CN102229904A - 一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法，以植物乳杆菌CICC23138为出发菌株，0.9％的生理盐水活化后备用；按植物乳杆菌基础培养基的0.1％添加亚油酸，5％接种活化菌种，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为一级驯化菌株；然后按植物乳杆菌基础培养基的0.2％添加亚油酸，5％接种一级驯化菌株，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为二级驯化菌株；以此类推，以上一级驯化菌株为种子，进行逐级驯化，进行每一级驯化时，亚油酸添加量按0.1％的剂量递增，直至七级驯化后获得七级驯化菌株；脱脂乳中培养七级驯化菌株，活菌数≥1010个/ml为发酵成熟；将成熟的发酵菌种冷冻干燥制成发酵剂粉末。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法，具体涉及一种发酵亚油酸制备共轭亚油酸的发酵剂及其制备方法，属生物工程领域。
(二)背景技术
共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一类含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸，是近年人类发现的最重要的功能性油脂酸之一。CLA具有抗癌、减肥、抗动脉粥样硬化、防治糖尿病、调节血脂、增强机体免疫能力和促进生长等多种生理活性。c9，t11 CLA和t10，c12CLA是最具生理活性。然而，CLA的来源十分局限，仅在反刍动物的乳和肉产品中存在，而非反刍动物产品中含量极低。
目前，工业化生产的CLA产物是多种异构体的混合物，选择性差，质量难以保证，而且安全性受到质疑。但利用微生物转化法生产CLA反应条件温和，异构体组成较单一，利于产品的开发应用。人们将获得CLA的注意力更多地转向了可食用的微生物，特别是能转化生成CLA的乳酸菌发酵剂。因此，生物转化法生成CLA已成为研究热点。
本发明采用植物乳杆菌为出发菌株，经逐级递增浓度亚油酸富集培养、驯化，获得共轭亚油酸高转化率菌株，制备一种产共轭亚油酸微生物发酵剂。本发明方法制备的发酵剂为兼性厌氧菌，易培养，无毒，可食用，因此本产品具有较高的实用价值和应用前景。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：本发明中所涉及的百分比除另有注明之外为重量比，本发明的产品采用这样的方法来制备的：
1.发酵菌株的选择及培养基的制备
本发明选用植物乳杆菌CICC23138，购于中国工业微生物菌种保藏中心。
植物乳杆菌基础培养基为：蛋白胨10.0g、牛肉提取物10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖20.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸三胺2.0g、Tween-801.0mL、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.02g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1.0L，pH6.0～6.5，121℃灭菌20min。
2.发酵剂的制备过程
2.1出发菌株活化
分别量取0.9％的生理盐水10ml试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至30℃，将植物乳杆菌CICC23138安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。
2.2植物乳杆菌CICC23138驯化
量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，然后按基础培养基体积的0.1％添加亚油酸，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，按基础培养基体积的5％接种2.1步骤中已经活化的菌种，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为一级驯化菌株；然后量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，按基础培养基体积的0.2％添加亚油酸，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，按基础培养基体积的5％接种一级驯化菌株，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为二级驯化菌株；以此类推，以上一级驯化菌株为种子，接种量按基础培养基体积的5％，进行逐级驯化，进行每一级驯化时，基础培养基中的亚油酸添加量按基础培养基体积的0.1％的剂量递增，直至七级驯化，基础培养基中的亚油酸添加量达0.7％，结束七级驯化后获得七级驯化菌株。
2.3生产发酵剂的制备
首先配置10％的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入2％的液态甘油、2％低聚木糖、2％葡萄糖，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，分别按2％体积比例接种七级驯化菌株，37℃厌氧培养30——36小时，检测生产发酵剂活菌数，活菌数≥1010个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数＜1010个/ml，继续培养，直至达到1010个/ml。
2.4发酵剂粉末冻干菌剂的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制成发酵剂粉末冻干菌剂。
3.应用效果
下面通过具体实验来证明本发明专利的应用效果
采用植物乳杆菌CICC23138作为对照，培养基采用植物乳杆菌基础培养基添加不同浓度的亚油酸，厌氧发酵30小时后，通过紫外分光光度计检测培养基中共轭亚油酸含量，结果如表3-1。
表3-1本发明产品的应用效果
本发明产品与CICC23138相比，共轭亚油酸的转化率大幅度提高，当亚油酸底物浓度2.5g/L时，本发明产品转化率高达94％，因亚油酸对发酵菌种具有一定的抑制作用，故对照菌株CICC23138的转化能力随亚油酸底物浓度的增高而降低，当亚油酸底物浓度超过3.5g/L时，对本发明产品的菌株活力也有一定的抑制作用，最适底物浓度为2.5g/L。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述：
本发明的产品采用这样的方法来制备的：
1.发酵菌株的选择及培养基的制备
本发明选用植物乳杆菌CICC23138，购于中国工业微生物菌种保藏中心。
植物乳杆菌基础培养基为：蛋白胨10.0g、牛肉提取物10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖20.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸三胺2.0g、Tween-801.0mL、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.02g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1.0L，pH6.0～6.5，121℃灭菌20min。
2.发酵剂的制备过程
2.1出发菌株活化
分别量取0.9％的生理盐水10ml试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至30℃，将植物乳杆菌CICC23138安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。
2.2植物乳杆菌CICC23138驯化
量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，然后按基础培养基体积的0.1％添加亚油酸，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，按基础培养基体积的5％接种2.1步骤中已经活化的菌种，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为一级驯化菌株；然后量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，按基础培养基体积的0.2％添加亚油酸，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，按基础培养基体积的5％接种一级驯化菌株，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为二级驯化菌株；以此类推，以上一级驯化菌株为种子，接种量按基础培养基体积的5％，进行逐级驯化，进行每一级驯化时，基础培养基中的亚油酸添加量按基础培养基体积的0.1％的剂量递增，直至七级驯化，基础培养基中的亚油酸添加量达0.7％，结束七级驯化后获得七级驯化菌株。
2.3生产发酵剂的制备
首先配置10％的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入2％的液态甘油、2％低聚木糖、2％葡萄糖，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，分别按2％体积比例接种七级驯化菌株，37℃厌氧培养30——36小时，检测生产发酵剂活菌数，活菌数≥1010个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数＜1010个/ml，继续培养，直至达到1010个/ml。
2.4发酵剂粉末冻干菌剂的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制成发酵剂粉末冻干菌剂。
Claims (1)
1.一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法，其特征是：
1)以植物乳杆菌CICC23138为出发菌株，量取0.9％的生理盐水10ml试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至30℃，将植物乳杆菌CICC23138安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用；
2)量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，然后按基础培养基体积的0.1％添加亚油酸，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，按基础培养基体积的5％接种1)步骤中已经活化的菌种，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为一级驯化菌株；然后量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，按基础培养基体积的0.2％添加亚油酸，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，按基础培养基体积的5％接种一级驯化菌株，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为二级驯化菌株；以此类推，以上一级驯化菌株为种子，接种量按基础培养基体积的5％，进行逐级驯化，进行每一级驯化时，基础培养基中的亚油酸添加量按基础培养基体积的0.1％的剂量递增，直至七级驯化，基础培养基中的亚油酸添加量达0.7％，结束七级驯化后获得七级驯化菌株；
3)配置10％的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入2％的液态甘油、2％低聚木糖、2％葡萄糖，121℃灭菌20分钟冷却至37℃，分别按2％体积比例接种七级驯化菌株，37℃厌氧培养30——36小时，检测生产发酵剂活菌数，活菌数≥1010个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数＜1010个/ml，继续培养，直至达到1010个/ml；
4)将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制成发酵剂粉末冻干菌剂。
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