KR100774969B1 - 콜레스테롤 흡수 억제 및 혈중 지질 개선을 통한 동맥경화예방 락토바실러스 플랜타럼 케이8 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 콜레스테롤 수송단백질인 에이비씨에이1 수송단백질 (ABCA1) 발현을 유도하는 젖산균인 락토바실러스 플랜타럼 K8에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 에이비씨에이1 수송단백질을 발현을 유도하여 이들의 작용으로 장관에서 콜레스테롤 흡수를 억제하고 혈중 HDL 지단백을 높이고 LDL 지단백을 낮춰 혈중 지질을 개선할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 균주 또는 파쇄물, 또는 균주를 배양한 배양물이나 발효식품을 섭취하였을 때, 혈중 콜레스테롤 저하 및 혈중 지질 개선을 통하여 동맥경화를 예방할 수 있다.

에이비씨에이1, 락토바실러스 플랜타럼 K8, 콜레스테롤, HDL 지단백, 동맥경화

Description

콜레스테롤 흡수 억제 및 혈중 지질 개선을 통한 동맥경화 예방 락토바실러스 플랜타럼 케이8 {Lactobacillus plantarum K8 preventing atherosclerosis by inhibiting absorption of cholesterol and improving the profile of lipid in blood}

도1은 락토바실러스 플랜타럼 K8 및 젖산균이 장관 상피세포 (Caco-2)에서 에이비씨에이1 수송단백질 발현 정도를 보여주는 그림이다.

도2는 락토바실러스 플랜타럼 K8 및 젖산균 장관 상피세포 (Caco-2)에서 콜레스테롤 역수송을 반증하는 콜레스테롤 유출을 유도하는 정도를 비교한 그림이다.

도3은 고지방 식이를 투여한 마우스에서 락토바실러스 플랜타럼 K8이 혈중 총 콜레스테롤이 미치는 영향을 보여주는 그림이다.

도4는 고지방 식이를 투여한 마우스에서 락토바실러스 플랜타럼 K8이 혈중 트리글리세라이드에 미치는 영향을 보여주는 그림이다.

도5는 고지방 식이를 투여한 마우스에서 락토바실러스 플랜타럼 K8이 혈중 HDL 및 LDL 지단백에 미치는 영향을 보여주는 그림이다.

도6은 고지방 식이를 투여한 마우스에서 락토바실러스 플랜타럼 K8이 장관 상피조직에서 에이비씨에이1 수송단백질 발현을 유도하는 정도를 보여주는 그림이다.

본 발명은, 콜레스테롤 수송단백질인 에이비씨에이1 단백질 (ABCA1) 발현을 유도하는 젖산균에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장관에서 콜레스테롤 흡수를 억제하고 혈중 HDL 지단백을 높이고 LDL 지단백을 낮춰 혈중 지질을 개선을 통하여 동맥경화를 예방할 수 있는 락토바실러스 플랜타럼에 관한 것이다.

콜레스테롤은 세포를 구성하는 필수성분으로 세포의 성장, 분화 및 발육에 중요한 역할을 한다. 혈중 콜레스테롤의 양이 높을 경우 혈관 벽에 지방과 더불어 마크로파지, 거품세포 등이 생성, 침착되고 플라크(plaque)를 형성하여 혈액 순환을 저해하는 동맥경화증세가 오기 쉬운 것으로 알려져 있다 (Ross, R., Nature 362:801-809(1993)). 따라서, 이러한 콜레스테롤의 계속적인 축적은 결국 동맥을 폐쇄하고, 여러 가지 심장질환과 협심증 등 심각한 심혈관계 질환을 초래한다. 음식물로부터 섭취된 콜레스테롤(이하 "식이 콜레스테롤"이라 함)과 심혈관계 질환의 관계에 대한 LRH-CPPT (The Lipid Research Clinics-Coronary Primary Prevention Trial) 연구결과 (The Lipid Research Clinic Program, J. Am. Med. Assoc., 251:365(1984))와 헬싱키 심장 연구(Helsinki Heart Study) 결과 (Frick, M.H. et al., N. Eng. J. Med., 317:1237(1987))에 따르면, 식이 콜레스테롤의 섭취가 1% 정도 감소되면 심혈관계질환이 2% 정도 감소된다고 한다. 식이 콜레스테롤은 주로 간, 소장 등에 의해서 합성되는 내인성 콜레스테롤과 함께 혈액 속을 순환하는 콜레스테롤의 준위에 기여한다. 따라서 콜레스테롤의 흡수 효율은 혈장의 콜레스테롤 준위에 중요한 요소로 작용하고 또한 이는 동맥경화를 비롯한 심혈관계 질환의 발생에 관여하여 위험요소로 작용한다.

역학조사 결과에 의하면 높은 수치의 LDL 지단백과 낮은 수치의 HDL 지단백이 동맥경화의 주요 원인으로 밝혀졌다. 또한 최근 LDL 지단백을 낮추는 스타틴 계열의 약제 사용으로 사망률과 질병 발생을 줄일 수 있었다. 그러나 LDL 지단백이 낮은 경우에도 여전히 동맥경화에 의한 여러 질병과 합병증이 발생하고 있기 때문에 단순한 LDL 지단백을 낮추는 이상의 치료 및 예방 조치가 필요하며 HDL 지단백를 높이는 것이 적절한 병용 조치로 여겨지고 있다.

HDL 지단백는 여러 메커니즘을 통해 동맥경화 예방 효과를 나타내지만 말초조직, 특히 혈관의 동맥경화 병변 조직에서 콜레스테롤을 간, 부신 및 호르몬을 생산하는 장기 등으로 운반하는 역수송 (reverse cholesterol transport)의 중요한 역할을 통해 동맥경화를 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다. 고콜레스테롤혈증 (hypercholesterolemia)에서 동맥 혈관벽의 마크로파지는 산화된 LDL을 포획하고 이로부터 유래한 콜레스테롤 에스터를 세포 내에 축적하게 된다. 이 중 일부는 27-하이드록스콜레스테롤로 전환되고 에이비씨1 수송단백질을 통해 ApoAI 또는 ApoE 단백질 수용체에 전달되어 HDL 지단백 전구체를 형성하며 이 후, 완전한 HDL 지단백으로 간으로 운반되고 포획 수용체 형태 BI (scavenge receptor type BI, SR-BI)에 의해 간에 흡수, 제거된다.

식품 스테롤과 스탄올은 동물성 콜레스테롤과 유사하여 장관에서 콜레스테롤과 경쟁하여 흡수를 억제하며 따라서 콜레스테롤 저하효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 경쟁은 콜레스테롤과 식물 스테롤을 같이 섭취하였을 때만 나타나야 하지만 한 번만 섭취하여도 같은 효과가 있음이 알려졌다. 이러한 결과는, 식물 스테롤 등이 대장 상피세포주 (CaCo-2)에서 에이비씨에이1 수송단백질의 발현을 유도하여 콜레스테롤 역수송에 의하여 콜레스테롤 흡수를 상쇄하고 장관 HDL 지단백의 수치를 높여주기 때문이다 (Plat, J. et al., FASEB. 16:1248(2002)).

발효유제품의 콜레스테롤 저하 효과가 보고되었으며 혈중 콜레스테롤의 함량을 저하시키는 젖산균으로 스트렙토코커스 써머필러스 (Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 엑시도필러스 (Lb. acidophilus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 등이 알려져 있다 (정후길 등, 식품산업과 영양, 5:29 (2000)). 이러한 발효유제품과 젖산균은, 우유에 존재하거나 젖산균 발효에 의해 생성된 대사산물에 의한 콜레스테롤 생합성 경로의 속도 결정 단계의 효소인 HMG-CoA reductase의 활성 저해, 콜레스테롤 산화효소 등을 생산하는 젖산균에 의한 콜레스테롤 분해, 젖산균이 콜레스테롤을 균체 내에 축적하여 흡수 억제, 콜레스테롤 흡수에 도움을 주는 담즙산을 대사하여 혈중 콜레스테롤을 저하하는 것으로 알려져 있다. 따라서 식이 콜레스테롤과의 경쟁 또는 흡착, 대사를 통한 젖산균의 혈중 콜레스테롤 저하는 식이와 함께 섭취해야 하는 단점이 있다.

따라서 본 발명의 목적은, 에이비씨에이1 수송단백질의 발현을 유도하여 콜레스테롤의 흡수를 억제할 뿐만 아니라, 장관 상피세포 및 혈관의 마크로파지에서 콜레스테롤 역수송을 통해 HDL 지단백 수치를 높여 혈중 지질 개선을 통하여 동맥경화를 예방할 수 있는 젖산균 (락토바실러스 플랜타럼 K8)을 제공하는 것이다. 이러한 에이비씨에이1 수송단백질 발현 유도를 통한 동맥경화 예방은 식이와 함께 섭취해야 하는 제약을 극복할 수 있을 뿐만 아니라 젖산균의 정장작용을 기대할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 플랜타럼 K8을 이용하여 제조한 발효식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 플랜타럼 K8을 이용하여 제조한 건강기능성식품을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 김치로부터 분리한 젖산균 중에서 장관 상피세포에서 에이비씨에이1 수송단백질 발현을 유도하는 젖산균을 선발하였다. 본 발명에서 선발한 락토바실러스 플랜타럼 K8이 가장 많이 발현을 유도하였으며 파쇄물에서 효과가 더 좋았다. 이는 젖산균의 세포벽이나 세포질 성분이 발현에 관여하며 파쇄에 의해 상피세포에 보다 용이하게 작용할 수 있게 되었기 때문으로 생각된다. 이 젖산균에 대해서 장관 상피세포와 마크로파지에서 콜레스테롤 역수송을 반증하는 콜레스테롤 유출 (cholesterol efflux)을 증가시킴을 확인하였으며 에이비씨에이1 수송단백질 발현 유도능과 비례하였다. 선발된 젖산균은 고지방 식이를 투여한 마우스에서 혈중 콜레스테롤과 LDL 지단백을 낮출 뿐만 아니라 HDL 지단백을 올리는 것을 확인하였다. 젖산균을 투여한 마우스의 장관 상피세포에서 에이비씨에이1 수송단백질의 발현을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 젖산균의 특성은 다음과 같다.

1. 균의 형태

MRS 한천평판배지에서37℃에서 2일간 배양하였을 때,

① 균의 형태: 단간균

② 운동성: 없음

③ 포자형성능: 없음

④ Gram staining: 양성

2. 생리적 특징

① 15℃에서 생육: ＋

② 45℃에서 생육: ＋

③ 젖산 생산 및 형태: DL형 젖산

④ 당발효 시험

아미그달린:＋

아라비노스:＋

셀로바이오스:-

에스큘린: ＋

글루코네이트:

만니톨:＋

멜레지토스:＋

멜리바이오스:＋

라피노스:＋

리보스:＋

솔비톨:＋

설탕:＋

자일로스:-

이와 같은 균의 형태적, 생리적 및 생장 특성에 근거하여 본 발명의 균주는 락토바실러스 플랜타럼 K8로 명명하였다. 본 발명의 균주는 2006. 1. 20일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다 (기탁번호: KCTC10887BP).

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

실시예 1

장관 상피세포 (CaCo-2)에서 에이비씨에이1 수송단백질 발현 확인 시험

CaCo-2 세포주를 10% (부피/부피) 소 태아 혈청을 첨가한 둘베코 변형 배지 (Hyclone)에서, 젖산균은 MRS 배지 (Difco)에서 배양하였다. 젖산균은 배양 후, 수확하여 식품공전 상의 젖산균수 확인방법에 따라 BCP 첨가 평판측정용 배지에서 균수를 확인하였으며 열처리 (70℃, 30분)하여 사균체를 준비하였으며 세포파쇄기 (Stansted Fluid Power Ltd.)를 사용하여 25,000~30,000 psi 압력으로 파쇄하여 파쇄물을 준비하였다. 상피세포를 심은 웰에 젖산균 10⁸ colony forming unit (cfu)를 12시간 처리하였다. 대조군 및 젖산균을 처리한 상피세포에서 TRIzol (GIBCO BRL)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에서 에이비씨에이1 수송단백질의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위하여 SYBR green (Applied Biosystem)을 이용한 real-time PCR (Applied Biosystem)을 수행하였다. 대조군과의 비교를 위하여 항시 발현하는 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA의 양으로 평균화하여 대조군을 1로 하여 비교하였다. TRIzol, SYBR green 및 real-time PCR은 제조업체의 사용법을 따랐다.

비교예 1

상기 실시예와 동일한 방법 및 조건으로 발효 유제품의 제조에 사용하는 Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Lactobacillus casei의 에이비씨에이1 수송단백질 발현 유도를 확인하였다. 실시예 1 및 비교예 1의 결과를 도1에 나타내었다.

실시예 2

젖산균의 콜레스테롤 역수송 유도를 확인하는 실험 (Cholesterol efflux)

젖산균이 실제로 장관 상피세포 및 마크로파지 내의 콜레스테롤을 ApoAI 수용체 단백질을 통하여 HDL 지단백을 형성하고 세포 밖으로 유출하는 콜레스테롤 역수송을 유도하는 지 확인하였다. 웰당 50내지 60%가 덮이도록 장관 상피세포와 마크로파지를 접종하고 하룻밤 배양하였다. 배지를 교환하고 동위원소 (³H)로 표지된 콜레스테롤을 웰당 2μCi를 첨가하고 24시간 배양하여 세포 내에 축적하도록 하였다. 배지 중의 표지된 콜레스테롤을 phosphate-buffered saline (PBS) 용액로 세척하여 제거하고 소 태아 혈청 대신 0.2% (중량/부피) bovine serum albumin을 첨가한 둘베코 변형배지 (Hyclone)에서 12시간 배양하였다. 이 때, 웰당 젖산균 10⁸ cfu를 처리하여 에이비씨에이1 수송단백질의 발현을 유도하였다. PBS로 세척한 후, 콜레스테롤의 수용체인 ApoAI 단백질을 10 ㎍/㎖이 되도록 첨가하고 8시간 배양하였다. 에이비씨에이1 수송단백질의 ApoAI으로의 역수송으로 배지 중에 유출된 표지된 동위원소의 양과 세포 내에 남아있는 표지된 콜레스테롤의 양을 liquid scintillation counter로 측정하였다. 유출된 콜레스테롤의 양을 배지 및 세포 내 콜레스테롤의 양으로 나누어 콜레스테롤 역수송 정도를 비교하여 도2에 나타내었다.

실시예 3

고지방 식이로 유도된 마우스의 혈중 콜레스테롤의 저하 효과 및 HDL 지단백 상승효과

마우스(C57BL/6, 5주령, 수컷, 대한바이오링크)를 일반 고형 사료로 1주일간 예비 사육하여 적응 기간을 거친 후, 정상식이군, 고지방식이군, 락토바실러스 플랜타럼 K8 투여 고지방식이군으로 각 군당 8마리씩 분류하였다. 고지방 식이는 AIN-76 식이 조성을 참고로 하여 표 1과 같이 조성하고, 물과 함께 자유롭게 섭취하도록 하였다. 락토바실러스 플랜타럼 K8은 MRS 배지 (Difco, USA)에서 배양하여 회수하였으며 여기에 냉동보호제 (탈지분유), 설탕, 카복시메틸 셀루로스 소디윰 염 수용액에 현탁하고 냉동건조하여 젖산균 분말을 제조하였다. 이렇게 제조된 젖산균 분말은 식품 발효를 위한 종균 및 건강기능성 식품 제조에 사용할 수 있다.제조된 젖산균 분말을 멸균생리식염수에 현탁하여 브로모 크레졸 퍼플 첨가 평판측정용 한천배지에서 37℃에서 2일간 배양하여 나온 집락의 수를 계수하였다. 락토바실러스 플랜타럼 K8 10⁶ cfu를 하루 1회 강제 투여하였으며 대조군에는 젖산균 분말 제조에 사용한 부형제를 투여하여 4주간 사육하였다.

성 분	정상식이군 (중량%)	고지방식이군 (중량%)
카제인(Casein)	20.0	20.0
DL-메티오닌	0.3	0.3
수크로스	50.0	43.2
덱스트로스	15.0	15.0
알파셀(Alphacel)	5.0	5.0
AIN-76 미네랄 혼합물	3.5	3.5
AIN-76 비타민 혼합물	1.0	1.0
콜린 바이타르트레이트 (Choline Bitartrate)	0.2	0.2
옥수수 기름	5.0	5.0
돼지기름(Lard)		5.0
콜레스테롤		1.5
소듐 콜레이트 (Sodium Cholate)		0.3

사육이 끝난 마우스를 12시간동안 절식시킨 뒤, 디에틸 에테르로 마취시키고 심장으로부터 heparin 처리된 주사기를 이용하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액에서 8,000rpm, 15분간 원심분리하여 혈장을 분리하고 측정 전까지 -20℃에서 보관하였다. 총 콜레스테롤 함량, 트리글리세라이드 함량과 HDL 함량은 총콜레스테롤 측정용 시액 AM 202-K (아산제약주식회사, 대한민국), 중성지방 측정용 시액 AM 157S-K (아산제약주식회사, 대한민국), 에취디엘 콜레스타제 AM 203-K (아산제약주식회사, 대한민국)를 사용하여 측정하였으며 도3, 4, 5에 나타내었다. LDL 함량은 Friedewald 식 총 콜레스테롤-(HDL+(트리글리세라이드/5))에 의하여 구하였다 (Friedewald et al., Clin. Chem. 1972. 18:499-502).

실시예 4

락토바실러스 플랜타럼 K8 투여에 의한 에이비씨에이1 수송단백질의 발현 확인

실시예 3의 마우스를 희생시킨 후, 장관 상피조직에서 실시예 1과 같은 방법으로 에이비씨에이1 수송단백질의 발현을 real-time PCR을 통하여 확인하였으며 정상식이군을 1로 하여 도6에 나타내었다.

이상의 설명 및 실시예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 K8은 고지방 식이에 따른 혈중 콜레스테롤 수치를 저하시킬 수 있다. 이러한 효과는 식이 콜레스테롤과 같이 섭취하여 단순히 섭치를 저해하는 것뿐만 아니라 콜레스테롤의 역수송에 기여하는 에이비씨에이1 수송단백질의 발현을 유도하여 지속적인 콜레스테롤 흡수 억제에서 기인하는 것이다. 또한 콜레스테롤 역수송을 통한 HDL 지단백의 상승을 기대할 수 있다.

그러므로 본 발명의 균주 또는 파쇄물, 균주를 배양한 배양물이나 발효식품은 음식 섭취와 별도로 한번의 섭취를 통해 콜레스테롤 저하 및 HDL 지단백 상승을 통해 동맥경화를 예방할 수 있다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 락토바실러스 플랜타럼 K8 KCTC 10887BP 균주 또는 그 파쇄물을 함유하는, 장관 상피세포에서 에이비씨에이1 수송단백질의 발현을 통한 콜레스테롤 흡수 억제 및 HDL 지단백 증진용 식품.
3. 삭제
4. 삭제

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