KR100464642B1 - 락토바실러스 플란타룸 케이와이 1032 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus)속의 새로운 유산균인 락토바실러스 플란타룸 KY1032(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년 10월 2일, 수탁번호 : KCCM-10430)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 공역 리놀레인산을 다량으로 생성하는 락토바실러스 플란타룸 KY1032에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 락토바실러스 플란타룸 KY1032은 생리 활성이 뛰어난 공역 리놀레인산을 대량생산할 수 있는 효과가 있으며, 락토바실러스 플란타룸 KY1032 및/또는 그 배양물을 포함하는 발효제품은 생리활성이 뛰어난 효과가 있다.

Description

락토바실러스 플란타룸 케이와이1032{LACTOBACILLUS PLANTARUM KY1032}
본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus)속의 새로운 유산균인 락토바실러스 플란타룸 KY1032(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년 10월 2일, 수탁번호 : KCCM-10430)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 공역 리놀레인산을 다량으로 생성하는 락토바실러스 플란타룸 KY1032에 관한 것이다.
1986년에 경상대의 하영래 교수가 미국의 위스콘신 대학에서 발암성 물질을 조정하는 물질이 공역 리놀레인산인 것을 발견한 이후로 공역 리놀레인산에 대한 연구가 많이 이루어 졌다. 공역 리놀레인산은 천연의 다기능성 지방산으로서 항암성, 면역증강성, 항산화성, 항콜레스테롤성, 항곰팡이성, 동물 체지방 감소 효과 및 동물 생장 촉진 등의 효용성이 있다. 그리고 이러한 생리활성 효과가 밝혀지면서 공역 리놀레인산에 대한 수요가 높아지게 되었다. 미국의 시그마사(Sigma chemical, USA) 와 메트레야사(Matreya, Inc USA)에서는 고순도의 공역 리놀레인산과 그 이성질체를 연구용으로 판매하고 있으며 미국과 일본 독일 등 많은 나라에서 다이어트 용으로 판매하고 있다.
공역 리놀레인산은 octadecadienoic acid 의 positional(9,11; 10,12), geometric(c,t; t,c; c,c; t,t) isomer이다. 1987년 Ha 등은 c9,c11-, c9,t11-, t9,c11-, t9,t11-, c10,c12-, c10,t12-, t10,c12-, t10,t12-CLA의 8개를 종합적으로 CLA라 명명하였다.
그러나 최근 분석법의 발달로 낙농제품에는 8개 외에 t7,c9-, t7,t9-, t11,c13-, t11,t13-, c12,t14-, t12,t14-, t8,c10-, t8,t10-CLA가 추가로 발견되어 적어도 16개의 이성체를 함유하고 있음이 밝혀졌다.
공역 리놀레인산은 포유류의 반추위에서 생성되며 이들로부터 생성되는 우유와 치즈 같은 식품에 많이 함유되어 있다. 그러나 이러한 식품에 천연으로 존재하는 공역 리놀레인산의 양은 극히 적어서 상업적으로 이용하기가 어렵다. 따라서 상업적으로 이용되고 있는 대부분의 공역 리놀레인산은 리놀레인산으로부터 알칼리 이성화법(alkaline isomerization)에 의해 합성한 것들이다. 그러나 이렇게 합성된 공역리놀레인산은 여러 종류의 이성질체를 만들기 때문에 생리활성이 있는 것으로 밝혀진 이성질체를 따로 분리해 내야만 한다. 또한 우리 나라와 같이 합성된 공역 리놀레인산을 식품 첨가물로 허가하지 않은 나라에서는 식품이나 의약품으로 사용할 수 없게 되어있다. 공역 리놀레인산에 대해 수행되어져야 할 연구가 많이 있지만 가장 기본적인 것은 생리 활성이 있는 공역 리놀레인산을 안전하게 많이 생산해 내는 것이다. 따라서 국내는 물론 많은 외국의 연구 기관에서 미생물을 이용한 공역리놀레인산의 생산에 관심을 가지고 있다.
본 발명에서는 유제품에 사용하는 유산균 중에서 공역 리놀레인산을 많이 생성하는 유산균을 선발하여 최적 조건을 정립하였다. 이렇게 선발된 유산균을 발효유에 적용함으로써 고 기능성 발효유의 개발에 이용하려고 한다.
본 발명은, 종래의 유산균에 비하여 공역 리놀레인산을 다량으로 생성하는 락토바실러스 플란타룸 KY1032(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년 10월 2일, 수탁번호 : KCCM-10430)를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은, 락토바실러스 플란타룸 KY1032 및/또는 그 배양물을 포함하는 발효제품을 제공하는 것이다.
도1은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KY1032의 광학 현미경 사진.
도2는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KY1032의 온도별 pH변화 그래프.
도3은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KY1032의 온도별 성장 그래프(개체수).
도4는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KY1032의 온도별 성장 그래프(흡광도).
도5는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KY1032의 Free linoleic acid 농도별 성장 그래프(흡광도).
도6은 도5의 대조구로서, Free linoleic acid 대신 홍화유를 넣었을 때의 농도별 성장 그래프(흡광도).
본 발명에 의한 락토바실러스 플란타룸 케이와이1032(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년 10월 2일, 수탁번호 : KCCM-10430)는 공역 리놀레인산을 다량으로 생성하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 케이와이1032(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년 10월 2일, 수탁번호 : KCCM-10430) 및/또는 그 배양물을 포함하는 발효제품을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KY1032 균주의 특성은 다음과 같다. 당 이용성 실험은 표 1, 균주의 광학 현미경 사진은 도 1과 같다.
1. 균의 형태 : 막대형
2. 집락 색깔 : 우유빛의 둥근 환 모양
3. 생육 최적 온도 : 37℃
4. 운동성 : 없음
5. 그람 염색 : 양성
6. 카탈라제 : 음성
7. 산소 영향 : 내기 혐기성
[표 1] 당 이용성 실험
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예1]락토바실러스 플란타룸 KY1032 균주의 온도에 따른 pH의 변화
락토바실러스 플란타룸 KY1032의 온도별(32℃, 37℃, 40℃)로 500㎖ MRS 시험관에서 배양하였다. 이렇게 배양한 배양액의 pH를 시간대별로 측정한 결과, 표2와 같았으며, 표2를 그래프로 나타낸 것이 도2이다. 도2를 살펴보면, 시간이 경과함에 따라 pH가 낮아짐을 알 수 있었으며, 8시간 경과후에는 pH의 변동폭이 적었으며, 32℃에서 배양된 배양액은 37℃, 40℃에서의 배양액보다 pH가 높았다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸 KY1032는 배양 부산물로 산을 생성함을 알 수 있으며, 8시간이 경과한 후에는 세포의 증식이 활발하지 않으며, 적정 생육온도는 37℃ 내지 40℃인 것으로 판단됨을 알 수 있다.
[표 2]
[실시예2]락토바실러스 플란타룸 KY1032 균주의 성장곡선
락토바실러스 플란타룸 KY1032의 적정 생장온도를 알아내기 위해 온도별(32℃, 37℃, 40℃)로 500㎖ MRS 시험관에서 배양하였다. 이렇게 배양한 균을 시간대별로 ㎖당 개체수를 계수한 결과, 표3과 같았으며, 표3을 그래프로 나타낸 것이 도3이다. 또한, 시간대별 배양액의 600nm에서의 흡광도(OD)를 측정하여 그래프를 도시한 결과 도4와 같았다.
[표 3]
도3과 도4를 살펴보면, 락토바실러스 플란타룸 KY1032는 37℃에서의 활동이 가장 왕성하며, 8시간이 경과되면 균주의 개체수는 감소함을 알 수 있었으며, 균주에 의해 생성되는 부산물은 증가하고 있음을 알 수 있었다.
[실시예3]지방산 기질 농도별 균주의 성장장애
도5는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KY1032의 Free linoleic acid농도별 성장(흡광도 기준) 그래프(배양온도 37℃)이며, 도6은 도5의 대조구로서, Free linoleic acid 대신 홍화유를 넣었을 때의 농도별 성장(흡광도 기준) 그래프(배양온도 37℃)이다.
도5를 살펴보면, 락토바실러스 플란타룸 KY1032는 Free linoleic acid 농도가 높아짐에 따라 균주의 성장이 둔화되었으며, 농도 0.06%에서 가장 왕성한 성장을 하였다.
반면, 대조구인 도6에서는 홍화유의 농도에 따른 균주의 저항성(성장 저해)이 없었는데, 이는 일반 유지인 홍화유가 대부분 트리글리세라이드(triglyceride) 형태로 되어 있기 때문에 유리지방산과 같이 균체의 성장에 장애를 주지 않은 것으로 추정된다.
[실시예4]기질 농도별 공역 리놀레인산(CLA)의 생산 비교
공역 리놀레인산(CLA)으로의 전환율을 최대로 하는 기질농도를 알아보기 위해, 먼저 기질 농도별 공역 리놀레인산(CLA) 생산량을 알아보았다. 기질은 free linoleic acid이다.
공역 리놀레인산(CLA)을 생성하는 실험을 위해 먼저 락토바실러스 플란타룸 KY1032를 MRS 배지에 2회 계대 배양하였다. 이렇게 계대 배양한 균을 지방산을 농도별(0.03, 0.06, 0.12, 0.2%)로 넣은 MRS 시험관에 넣어 배양하였다. 37℃에서 배양하며 시간별(24, 48, 96시간)로 공역 리놀레인산의 양을 측정하였다.
공역 리놀레인산 측정은 가스 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 이를위한 측정 방법은 다음과 같다.
배양액을 5ml을 취하여 이소프로파놀과 헥산을 3:2로 혼합한 혼합액에서 잘 흔들어 추출한 후 상등액을 취하여 질소 가스로 말린 후 1노르말 황산으로 메틸레이션을 하였다. 이렇게 유도체화를 시킨 후에 헥산을 3ml 가하여 공역 리놀레인산을 추출한 후 가스 크로마토그래피를 이용하여 정량 분석하였다.
본 균주가 생성한 공역리놀레인산을 가스크로마토그래피로 정량 하였을 때 c9,t11-CLA, t10,c12-CLA 이성질체의 양은 표4와 같다. 락토바실러스 플란타룸 KY1032 균주는 지방산 기질을 0.2%로 넣어 주고 48시간 배양했을 때 가장 많은 공역리놀레인산을 만들었다. 생성량은 407.88mg/ℓ이다.
[표 4] 지방산 기질별, 시간별 공역리놀레인산 생성량 비교
(단위 : mg/ℓ)
[실시예5]기질 농도별 공역 리놀레인산(CLA) 전환율
기질 농도별 공역 리놀레인산(CLA)로의 전환율을 비교해 본 결과 표5와 같았다.
[표 5] 배양 후 48시간에서의 기질 농도별 전환율
표5를 살펴보면, 공역 리놀레인산의 생성량은 기질농도 0.2%일 때 가장 많았지만, 기질 농도별 전환율을 볼 때 기질 농도 0.06%일때 36.7%로 가장 큰 효율을 보인다. 여기에, 아래의 회수율을 확정하기 위한 실험에서의 회수율을 적용하면 기질농도 0.06%일 때, 공역 리놀레인산 전환율은 42.4%를 보였다.
**회수율을 확정하기 위한 실험
- sample을 취하여 methylation을 하고 이것을 GC로 분석하기까지는 많은 과정들이 필요하다. 이러한 과정에서 손실분이 생기게 된다. 본 실험에서는 이 손실분을 측정하여 회수율을 정하고자 한다.
- CLA standard (c-9,t11-CLA, Matreya, USA) 100ppm을 1㎖취하여 screw-cap test tube에 넣은 후 N2 로 용매를 날린다. → MethanolicH 2 SO 4 (0.1N) 3ml 씩 넣고 30초간 vortexing → Water bath(55℃)에서 10분간 반응 → 실온까지 냉각 후 hexane 3ml로 추출 (1분간 hand shaking) → Distilled water 3ml로 washing →sodium sulfate anhydrous로 drying → GC로 측정
- 3회 반복 실험 결과 28.21, 28.94, 28.40㎎/ℓ(평균 28.51㎎/ℓ)가 나왔다.
- 회수율 측정
100㎎/ℓ의 CLA standard를 1㎖취하여 나중에 3㎖의 hexane으로 희석하여 GC로 정량을 하였음으로 3배 희석을 한 것과 같다.
∴ Methylation을 마친 3㎖의 시료속에는 33.3㎎/ℓ농도의 CLA가 있는 것이다.
▶ 결론적으로 회수율은 다음과 같다.
∴ 따라서 GC정량을 한 후 곱해주어야 할 교정값은 다음과 같다.
이상과 같이 본 발명에 의하면, 락토바실러스 플란타룸 KY1032은 생리 활성이 뛰어난 공역 리놀레인산을 대량생산할 수 있는 효과가 있으며, 락토바실러스 플란타룸 KY1032 및/또는 그 배양물을 포함하는 발효제품은 생리활성이 뛰어난 효과가 있다.

Claims (3)

  1. 락토바실러스 플란타룸 케이와이1032(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년 10월 2일, 수탁번호 : KCCM-10430).
  2. 제1항에 있어서,
    공역 리놀레인산을 다량으로 생성하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 케이와이1032(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년 10월 2일, 수탁번호 : KCCM-10430).
  3. 락토바실러스 플란타룸 케이와이1032(기탁기관 : 한국미생물보존센터, 기탁일자 : 2002년 10월 2일, 수탁번호 : KCCM-10430) 및/또는 그 배양물을 포함하는 발효제품.
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