KR100417390B1

KR100417390B1 - 신규 미생물 비피도박테리움 브레베 ｌｍｃ7 비피더스균주, 동 균주를 이용한 공액이중결합 지방산의 생산방법및 동 균주를 이용한 발효유의 제조방법

Info

Publication number: KR100417390B1
Application number: KR10-2001-0038386A
Authority: KR
Inventors: 정수현; 김인환; 김영주; 정재홍; 윤칠석
Original assignee: 윤칠석
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2004-02-05
Also published as: KR20030002688A

Abstract

본 발명은 사슬내에 비공액이중결합(Unconjugated double bond) 구조를 지니는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 기질로 하여 공액이중결합구조로 전환하는 특성이 우수한 신규한 비피도박테리움 브레베 LMC7 균주 및 비피도박테리움 브레베 LMC7을 혐기적 또는 호기적 조건에서 배양하여 당해 배양물로부터 사슬내에 공액이중결합구조를 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 생산하는 방법을 개시한다.

본 발명의 균주는 공액이중결합구조로의 전환능이 우수하면서도 발효특성이 우수한 장점이 있어 각종 발효제품의 생산에 적합하다.

Description

신규 미생물 비피도박테리움 브레베 ＬＭＣ7 비피더스 균주, 동 균주를 이용한 공액이중결합 지방산의 생산방법 및 동 균주를 이용한 발효유의 제조방법{Novel Microorganism of Bifidobacterium breve LMC7 Bifidus strain, Method for Production of Conjugated Fatty Acid and Fermented Milk using Said Microorganism}

본 발명은 사슬내에 비공액이중결합(Unconjugated double bond) 구조를 지니는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 기질로 하여 공액이중결합구조로 전환하는 특성이 우수한 신규한 비피도박테리움 브레베 LMC7 균주 및 비피도박테리움 브레베 LMC7을 혐기적 또는 호기적 조건에서 배양하여 당해 배양물로부터 사슬내에 공액이중결합구조를 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 생산하는 방법에 관한 것이다.

공액이중결합을 지니는 대표적인 지방산인 CLA(Conjugated linoleic acids, 이하 CLA로 약칭한다)는 항암작용, 체지방감소 효과, 동맥경화증 예방 및 완화작용, 혈액내 토탈 및 LDL-콜레스테롤 및 TG를 낮춰주고, 당뇨병 치료효과 등의 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 지방산중 리놀레인산(Linolecic acid)은cis-9,cis-12 입체배치(configuration)에 이중결합을 가지고 있는 탄소수 18개의 지방산이며, CLA란cis혹은trans배열에 공액화 이중결합(conjugated double bonds)을 가지고 있는 리놀레인산의 위치적 및 형태적 이성체(positional and geometric isomers)를 일컫는 일반적인 명칭이다. 이들 CLA는 9, 11 위치 및 10, 12 위치에cis혹은trans배열을 취하며, 이들 중 영양·생리학적으로 생리활성을 나타내는 것은cis-9,trans-11 옥타데카디에노인산 및trans-10,cis-12 옥타데카디에노인산으로 알려져 있다.

또한 CLA는 천연적으로 식품에 미량 함유되어 있기도 한데, 특히 반추위 동물로부터 생산된 육류와 치즈 등 유제품에 함유되어 있다고 보고되고 있다(Fogerty, A.C., Ford, G.L. and Svoronos, D. 1988. Octadeca-9,11-dienoic acid in food stuffs and in the lipids of human blood and breast milk. Nutrition Reports International. 38:937-944 ; Lin, T.Y. Lee, F.J. 1997. Conjugated linoleic aicd as affecyed by food source and processing. Scientfic Agriculture. 45:284-295).

그리고 자연적으로 식품에 존재하는 CLA, 특히 반추동물이 생산하는 식품류에서 발견되는 총 CLA 중cis-9,trans-11 옥타데카디에노인산이 85∼95%를 차지하고 있다. 하지만 단위동물이 생산하는 축산물 즉 계란, 닭고기, 돼지고기, 메추리알, 개고기, 오리고기 등에는 CLA함유량이 거의 없는 경우가 많으며 간혹 함유되고있더라도 우유나 소고기에 함유된 양의 1/10이하의 극소량으로 존재할 뿐이다. 이러한 이유는 반추동물의 경우 Rumen 미생물인 부티리비브리오 피브리솔벤(Butyrivibrio fibrisolvens)에 의하여 CLA는 불포화 지방산인 리놀레인산이 수소첨가반응이 되는 과정 중의 대사산물로 형성이 되는데 단위동물의 경우는 이러한 기능을 담당하는 미생물 및 소화기관이 없기 때문이다. 하지만 이들 육류와 우유, 치즈 등의 공액이중결합 리놀레인산의 함량(0.55∼9.12 mg/g fat)은 극히 미량이므로 상기와 같은 기존의 식품 섭취를 통해서는 인체내에서 공액이중결합 리놀레인산의 우수한 생리활성을 기대하기는 어렵다

현재까지 CLA는 리놀레인산을 알칼리 촉매하에서 공액화하는 화학적 합성법(American Oil Chemists' Society Official Method Cd 7-58, pages 1-11, American Oil Chemists' Society, Champaign, III. 1973)에 의해 주로 생산되어 미국, 유럽등에서 건강 기능성 식품으로 섭취되고 있으나, 화학적 합성법에 의한 CLA는 화학적 합성이라는 점과 합성에 사용한 화학물질로부터 유래한 잔류물질 및 최종 생산물에 지방산화물이 높아서 식품에 직접 사용하기에는 문제가 있다.

한편 천연 CLA가 반추위 동물에서 유래한 편성혐기성 미생물(Butyrivibrio fibrisolvens)에 의한 리놀레인산의 수소화 과정중 대사산물로서 생성되는 것으로 알려진 후, 미생물에 의한 천연 공액이중결합 리놀레인산의 생산에 관한 관심이 증가되어 왔다. 하지만 이들 미생물은 생육에 고도의 혐기상태가 요구되어 배양이 어려운 단점이 있고, 생성된 CLA를 다른 물질로 전환시키기도 하며, 일부 균은 병원성균이라는 근본적인 문제점을 안고 있어 천연 공액이중결합 리놀레인산의 상업적생산에는 이용되고 있지 못한 실정이다.

이와 관련된 종래기술로는 미국 특허 5,856,194호 및 6,060,304호가 있고, 이들 특허에서는Lactobacillusstrain인Lactobacillus reuteriPYR8(ATCC55739)를 사용하고 있으나, 배양시 고도의 혐기상태가 요구되고, 산성 형태의 리놀레인산만을 기질로 사용하여야 하며, 적정 생육 pH도 7.5이상으로 높아서 발효요구르트 등(pH 5.3)의 생산에 상업적으로 적용할 수가 없는 한계가 지적된다.

또 다른 미국특허 5,770,247호는 리놀레인산 및 리놀레인산 함량이 높은 유지를 젖소사료에 1∼5% 첨가하여 천연 CLA함량이 높은 우유를 생산하는 방법을 개시하고 있으나, 전술한 바와 같이 이와 같은 불포화 지방산은 Rumen에서 미생물에 의한 생화학적 수소첨가반응에 의해 거의가 포화지방산으로 전환되므로 실제로 생산되는 우유의 지방산 조성 중 CLA가 함유되는 비율은 크게 증가될 수 없는 한계가 있다.

한편 비피더스균은 모유를 섭취하는 유아의 장내 미생물 중 최우세균으로 존재하며, 장내 미생물의 바람직한 균형 유지, 장내 유해균의 증식저지 등 우수한 정장효과를 나타내어 발효유제품에 사용되고 있으며, 보다 우수한 생리활성을 갖는 균주를 개발하는 것이 중요한 과제로 부각되고 있다. 현재 국내에서도 비피더스균이 나타내는 생리활성을 기대하기 위해 요구르트 등의 발효유제품 제조공정에서 비피더스균을 첨가하고는 있으나 요구르트 제조에 사용되는 상업용 비피더스 균주는 대부분이 수입된 균주로 외국인에서 유래된 균주이므로 한국인에게 적합한 생리활성을 나타내지 못한다는 점이 지적되어 왔다.

따라서 아직까지 국내는 물론 국외에서도 항암작용, 체지방감소 효과, 항동맥경화 효과, 콜레스테롤 축적억제 효과, 당뇨치료 효과 등의 다양한 생리활성을 나타내는 CLA를 생산하는 비피더스 균주에 관한 연구·보고와 이에 관한 이용도 전무한 실정이다.

본 발명자는 상기와 같이 종래기술이 지니는 한계에 대한 해결방안을 강구하여 오던 중 공액이중결합구조로의 전환능이 우수하면서도 발효특성이 우수한 신균주를 국내인으로부터 분리해 내는데 성공함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 기질로 하여 공액이중결합구조로 전환하는 특성이 우수한 신규한 비피도박테리움 속균을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 공액이중결합구조의 지방산 또는 아실글리세롤을 생산하는 방법을 제공함에 있다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 기능성이 보강된 발효유제품을 제조하는 방법을 제공함에 있다.

도 1은 본 발명의 비피더스균주를 탈지유 배지에 배양시 첨가된 리놀레인산으로부터 생산된 공액이중결합 리놀레인산과 기타 지방산의 가스크로마토그라피 분석 크로마토그램이고,

도 2는 본 발명의 비피더스균주를 탈지유 배지에 배양시 첨가된 리놀레인산으로부터 전환된 공액이중결합 리놀레인산의 GC-MS 분석에 의한 이온크로마토그램이고,

도 3은 본 발명의 비피더스 균주의 광학현미경 사진(3,400 배율)이고,

도 4는 본 발명의 비피더스균주의 탄수화물 발효패턴(API 50 CHL Test Kit 사용)을 나타내는 사진이고,

도 5는 본 발명의 비피더스균주를 호기 및 혐기배양시의 균주성장의 변화를 나타내는 그래프이고,

도 6은 본 발명의 비피더스균주의 우유, 탈지유, 우유와 탈지유 혼합배지에서의 배양시 생균수의 변화를 나타내는 그래프이고,

도 7은 본 발명의 비피더스균주의 우유, 탈지유, 우유와 탈지유 혼합배지에서의 배양시 pH의 변화를 나타내는 그래프이고,

도 8은 본 발명의 비피더스균주의 우유, 탈지유, 우유와 탈지유 혼합배지에서의 배양시 공액이중결합 지방산의 함량변화를 나타내는 그래프이며,

도 9는 본 발명의 비피더스균주의 우유배지에서 기질첨가 및 발효조건에 따른 생산된 공액이중결합 리놀레인산의 함량을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 사슬내에 비공액이중결합(Unconjugated double bond) 구조를 지니는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 기질로 하여 공액이중결합구조로 전환하는 특성이 우수한 신규한 비피도박테리움 속균을 포함한다.

상기 본 발명의 신규한 비피도박테리움 속균은 바람직하기로는 적어도 cis-9, cis-12 위치에 비공액이중결합을 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤 중 적어도 1종을 공액이중결합 구조로의 전환에 사용되는 기질로 이용한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 사슬내 cis-9, cis-12 위치에 비공액이중결합을 포함하는 지방산은 리놀레인산으로, 또한 이를 함유하는 아실글리세롤로는 모노리놀레인으로 한다.

상기와 같이 전환되는 공액이중결합구조는 구조적으로는 적어도 cis-9, trans-11 입체배치를 포함하며, 이들 구조를 가지는 지방산 및 아실글리세롤은 유제품류, 유아용 정장식품류, 생균제, 건강기능성 식품, 사료첨가제, 의약품류생산, 화장품원료 등의 용도로서 사용가능하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 공액이중결합구조를 가지는 지방산 또는 아실글리세롤은 리놀레인산 또는 모노리놀레인을 기질로 하여 생산되는 CLA 또는 동 지방산을 함유하는 아실글리세롤로 한다.

상기와 같은 기능을 수행하는 비피더스 균주는 본 발명자에 의해 건강한 한국인 유아와 청장년 50명 이상의 분변을 시료로 사용하여 먼저 300여종의 비피더스 균주를 분리하고, 상기 분리된 비피더스 균주에 대하여 CLA를 생산하는 비피더스 균주를 1차로 선발한 후 동 과정을 통해 선발된 비피더스 균주에 대해 내산성, 내담즙산성 실험 및 CLA의 생산실험을 통해 선별할 수 있었다.

상기 과정을 통해 선별된 비피더스 균주는 실험결과 종래 상업용 균주 및 표준 공시균주와는 다른 특성을 지니고 있음이 확인되었으며, 본 발명자는 동 균주를 비피도박테리움 브레베 LMC7로 명명하고 한국생명공학연구원 유전자원센터 유전자은행실에 KCTC 1017BP(2001.5.24)으로 기탁하였다.

본 발명에 의한 균주(KCTC 1017BP)는 기존의 비피더스 균주와는 달리 리놀레인산을 첨가한 우유 및 탈지분유 배지에서도 균주의 생육이 10⁸cfu/ml 수준 이상임은 물론 이를 이용한 발효유의 유통기한 중에도 거의 사멸이 일어나지 않아 제품에의 적용성 면에서 매우 우수하다.

또한 본 발명은 상기 비피도박테리움 브레베 LMC7을 혐기적 또는 호기적 조건에서 배양하여 당해 배양물로부터 사슬내에 공액이중결합구조를 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 생산하는 방법을 포함한다.

상기 비피도박테리움 브레베 LMC7의 기질로는 바람직하기로는 적어도 cis-9, cis-12 위치에 비공액이중결합을 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤 중 적어도 1종을 포함하며, 상기 공액이중결합구조를 포함하는 생성물은 구조적 특징으로서 적어도 cis-9, trans-11 입체배치를 포함함을 특징으로 한다.

보다 바람직하기로는 상기에서 비공액이중결합을 포함하는 지방산은 리놀레인산이며, 아실글리세롤은 모노리놀레인으로 한다. 이때 기질로 사용되는 리놀레인산 또는 모노리놀레인은 특정한 한정을 요하는 것은 아니나 배지내에 대략 0.05∼2.5% 정도 첨가하는 것이 최종 생성물의 수율면에서 바람직하다.

상기 공액이중결합구조를 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 생산하는 비피도박테리움 브레베 LMC7은 균체 또는 고정화균체로서 제공됨이 가능하다.

상기 균주를 우유 또는 탈지유를 포함하는 배양액에서 배양하면 당해 배양물내에 사슬내에 적어도 cis-9, trans-11 입체배치를 포함하는 공액이중결합구조의 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 함유하는 발효유를 제조할 수 있다.

다만 상기와 같이 발효유를 제조하는 경우 최종제품의 품질특성을 위해 상기 지방산 또는 아실글리세롤의 발효유 내 함량은 10∼1,000mg/100㎖로 하는 것이 좋으며, 발효유 제조시 사용되는 원료 우유는 총지방 함량이 4%이하인 것으로 함이 바람직하다.

다음으로 본 발명의 비피도박테리움 속균에 대한 분리방법 및 균학적 특성에 관해 보다 상세하게 설명하기로 한다.

균주의 분리

(1) 1차 선별

본 발명자는 50명 이상의 건강한 한국인 유아와 성인으로부터 분변을 채취하여, 생리적 식염수를 사용하여 분변을 10^-8까지 희석한 후, 각각의 희석액으로 부터 0.1㎖를 취한 후 비피더스균의 선택배지인 TP배지를 사용하여 비피더스균을 분리하였다. 상기 TP 배지의 성분 조성은 하기 표 1과 같다.

<표 1> TP 배지의 성분 조성

성분	함량	비고
Trypticase peptone	10.0g	BBL
Proteose peptone No. 3	5.0g
(NH₄)₂SO₄	3.0g
KH₂PO₄	2.0g
K₂HPO₄	1.0g
L-cystein·HCl	0.5g
MgSO₄	0.2g
Agar	15.0g
20% TOS solution¹⁾	50.0 ml
Na-propionate	50.0 ml
증류수	1,000 ml
1) TOS : Transgalactooligosaccharide※ 최종 pH는 7.0으로 조정

상기 배지를 가스 팩 시스템(gas pack system)에 의한 혐기 배양조(anaerobic jar)와 배양기내의 공기를 혼합혐기가스(anaerobic mixed gas; H₂:CO₂:N₂=5:15:80)로 치환한 혐기 배양기(anaerobic incubator)를 사용하여 37℃에서, 48시간 동안 배양하였다.

이와 같은 방법으로 300여 비피더스 균주를 분리한 후, 이들을 대상으로 CLA를 생산하는 비피더스 균주를 1차로 선발하였다.

(2) 2차 선별

상기 1차 선별된 비피더스 균주에 의한 CLA 생산능의 측정을 위해 각 비피더스 균주를 리놀레인산을 0.05% 첨가한 10% 탈지유 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 혐기 배양한 후 생성된 CLA를 가스크로마토그라피 상에서 확인하였다.

탈지유 배양액으로부터 지방산의 추출을 위하여 분액깔대기에 탈지유 배양액, 내부표준물질로서 헵타데카노익 산, 클로로포름-메탄올(2:1) 용액을 가하고 강하게 혼합한 후 1시간 동안 정치시켜 클로로포름층(하층)으로 지방이 추출되도록 하였다. 하층액은 다시 1% KCl 용액과 혼합하여 강하게 흔들고 정치시킨 후 클로로포름층(하층액)만을 회수하여 회전증발기(rotary vacuum evaporator)를 사용하여 클로로포름 용매를 제거시켜 지방을 회수하였다. 지방산조성을 분석하기 위하여 회수된 지방을 시험관에 넣고 1% 황산 무수에탄올 용액 15 mL를 가하고 마개로 밀폐한 후 80 ℃수조에서 1시간 반응하여 지방을 에틸에스터(ethyl ester)화 하였다. 에틸에스터화된 지방을 n-hexane 2 mL로 추출하고 가스크로마토그라피( Varian 3800, USA)를 이용하여 CLA 및 기타 지방산 함량을 측정하였다.

상기 과정을 통해 리놀레인산으로부터 CLA로의 전환능이 가장 우수한 균주를 선발하여 본 발명의 신규 비피더스균(비피도박테리움 브레베 LMC7 균주)으로 최종 선발하였다. CLA의 확인은 하기 방법에 따라 실시하였다.

(3) 공액이중결합 리놀레인산의 확인

비피도박테리움 브레베 LMC7 균주에 의한 탈지유에서 생산된 CLA를 가스크로마토그라피-매스스팩트럼(GC-MS)으로 확인한 결과는 도 1 및 2에 나타낸 바와 같다.

도 1은 배지 중에 함유된 각 지방산의 에틸에스터들의 크로마토그램(total ion chromatogram)으로서 6.12분이 피크(peak)는 리놀레인산의 에틸에스터에 해당하며, 7.14분의 피크가 CLA의 에틸에스터의 피크에 해당된다. 4.34분대의 피크는 내부표준물질로서 사용한 헵타데카노익 산의 에틸에스터에 해당하는 피크이다.

도 2는 크로마토그램상에 나타난 7.14분의 CLA의 에틸에스터 피크의 매스스펙트럼(위)과 표준품 리놀레인산 에틸에스터의 매스스펙트럼(아래)으로서 두 매스스펙트럼의 이온 피크들이 일치하고 있음을 알 수 있다.

균주의 특성

본 발명의 비피도박테리움 브레베 LMC7을 혐기 배양기(anaerobic incubator)를 사용하여 L-시스테인·HCl을 0.05% 첨가한 MRS(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)고체배지에서 배양하였다.

상기 균주는 생리식염수에 현탁하여 현미경으로 관찰한 결과 형태적으로 다형성을 나타내며(도 3), 또한 TPY 액체배지에 접종하여 활성화시킨 배양액으로 Scardovi(Scardovi, V. 1984. GenusBifidobacterium. in Bergey's Manual of Sytematic Bacteriology. 9th Ed. Vol. 2. pp.1418-1434. Williams Wilkins Publishers. Baltimore, MD, USA)의 방법에 따라 F6PPK(fructose-6-phosphate phosphoketolase)실험을 실시한 결과 상기 균주는 비피더스 균주임을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 본 발명의 균주는 API 50 CHL test kit(API, France)를 이용하여탄수화물 발효 실험을 실시한 결과 공시균주 비피도박테리움 브레베 ATCC 15700의 탄수화물 발효성상과 같은 결과를 나타냄을 확인하였다(도 4, 표 2).

<표 2> 비피도박테리움 LMC7 균주와 비피도박테리움 브레베 ATCC 15700의 탄수화물 발효능 비교

LMC7	B. breve ATCC 15700
Glycerol	-	Glycerol	-
Erythritol	-	Erythritol	-
D-Arabinose	-	D-Arabinose	-
L-Arabinose	-	L-Arabinose	-
Ribose	+	Ribose	+
D-Xylose	-	D-Xylose	-
L-Xylose	-	L-Xylose	-
Adonitol	-	Adonitol	-
??-Methyl xyloside	-	??-Methyl xyloside	-
Galactose	+	Galactose	+
D-Glucose	+	D-Glucose	+
D-Fructose	+	D-Fructose	+
D-Mannose	+	D-Mannose	+
L-Sorbose	-	L-Sorbose	-
Rhamnose	-	Rhamnose	-
Dulcitol	-	Dulcitol	-
Inositol	-	Inositol	-
Mannitol	+	Mannitol	+
Sorbitol	+	Sorbitol	+
α-Methyl D-mannoside	-	α-Methyl D-mannoside	-
α-Methy D-glucoside	+	α-Methy D-glucoside	+
N acetyl glucosamine	+	N acetyl glucosamine	+
Amygdaline	+	Amygdaline	+
Arbutine	+	Arbutine	+
Esculine	+	Esculine	+
Salicine	+	Salicine	+
Cellobiose	+	Cellobiose	+
Maltose	+	Maltose	+
Lactose	+	Lactose	+
Melibiose	+	Melibiose	+
Saccharose	+	Saccharose	+
Threhalose	+/-	Threhalose	-
Inulin	-	Inulin	-
Melezitose	+	Melezitose	-
D-Raffinose	+	D-Raffinose	+
Starch	+	Starch	+
Glycogen	+	Glycogen	+
Xylitol	+	Xylitol	+

이하 상기 제반과정에 의한 비피도박테리움 LMC7 균주의 특성 및 CLA 생산능을 구체적인 실시예를 통해 확인하고, 동균주를 발효단계에 직접 적용한 구체적인 실시예를 통해 본 균주의 유용성을 검증하고자 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 균주를 설명하기 위한 바람직한 예시에 불과한 것으로 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로는 되지 아니한다.

<실시예 1> 비피더스 균주의 내산성, 내담즙산성

실험과정

선발된 비피더스 균주의 내산성 시험을 위하여 L-시스테인·HCl이 0.05% 첨가된 MRS 액체배지의 초기 pH를 HCl을 사용하여 4.0으로 조절하였으며, 내담즙산성 시험을 위해서는 L-시스테인·HCl이 0.05% 첨가된 MRS 액체배지에 답즙을 0.5% 가한 것을 배지로 사용하였다.

실험결과

상기 준비된 각 배지에 비피더스균주를 1차 활성화시킨 다음 1% 되도록 접종하여 24시간 동안 혐기배양하면서 OD₆₀₀값을 측정한 결과, 본 발명에 의한 비피도박테리움 브레베 LMC7 균주는 내산성과 내담즙산성을 동시에 보유하고 있으며, 그 성능도 매우 우수한 것으로 나타났다.

본 발명에 의한 비피도박테리움 브레베 LMC7 균주의 내산성과 내담즙산성을상업용 균주 비피도박테리움 론검과 비교했을 때, LMC7 균주의 pH 4.0에서의 OD₆₀₀값은 0.13으로 상업용 균주의 0.05보다 매우 높았으며, 담즙을 첨가한 배지에서의 OD600값도 0.36으로 상업용 균주의 0.34보다 높았다.

<실시예 2> 비피더스균주의 내산소성

실험과정

선발된 비피더스 균주를 L-시스테인·HCl이 0.05% 첨가된 MRS 액체배지에서 24시간 혐기배양한 배양액 1%를 MRS 액체배지와 시스테인이 첨가된 MRS 액체배지에 접종하여 48시간 동안 각각 혐기배양 및 호기배양하였다. 혐기배양은 알루미늄 캡으로 밀봉할 수 있는 25 ㎖ 튜브에 배지를 20㎖ 채운 후 배지 상부의 공기를 질소가스로 치환하여 멸균하고 배양액을 접종하여 37℃에서 배양하였으며, 호기배양은 100㎖ 삼각 플라스크에 배지 20㎖ 를 가하고 공기가 통하는 실리콘마개로 플라스크 입구를 막고 멸균한 후 배양액을 접종하고 37℃에서 정치배양하였다.

실험결과

각 배양액에서 본 균주의 성장은 OD₆₀₀값을 측정하여 나타내었으며, 경시적인 OD₆₀₀값의 변화는 도 5에 나타내었다. MRS 액체배지에서의 본 비피더스 균주의 생육은 24시간까지 큰 차이가 없었으며 이후 혐기적으로 배양한 경우가 호기적으로 배양한 경우보다 OD₆₀₀값이 다소 높게 나타나는 경향을 보였으나 큰 차이는 아니었다. 시스테인이 첨가된 MRS(도5에서 mMRS배지로 표기) 액체배지에서는 호기적과 혐기적배양시 균의 성장이 거의 같은 수준으로 이루어졌으며, 48시간 배양종료시의 OD₆₀₀값이 호기적 배양의 경우 2.0, 혐기적 배양의 경우 1.98로 차이가 거의 없었다. 이상과 같이 본 균주는 기존의 일반 비피더스 균주와는 달리 산소에 노출되어도 균의 생육이 저해받지 않는 특성을 지닌 매우 우수한 균주임을 확인할 수 있다.

<실시예 3> 균체 및 고정화 균체에 의한 CLA의 생산

본 발명의 비피도박테리움 브레베 LMC7 균체를 대상으로 리놀레인산으로부터 CLA의 전환능에 대한 pH 영향을 조사하였다.

실험과정

본 균주를 L-시스테인·HCl이 0.05% 첨가된 MRS 액체배지에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다. 이 균체를 다시 생리적 식염수에 현탁하고 원심분리하여 균체로부터 배지 성분을 제거하였다. 균체 0.4g을 pH를 4.0부터 10.0으로 각각 조절한 완충용액 5㎖ 에 현탁하고 리놀레인산을 0.05% 되도록 첨가한 후 20℃에서 3시간 100 rpm으로 진탕하였다.

실험결과

본 발명의 비피도박테리움 브레베 LMC7 균주에 의한 리놀레산으로부터 CLA(c9,t11)으로의 전환율은 pH 5.5에서 가장 높은 82.8% 였으며, 다음으로 pH 6.0에서 76.2% 였다(표 3).

이와 같은 결과는 종래기술과는 달리 본 균주의 균체 또는 고정화균체는 pH가 5.3정도인 발효요구르트 등의 상업적 이용에도 적용성이 매우 우수함을 입증하고 있는 바 그 효용가치가 지대함을 알 수 있다.

<표 3> 비피도박테리움 LMC7 균체의 리놀렌인산으로부터 CLA로의 전환율

pH	c9,t11 CLA 함량(??g/ml)	전환율 (%)
4.0	25.92	5.2
4.5	118.64	23.7
5.0	272.38	54.5
5.5	414.23	82.8
6.0	380.81	76.2
6.5	304.40	60.9
7.0	272.21	54.4
7.5	264.01	52.8
8.0	211.41	42.3
8.5	173.45	34.7
9.0	95.04	19.0
9.5	39.53	7.9
10.0	8.69	1.7

<실시예 4> 발효유제품의 생산

본 발명의 비피도박테리움 브레베 LMC7의 발효유제품에의 적용가능성을 평가하기 위해 동 균주의 발효 특성을 조사하였다.

실험과정

지방 3.5%의 우유배지, 10% 탈지유배지, 지방 3.5%의 우유에 탈지유를 5% 혼합한 세 종류의 배지에 리놀레인산을 0.05% 수준으로 첨가한 후 본 균주를 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하면서 경시적으로 생균수의 변화, pH의 변화, CLA 함량의 변화를 측정하였다. 또한 배양이 끝난 배양액을 4℃에서 5일간 보존한 후의 생균수, pH, CLA 함량을 측정하였다.

실험결과

본 발명의 비피도박테리움 브레베 LMC7 균주는 각 배지에서 24시간내에 10⁹/ml 이상의 생균수를 나타내어 생육성이 매우 양호한 것으로 나타났다(도 6). 배양후 5일간 보존한 후의 생균수도 10% 탈지유에서만 10⁸/ml 수준으로 감소하였고 우유배지와 우유와 탈지유 혼합배지에서는 10⁹/ml 수준을 유지하여 발효유제품의 제조시 우수한 적용능을 갖는 것으로 보인다. pH는 배양 기간에 따라 저하되는 경향을 나타내었는데, 배양 48시간시 우유, 탈지유, 우유와 탈지유 혼합배지의 pH는 각각 4.72, 4.54, 4.96이었으며, 보존 5일 후에도 큰 변화가 없었다(도 7).

각 배지에서 본 균주의 발효에 의한 CLA의 생산량은 배양 18시간까지 증가하다 이후 일정한 수준을 유지하는 경향이었으며, 배양이 끝난 후 보존시에도 같은 수준을 유지하였다. 각 배지에서의 CLA 함량은 우유와 탈지유 혼합배지에서 가장 높아 48시간 배양시에 289 ㎍/㎖ 이었으며, 우유배지 252 ㎍/㎖, 탈지유 배지에서는 135 ㎍/㎖ 로 나타났다(도 8).

상기 결과에서와 같이 본 비피도박테리움 브레베 LMC7 균주는 유산균 발효균주로서 고농도의 CLA함유 발효유 제품 생산에 적용가능한 매우 우수한 균주임을 확인할 수 있다.

<실시예 5> 기질과 혐기적 및 호기적 발효조건에 따른 CLA 생산능

본 발명의 비피도박테리움 브레베 LMC7 비피더스 균주의 발효유제품에의 적용 가능성을 평가하기 위해 동 균주의 기질과 혐기적 및 호기적 발효조건에 따른 CLA 생산능을 조사하였다.

실험과정

CLA 생산을 위한 기질로서 리놀레인산 또는 모노리놀레인을 0.05% 수준으로 첨가한 우유를 살균한 후 본 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 동안 호기적 및 혐기적으로 배양한 후 CLA 함량을 측정하였다(도 9).

실험결과

본 발명의 비피더스 균주의 발효에 의한 CLA 생산능은 기질로서 모노리놀레인을 사용할 경우 혐기적 배양시 394.5 ㎍/㎖, 호기적 배양시 429 ㎍/㎖가 생산되어 리놀레인산을 사용한 경우의 237.1 ㎍/㎖ 및 252.4 ㎍/㎖보다 평균 1.7배 더 많은 CLA를 합성하였다.

CLA 전환용 기질로써 모노리놀레인을 적용하는 경우 상기한 바와 같이 CLA 생산능이 우수할 뿐만 아니라 모노리놀레인은 그 자체 유화력이 우수하므로 고농도의 CLA생산에 유리하고, 또한 생산된 CLA함유 모노리놀레인은 인간이 섭취시 흡수율도 아주 우수한 장점이 있다.

또한 실시예 3과 같은 방법으로 본 균주의 균체에 의한 pH 5.5에서의 리놀레인산 및 모노리놀레인으로부터 CLA(c9,t11)로의 전환율도 각각 82.8% 및 90.3%로 나타나고 있어 CLA 전환용 기질로써는 모노리놀레인이 다소 효용가치면에서 우수함을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 발효유제품의 생산시 첨가되는 기질함량 변화시 합성되는 CLA함량의 변화

본 발명의 비피도박테리움 브레베 LMC7 비피더스 균주를 현재 상업적으로 제조되고있는 요구르트제조에 직접 적용시 합성되는 CLA를 얼마까지 증가시킬 수 있으며, 실제로 유통되고 있는 150㎖/bottle를 하루 3회 음용시 권장되고 있는 CLA의 하루 섭취량을 충족시킬 수 있는지를 조사하였다.

실험과정

CLA를 생산하기 위한 기질로서 리놀레인산 또는 모노리놀레인을 배지에 각각 0.05%, 0.25%, 0.50% 1.0%, 1.5%, 2.0% 및 2.5%를 첨가하였고, 사용한 배지는 지방함량 3.5%의 우유를 크림분리기(cream seperater)를 사용하여 지방함량을 1.5%로 조절한 우유 85g과 탈지유 15g으로 혼합된 배지를 사용하였다.

실험결과

각각의 농도별로 기질이 첨가된 배지는 살균 후 본 균주를 접종하여 37℃에서 48시간동안 배양한 후 CLA함량을 분석하여 발효된 요구르트 100㎖ 중에 함유된 CLA함량을 표 4에 나타내었다.

<표 4> 기질함량 변화시 합성된 CLA함량(c-9,t-11CLA ㎎/100㎖ 요구르트)의 변화

기질농도,%	기질의 종류
기질농도,%	Linoleic acid	Monolinolein
0.05	42.53	46.54
0.25	212.51	232.47
0.50	435.12	475.23
1.0	750.41	850.52
1.5	900.28	975.26
2.0	700.95	801.27
2.5	253.21	375.24

상기 결과에서 보면 기질농도 0.5%까지는 첨가된 기질인 리놀레인산 및 모노리놀레인에서 각각의 CLA 전환율이 85∼87% 및 93∼95%로 높았으나, 1.0%이상 첨가시는 다소 감소하는 경향을 나타내고 있음을 알 수 있다. 또한 CLA를 사람이 섭취할 때 기능성을 발휘하기 위하여 요구되는 하루의 권장섭취량은 2.0g∼3.5g/day의 범위로 알려지고 있으므로, 본 균주를 적용시 기질을 0.5%이상 첨가해 발효시킨 요구르트를 150㎖/bottle로 하여 하루 3번 음용한다면 권장되는 CLA의 하루 섭취량을 만족시킬 수 있다.

본 발명의 균주는

리놀레인산 또는 모노리놀레인을 CLA로 전환시키는 능력이 우수하고, 발효특성에 있어서도 기존의 발효요구르트 등의 제품생산에 적합하여 효용가치가 매우 높다.

또한 발효가 완료된 제품에서도 충분한 기간 균주가 살아있으므로 인간이 섭취시 기존의 비피더스균이 발휘하는 인체기능성을 더욱 강화시킬 수 있는 장점이있으며, 균체 및 고정화 균체에 의한 CLA 생산에도 이용될 수 있다.

특히 CLA 전환용 기질로써 모노리놀레인을 잘 이용하므로, 이를 기질로 CLA생산시 고농도의 CLA생산에 유리하고, 또한 생산된 CLA함유 모노리놀레인은 인간이 섭취시 흡수율도 아주 우수하다고 할 수 있다.

또한 인체에서 분리되었으므로, 병원성 등의 염려 없이 발효 유제품류, 유아용 정장 식품류, CLA강화된 비피더스 우유, 생균제, 건강기능성 식품, 사료첨가제, 의약품류생산, 화장품소재생산 등의 다양한 용도로 활용될 수 있다.

Claims

사슬내에 비공액이중결합 구조를 지니는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 기질로 하여 공액이중결합구조로 전환하는 특성이 우수한 비피도박테리움 브레베 LMC7(KCTC 1017BP)
제 1항에 있어서, 상기 공액이중결합 구조의 전환에 제공되는 기질로는 적어도 cis-9, cis-12 위치에 비공액이중결합을 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤 중 적어도 1종을 포함함을 특징으로 하는 비피도박테리움 브레베 LMC7(KCTC 1017BP)
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 전환된 공액이중결합구조는 구조적 특징으로서 적어도 cis-9, trans-11 입체배치를 포함함을 특징으로 하는 비피도박테리움 브레베 LMC7(KCTC 1017BP)
제 2항에 있어서, 기질로는 리놀레인산 또는 모노리놀레인 중 적어도 1종임을 특징으로 하는 비피도박테리움 브레베 LMC7(KCTC 1017BP)
제 3항에 있어서, 상기 전환된 결과물은 공액이중결합 리놀레인산임을 특징으로 하는 비피도박테리움 브레베 LMC7(KCTC 1017BP)
비피도박테리움 브레베 LMC7을 혐기적 또는 호기적 조건에서 배양하여 당해 배양물로부터 사슬내에 공액이중결합구조를 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 생산하는 방법.
제 6항에 있어서, 비피도박테리움 브레베 LMC7의 기질로는 적어도 cis-9, cis-12 위치에 비공액이중결합을 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤 중 적어도 1종을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 공액이중결합구조를 포함하는 생성물은 구조적 특징으로서 적어도 cis-9, trans-11 입체배치를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 기질로는 리놀레인산 또는 모노리놀레인 중 적어도 1종임을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 생성물은 공액이중결합 리놀레인산임을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 기질은 배지내에 0.05∼2.5% 첨가함을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 공액이중결합구조를 포함하는 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 생산하는 비피도박테리움 브레베 LMC7은 균체 또는 고정화균체임을 특징으로 하는 방법.
비피도박테리움 브레베 LMC7을 우유 또는 탈지유를 포함하는 배양액에서 배양하여 당해 배양물내에 사슬내에 적어도 cis-9, trans-11 입체배치를 포함하는 공액이중결합구조의 지방산 또는 상기 지방산을 함유하는 아실글리세롤을 함유하는발효유의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 지방산 또는 아실글리세롤의 발효유 내 함량은 10∼1,000mg/100㎖로 함을 특징으로 하는 발효유의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 원료 우유는 총지방 함량이 4%이하인 것임을 특징으로 하는 발효유의 제조방법.