BR112012008005B1 - composição compreendendo cepas de lactobacillus plantarum - Google Patents
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Abstract
CEPAS DE LACTOBACILLUS PLANTARUM COMO AGENTES HIPOCOLESTEROLÊMICOS. A invenção referese a uma composição que compreende uma quantidade eficaz de ao menos uma das cepas selecionadas a partir do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, e Lactobacillus plantarum CECT 7529. Essas novas cepas têm boas características probióticas e são úteis para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios cardiovasculares.
Description
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente europeia 09172613.3, depositado em 9 de outubro de 2009 e Pedido de Patente Provisória US No. 61/265.095 depositado em 30 de novembro de 2009.
[0002] A presente invenção refere-se aos campos de medicina, microbiologia e nutrição, e particularmente a novas cepas probióticas de Lactobacillus plantarum para uso na redução de colesterol.
[0003] Níveis de colesterol extremamente elevados (hipercolesterolemia) estão fortemente associados com doença cardiovascular porque eles promovem o desenvolvimento de ateroma nas artérias.
[0004] Os produtos alimentícios e produtos farmacêuticos hipocolesterolêmicos potenciais estão continuamente sendo desenvolvidos de modo a controlar o colesterol sérico em pessoas com níveis extremamente altos. Esses produtos farmacêuticos podem ser baseados na interrupção da circulação entero-hepática (EHC) de sais biliares. O metabolismo dos sais biliares e o metabolismo do colesterol estão intimamente ligados. Os sais biliares são os produtos finais excretados (solúveis em água) de colesterol e são essenciais para a emulsificação de gorduras no trato digestivo. Eles são sintetizados no fígado principalmente como glico ou tauroconjugados. Os sais biliares são secretados várias vezes ao dia (seis em média) no duodeno, e passam através do jejuno para o íleo. Durante o trânsito intestinal, a maior parte dos sais biliares é reabsorvida para retornar ao fígado via a veia porta. Uma pequena proporção é perdida dentro das fezes e essa perda é novamente sintetizada a partir do colesterol endógeno no fígado. Um aumento da quantidade de sais biliares que são perdidos dentro das fezes resulta em uma neossíntese aumentada de colesterol, reduzindo assim eficazmente a piscina de colesterol endógeno. Um grupo de fármacos hipocolesterolêmicos atualmente usados, chamados resinas (Colestiramina, Colestipol, Colesevelam), é ativo através desse mecanismo de ação.
[0005] À parte das tentativas farmacêuticas ou cirúrgicas de diminuir os níveis de colesterol sérico através da interrupção do EHC, sugeriu-se que a ingestão de certas células bacterianas deva também influenciar os níveis de colesterol. As bactérias intestinais podem influenciar os níveis de colesterol através da assimilação de colesterol exógeno a partir da dieta na membrana bacteriana ou através da desconjugação dos sais biliares. Durante o trânsito intestinal, os sais biliares passam por um número de transformações bacterianas das quais uma das mais importantes é a desconjugação dos sais biliares. A capacidade de desconjugar (ou hidrolisar) os sais biliares é encontrada em algumas espécies de bactérias do ácido lático intestinal (LAB), mas também em outros gêneros. Mediante a desconjugação dos sais biliares, a glicina ou taurina é liberada a partir da porção esteroide da molécula, resultando na formação de sais biliares livres (desconjugados). Os sais biliares livres são mais facilmente precipitados em baixo pH. Eles são também menos eficazmente reabsorvidos do que suas contrapartes conjugadas. Portanto, os sais biliares desconjugados são mais prontamente excretados dentro das fezes do que os sais biliares conjugados. A desconjugação dos sais biliares influencia o EHC pelo aumento da excreção de sais biliares e acredita-se que seja mais eficaz na redução dos níveis de colesterol no sangue do que a mera retenção de colesterol exógeno.
[0006] A hidrolase de sais biliares (BSH), a enzima responsável pela desconjugação de sais biliares durante EHC, foi detectada em várias espécies LAB nativas ao trato gastrointestinal. Tanaka e outros (ver "Screening of Lactic Acid Bacteria for Bile Salt Hydrolase Activity", Journal of Dairy Science 1999, vol. 82, pág. 2530 a 2535) examinaram mais de 300 cepas de LAB a partir dos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus e das espécies Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, e Streptococcus thermophilus. Os resultados obtidos para 273 cepas mostraram que a atividade de BSH é heterogeneamente distribuída entre as diferentes espécies. De acordo com esse estudo, quase todas as cepas bifidobacterianas têm atividade de BSH, sendo que essa atividade pode somente ser encontrada em cepas selecionadas de lactobacilos.
[0007] O Lactobacillus plantarum é um LAB aerotolerante Grampositivo geralmente encontrado em muitos produtos alimentícios fermentados bem como matéria vegetal anaeróbica. Ele também está presente na saliva (a partir da qual ele foi primeiro isolado). Cepas de L. plantarum são especialmente adequadas para a preparação industrial de produtos alimentícios fermentados graças a sua boa taxa de sobrevida através do processo industrial e do período de conservação, bem como a seu perfil de acidificação alto e boas propriedades organolépticas. Algumas cepas de L. plantarum são também consideradas como probióticas. Os probióticos são microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício à saúde do hospedeiro. Para ser chamada de probiótica, a bactéria deve preencher várias exigências relacionadas à sua ausência de toxicidade, viabilidade em alcançar o trato gastrointestinal inferior (GIT) e adesão à mucosa intestinal, entre outras. A maior parte das bactérias probióticas pertence ao grupo LAB, mas, no entanto, sabe-se que as características e benefícios probióticos são extremamente dependentes da cepa, mesmo entre LAB da mesma espécie.
[0008] A cepa comercial de L. plantarum 299v é geralmente considerada como probiótica e foi descrita como diminuindo os níveis de fibrinogênio e colesterol no soro quando ingerida na forma de uma bebida probiótica (ver Bukowska e outros, "Decrease in fibrinogen and LDL-cholesterol levels upon supplementation of diet with Lactobacillus plantarum in subjects with moderately elevated cholesterol" Atherosclerosis 1998, vol. 137, pág. 437 a 438). Entretanto, a redução do colesterol LDL foi muito moderada nesses estudos e foi acompanhada por uma redução branda similar de colesterol HDL. Nenhum dado relacionado à BSHA de L. plantarum 299v foi publicado.
[0009] É então desejável fornecer novas cepas probióticas aprimoradas a serem usadas como agentes hipocolesterolêmicos.
[00010] A presente invenção fornece novas cepas probióticas aprimoradas para a redução de colesterol no sangue e, consequentemente, para a prevenção e tratamento de distúrbios cardiovasculares.
[00011] Três novas cepas probióticas de Lactobacillus plantarum isoladas de fezes humanas são fornecidas pelos presentes inventores. As cepas revelaram ter atividade BSH surpreendentemente alta. Como mencionado acima, a relação próxima existente entre a alta atividade de BSH bacteriano e a redução de colesterol torna as presentes cepas úteis como agentes hipocolesterolêmicos. Os exemplos de trabalho abaixo demonstram que essas cepas têm atividade de BSH significativamente mais alta se comparada a cepas de L. plantarum comercialmente disponíveis relevantes, tal como L. plantarum 299v ou a cepa de L. plantarum que está presente na mistura probiótica comercial VSL#3. É também mostrado que as cepas da invenção são eficazes na redução de colesterol em cultura a partir de meio contendo colesterol solúvel. Mesmo que cada uma das novas cepas demonstre vantagens com relação às cepas conhecidas, essas vantagens são aumentadas quando as três cepas são usadas juntas, mostrando assim um comportamento sinérgico.
[00012] A atividade de redução de colesterol das cepas da invenção foi também demonstrada in vivo. O exemplo abaixo demonstra que um produto contendo as cepas probióticas da invenção é particularmente eficaz na redução de colesterol quando administradas a indivíduos hipercolesterolêmicos.
[00013] Consequentemente, um primeiro aspecto da invenção refere-se a uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de ao menos uma das cepas selecionadas a partir do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, e Lactobacillus plantarum CECT 7529, ou cepas mutantes das mesmas, sendo que as cepas mutantes são obtidas usando as cepas depositadas como material de partida e sendo que as cepas mutantes retêm ou ainda aprimoram a atividade de redução de colesterol das cepas de origem. Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma composição que compreende uma quantidade eficaz de ao menos uma das cepas selecionadas a partir do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, e Lactobacillus plantarum CECT 7529, sendo que as cepas mutantes são obtidas usando as cepas depositadas como material de partida e sendo que as cepas mutantes retêm ou ainda aprimoram a atividade de redução de colesterol das cepas de origem. Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma composição que compreende uma quantidade eficaz de ao menos uma das cepas selecionadas a partir do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, e Lactobacillus plantarum CECT 7529.
[00014] O termo "quantidade eficaz", como usado aqui, significa uma quantidade de um agente ativo alta o bastante para entregar o benefício desejado, mas baixa o bastante para evitar sérios efeitos colaterais dentro do escopo do julgamento médico.
[00015] Outra modalidade da presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, e Lactobacillus plantarum CECT 7529 ou cepas mutantes desses, sendo que as cepas mutantes são obtidas usando as cepas depositadas como material de partida, e sendo que as cepas mutantes retêm ou ainda aprimoram a atividade de redução de colesterol das cepas de origem. Em uma modalidade particular, a composição da invenção compreende a uma quantidade eficaz de Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, e Lactobacillus plantarum CECT 7529.
[00016] Está claro que usando as cepas depositadas como material de partida, a pessoa versada na técnica pode repetidamente, por técnicas de mutagênese convencional ou reisolamento, obter mais mutantes ou derivados deles que retêm as características e vantagens descritas aqui. Consequentemente, o termo "um mutante desse" refere-se a cepas mutantes obtidas usando as cepas depositadas como material de partida, as ditas cepas mutantes retendo ou melhorando as propriedades de redução de colesterol das cepas de origem. A pessoa versada na técnica decidirá mediante o método adequado a ser empregado para determinar a atividade de redução de colesterol das cepas. Exemplos de métodos possíveis para medir essa atividade são mostrados nos exemplos abaixo.
[00017] As cepas desta invenção têm a vantagem de que elas são particularmente úteis como probióticos. Como mencionado acima, as bactérias probióticas devem preencher várias exigências relacionadas à ausência de toxicidade, viabilidade, adesão e efeitos benéficos. Essas características probióticas são dependentes da cepa, mesmo entre as bactérias da mesma espécie. Então, é importante encontrar essas cepas que têm um melhor desempenho em todas as exigências probióticas. Os exemplos abaixo demonstram que as presentes cepas têm excelentes características probióticas.
[00018] As cepas da invenção demonstraram que elas são altamente resistentes às condições do ambiente gastrointestinal de mamíferos (ambiente ácido, altas concentrações de lisozimas, sais biliares e peróxido de oxigênio), sendo assim capazes de sobreviver à passagem através do GIT. As cepas também têm boa adesão ao epitélio intestinal, o que permite que elas permaneçam no trato intestinal e exerçam seus efeitos probióticos. Quando comparadas com outras cepas comerciais, as cepas da invenção mostram uma melhor resistência às condições do GIT e maior capacidade de adesão. Adicionalmente, elas também demonstraram ser seguras, uma vez que não têm efeitos tóxicos, elas não levam a um aumento na translocação de LAB, nem facilitam a translocação enterobacteriana em mamíferos hospedeiros.
[00019] Ademais, as presentes cepas têm vários efeitos benéficos no hospedeiro. Em adição à sua atividade de redução de colesterol, elas beneficiam o equilíbrio da microbiota intestinal devido à sua atividade antagonista. O termo "atividade antagonista" refere-se à inibição do crescimento de bactérias gastrointestinais não benéficas pela atividade de bactérias probióticas. A condição de ter equilíbrio microbiano gastrointestinal inadequado é conhecida como disbiose e tem muitas consequências negativas para o ser humano. Mostra-se abaixo que as cepas têm uma capacidade maior de inibir o crescimento de cepas patogênicas quando comparadas a outras cepas comerciais de L. plantarum.
[00020] As cepas também produzem grandes quantidades de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA). A produção de SCFA a partir de fibras não digeríveis é uma interessante capacidade probiótica. Essa capacidade é desejável em um probiótico porque o SCFA produzido mostra várias propriedades benéficas no hospedeiro (ver Wong J., "Colonic health: fermentation and short chain fatty acids", J Clin Gastroenterol 2006, vol. 40, páginas 235 a 243). Dentre os SCFA, a produção de ácido propiônico e butírico são de maior interesse para o escopo da presente invenção. O primeiro tem um efeito antiinflamatório útil de modo a reduzir a inflamação sistêmica. A inflamação global tem uma incidência na aterogênese, que é um dos mais importantes fatores de risco cardiovascular (ver Naruszewicz M., "Potential parapharmaceuticals in the traditional Polish diet" 2005, Journal of Physiology and Pharmacology, vol. 56, suppl 1, pág. 69 a 78). O ácido butírico é geralmente conhecido como sendo benéfico para o epitélio colônico, uma vez que ele é a principal fonte de energia para células colônicas.
[00021] Ao exercer vários efeitos benéficos no hospedeiro humano, essas bactérias probióticas são úteis como agentes terapêuticos ou profiláticos. Particularmente, as cepas da presente invenção são eficazes na redução dos níveis de colesterol do sangue. Como explicado acima, os altos níveis de colesterol estão fortemente associados com doenças cardiovasculares porque eles promovem o desenvolvimento de ateroma nas artérias. Assim, as cepas da invenção são úteis para a prevenção ou tratamento de distúrbios cardiovasculares.
[00022] Consequentemente, outro aspecto da invenção está relacionado a uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de ao menos uma das cepas desta invenção, ou cepas mutantes dessas, para uso como um agente de prevenção e/ou terapêutico. Em uma modalidade preferencial, a composição da invenção é para uso na prevenção ou tratamento de distúrbios cardiovasculares em um animal, incluindo um ser humano. Em outra modalidade preferencial, a invenção fornece o uso da composição como descrita acima para a fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios cardiovasculares. Ela pode ser alternativamente formulada como um método para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios cardiovasculares em um animal, incluindo um ser humano, compreendendo administrar ao dito animal em necessidade de tratamento uma quantidade eficaz da composição da invenção.
[00023] Em outra modalidade, a composição da invenção é usada como um agente hipocolesterolêmico. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o uso da composição como descrito acima para a fabricação de um medicamento para a redução de colesterol. Ela pode ser alternativamente formulada como um método para a redução de colesterol em um animal, incluindo um ser humano, compreendendo administrar ao dito animal em necessidade de tratamento uma quantidade eficaz da composição da invenção.
[00024] A composição da invenção pode ser administrada a indivíduos saudáveis bem como a pacientes que sofrem de um distúrbio coronário. Em uma modalidade particular, o indivíduo que recebe a composição da invenção sofre de hipercolesterolemia.
[00025] As composições probióticas da invenção têm a vantagem adicional de serem desprovidas de efeitos colaterais apresentados por esteróis vegetais, que foram descritos como sendo contraindicados em combinação com estatina em indivíduos hiperabsorvedores de esterol. A evidência recente sugere que o risco coronário residual visto com a monoterapia com estatina é uma consequência de estatinas realmente aumentando o risco coronário em pacientes que são hiperabsorvedores de esteróis, incluindo esteróis vegetais. A quantidade de indivíduos hiperabsorvedores de esterol está em torno de 25% da população e a maior parte deles mostrou conter polimorfismos no meio-transportador ABCG8 de cassete de ligação (ABC) ao adenosina-5'-trifosfato (ATP) (Goldstein M e outros, "Statins, plant sterol absorption, and increased coronary risk". Journal of Clinical Lipidology, 2008, vol. 2, pág. 304 a 305). Ademais, sugeriu-se que os efeitos do enriquecimento de esterol vegetal alimentício e terapia com estatina são aditivos em elevar os níveis de esterol vegetal nos tecidos e no sangue, e que esses são particularmente evidentes em hiperabsorvedores de esterol. A composição probiótica da invenção não tem essas desvantagens e pode ser administrada a qualquer população e em combinação com cepas ou qualquer outro fármaco de redução de colesterol.
[00026] Assim, em uma modalidade particular, a composição da invenção é administrada a indivíduos hiperabsorvedores de esterol. Em outra modalidade particular, a composição da invenção é administrada em combinação com uma estatina.
[00027] As cepas da invenção também promovem efeitos imunomoduladores no hospedeiro, uma vez que eles induzem um padrão de citocina aprimorado a partir da mucosa intestinal. Esses efeitos imunomoduladores são benéficos ao hospedeiro porque eles ajudam a alcançar uma resistência aumentada a doenças e risco diminuído de alergias. Sabe-se que as bactérias Gram-positivas que vivem no GIT mostram a molécula LPS (lipo-polissacarídeo) em sua superfície celular, o que induz a produção de marcadores inflamatórios a partir das células da mucosa intestinal. A suplementação probiótica pode mudar essa situação para favorecer uma maior presença de bactérias Gram-positivas no GIT (agrupadas no grupo de bactéria de ácido lático), com melhor adaptação ecológica ou com propriedades antagonistas contra alguns microrganismos Gram-negativos, reduzindo assim a presença de LPS na mucosa intestinal. No entanto, alguns microrganismos probióticos mostram a capacidade de modular por si mesmos a produção de citocinas, que são moléculas mensageiras que regulam as respostas inflamatória e imune no corpo. Particularmente, algumas bactérias probióticas induzem um melhor padrão equilibrado entre a sinalização pró/anti-inflamatória na mucosa intestinal (sem reduzir o número de bactérias Gram-negativas). Como mencionado acima, essa imunomodulação bacterianamente estimulada também tem um efeito antiaterosclerótico.
[00028] Como será ilustrado abaixo, concluiu-se que as cepas da invenção promovem por si mesmas uma redução dos níveis inflamatórios de fator de necrose tumoral α (TNF-α) e um aumento dos níveis de interleucina-10 (IL-10) anti-inflamatória produzidos por células de mucosa intestinal, induzindo assim um padrão de citocina aprimorado a partir da mucosa intestinal. Esse efeito imunomodulador é complementado pelas propriedades antagonistas da cepa em reduzir a presença de bactérias Gram-negativas patogênicas no GIT e diminuindo a quantidade de LPS na mucosa intestinal.
[00029] As composições de acordo com a invenção que compreendem uma quantidade eficaz de ao menos uma das cepas depositadas ou de seus mutantes podem ser formuladas como produtos farmacêuticos ou veterinários comestíveis, nos quais as ditas cepas são os únicos agentes ativos ou são misturadas com um ou mais outros agentes ativos e/ou são misturadas com excipientes veterinária ou farmaceuticamente aceitáveis (no caso de um produto farmacêutico ou veterinário) ou aditivos adequados (no caso de um produto comestível). Em uma modalidade particular da invenção, os produtos adicionalmente contêm um ou mais agentes ativos adicionais. Preferencialmente, o agente ou agentes ativos adicionais são outras bactérias probióticas. Dependendo da formulação, as cepas podem ser adicionadas como bactérias purificadas, como uma cultura bacteriana, como parte de uma cultura bacteriana, como uma cultura bacteriana que foi pós-tratada, e sozinha ou junto com carreadores ou ingredientes adequados. Os prebióticos também poderiam ser adicionados, dando origem a uma composição simbiótica. Em uma modalidade particular, as composições da invenção adicionalmente contêm um prebiótico selecionado a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos.
[00030] Em outro aspecto, a invenção fornece um produto farmacêutico e/ou veterinário que contém uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo ao menos uma das cepas depositadas ou cepas mutantes dessas, junto com quantidades adequadas de excipientes veterinária ou farmaceuticamente aceitáveis. Nesse aspecto, o produto farmacêutico pode ser preparado para ser administrado oralmente na forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, microcápsulas, grânulos, suspensões, xaropes, pósliofilizados, preparações líquidas, etc. A seleção dos excipientes e os métodos mais apropriados para a formulação em vista do propósito particular da composição estão dentro do escopo dos versados na técnica de tecnologia farmacêutica. Embora a administração oral seja preferencial, outras formas são possíveis, tal como a forma injetável, retal ou tópica.
[00031] O termo "farmaceuticamente aceitável", como usado aqui, pertence a compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos de um indivíduo (por exemplo, um ser humano) sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessiva, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação risco/benefício razoável. Cada carreador, excipiente, etc. deve também ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação. Os carreadores, excipientes, etc. adequados podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrão. Igualmente, o termo "veterinariamente aceitável" significa adequado para o uso em contato com os tecidos de um animal não humano.
[00032] As cepas da invenção podem também ser incluídas em uma variedade de produtos comestíveis, tal como produtos lácteos, iogurtes, coalhadas, queijos (por exemplo, coalhada, creme, processado, mole ou duro), leite fermentado, pó lácteo, produto fermentado à base de leite, sorvete, produto à base de cereal fermentado, pó à base de leite, bebida, tempero e ração. O termo "produto comestível" é usado aqui em seu sentido mais amplo, incluindo qualquer tipo de produto, em qualquer forma de apresentação, que pode ser ingerido por um animal, mas excluindo produtos farmacêuticos e veterinários. Exemplos de outros produtos comestíveis são produtos à base de carne (por exemplo, pasta de fígado, salsicha e linguiça ou pastas de carne), pastas de chocolate, recheios (por exemplo, trufa, creme) e coberturas, chocolate, doces (por exemplo, caramelo, fondants ou balas de caramelo), produtos assados (bolos, massas), molhos e sopas, sucos de frutas e branqueadores de café. Os produtos comestíveis particularmente interessantes são suplementos dietéticos e fórmulas infantis. No sentido da presente invenção, os suplementos dietéticos também incluem nutracêuticos, que são conhecidos como sendo extratos de alimentos que têm um efeito medicinal na saúde humana. As forragens para o alimento animal são também incluídas no escopo da invenção. As composições da invenção poderiam ser também usadas como um ingrediente em outros produtos alimentícios.
[00033] Consequentemente, em outro aspecto da invenção, um
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- Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de pelo menos uma das cepas selecionadas do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, e Lactobacillus plantarum CECT 7529 para uso como um agente de prevenção e/ou terapêutico.
- Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz das cepas Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, e Lactobacillus plantarum CECT 7529.
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