전환한 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올 물질을 인슐린 분비 촉진 및 혈당치를 낮추기 위한 항당뇨 의약용도로 사용함을 특징으로 하는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서,

상기 유산균으로는 Bifobacterium KK-1, Bifidobacterium KK-2, Biofidobacterium K-103, Biofidobacterium K-506 중 어느 하나 이상을 사용함을 특징으로 하는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서,

상기 장내 세균으로는 Prevotella oris, Fusobacterium K-60 중 어느 하나 이상을 사용함을 특징으로 하는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서,

상기 글루코시다제 효소가 모든 균주로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서,

상기 글루코시다제 효소가 퓨조박테리아 β-글리코시다제이고, 상기 진세노사이드가 진세노사이드 Rb1임을 특징으로 하는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서,

상기 퓨조박테리아 β-글리코시다제가 진세노사이드 Rb1을 대사시키는 박테리아인 퓨조박테리아 K-60을 사람 장 배설물로부터 분리하고, 분리된 퓨조박테리아 K-60으로부터 정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 20-0-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사다이올 물질을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.