JP2013507332A - コレステロール低下剤としてのラクトバチルス・プランタルム菌株 - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、医学、微生物学、栄養学の分野に係り、特に、コレステロールの減少において使用するためのラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)の新規プロバイオティクス菌株に関する。
1.新規な菌株のインビトロでのコレステロール低下活性
本発明の菌株は乳児の糞便から分離され、下記の方法により、胆汁酸塩加水分解酵素(BSH)活性のスクリーニングにおける高いパフォーマンスで他の500菌株の中で選ばれた。選択された菌株は、明確なグラム+染色、並びに桿菌形態を示し、非芽胞形成性であった。菌株はブダペスト条約のもとColeccion Espanola de Cultivos Tipo(CECT、バレンシア大学、Edificio de investigacion, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot、バレンシア)に寄託された。対応する生存能力の証明書が発行され、菌株は以下のアクセッション番号を受け取った:ラクトバチルス・プランタルムCECT7527(この説明ではF2099とも命名)、ラクトバチルス・プランタルムCECT7528(この説明ではF3147とも命名)、及びラクトバチルス・プランタルムCECT7529(この説明ではF3276も命名)。CECTのエントリの日付は菌株F3276とF2099の対して2009年5月7日、菌株F3147に対して2009年7月15日であった。
菌株は5%CO2を含む空気中で30℃でMRS培地(pH6.4)で一晩培養した。インキュベーション後、培養液は108cfu/mlに標準化され、次の混合培養液が調製された:F2099+F3147、F2099+F3276、F3147+F3276、F2099+F3147+F3276。混合培養液は、構成菌株のそれぞれが同量、及び単一菌株培養液と同じ総細菌濃度が含まれた。単一菌株培養液及び混合培養液の両方がBSH活性についてアッセイされた。培養液は4%(w/v)のタウロデオキシコール酸(TDCA、Sigma、米国)のナトリウム塩、及び0.37g/lのCaCl2を添加したMRS寒天培地プレート上の滅菌紙ディスクの周りに含浸させた。プレートは嫌気的に72時間37℃でインキュベートし、ディスク周りの沈殿帯の直径が測定された。BSH活性は、阻害ゾーンの直径(IZD)からディスク径(DD)を減算し、式GI=(IZD−DD)/2に従って2者のこの差分を割ることによって算出した(表1参照)。
コレステロール低下試験は、水溶性コレステロールMRSブロスを用いて行った。上記で説明したように、単一菌株培養液及び混合培養液を調製した。水溶性コレステロール(ポリオキシエタニルコレステロールセバシン酸塩、Sigma、米国)は、0.45μmのミリポアを通じて濾過し、オートクレーブした0.05%L−システイン含有MRSブロスへ補充され最終濃度を300mg/mlとした。接種量は1mlのコレステロールMRSブロスあたり上記で得られた(108cfu/ml)細菌の培養液15μlであり、嫌気的に24時間、37℃でインキュベートされた。未接種MRSブロスも同じ条件でインキュベートされた。インキュベーション後、細菌細胞は遠心分離により除去され、L.プランタルムの培養上清及び未接種のコントロールはその後、自動分析装置(Olympus AU400)により、残りのコレステロール含量がアッセイされた。同じ実験が1%w/vの胆汁塩を含有するMRSブロス(SIGMA C4951由来の胆汁酸塩)中で実施されたが、この最後の組み合わせがより密接に腸内環境に似ているためである。これらのアッセイの結果を表2に見ることができ、未接種のコントロールに関するコレステロール低下の%として表されている。
分類学上の特性評価のために、本発明の菌株は、5%CO2を含む大気中で30℃でMRS培地(pH6.4)で一晩増殖させた。細菌は更に回収されて洗浄し、プレリシスバッファー(480μlのEDTA、50mM pH8.0、120μlのリゾチーム10mg/ml)に再懸濁され、更に60分間37℃でインキュベートした。DNAは、ウィザードのゲノムDNA精製キット(Promega)を用いて抽出した。前処理した細菌を2分間14000gで遠心分離して上清を除去した後は、プロメガのプロトコルに従った。簡単に言えば、細菌はNuclei Lysis Solutionに再懸濁され、5分間、80℃でインキュベートし、次いで室温まで冷却した。細胞溶解物を60分間37℃でのRNase溶液中でインキュベートし、タンパク質は、タンパク質沈殿溶液を添加して高速でボルテックスすることにより沈殿させた。試料は、冷却され、3分間15000gで遠心分離した。DNAを含む上清は清潔な1.5mlマイクロチューブへ移され、反転することでイソプロパノール600μlと混合した。DNAは15000gで2分間遠心分離によって収集し、注意深く上清を捨てた。DNAサンプルは70%エタノール600μlでチューブを数回穏やかに反転させることで洗浄した。エタノールは15000gで2分間遠心した後、吸引により除去した。最後に、DNAペレットを1時間、65℃でインキュベートすることにより、再水和液の100μl中に再懸濁した。サンプルは2〜8℃で保存された。
16S rRNAは、ユニバーサルプライマーEub27f及びEub1492rを用いてPCRにより増幅し、16S(1000以上のヌクレオチド)のほぼ完全なシーケンスの断片を生成する(表3)。その後、上述のように得られたDNAは、キットQuiaquick(Quiagene)を使用して洗浄した。
特性評価は、ゲノム消化及びパルスフィールド・ゲル電気泳動によって行った。F2099、F3147及びF3276菌株は、前述のプロトコルに供した (A.M. Rodasら、「ワインのラクトバチルス株の多相性研究:分類学的意味」Int J Syst Evol Microbiol 2005, 55巻, 頁197-207)。LP VSL#3及びLp299vは、コントロール株としてアッセイにも含まれた。全ての株はMRS寒天プレート上で成長させ、18時間、5%CO2、37℃でインキュベートされた。細胞は回収され8mlのPET(10mMトリス、pH7.6、1MのNaCl)中で3回洗浄され、その後、6000rpmで10分間遠心分離された。ペレットは700μlの溶解バッファー(6mMトリス、1MのNaCl、0.1MのEDTA、0.5%のSLS、0.2%デオキシコール酸、1mg/mlのリゾチーム、40U/mlのムタノリシン、20(g/mlのRNase)。1.6%の低融点アガロース(FMC BioProducts,Rockland,ME,米国)の等量が再懸濁した細胞に添加され、4℃で1時間で凝固された。インサートは、2mlの溶解バッファーII(0.5MのEDTA、pH9.2、1%のN−ラウリルサルコシン及び1mg/mlプロナーゼ)に移し、48時間50℃でインキュベートした。その後インサートはTEバッファー(10mMトリス、1mMのEDTA、pH8.0)で室温で洗浄した。全DNAの消化は、SFI−I及びSma−I制限酵素(ロシュ・ダイアグノスティックス社)により行った。
GITを通過するF2099、F3147及びF3276菌株の耐性を評価するために、哺乳動物の消化管の環境を模倣した条件下でアッセイが行われた。従って、リゾチーム、酸素、過酸化水素、酸性環境及び胆汁酸塩による処理後の生存が定量化された。結果は、Lp 299vおよびLp VSL#3で得られたものと比較した。
4.1粘液への付着
F2099、F3147及びF3276株の付着能力を市販の菌株のLP 299vのそれと比較した。
Caco−2 ECACC番号:86010202の細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手した。Caco−2細胞領域の単位面積当たりの付着細菌数を得るための実験手順は、上述のように粘液への付着に対するものと本質的に同じである。結果は、菌株F2099、F3147及びF3276の3.12×106cfu、2.11×106cfu及び5.19×105cfuはそれぞれ、2cm2のcaco−2細胞に結合可能であることを示し得る。再び、市販の菌株Lp 299vに比べて、本発明の菌株は優れた付着能力を持っている。
F2099、F3147及びF3276菌株の事前に固定した混合培養液(この混合培養はこれからAB−LIFEと呼ばれる)が、6匹の9週齢Wistarラット(オス及びメス)にPBS中5x1010cfu/kgで連続する2日間、総投与量1011cfu/kg投与された。動物には飼料(Teklacd2014)及び水を自由に与えた。投与は満腹以上食べた後であり、経口胃チューブにより補助された。同じ摂食レジメンはPBS単独を受けた6匹のコントロールラットに適用された。二日おきに、動物の幸福は体重、行動及び刺激への応答などのパラメータに値を割り当てることによって決定した。総得点は各パラメータにおいて得られた値の合計による:体重+動作+刺激に対する応答。まったく、動物の健康に対する悪影響は試験中に認められなかった。
菌株F2099、F3147及びF3276がアンタゴニスト活性を提示するかどうかを評価するために、キャンベルプロトコルがオキソイド培地中の細菌性病原体を接種した寒天プレートを用いて実施された。本研究で用いた病原体はヒトの消化管で一般的に存在するものの中から選ばれた(表11を参照)。プレートは均一に拭き取られ、5%CO2インキュベータ中、適切な温度でコンフルエンスまで増殖された。次いで、均一に播種されたシリンダ部、コンフルエントなF2099、F3147又はF3276寒天プレートは、病原体板の上にLoan-to-loanに置かれ、37℃で一晩インキュベートされた。
選択された粘膜のモデルは、(炎症反応の誘導原として)LPSのように菌体成分に感受性のため、及び抗炎症性サイトカインパターンの生産の誘導に適した培地中に分子が存在する場合、そのサイトカイン産生を調節するその感受性のため、単球細胞株THP−1である。
NS=((1−ILの値 24時間/ILの値 6時間)/24)×100;
ここで、NSは、正規化された勾配であり、IL(又はTNF−α)の値は6時間又は24時間の時点でのIL−10又はTNF−αの濃度である。結果は、pg/mlで表される。
プロピオン酸及び酪酸の産生をアッセイするため、本発明の菌株及びコントロールの菌株は、以下の繊維の各々の1%(w/v)を補充した基礎培地上で生育させた:イヌリン(SIGMA I2255)、ペクチン(SIGMA76282)とフラクトオリゴ糖(FOS)(SIGMA F8052)、これらは、毎日の食事において一般的に存在する繊維である。基礎培地の組成物は表13において見ることができる。培地は、嫌気性大気中にて12時間プレインキュベートされた。Lp株の各々を播種した後、培地は嫌気的条件下、37℃で一晩インキュベートした。一晩培養液は、その後遠心分離され、上清はその後のTracer Extrasil ODS2(3μm、15x0.4cm)逆相カラムを用いたAgilent 1100クロマトグラフによるHPLC分析のため素早く液体窒素で凍結された。試料中のプロピオン酸及び酪酸濃度に対する結果は表14に見ることができる。
高コレステロール血症被検体における本発明のプロバイオティクス組成物のコレステロール低下作用は、無作為化試験、二重盲検試験、プラセボ対照試験、並行した臨床試験で検討された。研究では、加えて、更なる心血管に関連するパラメーター、並びにプロバイオティクス組成物の耐用性 及びその官能特性を熟考した。
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Claims (15)
- ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)CECT7527、ラクトバチルス・プランタルムCECT7528、及びラクトバチルス・プランタルムCECT7529からなる群から選択される菌株の少なくとも一つの有効量を含む組成物。
- ラクトバチルス・プランタルムCECT7527、ラクトバチルス・プランタルムCECT7528、及びラクトバチルス・プランタルムCECT7529の有効量を含む、請求項1に記載の組成物。
- プロバイオティクスとして使用するための、請求項1−2の何れかに記載の組成物。
- 予防及び/又は治療薬として使用するための、請求項1−2の何れかに記載の組成物。
- 心血管疾患の予防及び/又は治療に使用するための、請求項4に記載の組成物。
- コレステロール低下剤として使用するための、請求項3−5の何れかに記載の組成物。
- スタチンと組み合わせた使用のための、請求項3−6の何れかに記載の組成物。
- ステロール過剰吸収性被験体において使用のための、請求項3−7の何れかに記載の組成物。
- 薬学的又は獣医学的に許容される賦形剤の適切な量と一緒に、請求項1−2の何れかに記載の組成物の有効量を含む薬学的及び/又は獣医学的製品。
- 他の食用成分の適量と一緒に、請求項1−2の何れかに記載の組成物の有効量を含む食品。
- 食事サプリメント(dietary supplement)である、請求項10に記載の食品。
- 栄養補助食品(nutraceutical)である、請求項11に記載の食品。
- 錠剤、カプセル剤、シロップ又は丸剤の形態である、請求項11−12の何れかに記載の食品。
- 乳製品又は肉製品である、請求項10に記載の食品。
- ラクトバチルス・プランタルムCECT7527、ラクトバチルス・プランタルムCECT7528及びラクトバチルス・プランタルムCECT7529からなる群から選択されるラクトバチルス・プランタルムの菌株。
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