DE60319323T2

DE60319323T2 - Säure und Gallensalz-resistente Lactobacillus Isolate, welche die Fähigkeit besitzen, Cholesterin zu erniedrigen oder zu assimilieren

Info

Publication number: DE60319323T2
Application number: DE60319323T
Authority: DE
Inventors: Yu-Ju Liu; Chin-Chu Nan-Tse Dist Yu; Ching-Fen Tan; Chii-Cherng Liao
Original assignee: Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 2002-10-30
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: CN1237168C; HK1065821A1; EP1424075B1; CN1493684A; EP1424075A2; CN1313600C; CN1680543A; HK1081993A1; EP1424075A3; DE60319323D1; ATE387206T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Magensäure- und Gallensalz-resistente Lactobacillus-Isolate, welche die Fähigkeit besitzen, Serumcholesterol zu erniedrigen und zu assimilieren, und die Anwendung davon.
"Milchsäurebakterien" sind eine Gruppe von Bakterien, welche Saccharide fermentieren können und welche Milchsäure als ein Hauptprodukt produzieren. Die allgemein anerkannten morphologischen und physiologischen Merkmale von Milchsäurebakterien bestehen darin, dass sie: (1) grampositiv; (2) stäbchenförmig oder scheibenförmig; (3) Katalase-negativ; (4) fähig zum Umwandeln von metabolisierter Glucose in mehr als 50% Milchsäure; (5) nicht sporenbildend; (6) unbeweglich und (7) mikroaerob sind.
Bis 1980 war von Milchsäurebakterien bekannt, im Allgemeinen vier Gattungen einzuschließen, nämlich, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc und Pediococcus (W. C. Frazler und D. C. Westhoff, 1978, Food Microbiology, 3. Aufl., McGraw-Hill, Inc., New York, USA). In einem breiteren Sinn umfassen Milchsäurebakterien ferner die zwei Gattungen Bifidobacterium und Sporolactobacillus. In den letzten Jahren sind Mikroorganismen explizit als eine taxonomische Gruppe gemäß DNA-Homologie und rDNA-Sequenzvergleich und Analyse im Klassifizierungssystem eingeordnet worden und erhielten eine Position in der Taxonomie. Nach dem Kenntnisstand der Anmelder ist die Familie der Milchsäurebakterien erweitert worden, um, im Dezember 1999, 16 Gattungen und 223 Arten einzuschließen.
Die so genannten "Probiotika" sind lebende Bakterien eines einzelnen Typs oder einer Mischung von Bakterien unterschiedlicher Typen, welche, nach Verzehr durch den Menschen oder einen tierischen Wirt, das gastrointestinale mikrobielle Gleichgewicht im Darmtrakt von Mensch oder Tier verbessern können (O'Sullivan et al. (1992), Trends in Food Sci. Technol., 3: 309-314; Fuller, R., P. J. Heidt, V. Rush und D. van der Waaij. (Hrsg.) (1995), Probiotics: prospects of use in opportunistic infections. Old Herborn University Seminar Monograph, Nr. 8, S. 1). Lactobacillus und Bifidobacterium sind die am weitesten bekannten und angewandten Probiotika.
Im Jahre 1908 schlug Dr. Eli Metchnikoff die Theorie vor, dass der Verzehr großer Mengen an Joghurt, welcher Stämme von Lactobacillus sp. enthält, zur Ersetzung von Toxin-produzierenden Bakterien führen wird, die normalerweise im Darm vorhanden sind, und somit zur Langlebigkeit ohne Altern führen würde (Eli Metchnikoff, 1908, The Prolongation Of Life, Hrsg.: P. Chalmers Mitchell, G. P. Putnam's Sons, The Knickerbocker Press, New York & London). Jüngere Untersuchungen und klinische Tests haben ebenfalls gezeigt, dass Lactobacillus in kritischer Weise mit der Gesundheit in Verbindung steht. Deshalb hat Lactobacillus in den letzten Jahren eine weitverbreitete Aufmerksamkeit erfahren.
Milchsäurebakterien spielen nicht nur im komplexen Biosystem des Darms eine bedeutende Rolle, sondern sie weisen ebenfalls probiotische Auswirkungen auf den Wirt auf. Die anerkannten Effekte von Milchsäurebakterien schließen die folgenden ein: Verbessern des Nährwerts von Wirt-Futtermaterial; Fördern der Synthese von Vitaminen und der Produktion von Enzymen (J. Denter und B. Bisping, 1994, Int. J. Food Microbiol., 22: 23-31), Hemmen des Wachstums von pathogenen Darmbakterien und Aufrechterhalten des Gleichgewichts der normalen Darmmikroflora (Hose, H., und Sozzi, T. (1991), J. Chem. Technol. And Biotech. 51: 540-544), Erzeugen von Antikörpern zur Steigerung der Immunität des Wirts (H. Majamaa et al. (1995), Journal of Pediatric Gastro-enterology and Nutrition, 20: 333-338), Verringern des Risikos von Dickdarmkrebs und Unterdrücken der Tumorbildung (E. J. Schiffrin et al., 1997, Am. J. Clin. Nutr., 66: 515S-520S). Forschungen zeigen ebenfalls, dass der Verzehr von mit Lactobacillus fermentierter Milch Serumcholesterol-Spiegel erniedrigen kann.
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind als eine führende Haupt-Todesursache in Industrieländern herausgestellt worden. In den Vereinigten Staaten starben mehr Menschen an koronärer Herzerkrankung als diejenigen mit Krebs und anderen Erkrankungen, und etwa Dreiviertel der Todesfälle werden von Atherosklerose und damit verbundenen Komplikationen verursacht. Ein hoher Serumcholesterol-Spiegel ist eine der Ursachen von kardiovaskulären Erkrankungen und Artherosklerose (Kannel et al. (1979), Ann. Intern. Med., 90: 85-91; Pekkanen et al. (1990), New England J. Med., 322: 1700-1707). In Taiwan stehen zerebrovaskuläre und kardiovaskuläre Erkrankungen auf der Liste der "Top Ten" der führenden Todesursachen und sind die Hauptursachen von Krankheit und Tod bei älteren Menschen. Daher ist Hypercholesterinämie eine Krankheitsursache, die nicht ignoriert werden sollte.
Im Jahre 1974 stellten Mann und Spoerry fest, dass Serumcholesterol-Spiegel in Menschen nach dem Verzehr von mit einem Lactobacillus-Stamm fermentierten Joghurt sanken, wohingegen keine signifikante Änderung bei denjenigen Personen beobachtet wurde, welche Frischmilch zu sich nahmen (Am. J. Clin. Nutr., 27: 464-469, 1974), was umfangreiche Forschungen über die Anwendung von Milchsäurebakterien und deren Auswirkungen zur Senkung von Cholesterol anspornte.
K. K. Grunewald berichtete in J. of Food Science: 47: 2078-2079 (1982), dass der Serumcholesterol-Spiegel in Ratten signifikant erniedrigt werden konnte, als man den Ratten Futter, das 10% von Lactobacillus acidophilus fermentierte Milch enthielt, vier Wochen lang verabreichte. Von Danielson et al. wurde ebenfalls in J. Anim. Sci.: 67: 966-974 (1989) berichtet, dass Acidophilus-Joghurt das Serumcholesterol und Niedrigdichte-Lipoproteine (Low Density Lipoproteins, LDLs) in Wildschweinen verringerte, welche mit einer Hochcholesterol-Nahrung in Kombination mit Joghurt, fermentiert mit Lactobacillus acidophilus LA16-Isolaten, während einer Dauer von 56 Tagen gefüttert wurden, aber keine Auswirkung auf Serumtriglyceride und Hochdichte-Lipoproteine (HDLs) aufwies.
Der zuvor erwähnte Bericht, der einen Isolatstamm von Lactobacillus acidophilus, LA16, betraf, ist eine der vielen Arbeiten von der Forschungsgruppe unter der Führung von Dr. Khem M. Shahani über die Charakteristika und Bioaktivitäten von Lactobacillus acidophilus. Spezifisch hat die Gruppe von Dr. Shahani ziemlich umfangreiche Forschungen über die Charakteristika und Bioaktivitäten eines speziell isolierten und kultivierten Stamms von Lactobacillus acidophilus, DDS-1, von menschlichem Ursprung durchgeführt, einschließlich Untersuchungen über dessen Effekt bei der Erniedrigung von Serumcholesterol-Spiegeln. Der isolierte DDS-1-Stamm wurde später patentiert (Informationen hinsichtlich DDS-1^TM stehen auf der Website von Nebraska Cultures, Inc., (http://www.nebraskacultures.com.benefits.html) zur Verfügung.
Im Jahre 1997 verglichen Akalin et al. die Effekte von gewöhnlichem Joghurt (fermentiert durch Streptococcus thermophilus und Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus) und Acidophilus-Joghurt (fermentiert durch Streptococcus thermophilus und Lactobacillus acidophilus) auf die Serumcholesterol-Spiegel in Mäusen und stellten fest, dass die Fähigkeit von Acidophilus-Joghurt zur Erniedrigung von Serumcholesterol-Konzentrationen signifikant höher war als diejenige des gewöhnlichen Joghurts (A. S. Akalin et al. (1997), J. Dairy Sci., 80: 2721-2725).
De Smet et al. berichteten in British J. of Nutrition, 79: 185-194 (1998), dass der fäkale Ausstoß von Gallensalzen in Schweinen, welche vier Wochen lang (von Woche 3 bis Woche 7) mit Lactobacillus acidophilus gefüttert worden waren, signifikant zunahm, und dass auch die Gesamt-Serumcholesterol-Konzentrationen in den Schweinen signifikant abnahmen. Es wurde deshalb gefolgert, dass die enzymatische Aktivität von Gallensalz-Hydrase (BSH, E.C.3.5.1.24) innerhalb von Lactobacillus der Mechanismus sein könnte, der für die Senkung von Serumcholesterol in den behandelten Schweinen verantwortlich ist.
Cholesterol kann in Menschen von der Leber synthetisiert werden und kann auch aus Fleisch aufgenommen werden. Es gibt zwei Wege für die Ausscheidung von Cholesterol: (1) Bildung von Cholsäure als Ergebnis des Leberstoffwechsels, welche dann mit Glycin oder Taurin konjugiert wird, wodurch sie wasserlöslich wird und anschließend Gallensalze, wie Glycocholate oder Taurocholate, mit Kalium- oder Natriumionen, für die Ausscheidung in den Fäkalien bildet; und (2) Bilden von Steroidhormonen, welche im Urin als Ergebnis des Hormonstoffwechsels ausgeschieden werden; allerdings wird nur ein kleiner Anteil des Cholesterols auf diese Weise ausgeschieden.
Gallensalze sind wasserlösliche Endprodukte im Cholesterinstoffwechsel. Diese Salze können in den enterohepatischen Kreislauf eintreten, und wegen der enzymatischen Aktivität von Gallensalz-Hydrase (BSH) von enterischen Bakterien, einschließlich Lactobacillus, Enterococcus, Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Clostridium und Bacteroid etc., können Cholsäuren von Glycin oder Taurin getrennt werden, wodurch dekonjugierte Gallensalze entstehen. Die dekonjugierten Gallensalze lösen sich nicht in Wasser und co-präzipitieren wahrscheinlich mit Serumcholesterol für die Ausscheidung aus dem Körper heraus.
Zusätzlich zu dem zuvor Angegebenen, wird es berichtet, dass der Stoffwechselmechanismus von Cholesterol sowohl Assimilation als auch Co-Präzipitation einschließt.
Im Jahre 1985 wurde darauf hingewiesen, dass Lactobacillus acidophilus an Cholesterol adhärieren und es assimilieren könnte, und dass Lactobacillus acidophilus in einem Medium mit 0,3% Ochsengalle eine höhere Cholesterolsenkung erzielen könnte (S. E. Gilliland et al. (1985), Appl. Environ. Microbiol, 49: 377-381). In ähnlicher Weise wurde von Noh et al., in J. Dairy Sci. (1997), 82: 3107-3113, berichtet, dass Lactobacillus acidophilus in der Lage zum Einbau von Cholesterol in Zellmembranen wäre, und dass das eingebaute Cholesterol weiter assimiliert und unter Bildung von Substanzen, die von den Zellen benötigt werden, metabolisiert werden könnte.
Andererseits wurde von F. A. M. Kalver und R. van der Meer in Appl. Environ. Microbiol. (1993), 59: 1120-1124, berichtet, dass Lactobacillus und Bifidobacterium Cholesterol nicht assimilieren könnten, jedoch in der Lage wären, den Cholesterolgehalt in einem Medium zu verringern, und zwar durch Erhöhen der Konjugationsaktivität von bakteriellen Gallensalzen, wenn der pH-Wert unter 6,0 beträgt, was zu einer Co-Präzipitation von Cholesterol mit Gallensalzen führt (dieses Phänomen kann mit der BSH-Aktivität der Bakterien in Verbindung stehen).
Im Jahre 1997 wiesen M. M. Brashears und S. E. Gililland darauf hin, dass Lactobacillus eine gute Cholesterol-Copräzipitation während des Wachstums ohne pH-Steuerung (d. h. bei einem normalen pH-Wert von 4,5 bis 5,5) aufzeigt. Wenn jedoch der pH-Wert bei etwa 6,0 gehalten wurde, wird die Fähigkeit der Bakterien, Cholesterol zu entfernen, bedeutend vermindert (M. M. Brashears und S. E. Gililland (1997), Influences of pH during growth an removal of cholesterol from MRS broth by Lactobacillus casei und Lactobacillus acidophilus, Animal Science Research Report, S. 32-37; http://www.ansi.okstate.edu/research/1997rr/006.htm).
Im Jahre 1998 versuchten Zhang Jia-cheng et al. zu beweisen, dass "Assimilation" der Hauptmechanismus bei der Senkung von Cholesterol durch Milchsäurebakterien ist, und zwar durch Experimentieren mit Milch von hohem Lipidgehalt und essbarem Öl (Zhang Jia-cheng et al. (1998), "The research of cholesterol elimination in food by lactic acid bacteria – the screening of lactic acid bacteria species (strains)", Food Science (P. R. O. C), 19: 20-22).
Im Jahre 1999 zeigten Usman und Hosono in J. Dairy Sci., 82: 243-248, dass eine neu festgestellte Lactobacillus-Spezies, Lactobacillus gasseri, Cholesterol unter Kulturbedingungen ohne Gallensalze aufnehmen kann. In einer anderen Untersuchung führten die gleichen Autoren Messungen der Lebensfähigkeit dieser Spezies bei der Aufbewahrung durch (J. Dairy Sci., (1999) 82: 2536-2542).
Die Anwendung eines biologischen Verfahrens zur Verringerung von Serumcholesterol-Spiegeln in Menschen wird ökonomischer und effektiver sein. Aus den zuvor angegebenen Bezugsstellen ist es offensichtlich, dass Milchsäurebakterien den Effekt zur Verringerung von Cholesterol sowohl in vivo als auch in vitro aufzeigen können, und dass die möglichen Mechanismen die Dekonjugation durch Gallensalz-Hydrase (BSH), Co-Präzipitation von Cholesterol mit dekonjugierten Gallensalzen unter sauren Bedingungen und die Assimilation von Cholesterol durch Milchsäurebakterien-Zellen einschließen. Das EP 0 792 586 beschreibt Lebensmittelprodukte, welche Bakterien mit BSH-Aktivität enthalten.
Nach Aufnahme in den menschlichen Körper, erfahren Milchsäurebakterien jedoch Druck aus der gastrointestinalen Umgebung und der Spezifität der intestinalen Absorption. Deshalb müssen Milchsäurebakterien zuerst die ungünstige Umgebung des Verdauungssystems überwinden und den Darmtrakt besiedeln, damit sie wachsen und ihre Reaktion(en) im Darmtrakt ausüben [können]. Ferner sind Lactobacillus acidophilus-Stämme eine Gruppe von Bakterien, welche komplexe Nährstoffanforderungen aufweisen. Die Bakterien sind in fermentierter Milch relativ stabil. Allerdings können die Bakte rien in kommerziell verfügbaren Produkten (in der Form von Trockenpulver, Körnern, Tabletten) nach einer langfristigen Aufbewahrung bei Raum- oder Kühlschranktemperatur kaum lebensfähig bleiben, sodass der Spiegel an Bakterien nicht ohne Weiteres bei einem anfänglichen Aufbewahrungsspiegel beibehalten werden kann. Folglich ist die tatsächliche Zahl an Bakterien in einem nicht-fermentierten Milchprodukt häufig geringer als diejenige, welche auf dem Produktetikett angegeben ist. Die Art und Weise, wie man den Spiegel an Milchsäurebakterien in Milchsäurebakterien-Produkten während der Vermarktung und Lagerung aufrechterhält, ist daher von äußerster Bedeutung für die Hersteller. Ferner ist das Screening von Bakterien zum Erhalten von Bakterienstämmen, welche gute Resistenz gegenüber Säuren und Gallensalzen aufweisen und welche fähig sind, Serumcholesterol zu erniedrigen, ein bedeutender Punkt in der Entwicklung von ausgezeichneten Lactobacillus-Produkten.
Wenn, wie oben erwähnt, die Resistenz gegenüber Säuren und Gallensalzen und die Aufbewahrungsstabilität beim Screening von Bakterien berücksichtigt werden, können Kosteneinsparungen im anschließenden Herstellungsprozess erzielt werden, und die gescreenten Bakterienstämme können einen größeren Bereich an Anwendungen aufweisen. Darüber hinaus steht das Screening nach effektiven Bakterienstämmen auch im Zusammenhang mit Herkunft und Örtlichkeit. Deshalb haben sich die Anstrengungen von Forschern in den letzten Jahren auf das Screening von Bakterienstämmen menschlichen Ursprungs fokussiert.
In Japan enthalten von insgesamt 171 FOSHU (Fonds for Specified Health Use)-zugelassenen Produkten 36 probiotische Bakterien. Sie stellen etwa 21% der Gesamtanzahl von Produkten dar, aber besitzen einen Produktionswert von bis zu 82%. In Europa beläuft sich der Produktionswert von probiotischen Bakterien auf dem Lebensmittelmarkt auf 1 Milliarde US-Dollar. In den Vereinigten Staaten betrugen die Joghurt-Verkaufszahlen im Jahr 2000 bis zu 1,86 Milliarden US-Dollar. In Taiwan wuchs der Markt für probiotische Bakterien auf NT$ 4,2 Milliarden Dollar im Jahre 2000. Die Anwendungen für probiotische Bakterien haben jedes Jahr zugenommen und sind nicht länger auf fermentierte Milch, Milch, Eiscreme, Süßwaren und Nahrungsmittel-Ergänzungen eingeschränkt. Die Produkte werden von Erwachsenen, Kindern, Geflügel und Vieh verzehrt. Es wird vorausgesagt, dass es einen gewaltigen Spielraum für das Wachstum auf dem Probiotika-Markt gibt.
Es gibt weltweit eine Anzahl an Untersuchungen über Milchsäurebakterien. Viele der Patente und Veröffentlichungen über die Säuretoleranz und das Cholesterolerniedrigungs-Vermögen von Lactobacillus sp. richten sich auf Lactobacillus acidophilus, und beschäftigen sich großteils mit Galle- und Säure-resistenten Bakterienstämmen oder konzentrieren sich hauptsächlich auf deren Fähigkeit, Cholesterol zu senken, sowie die Gallentoleranz. Gegenwärtig betonen Untersuchungen, die an der Gallentoleranz von Lactobacillus sp. durchgeführt werden, dass die Bakterienstämme in einer Umgebung mit 0,3% Glycocholat wachsen können, und die Säuretoleranz wird unter Verwendung von Medien bei pH 2 getestet, der sauren Bedingung, welche im Magen-Darm-Trakt an der Anfangsstufe der Magensaft-Sekretion auftritt. Luchansky et al. (J. Dairy Sci., 74: 3293-3302) berichteten über die molekulare Klonierung und über Desoxyribonukleinsäure-Polymorphismen in L. acidophilus und L. gasseri.
Die Fähigkeit von Lactobacillus sp. zum Erniedrigen von Serumcholesterol beträgt etwa 20% gemäß den veröffentlichten Patenten und liegt, abhängig von den angewandten Verfahren, im Bereich von etwa 10% bis etwa 80% gemäß den Veröffentlichungen.
USP 4 839 281 und USP 5 032 399 offenbaren einen Stamm, L. acidophilus GG (ATCC 53103), welcher aus humanen Fäkalien isoliert worden war. Dieser Stamm kann in einer Umgebung wachsen, welche 0,15% Gallensalze enthält, und die Menge an restlichen Bakterien nach Kultivieren während 2 Stunden bei pH 1–2 beläuft sich auf 103 CFU bzw. koloniebildende Einheiten.
Es wurde von S. E. Gilliland und D. K. Walker in J. Dairy Sci.: 73: 905-911 (1990) berichtet, dass L. acidophilus ATCC 43121 (entsprechend CCRC 17064) von Schweineursprung und L. acidophilus ATCC 4356 (entsprechend CCRC 10695) von menschlichem Ursprung beide in MRS-Nährbrühe, welche mit 0,3% Gallensalzen ergänzt ist, wachsen können und die Fähigkeit besitzen, Serumcholesterol zu senken.
Weiterhin haben L. acidophilus LA16, der Stamm, der wie berichtet von Danielson et al. in J. Anim. Sci. (1989), 67: 966-974, aus Schweinen isoliert wurde, und Lactobacillus acidophilus DDS-1, ein isolierter Stamm von menschlicher Herkunft (ein endogener humaner Stamm), der von den Wissenschaftlern unter Führung von Dr. Khem M. Shahani entwickelt worden war, und welcher nun ein patentiertes Produkt von Nebraska Cultures, Inc., ist, die Fähigkeit gezeigt, Serumcholesterol zu erniedrigen (http://www/nebraskacultures.com./benefits.html).
Usman und Hosono berichteten in J. Dairy Sci., 82: 243-248 (1999), dass ein isolierter Lactobacillus-Stamm, Lactobacillus gasseri, Resistenz gegen Säuren und Gallensalze und die Fähigkeit, Cholesterol zu erniedrigen, aufzeigte. Plocková et al. untersuchten ebenfalls die pH-Toleranz und die Gallenresistenz von Lactobacilli (Potrav. Védy, 14(3), 165-174).
In USP 5 516 684 und USP 5 707 854 offenbaren Yoshio Saito und Jun Mizutani zwei Stämme von L. acidophilus, nämlich L. acidophilus FERM-P-14204 und L. acidophilus FERM-P-14205. Diese Stämme zeigen keine Dekonjugation von Gallensäuren und hemmen nicht die Nährstoffabsorption, aber sie zeigen eine Erniedrigung von Cholesterol im Blut und in der Leber.
Allerdings sind die vorangehend erwähnten Lactobacillus-Stämme von fremder Herkunft. Es wäre wünschenswert, Lactobacillus-Isolate zu erhalten, welche Säure- und Gallen-resistent sind und welche fähig sind, Serumcholesterol zu erniedrigen, und zwar durch Screening von Bakterienstämmen in Taiwan, damit die so erhaltenen Isolate sich an die gastrointestinale Umgebung der Menschen von Taiwan anpassen können und, bei Verwendung als Starter oder bei Zugabe zu verarbeiteten Produkten, nach dem Verzehr den Darm erreichen und den Darm besiedeln können, um dadurch die Funktionalität der Produkte zu erhöhen.
Folglich sieht die vorliegende Erfindung im ersten Aspekt einen isolierten Stamm von Lactobacillus sp. vor, wobei der Stamm folgendes ist:

(i) ein hinterlegter Stamm, gewählt aus: (a) Lactobacillus gasseri B21T1, hinterlegt in der Amerikanischen Kultur-Typ-Sammlung (American Type Culture Collection) unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4483; (b) Lactobacillus gasseri B21T6, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4484; (c) Lactobacillus gasseri C21T1, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4479; (d) Lactobacillus gasseri X21B7, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4480; (e) Lactobacillus gasseri B38T38, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4481; oder (f) Lactobacillus acidophilus B6T7, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4482;
(ii) der subkultivierte Abkömmling des hinterlegten Stamms (i); oder
(iii) eine von dem hinterlegten Stamm (i) abgeleitete Mutante;

In der vorliegenden Erfindung wurden Stuhlproben von gesunden Kleinkindern als Quellen für die Bakterienstämme verwendet. Die Proben wurden gescreent, um Bakterienstämme zu isolieren, welche zum Überdauern von Säuren und Gallensalzen in der gastrointestinalen Umgebung und zur Erniedrigung von Cholesterin fähig sind. Als ein Ergebnis wurden 6 neue Lactobacillus-Isolate mit den vorstehend angegebenen Merkmalen erhalten, nämlich, Lactobacillus gasseri B21T1, B21T6, C21T1, X21B7 und B38T38, und L. acidophilus B6T7. Diese Isolate wurden am Food Industry Research and Development Institute (FIRDI, 331 Shih-Pin Road, Hsinchu City 300, Taiwan, R. O. C.) am 18. Juni 2002 unter den Zugangsnummern CCRC 910195, CCRC 910196, CCRC 910198, CCRC 910199, CCRC 910197 bzw. CRC 910194 hinterlegt. Diese Isolate wurden ebenfalls in der Amerikanischen Kultur-Typ-Sammlung (ATCC, P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA) gemäß dem Budapester Vertrag am 21. Juni 2002 hinterlegt und erhielten die ATCC-Zugangsnummern PTA-4483, PTA-4484, PTA-4479, PTA-4480, PTA-4481 bzw. PTA-4482.
Die neuen Lactobacillus-Isolate gemäß der vorliegenden Erfindung zeigten eine höhere Fähigkeit zur Cholesterol-Erniedrigung im Vergleich zu den früher bekannten L. acidophilus ATCC 43121, ATCC 4356 und DDS-1.
Im zweiten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung vor, umfassend mindestens eines der neuen Lactobacillus-Isolate gemäß der vorliegenden Erfindung oder dessen subkultivierten Abkömmling oder eine daraus abgeleitete Mutante, wie beansprucht in Anspruch 1, und einen für die Herstellung von Lebensmitteln, wie Getränken, Kuchen, Kindernahrung, fermentierter Milch, diätischen Ergänzungen und Tierfutter, geeigneten Träger.
Gemäß dem dritten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, umfassend mindestens eine probiotisch wirksame Menge an einem der neuen Lactobacillus-Isolate gemäß der vorliegenden Erfindung oder dessen subkultivierten Abkömmling oder eine davon abgeleitete Mutante zur Behandlung und Prävention von gastrointestinalen Erkrankungen sowie für die Senkung von Serumcholesterol.
Die oben angegebenen und weiteren Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen offensichtlich werden, wenn diese im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen herangezogen wird, worin:
Die 1 ein Säulendiagramm ist, welches einen Säuretoleranz-Vergleich zwischen den Lactobacillus-Isolaten gemäß der vorliegenden Erfindung und bekannten Lactobacillus-Stämmen zeigt, wobei die Säuretoleranz als Δlog (a-b) ausgedrückt wird, worin "a" für die Anzahl an lebensfähigen Zellen nach Kochsalzlösungs-Behandlung bei pH 7 während 2 Stunden steht, und "b" für die Anzahl an lebensfähigen Zellen nach Kochsalzlösungs-Behandlung bei pH 2 während 2 Stunden steht;
2 ist ein Säulendiagramm, welches einen Gallensalztoleranz-Vergleich zwischen den Lactobacillus-Isolaten gemäß der vorliegenden Erfindung und bekannten Lactobacillus-Stämmen zeigt, wobei die Gallensalz-Toleranz ausgedrückt wird als Δlog (c-d), worin "c" für die Anzahl an lebensfähigen Zellen nach Inkubation in MRS-Nährbrühe während 24 Stunden steht, und "d" für die Anzahl an lebensfähigen Zellen nach Inkubation in mit 0,3% Ochsengalle ergänzter MRS-Nährbrühe während 24 Stunden steht;
3 ist ein Säulendiagramm, welches einen Wachstumsvergleich zwischen dem Lactobacillus-Isolat gemäß der vorliegenden Erfindung und bekannten Lactobacillus-Stämmen zeigt, welche beide in MRS-Nährbrühen mit 0,3% Ochsengalle kultiviert wurden;
4 zeigt die Beziehung zwischen der Konzentration an Cholesterol und der Menge an Phosphatidylcholin-Cholesterolmizellen, wobei die Mizellen unter Bezug auf S. Razin et al. (1980), Biochimica Biophysica Acta, 598: 628-640, hergestellt wurden, und zwar zum Zweck des Testens der Cholesterolsenkungs-Fähigkeit der isolierten Bakterienstämme gemäß der vorliegenden Erfindung;
5 zeigt die Nukleotidsequenz der 16S rDNA eines Bakterienisolats gemäß der vorliegenden Erfindung, Lactobacillus gasseri B21T1;
6 zeigt die Nukleotidsequenz der 16S rDNA eines Bakterienisolats gemäß der vorliegenden Erfindung, Lactobacillus gasseri B21T6;
7 zeigt die Nukleotidsequenz der 16S rDNA eines Bakterienisolats gemäß der vorliegenden Erfindung, Lactobacillus gasseri C21T1;
8 zeigt die Nukleotidsequenz der 16S rDNA eines Bakterienisolats gemäß der vorliegenden Erfindung, Lactobacillus gasseri X21B7;
9 zeigt die Nukleotidsequenz der 16S rDNA eines Bakterienisolats gemäß der vorliegenden Erfindung, Lactobacillus gasseri B38T38; und
die 10 zeigt die Unterschiede in den 16S rDNA-Nukleotidsequenzen zwischen dem Lactobacillus acidophilus-Isolat B6T7 der vorliegenden Erfindung, L. acidophilus und L. plantarum, wobei Stellen mit Nukleotidunterschieden zwischen dem B6T7-Isolat und L. acidophilus durch Buchstaben im Fettdruck angegeben werden, und Stellen mit Nukleotidunterschieden zwischen dem B6T7-Isolat und L. plantarum durch das Zeichen "*" angegeben werden.
Um Lactobacillus-Stämme zu erhalten, welche für Taiwan indigen sind und für ein Wachstum in der gastrointestinalen Umgebung der Bevölkerung von Taiwan geeignet sind, verwendeten die Anmelder Stuhlproben von gesunden Kindern mit einem Alter von ein bis sechs Jahren, welche in Hsinchu City, Taiwan, leben, als Quellen für das Screening der gewünschten Bakterienstämme und verwendeten eine Serie von auf Rogosa-Agar basierenden Selektionsmedien zum Screenen von hinsichtlich Lactobacillus verdächtigten Stämmen. 400 verdächtigte Stämme wurden in 828 Isolaten gefunden, welche aus 43 Proben erhalten wurden. Diese verdächtigten Stämme wurden weiter hinsichtlich der Charakteristika getestet, die in der vorangehenden Zusammenfassung der Erfindung, siehe oben, erwähnt wurden, welche zusammengefasst werden können als:

1. Stabilität gegenüber Säure;
2. Stabilität gegenüber Gallensalzen; und
3. Fähigkeit zur Erniedrigung von Cholesterol.

Diese verdächtigten Stämme wurden mit bekannten Stämmen bezüglich der zuvor erwähnten Merkmale verglichen und wurden gescreent, wodurch man 6 Lactobacillus-Isolate mit den gewünschten Fähigkeiten erhielt.
Die 6 erhaltenen Isolate wurden ferner unter Anwendung des API-Identifikationssystems, des Micro-IS-Systems und der 16S rDNA-Sequenzanalyse identifiziert. Gemäß den Identifizierungsergebnissen wurden diese 6 Isolate jeweils klassifiziert und als Lactobacillus gasseri B21T1, B21T6, C21T1, X21B7 und B38T38, sowie L. acidophilus B6T7 bezeichnet. Diese Isolate wurden beim Food Industry Research and Development institute (FIRDI), 331 Shih-Pin Road, Hsinchu City 300, Taiwan, R. O. C.) am 18. Juni 2002 unter den Zugangsnummern CCRC 910195, CCRC 910196, CCRC 910198, CCRC 910199, CCRC 910197 bzw. CRC 910194 hinterlegt. Diese Isolate wurden auch in der Amerikanischen Kultur-Typ-Sammlung (ATCC, P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA) gemäß dem Budapester Vertrag am 21. Juni 2002 hinterlegt und erhielten die Zugangsnummern PTA-4483, PTA-4484, PTA-4479, PTA-4480, PTA-4481 bzw. PTA-4482.
Im Hinblick auf die nutzbringenden, oben erwähnten, Merkmale sind die Lactobacillus-Isolate gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet zur Verwendung als Probiotika. Zum Beispiel können diese Isolate in eine große Auswahl an essbaren Materialien formuliert werden, einschließlich flüssigen Milchprodukten (Milch, konzentrierte Milch), fermentierter Milch (Joghurt, Sauermilch, Gefrierjoghurt, mit Milchsäurenbakterien fermentierte Getränke), Milchpulver, Eiscreme, Rahmkäse, Trockenkäse, Sojabohnenmilch und fermentierter Sojabohnenmilch, Frucht-Gemüse-Säften, Fruchtsäften, Sportgetränken, Desserts, Süßwaren bzw. Kandiszucker, Kinder(fertig)nahrungen, Gesundheits-Nahrungsmittelprodukten, Tierfutter und diätetischen Ergänzungen. Die Bakterienzahl in jedem dieser Produkte kann etwa 10⁶ bis 10⁹ CFU (koloniebildende Einheiten) pro Gramm oder pro Milliliter betragen.
Für den Fachmann auf dem Gebiet ist es offensichtlich, dass die Lactobacillus-Isolate dieser Erfindung als eine Lebensmittelergänzungs-Komponente verwendet werden können, und dass sie, gemäß bekannten Methodiken, während der Herstellung von Rohmaterialien zugegeben werden können, oder dass sie, wenn ihre Teilnahme bei der Fermentierung nicht gewünscht wird, anschließend an den Fermentierungsprozess zugegeben werden können, sodass sie zu Formen formuliert werden können, welche für den Verzehr durch Mensch und Tier geeignet sind. Vorzugsweise können die Lactobacillus-Isolate der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit mindestens einem anderen probiotischen Organismus zu essbaren Materialien formuliert werden. Diese probiotischen Organismen können Lactobacillus sp., wie L. acidophilus, L. lactis, L. brevis, L. casei, L. plantarum, L. salivarius, L. bifidus, L. bulgaricus, L. causasicus und L. rhamnosus; Streptococcus sp., wie Streptococcus thermophilus und Streptococcus lactis; Hefen, wie Candida kefyr, und Saccharomyces florentinus; oder eine Kombination hiervon einschließen.
In einer anderen Anwendung werden die Lactobacillus-Isolate der vorliegenden Erfindung per se oder die oben erwähnten Produkte, welche diese Isolate beinhalten, als lyophilisiertes Pulver oder sprühgetrocknetes Pulver hergestellt, sodass jedes Produkt etwa 10⁸ bis mehr als 10⁹ CFU an aktiven Lactobacillus-Zellen enthält. Darüber hinaus können solche Produkte in Tabletten- oder Kapselform hergestellt werden, indem man dazu Hefepulver, Saccharide oder andere Füllmittel, z. B. die Verdauung verbessernde Arzneistoffe oder Instant-Fertignahrungsmittel, enthaltend Lactobacillus, und Bakterienpulver, für den direkten Verzehr zusetzt.
Darüber hinaus betrachtet die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung der zuvor erwähnten Lactobacillus-Isolate allein oder in Kombination mit anderen aktiven Bestandteilen als Arzneistoff zur Bekämpfung der Ansiedlung von unerwünschten Darmmikroorganismen im Verdauungstrakt eines Säugers, sodass gastrointestinale Probleme gelindert werden, welche von diesen unerwünschten Darmmikroorganismen verursacht werden. Die Zusammensetzung des Arzneistoffs kann zu einer Lösung, Emulsion, Pulver, Tablette, Kapsel oder anderen geeigneten Formen zur oralen Verabreichung formuliert werden.
Im Hinblick auf die Fähigkeit der Lactobacillus-Isolate der vorliegenden Erfindung, Cholesterol zu erniedrigen, wird es auch in Betracht gezogen, dass die Lactobacillus-Isolate der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung von Gesundheits-Nahrungsmittelprodukten und nicht verschreibungspflichtigen Arzneistoffen zur Senkung von Serumcholesterol verwendet werden können.
Wie hierin oben beschrieben wurde, wird davon ausgegangen, dass Bakterienstämme, aufweisend bakteriologische Charakteristika, welche zu denjenigen von den Lactobacillus-Isolaten der vorliegenden Erfindung, deren subkultivierten Abkömmlingen oder davon abgeleiteten Mutanten, wie beansprucht in Anspruch 1, identisch sind, innerhalb des Umfangs und technischen Konzepts der vorliegenden Erfindung liegen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Mutante" auf einen Bakterienstamm, dessen genetische Zusammensetzung sich von derjenigen eines Referenz- oder Eltern-Stamms um mindestens ein Nukleotid unterscheidet, z. B. wegen Nukleotidsubstitution, -insertion oder -deletion. Eine Mutante der Erfindung kann durch eine Anzahl von Methoden, die von natürlicher Mutation verschieden sind, produziert werden. Zum Beispiel kann die Mutante aus der statistischen Mutagenese ihres Elternstamms erhalten werden, z. B. mittels chemischem Mutagen, Transposon oder Bestrahlung. Darüber hinaus kann ein Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung eine rekombinante Nukleinsäuresequenz einschließen. Zum Beispiel kann eine Mutante ein Bakterienstamm sein, wel cher eine zusätzliche Nukleinsäuresequenz beinhaltet, z. B. eine Sequenz, die in eine Zelle ihres Eltern-Stamms transformiert, transduziert oder anderweitig inseriert wurde. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid codieren, welches generell oder konditionell exprimiert wird. Alternativ dazu kann die zusätzliche Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz codieren, welche fähig zur Veränderung der zellulären Physiologie ist, z. B. eine Antisense-, eine Ribozym- oder irgendeine andere Nukleinsäuresequenz. In einem anderen Beispiel wird die Nukleinsäure in ein endogenes Gen inseriert, um dadurch die Funktion des endogenen Gens zu verändern (zu steigern oder zu zerstören). Zum Beispiel kann die inserierte Nukleinsäure ein Knockout-Konstrukt sein, welches das endogene Gen inaktiviert, oder ein künstlicher Enhancer oder Promotor, welcher die Transkription des endogenen Gens erhöht.
Die vorliegende Erfindung wird in weiterer Ausführlichkeit unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche lediglich zu veranschaulichenden Zwecken angegeben sind, und mit denen nicht beabsichtigt ist, den Umfang der vorliegenden Erfindung zu begrenzen.
Beispiel 1 Isolierung und Screening von Lactobacillus-Isolaten
Materialien und Methoden:
I. Kulturmedien und Verdünnungsmittel:
1. Screening-Kulturmedien: (A) Tomatensaft-Agar-Medium:

Enzymatisches Casein-Hydrolysat (Sigma, Louis, MO., USA) 10 g

Magermilch 10 g

Tomatensaft 400 ml

Agar 12 g

Destilliertes Wasser Einstellen auf 1 Liter

(B) Rogosa-Agar-Medium:

Rogosa-Agar (Merck, Darmstadt, Deutschland) 74,5 g

Destilliertes Wasser 1 L
Nach Auflösen des Agars durch Mikrowellen-Erwärmung und Abkühlen der resultierenden Mischung auf 55°C wird der pH mit Essigsäure auf 5,5 eingestellt. (C) Lactobacillus-Selektions-Medium (LBS):

Rogosa-Agar 8,4 g

Tomatensaft 40 ml

destilliertes Wasser 60 ml
Nach Auflösen des Agars durch Mikrowellen-Erwärmung und Abkühlen der resultierenden Mischung auf 55°C wird der pH mit Essigsäure auf 5,5 eingestellt.
(D) Rogosa + X-glu-Agar-Medium:
80 mg 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid (X-glu, Sigma, Louis, MO, USA) wurden in 100 ml 0,2 M Tris-Puffer (pH 8,5) gegeben und unter Einsatz von Schallbehandlung gelöst. 10 ml der resultierenden Lösung wurden zu 190 ml Rogosa-Agar bei 55°C zugesetzt, um Rogosa + X-glu-Agar zu bilden, welcher X-glu bei einer Endkonzentration von 40 μg/ml enthielt.
2. Bakterielles Aktivations-Medium:

(A) Bacto Lactobacilli-MRS-Nährbrühe (Difco Laborstories, Detroit, MI, USA); und
(B) MRS-Agar: Bacto-Lactobacilli-MRS-Nährbrühe, ergänzt mit bakteriologischem Agar (Scharlau Chemi S. A., Barcelona, Spanien) (15 g/l).

3. Ribose-Nutzungs-Medium:

Zusammensetzung von Basalmedium:

Bacto-Proteose-Pepton Nr. 3 (Difco Laborstories, Detroit, MI, USA)	10 g
Bacto-Hefe-Extrakt (Difco Laborstories, Detroit, MI, USA)	5 g
Tween 80	1 g
Ammoniumhydrogencitrat	2 g
Natriumacetat	5 g
Magnesiumsulfat	0,1 g
Mangansulfat	0,05 g
Dikalium(hydrogen)phosphat	2 g
Chlorphenol-Rot	0,05%
Destilliertes Wasser	1 l
Einstellen des pH-Werts auf 6,3 mit HCl.

Das Basalmedium, wie oben hergestellt, wurde in Teströhrchen in einer Menge von 4,5 ml Basalmedium je Röhrchen gepackt. Nach Sterilisieren durch Autoklavierung bei 121°C während 15 Minuten wurde in jedes Röhrchen 0,5 ml einer 10%igen Riboselösung zugesetzt, welche durch Filtration sterilisiert worden war.
4. Verdünnungsmittel: 0,1% Pepton-Wasser (BACTO^TM Peptone, Difco Laborstories, Detroit, MI, USA)
II. Vorgehensweisen zum Isolieren und Screenen von Lactobacillus-Stämmen:

1. Fäzes von ungefähr der Größe einer Fingerspitze, welche aus dem mittleren Bereich der Stuhlproben von Kindern im Alter von einem bis sechs Jahren unter Verwendung eines Stäbchens entnommen worden waren, wurden in ein Teströhrchen gegeben, welches 9 ml des oben genannten Verdünnungsmittels (0,1% Pepton-Wasser) enthielt, wodurch man eine 10-fach verdünnte Testlösung erhielt. Die verdünnte Testlösung wurde ausreichend und gleichmäßig gerührt und wurde dann mehrere Minuten lang stehen gelassen, sodass die Mikroorganismen in den Testproben in das Verdünnungsmittel freigesetzt wurden.
2. 1 ml der vorstehend genannten verdünnten Testlösung wurde in ein anderes Teströhrchen, welches 9 ml desselben Verdünnungsmittels enthielt, eingebracht. Auf diese Weise wurde eine Verdünnungsreihe ausgeführt, bis eine 10⁴-fache Verdünnung erstellt wurde.
3. 10²-, 10³- und 10⁴-fach verdünnte Testlösungen, jeweils in einer Menge von 0,2 ml, und hergestellt durch die serielle Verdünnung, die im Schritt 2 beschrieben ist, wurden jeweilig auf verschiedene Screening-Medien aufgetragen (Rogosa-Agar, Tomatensaft-Agar, Lactobacillus-Selektivmedium und Rogosa + X-glu-Agar) und wurden unter Verwendung eines L-förmigen Glasstabs gleichmäßig ausgestrichen. Diese Screening-Medien wurden dann in einen anaeroben Inkubator eingebracht, enthaltend gemischte Gase (5% H₂, 10% CO₂ und 85% N₂), der auf eine Temperatur von 37°C eingestellt war, und 2 bis 4 Tage lang kultiviert;
4. Stäbchenförmige Bakterienkolonien, welche eine blaue Farbe auf Rogosa + X-glu-Agar aufwiesen und welche bei mikroskopischer Untersuchung gezeigtermaßen nichtbeweglich waren, oder diejenigen, welche bei Kultivieren auf anderen Screening-Medien halb-transparent erschienen und welche bei mikroskopischer Untersuchung ebenfalls nicht-beweglich waren, wurden ausgewählt. Die mittels eines Stäbchens abgenommenen Bakterien brachte man in ein Teströhrchen, enthaltend MRS-Nährbrühe und ein inneres Fermentations-Rohr, ein. Nach 1 bis 2 Tagen Kultivieren bei 37°C wurden Bakterienstämme, welche ohne Erzeugung von Gas proliferierten und von welchen gezeigt wurde, bei Grampositiv-Färbung ein positives Ergebnis aufzuweisen, abgesammelt.
5. Nachdem sie zweimal in MRS-Nährbrühe aktiviert worden waren, wurden die im Schritt 4 gesammelten Bakterienstämme hinsichtlich Wachstumstemperatur und Ribose-Nutzung auf die folgenden Arten getestet: (i) MRS-Nährmedium wurde mit 1% eines bakteriellen Inokulums inokuliert und wurde 14 Tage lang bei 15°C stehen gelassen. Wenn gezeigt wurde, dass das Medium ein Bakterienwachstum darin aufwies, deutete dies darauf hin, dass der inokulierte Bakterienstamm bei 15°C wachsen kann. Wenn andererseits am Tag 14 kein Bakterienwachstum gefunden wurde, wies dies darauf hin, dass der inokulierte Bakterienstamm bei 15°C nicht wachsen kann. (ii) MRS-Nährmedium wurde mit 1% eines bakteriellen Inokulums inokuliert und 2 Tage lang bei 45°C stehen gelassen. Wenn es sich zeigte, dass das Medium ein Bakterienwachstum darin aufwies, deutete dies darauf hin, dass der inokulierte Bakterienstamm bei 45°C wachsen kann. Wenn andererseits kein Bakterienwachstum gefunden wurde, wies dies darauf hin, dass der inokulierte Bakterienstamm bei 45°C nicht wachsen kann. (iii) Ein Ribose-Nutzungs-Medium wurde mit 1% eines bakteriellen Inokulums inokuliert und wurde mehrere Tage lang bei 37°C stehen gelassen. (iv) Wenn sich die Farbe des Kulturmediums von Violett zu Gelb verwandelte, zeigte dies an, dass der inokulierte Bakterienstamm in der Lage ist, Ribose für das Wachstum zu nutzen und Säure herzustellen. Wenn die Farbe des Kulturmediums nach sieben Tagen violett blieb, ließ man das Medium einige weitere Tage lang stehen. Wenn sich die Farbe des Kulturmediums immer noch nicht zu Gelb verwandelte, wies dies darauf hin, dass der inokulierte Bakterienstamm nicht fähig ist, Ribose für das Wachstum zu nutzen und Säure herzustellen.

III. Ergebnisse:
In diesem Beispiel basierten die Lactobacillus-Screening-Medien vorwiegend auf Rogosa-Agar, wobei einige von ihnen ferner mit Tomatensaft oder X-glu ergänzt wurden. Tomatensaft ist reich an Vitamin-B-Gruppen und ist nützlich für das Wachstum von Lactobacillus. Wie für Rogosa-Agar, hilft die darin enthaltene Essigsäure bei der Senkung des pH-Werts, sodass Bakterienwachstum inhibiert wird, und die hohe Konzentration an Acetationen besitzt ebenfalls die Auswirkung des Hemmens des Wachstums von Mikroorganismen.
Wenn ein Lactobacillus acidophilus-Stamm auf Rogosa-Agar kultiviert wird, wird er weiße Kolonien bilden und ist nicht ohne Weiteres von anderen Stämmen von Lactobacillus unterscheidbar. Wenn X-glu zum Rogosa-Agar zugesetzt wird, werden die Bakterienkolonien von Lactobacillus acidophilus eine blaue Farbe bekommen. Dies beruht darauf, dass die Zellen von Lactobacillus acidophilus die Aktivität von β-D-Glucosidase aufweisen, welche die β-D-glucosidische Bindung von X-glu spalten kann, wodurch ein blaues Chromogen erzeugt wird, welches die Bakterienkolonien von Lactobacillus acidophilus blau aussehen lässt. Da dieses Enzym jedoch ebenfalls in den Zellen vieler anderer Mikroorganismen vorhanden ist, müssen die selektierten Bakterienstämme einer mikroskopischen Untersuchung, einer Gram-Färbung und den oben erwähnten physiologischen und biochemischen Tests hinsichtlich Ribosenutzung und Wachstumstemperatur unterzogen werden, bevor verdächtigte Stämme mit den gewünschten Eigenschaften selektiert werden können.
Die Anmelder sammelten 43 Stuhlproben von gesunden Kindern mit einem Alter von ein bis sechs Jahren, welche aus Hsinchu City in Taiwan kamen. Die verdünnte Probe jeder Testprobe wurde auf jedes der Selektivmedien ausplattiert, und zwar gemäß den oben beschriebenen Vorgehensweisen. Als die Bakterienkolonie-Bildung auf den Selektivmedien beobachtet wurde, wurden Bakterienkolonien mit verschiedenen Farben und Morphologien ausgewählt, um einer mikroskopischen Untersuchung unterzogen zu werden. Bakterienkolonien, welche aus stäbchenförmigen Bakterienzellen gebildet waren, wurden ferner einer Gram-Färbung unterworfen. Jedwede Bakterienkolonie, von welcher man feststellte, grampositive Stäbchen-Bakterien zu enthalten, wurde dann selektiert und als ein "Isolat" bezeichnet.
Die so selektierten Isolate wurden jeweilig in MRS-Nährbrühe eingebracht, welche ein inneres Fermentationsröhrchen darin enthielt, und diejenigen, welche während der Kultur kein Gas erzeugten, wurden selektiert, um Wachstumstemperatur- und Ribosenutzungs-Tests unterzogen zu werden. Jedweder getestete Stamm, welcher bei 45°C aber nicht bei 15°C wachsen kann, und welcher Ribose nicht als Kohlenstoffquelle für das Wachstum nutzen kann, wurde aufbewahrt, und die auf dieser Stufe selektierten Stämme wurden als "verdächtigte Stämme" bezeichnet.

Unter Bezug auf die Tabelle 1 erhielten die Anmelder 400 verdächtigte Stämme von insgesamt 828 Isolaten, welche aus den gesammelten 43 Testproben selektiert worden waren. Tabelle 1. Nummerierung von gesammelten Testproben* und Anzahlen von aus den Testproben erhaltenen Bakterienisolaten.

Proben-Nummer	Anzahl an Bakterienisolaten	Anzahl verdächtigter Stämme	Proben-Nummer	Anzahl an Bakterienisolaten	Anzahl verdächtigter Stämme
1	40	0	23	3	0
2	0	0	24	0	0
3	0	0	25	100	100
4	26	0	26	0	0
5	45	0	27	0	0
6**	68	55	28	0	0
7	0	0	29	0	0
8	0	0	30*	60	0
9	0	0	31	0	0
10	0	0	32	0	0
11	0	0	33	0	0
12	60	60	34	0	0
13	0	0	35	0	0
14	0	0	36	139	115
15	0	0	37	0	0
16	0	0	38**	120	40
17	0	0	39	0	0
18	0	0	40	0	0
19	0	0	41	60	0
20	14	0	42	0	0
21**	30	30	43	60	0
22	3	0	insgesamt	823	400

* Herkunft der Testproben: Fäkalien von Kindern im Alter von ein bis sechs Jahren aus Hsinchu City, Taiwan.
**: Die Probennummern, aus denen die Lactobaclllus-Isolate gemäß dieser Erfindung erhalten wurden.

Die verdächtigten Stämme wurden dann einem Säuretoleranztest, Gallensalz-Toleranztest und einem Cholesterol-Erniedrigungs-Test unterzogen, welche in den folgenden Beispielen beschrieben sind. Sechs Isolate, nämlich B21T1, B21T6, C21T1, X21B7, B38T38 und B6T7, zeigten hervorragende Eigenschaften in diesen Tests und wurden deshalb mit den folgenden bekannten Bakterienstämmen in Hinsicht auf die oben erwähnten Eigenschaften verglichen:

1. Lactobacillus acidophilus CCRC 17064 (entsprechend ATCC 43121; isoliert aus Schweinen): dieser Lactobacillus-Stamm besitzt die Fähigkeit, Serumcholesterol zu erniedrigen (S. E. Gilliland et al. (1985), Appl. Environ. Microbiol., 49: 377-381; S. E. Gilliland und D. K. Walker (1990), J. Dairy Sci., 73: 905-911; F. A. M. Kalver und R. van der Meer (1993), Appl. Environ. Microbiol., 59: 1120-1124; D. O. Noh et al. (1997), J. Dairy Sci., 82: 3107-3113);
2. Lactobacillus acidophilus CCRC 10695^T (entsprechend ATCC 4356; isoliert aus Menschen): dieser Lactobacillus-Stamm ist ein Standardstamm von Lactobacillus acidophilus und ist von menschlicher Herkunft (D. K. Walker und S. E. Gilliland (1993), J. Dairy Sci., 76: 956-961);
3. Lactobacillus acidophilus DDS-1 (isoliert aus Menschen): dieser Lactobacillus-Stamm ist ein kommerziell verfügbares Produkt (Nebraska Cultures, Inc.);
4. Lactobacillus acidophilus CCRC 14065 (entsprechend CSCO 2401, kommerziell verfügbar von Commonwealth Scientific Industrial Research Organization (CSIRO), Canberra, Australien; und
5. Lactobacillus gasseri CCRC 14619^T (entsprechend ATCC 33323; isoliert aus Menschen) (Int. J. Syst. Bacteriol. (1980), 30, 601; E. Lauer und O. Kandler, Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe C, 1980, 1, 75-78).

Beispiel 2 Säuretoleranztest
I. Experimentelle Vorgehensweisen:
Der in diesem Beispiel durchgeführte Bakterienzellen-Überlebenstest wurde unter Bezugnahme auf das Verfahren, welches in J. E. Holcombe et al. (1991), Cult. Dairy Prod. J., 26(3): 4-5, beschrieben ist, sowie demjenigen, welches in US 5 711 977 offenbart wird, erteilt an Y. S. Yang et al., ausgeführt, wobei eine neutrale Umgebung (pH 7) und eine saure Umgebung (pH 2), welche den Magen simulierte, angewandt wurden.
Nach zweimaliger Aktivierung in MRS-Nährbrühe wurde die Kultur von jedem der getesteten Bakterienstämme 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstands wurde das Zellpellet in 1 ml normaler Kochsalzlösung (0,85% NaCl, pH 7) resuspendiert und mittels eines Stäbchens gerührt, gefolgt von Vortexen zum Erhalten einer homogenen Bakteriensuspension. Aliquots (0,5 ml) der resultierenden bakteriellen Zellsuspension wurden mit normalen Kochsalzlösungen von pH 7 bzw. pH 2 vermischt, und die resultierenden Mischungen wurden 2 Stunden lang in einem 37°C-Inkubator stehen gelassen. Danach wurden die Bakterienzellen, welche überlebt hatten, gezählt, und die Säuretoleranz jedes getesteten Bakterienstamms wurde durch Δlog (Anzahl an Bakterienzellen) ausgedrückt, d. h. einem berechneten log-Wert von (Anzahl an Bakterienzellen, welche nach der normalen Kochsalzlösungs-Behandlung bei pH 7 überlebten, minus Anzahl an Bakterienzellen, welche nach der normalen Kochsalzlösungs-Behandlung bei pH 2 überlebten). Bakterienstämme mit einem kleineren Wert für Δlog (Anzahl an Bakterienzellen) wurden als eine höhere Säuretoleranz aufweisend angesehen.
II. Ergebnisse:
Die meisten Mikroorganismen weisen keinerlei Toleranz in einer sauren Umgebung auf. Obwohl Milchsäurebakterien an sich säureproduzierende Bakterien sind, wachsen sie nur in Umgebungen mit einem pH-Wert von 3,2 bis 4,5. Deshalb ist die extrem saure Umgebung des Magens (pH 2,0 bis 3,2) auch ein Hauptfaktor, welcher die Überlebensrate der Milchsäurebakterien beeinflusst. Abhängig von der Eintrittszeit und dem Typ des Mageninhalts wird der pH-Wert von Magensäure während einer Dauer von 2 Stunden durchschnittlich in einem Bereich von pH 1,5 bis 4,5 variieren. Deshalb wurde in dem Experiment dieses Beispiels ein pH-Wert von 2 als ein Stellvertreter des pH-Werts des Magens verwendet. Da Magensäure eine ähnliche Natur wie Chlorwasserstoffsäure aufweist, wurde darüber hinaus eine normale Kochsalzlösung verwendet, bei welcher der pH-Wert mit Chlorwasserstoffsäure auf 2 eingestellt worden war (0,85% NaCl/0,01 N HCl), um die getesteten Bakterienstämme 2 Stunden lang bei 37°C zu behandeln. Die Bakterienzellen, welche in dieser Säurebehandlung überlebt hatten, wurden gezählt und mit denjenigen der Kontrollgruppe verglichen, die mit normaler Kochsalzlösung bei pH 7 behandelt worden war.
Die erhaltenen experimentellen Ergebnisse zeigten, dass nach den Behandlungen bei den oben angegebenen zwei verschiedenen pH-Werten bei 37°C während 2 Stunden, Lactobacillus acidophilus CCRC 17064 die höchste Säuretoleranz zeigte (1), und die Bakterienzählung davon nach der Säurebehandlung lediglich um 1,9 hinsichtlich des log-Werts abnahm. Andererseits zeigten Lactobacillus acidophilus CCRC 10695^T und Lactobacillus gasseri CCRC 14619^T geringe Säuretoleranz, und ihre Bakterienzählungen nahmen um 4,3 bzw. 4,4 hinsichtlich des log-Werts ab.
Die Säuretoleranz des neuen Isolats B21T1, erhalten im Beispiel 1 dieser Erfindung, (welches als Lactobacillus gasseri gemäß seinen bakteriologischen Charakteristika klassifiziert wurde, wie im folgenden Beispiel beschrieben wird), ist ähnlich zu derjenigen von CCRC 14065, und ihre Bakterienzählungen sanken um 3,9 hinsichtlich des log-Werts. Die anderen fünf neuen Isolate der vorliegenden Erfindung (B21T6, C21T1, X21B7, B38T38 und B6T7) besitzen ähnliche Spiegel an Säuretoleranz, und sind fähig, den Screening-Index der Säuretoleranz zu erfüllen, einen Wert des Δlog (Anzahl an Bakterienzellen) < 4 ( US 5 711 977 , erteilt an Y. S. Yang et al.).
Beispiel 3. Gallensalz-Toleranz-Test
I. Experimentelle Vorgehensweisen: 1% eines Bakterien-Inokulums
Nach zweimaligem Aktivieren in MRS-Nährbrühe wurde 1% Inokulum von jedem getesteten Bakterienstamm in 10 ml MRS-Nährbrühe bzw. 10 ml MRS-Nährbrühe, ergänzt mit 0,3% Ochsengalle (MRSO), inokuliert. Nach 24 Stunden langem Kultivieren bei 37°C wurde die Bakteriendichte (OD₆₅₀) jeder Kultur mittels eines Spektrophotometers gemessen, und die Anzahl an überlebenden Bakterienzellen wurde ebenfalls gezählt. Die Gallensalz-Toleranz wird durch Δlog (Anzahl an Bakterienzellen) ausgedrückt, d. h. einem berechneten log-Wert von (Anzahl an Bakterienzellen, kultiviert in MRS-Nährbrühe, minus der Anzahl an Bakterienzellen, kultiviert in MRSO-Nährbrühe), wobei die Gallensalz-Toleranz des getesteten Bakterienstamms umso höher sein wird, je kleiner das berechnete Δlog (Anzahl an Bakterienzellen) ist.
II. Ergebnisse:
Verschiedene Milchsäurebakterien zeigten enorme Unterschiede hinsichtlich der Überlebensrate nach Behandlung mit Gallensalzen. Deshalb ist das Screening von Milchsäurebakterien mit Gallensalz-Toleranz wichtig in der Selektion von probiotischen Bakterien (S. E. Gilliland et al. (1984), J. Dairy Sci., 67: 3045-3051; P. Marteau et al. (1997), J. Dairy Sci., 80: 1031-1037). In früheren Untersuchungen wurde Ochsengalle weithin in Medien für das selektive Kultivieren von menschlichen Darmbakterien verwendet. Deshalb sollte die Effektivität von Ochsengalle sehr ähnlich zu derjenigen von menschlichen Gallensalzen sein, und Ochsengalle wurde üblicherweise in einer durchschnittlichen Konzentration von 0,3% (w/v) verwendet (S. E. Gilliland und D. K. Walker (1990), J. Dairy Sci., 73: 905-911; D. K. Walker und S. E. Gilliland (1993), J. Dairy Sci., 76: 956-961).

Die erhaltenen experimentellen Ergebnisse zeigten, dass mit der Ausnahme von CCRC 10695^T, CCRC 14619^T und CCRC 14065 der gemessene OD₆₅₀-Wert (Bakteriendichte) von jedem getesteten Bakterienstamm größer als 2 war (Tabelle 2), ungeachtet dessen, ob der getestete Bakterienstamm in einem Medium mit oder ohne 0,3% Ochsengalle kultiviert worden war. Dies weist darauf hin, dass die Zugabe von 0,3% Ochsengalle einen geringen Effekt auf das Wachstum der getesteten Bakterienstämme zu besitzen scheint. Tabelle 2. Wachstumsvergleich von getesteten Bakterienstämmen, kultiviert in MRS-Nährbrühe mit und ohne 0,3% Ochsengalle während 24 Stunden.

Kulturen von getesteten Bakterienstämmen	Bakteriendichte (OD₆₅₀-Wert)
Kulturen von getesteten Bakterienstämmen	MRS-Nährbrühe	MRS-Nährbrühe + 0,3% Ochsengalle
B6T7	2,49	2,74
C21T1	2,44	2,56
B38T38	2,45	2,03
B21T1	2,57	2,53
B21T6	2,62	2,29
X21B7	2,69	2,50
CCRC 17064	2,91	2,37
CCRC 10695^T	2,35	1,09
CCRC 14065	2,55	1,79
CCRC 14619^T	2,96	1,58
DDS-1	2,87	2,72

Allerdings wird es ebenfalls bemerkt, dass die Bakteriendichten von zwei neuen Isolaten gemäß der vorliegenden Erfindung, nämlich B6T7 und C21T1, in MRSO-Nährbrühe höher sind als in MRS-Nährbrühe. Dies zeigt, dass andere Faktoren existieren können, welche die Lichtabsorption stören. Deshalb wurden die Anzahlen an überlebenden Bakterienzellen der getesteten Bakterienstämme, welche während 24 Stunden in diesen zwei Medien kultiviert wurden, weiter untersucht.
Unter Bezugnahme auf die 2 lässt es sich aus einer Verringerung der Zellzahl der untersuchten Bakterienstämme ersehen, dass CCRC 14619^T eine sehr geringe Gallensalz-Toleranz aufweist, und CCRC 10695^T bzw. das neue Isolat B38T38 der vorliegenden Erfindung gezeigtermaßen jeweils eine höhere Gallensalz-Toleranz als diejenige von CCRC 14619^T aufweisen. Der Bakterienstamm, welcher die höchste Gallensalz-Toleranz aufzeigt, ist das neue Isolat B6T7 der vorliegenden Erfindung, und die Gallensalz-Toleranz des Rests der Bakterienstämme ist im Wesentlichen ähnlich. Das heißt, nach 24 Stunden Kultivieren in MRS-Nährbrühe, welche 0,3% Ochsengalle enthielt, lagen die Zahlen an toten Bakterienzellen davon im Bereich von 1 bis 2 log-Werten.
Ferner wurden die Wachstumskurven einiger Bakterienstämme, welche in MRS-Nährbrühe mit 0,3% Ochsengalle kultiviert worden waren, beobachtet. Die Wachstums geschwindigkeit von jedem der getesteten Stämme wird durch den Gradienten der Wachstumskurve repräsentiert. Damit soll gesagt sein, je größer der Gradient, desto schneller die Wachstumsgeschwindigkeit, und umso höher daher die Toleranz gegenüber Gallensalz. Aus der 3 kann es ersehen werden, dass die Wachstumsgeschwindigkeit von CCRC 17064 am schnellsten ist, diejenige der neuen Isolate X21B7 und B21T1 der vorliegenden Erfindung langsamer sind, und diejenigen von CCRC 14065, CCRC 10695^T und DDS-1 die Langsamsten sind.
Obwohl geringe Unterschiede unter den aus verschiedenen Beobachtungsverfahren erhaltenen Versuchsergebnissen vorhanden sind, kann man von diesen Tests ausgehend annehmen, dass die sechs neuen, in der vorliegenden Erfindung gescreenten, Lactobacillus-Isolate die gleiche Toleranz gegen Säure und Gallensalze aufzeigen.
Beispiel 4. Assay hinsichtlich der Fähigkeit der getesteten Bakterienstämme zur Senkung von Cholesterol
I. Experimentelle Vorgehensweise:
(A) Quellen von Cholesterol:
In Bezug auf den Test von Bakterienstämmen bei der Erniedrigung von Cholesterol wurde PPLO (BACT PPLO-SERUM-FRAKTION) in den meisten Bezugsstellen und Patentveröffentlichungen des Stands der Technik als Quelle für Cholesterol verwendet. Allerdings wurde die Herstellung dieses Produkts bereits eingestellt. Daher nahmen die Anmelder, in diesem Beispiel, die Phosphatidylcholin-Cholesterol-Herstellungsverfahren an, offenbart in Huang, C., und T. E. Thomopson (1974), Methods Enzymol., 32: 485-489, und in S. Razin et al. (1980), Biochimica Biophysica Acta, 598: 628-640, in welchen Pferdeserum und Phosphatidylcholin-Cholesterol als Quelle für Cholesterol verwendet wurden, um eine homogen verteilte Phosphatidylcholin-Cholesterol-Lösung herzustellen, deren Volumen in einer positiven linearen Funktions-Beziehung zur Cholesterolkonzentration steht (4).
1. Pferdeserum
In Wasser gelöstes Pferdeserum wurde durch einen 0,45-μm-Membranfilter gefiltert und wurde in einem Kühlschrank bei –20°C aufbewahrt.
2. Phosphatidylcholin-Cholesterol (Eierlecithin + Cholesterol)
Gemäß S. Razin et al. (1980), Biochimica Biophysica Acta, 598: 628-640, wurden Eierlecithin und Cholesterol in eine Schliffstopfen-Flasche eines Rotationsvakuum-Verdampfers (EYELA) eingebracht und wurden in einer ausreichenden Menge an Chlo roform gleichmäßig gelöst, woran sich eine Trocknung mittels Stickstoff-Durchblasung anschloss, sodass Cholesterol und Eierlecithin homogen gemischt wurden, um einen gleichförmigen Film auf der Glaswand der Schliffstopfen-Flasche zu bilden. Nach erneutem Lösen des Films in einer 0,4 M Saccharoselösung wurde die Schliffstopfen-Flasche mit N₂-Gas darin befüllt, und dann mit einem Deckel verschlossen, gefolgt von Einwickeln mit einer Aluminiumfolie, sodass die Wahrscheinlichkeit einer Lipidoxidation verringert wurde.
Nachdem die verschlossene Schliffstopfen-Flasche in einem Sonicator vom Wasserbadtyp bei 4°C 15 Minuten lang schallbehandelt worden war, wurde die so gebildete gemischte Lösung zweimal durch einen 0,22-μm-Membranfilter unter Druck hindurchgeleitet und wurde dann in einem 4°C-Kühlschrank aufbewahrt (die Lösung muss innerhalb von 3 Tagen ab ihrer Herstellung verwendet werden).
(B) Test-Gruppierung:
Test (1): Nach zweimaligem Aktivieren in MRS-Nährbrühe wurde 1% Inokulum von jedem der getesteten Bakterienstämme in 10 ml MRSS inokuliert, enthaltend 8,8 ml MRS, 1,2 ml Cholesterollösung, wie oben hergestellt, und 0,3% Ochsengalle, und 24 Stunden lang in einem anaeroben Inkubator (10% CO₂ und 90% N₂) bei 37°C kultiviert. Danach wurden, gemäß dem im nachstehenden Punkt (C) beschriebenen Verfahren, Überstandproben und Zellpelletproben jeweils aus den resultierenden Kulturen, welche mit den getesteten Bakterienstämmen inokuliert worden waren, für die Messung des Cholesterolgehalts abgesammelt.
Test (2): Nach zweimaligem Aktivieren in MRS-Nährbrühe, wurde 1% Inokulum von jedem der getesteten Bakterienstämme in 10 ml MRSO inokuliert und bei 37°C während 20-22 Stunden kultiviert. Danach wurde 1% Inokulum, entnommen aus der resultierenden Kultur von jedem getesteten Bakterienstamm, in 10 ml MRSS inokuliert und 24 Stunden lang in einem anaeroben 37°C-Inkubator (10% CO₂ und 90% N₂) kultiviert. Danach wurden, gemäß dem im nachstehenden Punkt (C) beschriebenen Verfahren, Überstandproben bzw. Zellpelletproben jeweils aus den resultierenden Kulturen, welche mit den getesteten Bakterienstämmen inokuliert worden waren, für die Messung des Cholesterolgehalts abgesammelt.
(C) Messung des Cholesterolgehalts
Die Messung des Cholesterolgehalts wurde gemäß dem o-Phthalaldehyd-Verfahren (L. L. Rudel und M. D. Moris (1973), Notes an Methodology, 14: 364-366; S. E. Gilliland et al. (1985), Appl. Environ. Microbiol, 49: 377-381) durchgeführt.
In Hinsicht auf jede der resultierenden Kulturen, inokuliert mit den getesteten Bakterienstämmen, wie beschrieben im oben genannten Test (1) und Test (2), wurde aus einer getesteten Bakterienlösung eine Probe in einer Menge von 1 ml entnommen und 10 Minuten lang bei 12000 U/min zentrifugiert. 0,5 ml des so gebildeten Überstands wurden in ein Röhrchen gebracht, um als eine Überstandprobe der resultierenden Kultur, inokuliert mit einem jeweiligen getesteten Bakterienstamm, zu dienen.
In Hinsicht auf jede der resultierenden Kulturen, inokuliert mit den getesteten Bakterienstämmen, wie beschrieben im oben genannten Test (1) und Test (2), wurde aus einer getesteten Bakterienlösung eine Probe in einer Menge von 1 ml entnommen und 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde entfernt. Das übrig gebliebene Zellpellet wurde erneut in 10 ml MRSO-Nährbrühe gelöst und gleichmäßig gemischt. 0,5 ml Lösung wurden aus der resultierenden Mischung entnommen und in ein Teströhrchen gegeben, um als eine Zellpellet-Probe der resultierenden Kultur, inokuliert mit einem jeweiligen getesteten Bakterienstamm, zu dienen.
Jede getestete Probe wurde mit 3 ml 95%igem Ethanol versetzt und durch gleichmäßiges Schütteln gründlich vermischt. Ferner wurden 2 ml 50%iges KOH dazugegeben, und die resultierende Mischung wurde erneut gleichmäßig geschüttelt. Danach wurde die Mischung bei 60°C in einem Wasserbad 10 Minuten lang erwärmt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die abgekühlte Mischung wurde mit 5 ml Hexan versetzt und gleichmäßig gerührt, gefolgt von Zugabe von 3 ml H₂O. Nach gleichmäßigem Schütteln wurde die so gebildete Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. 2,7 ml der resultierenden Hexanschicht wurden in ein anderes Teströhrchen entnommen, und das Hexan wurde unter N₂ bei 60°C verdampft. Der nach dem Verdampfen übrig gebliebene feste Rückstand wurde mit 4 ml einer o-Phthalaldehyd-Reagenzlösung (0,5 mg o-Phthalaldehyd/1 ml Essigsäure) versetzt. Die resultierende Mischung wurde gleichmäßig geschüttelt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, gefolgt von Zugabe von 2 ml konzentrierter Schwefelsäure. Die so gebildete Mischung wurde gleichmäßig geschüttelt und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde die Mischung einer OD₅₅₀-Messung unter Verwendung eines Spektrophotometers unterzogen.
(D) Überprüfung der Fähigkeit eines getesteten Bakterienstamms zur Erniedrigung von Cholesterol
Die Fähigkeit eines Bakterienstamms, Cholesterol zu senken, wurde unter Verwendung der folgenden Formel eingeschätzt: A = 100 – [(B/C)x100]

A: = Verringerung des Cholesterols (%).
B: = Cholesterolgehalt (mg) im Überstand der mit dem getesteten Bakterienstamm inokulierten Kultur
C: = Cholesterolgehalt (mg) im Überstand der Kultur ohne Inokulation mit dem getesteten Bakterienstamm (Kontrollgruppe)

Wenn der Wert des "A"-Werts größer als 80% ist, wird davon ausgegangen, dass der Bakterienstamm eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Erniedrigung von Cholesterol aufweist.
(E) Überprüfung der Fähigkeit eines getesteten Bakterienstamms zur Assimilierung von Cholesterol

A' = 100 – [(B' + C')x100]

A'

= Assimilation von Cholesterol (%)

B'

= Cholesterolgehalt (mg) im Überstand der mit dem getesteten Bakterienstamm inokulierten Kultur

C'

= Cholesterolgehalt (mg) im Zellpellet der mit dem getesteten Bakterienstamm inokulierten Kultur

Wenn der Wert des "A"-Werts größer als 15% ist, wird davon ausgegangen, dass der Bakterienstamm eine bemerkenswerte Fähigkeit zum Assimilieren von Cholesterol aufweist.
II. Ergebnis:
(i) Fähigkeiten der getesteten Bakterienstämme zur Erniedrigung von Cholesterol
Beim Vergleich von Test (1) (d. h. Kultivieren eines getesteten Bakterienstamms in MRS-Nährbrühe) und denjenigen von Test (2) (d. h. Kultivieren eines getesteten Bakterienstamms in MRSO-Nährbrühe) liegt der Unterschied dazwischen darin, dass in Test (2) ein getesteter Bakterienstamm in MRSO-Nährbrühe inokuliert und 20 bis 22 Stunden lang kultiviert wurde. 1% Inokulum wurde daraus entnommen und in 10 ml MRSS für die weitere Kultur inokuliert. Der Zweck von Test (2) besteht darin, die getesteten Bakterienstämme erneut zu screenen, um zu bestimmen, ob sie ausgezeichnete Gallensalz-Toleranz aufweisen, und auch, um Bakterienstämme mit der Fähigkeit, Cholesterol zu erniedrigen, zu screenen.
Die Ergebnisse der Tests unter Verwendung von Pferdeserum als Cholesterolquelle (Tabelle 3) zeigten, dass Lactobacillus acidophilus CCRC 17064 und DDS-1 des Stands der Technik ebenfalls signifikante Effekte in diesem Test zeigten, und ihre Fä higkeiten zur Erniedrigung von Cholesterol 88 bis 98% erreichten. Andererseits waren die Fähigkeiten von CCRC 14065, CCRC 10695^T und CCRC 14619^T bei der Erniedrigung von Cholesterol nicht signifikant. Dies könnte auf der Tatsache beruhen, dass diese Bakterienstämme eine geringe Gallensalz-Toleranz aufweisen und nicht gut in MRSO-Nährbrühe wachsen, sodass ihre Cholesterol-erniedrigenden Fähigkeiten, wie beobachtet, lediglich 30 bis 43% erreichten.

In diesen zwei Tests wurde gezeigt, dass die neuen Isolate der vorliegenden Erfindung, d. h. B6T7, C21T1, B21T1, B21T6, B38T38 und X21B7 eine Cholesterol-senkende Fähigkeit von bis zu 91–99% oder mehr aufweisen, was geringfügig höher ist als diejenigen von CCRC 17064 und DDS-1. Dies zeigt, dass die gemäß der vorliegenden Erfindung gescreenten Bakterienstämme ebenfalls eine ausgezeichnete Fähigkeit zur Senkung von Serumcholesterol besitzen. Tabelle 3. Ermittlung der Fähigkeit von getesteten Bakterienstämmen zur Senkung von Cholesterol (Pferdeserum-Modell)^a

Kulturen	Wachstum in MRS-Nährbrühe^b		Wachstum in MRSO-Nährbrühe^c
Kulturen	Cholesterol^d in verbrauchter Nährbrühe (μg/ml)	Cholesterol-Senkung (%)	Cholesterol^d in verbrauchter Nährbrühe (μg/ml)	Cholesterol-Senkung (%)
B6T7	6,71	92,2	7,14	92,7
C21T1	0,69	99,2	2,41	97,2
B38T38	2,24	97,4	7,57	91,2
B21T1	3,10	96,6	0,34	99,6
B21T5	2,84	96,7	2,24	97,4
X21B7	1,34	98,4	3,27	96,2
CCRC 17064	1,12	98,7	9,81	88,4
CCRC 10695	8,00	90,7	56,97	33,8
CCRC 14065	11,70	86,4	59,90	30,4
CCRC 14619	2,84	96,7	49,14	42,9
DDS-1	5,94	93,1	5,16	94,0
Kontrolle	86,06	-	86,06	-

^a: MRS-Nährbrühe, ergänzt mit 0,3% Ochsengalle und 12% Pferdeserum.
^b: Vor dem Test wurden alle Kulturen in MRS-Nährbrühe subkultiviert, wobei 1% Inokulum verwendet wurde, und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
^c: Vor dem Test wurden alle Kulturen in MRSO-Nährbrühe (MRS-Nährbrühe mit 0,3% Ochsengalle) subkultiviert, wobei 1% Inokulum verwendet wurde, und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
^d: Anfänglicher Cholesterolgehalt in der Nährbrühe belief sich auf 86,06 μg/ml.

Unter Bezugnahme auf die Tabelle 4 beobachtete man, als Phosphatidylcholin-Cholesterol anstatt von Pferdeserum als Cholesterolquelle im Test verwendet wurde, im Zusammenhang mit der Ermittlung der Fähigkeit der getesteten Bakterienstämme, Cholesterol zu erniedrigen, dass die Fähigkeit jedes Bakterienstamms hinsichtlich der Cholesterolsenkung (%) tendenziell abnimmt. Dies weist darauf hin, dass die Fähigkeit von Lactobacillus-Stämmen zur Erniedrigung des Cholesterolspiegels mit dem Typ an Cholesterol in Verwendung variieren kann. Es wird bemerkt, dass die Fähigkeit von CCRC 17064 zur Senkung von Phosphatidylcholin-Cholesterol sich auf 11 bis 29% beläuft, wohingegen die Fähigkeiten der Bakterienstämme der vorliegenden Erfindung zur Senkung von Phosphatidylcholin-Cholesterol 23 bis 48% erreichten, was offensichtlich höher ist, als jene, die von CCRC 17064 erzielt wird, obschon geringfügig niedriger als jene, die von DDS-1 erzielt wird (50%). Tabelle 4. Ermittlung der Fähigkeiten von getesteten Bakterienstämmen zur Senkung von Cholesterol (Phosphatidylcholin-Cholesterol-Mizellenmodell)^a

Kulturen	Wachstum in MRS-Nährbrühe^b		Wachstum in MRSO-Nährbrühe^c
Kulturen	Cholesterol^d (μg/ml)	Cholesterol-Senkung (%)	Cholesterol^d (μg/ml)	Cholesterol-Senkung (%)
B6T7	45,05	23,92	33,70	43,10
C21T1	30,71	48,15	43,59	26,40
B38T38	33,75	43,01	35,16	40,62
B21T1	32,34	45,39	32,83	44,57
B21T6	35,43	40,16	36,25	38,79
X21B7	35,11	40,71	39,29	33,65
CCRC 17064	52,66	11,07	42,01	29,06
DDS-1	29,24	50,83	29,46	50,26
Kontrolle	59,22	-	59,22

^a: MRS-Nährbrühe, ergänzt mit 0,3% Ochsengalle und 12% Phosphatidylcholin-Cholesterol-Mizellen.
^b: Vor dem Test wurden alle Kulturen in MRS-Nährbrühe subkultiviert, wobei 1% Inokulum verwendet wurde, und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
^c: Vor dem Test wurden alle Kulturen in MRSO-Nährbrühe (MRS-Nährbrühe mit 0,3% Ochsengalle) subkultiviert, wobei 1% Inokulum verwendet wurde, und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
^d: Anfänglicher Cholesterolgehalt in der Nährbrühe belief sich auf 59,22 μg/ml.

(ii) Cholesterol-Assimilation durch getestete Bakterienstämme:
In Hinsicht auf den Mechanismus von Milchsäurebakterien zur Senkung von Cholesterol, wird Cholesterol durch die Co-Präzipitation von Cholesterol und dekonjugierten Gallensalzen (F. A. M. Kalver und R. van der Meer (1993), siehe oben, M. M. Brashears und S. E. Gilliland (1997), siehe oben), als auch die Assimilation von Cholesterol durch den Bakterienstamm an sich, entfernt (Gilliland et al. (1985), siehe oben; D. O. Noh et al. (1997), siehe oben; und Zhang et al. (1998), siehe oben).

Unter Bezugnahme auf die Tabelle 5 kann es ersehen werden, dass CCRC 17064, die sechs Isolate, welche gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, und DDS-1, Cholesterol assimilieren können. Allerdings unterscheiden sich die verschiedenen Bakterienstämme geringfügig hinsichtlich ihrer Fähigkeiten, Cholesterol zu assimilieren. Die beobachtete Assimilations-Rate liegt im Bereich von 11 bis 40%. Die Cholesterolassimilation durch CCRC 14065, CCRC 10695^T und CCRC 14619^T war nicht signifikant. Tabelle 5. Ermittlung der Cholesterol-Assimilation^a von getesteten Bakterienstämmen

Kulturen	Wachstum in MRS-Nährbrühe^b			Wachstum in MRSO-Nährbrühe^c
Kulturen	Cholesterol^d in verbrauchter Nährbrühe (%)	Cholesterol in Zellpellet (%)	Assimiliertes Cholesterol (%)	Cholesterol^d in verbrauchter Nährbrühe (%)	Cholesterol in Zellpellet (%)	Assimiliertes Cholesterol (%)
B6T7	7,8	51,4	40,8	7,3	74,1	18,6
C21T1	0,8	86,0	13,2	2,6	72,3	24,9
B38T38	2,6	79,1	18,3	8,8	63,7	7,5
B21T1	3,4	81,7	14,9	0,4	88,4	11,2
B21T6	3,3	87,2	29,5	2,6	81,4	16,0
X21B7	1,6	87,0	31,4	3,8	71,3	24,9
CCRC 17064	1,3	68,5	30,2	11,6	72,9	15,5
CCRC 10695	9,3	71,7	19,0	68,2	33,4	0,4
CCRC 14065	13,5	82,0	4,4	69,6	27,6	2,6
CCRC 14619	3,3	80,6	16,1	57,1	42,7	0,2
DDS-1	6,9	76,5	14,5	6,3	61,3	11,2

^a: MRS-Nährbrühe, ergänzt mit 0,3% Ochsengalle und 12% Pferdeserum.
^b: Vor dem Test wurden alle Kulturen in MRS-Nährbrühe subkultiviert, wobei 1% Inokulum verwendet wurde, und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
^c: Vor dem Test wurden alle Kulturen in MRSO-Nährbrühe (MRS-Nährbrühe mit 0,3% Ochsengalle) subkultiviert, wobei 1% Inokulum verwendet wurde, und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
^d: Die Konzentration an Cholesterol in der Kontrolle wurde als 100 Teile definiert.

Werden die oben aufgeführten Testergebnisse zusammengefasst, ist es deutlich, dass die sechs neuen Lactobacillus-Isolate, welche gemäß der vorliegenden Erfindung in Taiwan erhalten und gescreent wurden, nachgewiesenermaßen eine ausgezeichnete Säure- und Gallensalz-Resistenz sowie die Fähigkeit, Cholesterol zu erniedrigen, auf weisen. Weitere Identifizierungs- und Charakterisierungstests dieser Lactobacillus-Isolate wurden in den folgenden Beispielen durchgeführt.
Beispiel 5. Identifizierung und Charakterisierung von Lactobacillus-Isolaten
I. Experimentelle Vorgehensweisen:
(1) Vorbereitende Identifizierungstests:
Frisch kultivierte Bakterienstämme (kultiviert während 18 bis 24 Stunden) wurden vorläufigen Identifizierungstests unterzogen, wobei deren ausgeführte Aspekte beinhalten: Gram-Färbung, morphologische Beobachtungen, Katalase-Test, Motilität, Wachstum unter aeroben und anaeroben Bedingungen (O. Kandler und N. Weiss (1986), Regular, nonsporing Gram-positive rods and Cocci. In: Bergey's Manuel of Systematic Bacteriology. (Sneath, P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, M. E., und Hotl, J. G., Hrsg.), Band II, S. 1208-1234. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA).
(2) API-Identifizierungssystem:
Dieser Identifizierungstest basiert auf demjenigen, welcher in G. H. Fleet et al. (1984), Appl. Environ. Microbiol., 48: 1034-1038 beschrieben wurde. Die Identität der Milchsäurebakterien wurde mit dem API 50 CHL-Kit (French API BioMerieux Research Laborstory, La Balme Les Grottes, Montalien, Jeraeh, Frankreich) bestätigt. Die getesteten Punkte waren: Tests der Säureherstellung aus 49 Kohlenstoffquellen, welche Folgende einschließen: Glycerin, Erythritol, D-Arabinose, L-Arabinose, Ribose, D-Xylose, L-Xylose, Adonitol, β-Methylxylosid, Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, L-Sorbose, Rhamnose, Dulcitol, Inositol, Mannitol, Sorbitol, α-Methyl-D-mannosid, α-Methyl-D-glucosid, N-Acetylglucosamin, Amygdalin, Arbutin, Esculin, Salicin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Melibiose, Saccharose, Trehalose, Inulin, Melezitose, D-Raffinose, Amidon, Glycogen, Xylitol, β-Gentiobiose, D-Turanose, D-Lyxose, D-Tagatose, D-Fucose, L-Fucose, D-Arabitol, L-Arabitol, Gluconat, 2-Ketogluconat und 5-Ketogluconat.
Das API-System funktioniert gemäß den folgenden Arbeitsprozeduren:
Verwenden eines sterilen Tupfers, um eine Bakterienkolonie aufzupicken, welche auf einer Kulturplatte gezüchtet wurde, und Zulassen, dass die aufgepickte Bakterienkolonie in 2 ml an 0,85%iger normaler Kochsalzlösung gleichmäßig suspendiert wird; Aufsaugen der Lösung suspendierter Bakterienzellen unter Verwendung einer sterilen Pipette und Eintropfen von n Tropfen der Lösung in weitere 5 ml 0,85%ige sterile nor male Kochsalzlösung, sodass die Konzentration der resultierenden Bakterienlösung äquivalent zu derjenigen von McFarland Nr. 2-Standardlösung ist (eine gemischte Lösung, die aus 9,8 ml 1% H₂SO₄ und 0,2 ml 1% BaCl₂ gebildet ist). Mittlerweile wird eine weitere Lösung suspendierter Bakterienzellen entnommen, und 2n Tropfen der Lösung werden in ein Glasröhrchen pipettiert, welches API 50 CHL-Medium enthält. Nach gleichmäßigem Mischen wird ein geeignetes Volumen des so hergestellten Inokulums in jedes der Röhrchen eines Teststreifens zugegeben, mit Mineralöl überschichtet und in die Inkubationsschale eingebracht (wobei zuvor Wasser in die Schale gegeben wird, sodass ein Verlust an Medium durch Verdampfung während der Inkubation vermieden wird). Nach Bedecken mit einem Inkubations-Deckel wird die Inkubationsschale 48 Stunden lang bei 37°C stehen gelassen und wird anschließend für Zwecke des Ablesens herausgenommen. Die Ergebnisse werden aufgezeichnet und mit den Datenbanken des API-LAB-Software-Identifizierungssystems verglichen, sodass die passendsten taxonomischen Gattungen und Spezies für die Bakterienkolonie im Test bestimmt werden.
(3) Micro-IS-System:
Das Micro-IS-System basiert auf dem Verfahren, welches von M. Rogosa et al. (1971) vorgeschlagen wurde. Das Verfahren zum Codieren von Daten über Mikrobenstämme für Computer (Edition AB), Int. J. Syst. Bacteriol. 21: 1A-184A, [wird benutzt] und verwendet die Matrix 5 des Micro-IS-Systems (geeignet für Lactobacillus sp.). Die Testaspekte schließen die folgenden ein: Beweglichkeit; Wachstumstemperatur-Test (15°C, 45°C); Wachstum unter aeroben Bedingungen; Tests der Gaserzeugung aus D-Glucose und Glucose; Test der Säureherstellung aus Amygdalin, L-Arabinose, Cellobiose, D-Fructose, D-Galactose, D-Glucose, Lactose, Maltose, D-Mannitol, D-Mannose, Melezitose, Melibiose, Rhamnose, L-Rhamnose, D-Ribose, Salicin, D-Sorbitol, Saccharose, Trehalose und D-Xylose; und Wachstumstests in Bezug auf Esculin-Hydrolise und L-Arginin-Desaminierung. Das positive oder negative Ergebnis von jedem Test wird. in das Mirco-IS-Computer-Identifizierungsprogramm eingegeben, um die taxonomische Gattung oder Spezies der identifizierten Bakterien zu ergeben.
(4) 16S-rDNA-Sequenzanalyse:
Dieser Identifikationstest basiert auf dem Verfahren, das in Rosenblum et al. (1997), Nucleic Acid Res., 25: 4500-4504, beschrieben ist, und er funktioniert gemäß den folgenden Arbeitsprozeduren: Eine kleine Menge eines frisch kultivierten Bakterienstamms wird abgeschabt und in ein 1,5 ml großes Eppendorf-Röhrchen eingebracht. Nach Behandeln der Bakterienprobe mit Proteinase K und RNase und Verwenden einer Zentrifugiersäule zum Erhalten der genomischen Bakterien-DNA daraus, wird eine PCR-Amp lifikation durchgeführt, gefolgt von einer Reinigung. Nach Bestätigung durch Elektrophorese werden die PCR-amplifizierten Produkte einer Reaktion mit einem MicroSeq^TM 16S-rDNA-Gene-Kit (PE Co., USA) unterzogen, gefolgt von einer DNA-Sequenzierung unter Verwendung des ABI Prism 310 Genetic Analyzer. Ferner werden die 12 so erhaltenen Streifen von DNA-Sequenzen analysiert und unter Verwendung der MicroSeq^TM-Software (PE Co., USA) integriert, um eine 16S-rDNA-Sequenz von etwa 1500 bp zu erhalten, wobei die Sequenz einem Vergleich mit DNA-Datenbanken unterzogen wird (MicroSeq^TM Benutzerhandbuch, 1999, PE CO., USA).
II. Ergebnisse:
1. Isolat B21T1 der vorliegenden Erfindung

(i) Gemäß den Ergebnissen des vorläufigen Identifizierungstests ist das Isolat B21T1 grampositiv, Katalase-negativ und nicht-beweglich, und es wächst sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen;
(ii) Die Testergebnisse unter Anwendung des API 50 CHL-Identifikations-Kits vom API-System sind in der Tabelle 6 gezeigt, worin der Identifikations-Punktwert sich auf 91,0 (%ID) beläuft. Die Identität dieses Isolats wird als Lactobacillus acidophilus bestätigt;
(iii) Das Isolat B21T1 der vorliegenden Erfindung wird durch das Micro-IS-System als Lactobacillus acidophilus identifiziert, wobei die erhaltenen Ergebnisse in der Tabelle 7 gezeigt sind, und der Identifikations-Punktwert sich auf 0,682 beläuft (ID-Punktwert);
(iv) Das 16S-rDNA-Sequenzanalyse-Ergebnis des Isolats B21T1 der vorliegenden Erfindung wird in der 5 gezeigt. Nach einem Vergleich mit DNA-Datenbanken (MicroSeq^TM Benutzerhandbuch, 1999, PE CO., USA) wurde es festgestellt, dass die 16S-rDNA-Sequenz (SEQ. ID. Nr.: 1) des Isolats B21T1 der vorliegenden Erfindung am stärksten homolog zu der 16S-rDNA-Sequenz von Lactobacillus gasseri ist (B₁-Gruppe in Lactobacillus acidophilus)(G. Klein et al. (1998), International Journal of Food Microbiology, 41: 103-125); und
(v) Gemäß den oben erwähnten Identifikationsergebnissen ist das Isolat B21T1 der vorliegenden Erfindung am wahrscheinlichsten Lactobacillus gasseri, Subgruppe B₁ von Lactobacillus acidophilus.

Tabelle 6
Tabelle 7

Micro-IS-System
Stammnamen: B21T1, B21T6, C21T1, X21B7, B6T7

–	013001	BEWEGLICHKEIT	–	006001	ENDOSPOREN
–	017013	WACHSTUM 15°C	+	017017	WACHSTUM 45°C
+	016059	AEROBES WACHSTUM	–	024045	GLUCOSE ZU CO₂
–	028528	GLUCONAT, GAS	+	025203	AMYGDALIN, SÄURE
–	025181	L-ARABINOSE, SÄURE	+	025211	CELLOBIOSE, SÄURE
+	025193	D-FRUCTOSE, SÄURE	+	025194	D-GALACTOSE, SÄURE
+	025195	D-GLUCOSE, SÄURE	+	025212	LACTOSE, SÄURE
+	025213	MALTOSE, SÄURE	–	026371	D-MANNITOL, SÄURE
+	025196	D-MANNOSE, SÄURE	–	025217	MELEZITOSE, SÄURE
+	025214	MELIBIOSE, SÄURE	+	025218	RAFFINOSE, SÄURE
–	025191	L-RHAMNOSE, SÄURE	–	025184	D-RIBOSE, SÄURE
+	025210	SALICIN, SÄURE	–	028374	D-SORBITOL, SÄURE
+	025215	SACCHAROSE, SÄURE	+	025216	TREHALOSE, SÄURE
–	025186	D-XYLOSE, SÄURE	+	028060	L-MALAT-NUTZUNG

DIAGNOSE	**ID-PUNKTWERT	**WAHRSCHEINLICHKEIT	**BESTE WAHRSCHEINL.
1 L. acidophilus	0,68224	0,0079110108	0,0791101
2 L. vitulinus	0,31761	0,036828671	0,1104860

VORGESCHLAGENE TESTS	WERT IM SETWERT ALLEIN
1 024029 (L +) LACTAT-PROD.	1

2. Isolat B21T6 der vorliegenden Erfindung

i) Gemäß den vorläufigen Identifikations-Ergebnissen ist das Isolat B21T6 grampositiv, Katalase-negativ und nicht-beweglich, und es wächst sowohl bei aeroben als auch anaeroben Bedingungen;
(ii) Die Testergebnisse unter Verwendung des API 50 CHL-Identifikations-Kits vom API-System sind in der Tabelle 8 gezeigt, worin der Identifikations-Punktwert sich auf 93,6 (%ID) beläuft. Die Identität dieses Isolats wird als Lactobacillus acidophilus bestätigt;
(iii) Das Isolat B21T6 der vorliegenden Erfindung wird durch das Micro-IS-System als Lactobacillus acidophilus identifiziert, wobei die erhaltenen Ergebnisse in der Tabelle 7 gezeigt sind, und der Identifikations-Punktwert sich auf 0,682 beläuft (ID-Punktwert);
(iv) Das 16S-rDNA-Sequenzanalyse-Ergebnis des Isolats B21T6 der vorliegenden Erfindung wird in der 6 gezeigt. Nach einem Vergleich mit DNA-Datenbanken (MicroSeq^TM Benutzerhandbuch, 1999, PE CO., USA) wurde festgestellt, dass die 16S-rDNA-Sequenz (SEQ. ID. Nr.: 2) des Isolats B21T6 der vorliegenden Erfindung am stärksten homolog zu der 16S-rDNA-Sequenz von Lactobacillus gasseri (B₁-Gruppe in Lactobacillus acidophilus) ist; und
(v) Gemäß den oben erwähnten Identifizierungsergebnissen ist das Isolat B21T6 der vorliegenden Erfindung am wahrscheinlichsten Lactobacillus gasseri, Subgruppe B₁ von Lactobacillus acidophilus.

Tabelle 8
3. Isolat C21T1 der vorliegenden Erfindung

(i) Gemäß den vorläufigen Identifikations-Ergebnissen ist das Isolat C21T1 grampositiv, Katalase-negativ und nicht-beweglich, und es wächst sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen;
(ii) Die Testergebnisse unter Verwendung des API 50 CHL-Identifikations-Kits vom API-System sind in der Tabelle 9 gezeigt, worin der Identifikations-Punktwert sich auf 95,6 (%ID) beläuft. Die Identität dieses Isolats wird als Lactobacillus acidophilus bestätigt;
(iii) Das Isolat C21T1 der vorliegenden Erfindung wird durch das Micro-IS-System als Lactobacillus acidophilus identifiziert, wobei die erhaltenen Ergebnisse in der Tabelle 7 gezeigt sind, und der Identifikations-Punktwert sich auf 0,682 beläuft (ID-Punktwert);
(iv) Das 16S-rDNA-Sequenzanalyse-Ergebnis des Isolats C21T1 der vorliegenden Erfindung wird in der 7 gezeigt. Nach einem Vergleich mit DNA-Datenbanken (MicroSeq^TM Benutzerhandbuch, 1999, PE CO., USA) wurde festgestellt, dass die 16S-rDNA-Sequenz (SEQ. ID. Nr.: 3) des Isolats C21T1 der vorliegenden Erfindung am stärksten homolog zu der 16S-rDNA-Sequenz von Lactobacillus gasseri (B₁-Gruppe in Lactobacillus acidophilus) ist; und
(v) Gemäß den oben erwähnten Identifizierungsergebnissen ist das Isolat C21T1 der vorliegenden Erfindung am wahrscheinlichsten Lactobacillus gasseri, Subgruppe B₁ von Lactobacillus acidophilus.

Tabelle 9
4. Isolat X21B7 der vorliegenden Erfindung

(i) Gemäß den vorläufigen Identifikations-Ergebnissen ist das Isolat X21B7 grampositiv, Katalase-negativ und nicht-beweglich, und es wächst sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen;
(ii) Die Testergebnisse unter Verwendung des API 50 CHL-Identifikations-Kits vom API-System sind in der Tabelle 10 gezeigt, worin der Identifikations-Punktwert sich auf 94,3 (%ID) beläuft. Die Identität dieses Isolats wird als Lactobacillus acidophilus bestätigt;
(iii) Das Isolat X21B7 der vorliegenden Erfindung wird durch das Micro-IS-System als Lactobacillus acidophilus identifiziert, wobei die erhaltenen Ergebnisse in der Tabelle 7 gezeigt sind, und der Identifikations-Punktwert sich auf 0,682 beläuft (ID-Punktwert);
(iv) Das 16S-rDNA-Sequenzanalyse-Ergebnis des Isolats X21B7 der vorliegenden Erfindung wird in der 8 gezeigt. Nach einem Vergleich mit DNA-Datenbanken (MicroSeq^TM Benutzerhandbuch, 1999, PE CO., USA) wurde festgestellt, dass die 16S-rDNA-Sequenz (SEQ. ID. Nr.: 4) des Isolats X21B7 der vorliegenden Erfindung am stärksten homolog zu der 16S-rDNA-Sequenz von Lactobacillus gasseri (B₁-Gruppe in Lactobacillus acidophilus) ist; und
(v) Gemäß den oben erwähnten Identifizierungsergebnissen ist das Isolat X21B7 der vorliegenden Erfindung am wahrscheinlichsten Lactobacillus gasseri, Subgruppe B₁ von Lactobacillus acidophilus.

Tabelle 10
5. Isolat B38T38 der vorliegenden Erfindung

(i) Gemäß den vorläufigen Identifikations-Ergebnissen ist das Isolat B38T38 grampositiv, Katalase-negativ und nicht-beweglich, und es wächst sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen;
(ii) Die Testergebnisse unter Verwendung des API 50 CHL-Identifikations-Kits vom API-System sind in der Tabelle 11 gezeigt, worin der Identifikations-Punktwert sich auf 90,8 (%ID) beläuft. Die Identität dieses Isolats wird als Lactobacillus acidophilus bestätigt;
(iii) Das Isolat B38T38 der vorliegenden Erfindung wird durch das Micro-IS-System als Lactobacillus acidophilus identifiziert, wobei die erhaltenen Ergebnisse in der Tabelle 12 gezeigt sind, und der Identifikations-Punktwert sich auf 0,646 beläuft (ID-Punktwert);
(iv) Das 16S-rDNA-Sequenzanalyse-Ergebnis des Isolats B38T38 der vorliegenden Erfindung wird in der 9 gezeigt. Nach einem Vergleich mit DNA-Datenbanken (MicroSeq^TM Benutzerhandbuch, 1999, PE CO., USA) wurde festgestellt, dass die 16S-rDNA-Sequenz (SEQ. ID. Nr.: 5) des Isolats B38T38 der vorliegenden Erfindung am stärksten homolog zu der 16S-rDNA-Sequenz von Lactobacillus gasseri (B₁-Gruppe in Lactobacillus acidophilus) ist; und
(v) Gemäß den oben erwähnten Identifizierungsergebnissen ist das Isolat B38T38 der vorliegenden Erfindung am wahrscheinlichsten Lactobacillus gasseri, Subgruppe B₁ von Lactobacillus acidophilus.

Tabelle 11
Tabelle 12

Micro-IS-System
Stammnamen: B38T38

–	013001	BEWEGLICHKEIT	–	006001	ENDOSPOREN
–	017013	WACHSTUM 15°C	+	017017	WACHSTUM 45°C
+	016059	AEROBES WACHSTUM	–	024045	GLUCOSE ZU CO₂
–	028528	GLUCONAT, GAS	+	025203	AMYGDALIN, SÄURE
–	025181	L-ARABINOSE, SÄURE	+	025211	CELLOBIOSE, SÄURE
+	025193	D-FRUCTOSE, SÄURE	+	025194	D-GALACTOSE, SÄURE
+	025195	D-GLUCOSE, SÄURE	+	025212	LACTOSE, SÄURE
+	025213	MALTOSE, SÄURE	–	026371	D-MANNITOL, SÄURE
+	025196	D-MANNOSE, SÄURE	+	025217	MELEZITOSE, SÄURE
+	025214	MELIBIOSE, SÄURE	+	025218	RAFFINOSE, SÄURE
–	025191	L-RHAMNOSE, SÄURE	–	025184	D-RIBOSE, SÄURE
+	025210	SALICIN, SÄURE	–	026374	D-SORBITOL, SÄURE
+	025215	SACCHAROSE, SÄURE	+	025216	TREHALOSE, SÄURE
–	025186	D-XYLOSE, SÄURE	–	028060	L-MALAT-NUTZUNG

DIAGNOSE	**ID-PUNKTWERT	**WAHRSCHEINLICHKEIT	**BESTE WAHRSCHEINL.
1 L. delbrueckii ssp. lactis	0,64607	0,145038024	0,4351140
2 L. acidophilus	0,35240	0,079110108	0,0791101

VORGESCHLAGENE TE[STS]	WERT IM SETWERT ALLEIN
1 024029 (L +) LACTAT-PROD.	2
2 029268 L-ARGININ-DESAMIN.	2

6. Isolat B6T7 der vorliegenden Erfindung

(i) Gemäß den vorläufigen Identifikations-Ergebnissen ist das Isolat B6T7 grampositiv, Katalase-negativ und nicht-beweglich, und es wächst sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen;
(ii) Die Testergebnisse unter Verwendung des API 50 CHL-Identifikations-Kits vom API-System sind in der Tabelle 13 gezeigt, worin der Identifikations-Punktwert sich auf 92,4 (%ID) beläuft. Die Identität dieses Isolats wird als Lactobacillus plantarum bestätigt;
(iii) Das Isolat B6T7 der vorliegenden Erfindung wird durch das Micro-IS-System als Lactobacillus acidophilus identifiziert, wobei die erhaltenen Ergebnisse in der Tabelle 7 gezeigt sind, und der Identifikations-Punktwert sich auf 0,682 beläuft (ID-Punktwert);
(iv) Das 16S-rDNA-Sequenzanalyse-Ergebnis des Isolats B6T7 der vorliegenden Erfindung ist in der 10 gezeigt. Da die Identifizierungsergebnisse, welche mit dem API 50 CHL-Identifikations-Kit erhalten wurden, und diejenigen, welche mit dem Micro-IS-System-Identifizierungssystem erhalten wurden, das Isolat B6T7 der vorliegenden Erfindung als Lactobacillus plantarum bzw. Lactobacillus acidophilus von Lactobacillus klassifizieren, wurde die 16S-rDNA-Sequenz (SEQ. ID. Nr.: 6) des Isolats B6T7 der vorliegenden Erfindung mit der 16S-rDNA-Sequenz von Lactobacillus acidophilus (SEQ. ID. Nr.: 7) und derjenigen von Lactobacillus plantarum (SEQ. ID. Nr.: 8) verglichen. Es wurde festgestellt, dass die 16S-rDNA-Sequenz des Isolats B6T7 (SEQ. ID. Nr.: 6) der vorliegenden Erfindung am stärksten homolog zu der 16S-rDNA-Sequenz von Lactobacillus acidophilus ist, und sich stark von der 16S-rDNA-Sequenz von Lactobacillus plantarum unterscheidet; und
(v) Gemäß den oben angegebenen Indentifizierungsergebnissen ist das Isolat B6T7 der vorliegenden Erfindung am wahrscheinlichsten Lactobacillus acidophilus.

Tabelle 13
Fasst man die Identifizierungsergebnisse zusammen, gehören alle sechs, gemäß der vorliegenden Erfindung gescreenten Isolate Lactobacillus-Stämmen an, wobei B6T7 Lactobacillus acidophilus ist, und B21T1, B21T6, C21T1, X21B7 und B38T38 Lactobacillus gasseri, Subgruppe B₁ von Lactobacillus acidophilus sind.
Unter Bezugnahme auf die Tabelle 14, im Vergleich zu in Patenten und Literaturstellen des Stands der Technik offenbarten Lactobacillus-Stämmen, können die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen, sechs Lactobacillus-Isolate nicht nur in einer Umgebung, die 0,3% Gallensalze enthält, wachsen, sondern besitzen ebenfalls höhere Überlebensraten und eine gute Cholesterol-Erniedrigungs-Fähigkeit, nachdem sie 2 Stunden lang in einer sauren Umgebung von pH 2 kultiviert worden sind. Darüber hinaus besitzen die sechs Lactobacillus-Isolate der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, mit Cholesterol zu co-präzipitieren und Cholesterol zu assimilieren. Es ist offensichtlich, dass die Isolate der vorliegenden Erfindung und ihre subkultivierten Abkömmlinge ausgezeichnete probiotische Bakterien sind und in der Herstellung von Lebensmittelprodukten, wie Getränken, Kuchen, Kindernahrung, fermentierter Milch, diätetischen Ergänzungen und Tierfutter eingesetzt werden können. Des Weiteren können sie in der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung und Prävention von gastrointestinalen Erkrankungen und für die Senkung von Serumcholesterol verwendet werden.

Zum Beispiel können die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Lactobacillus-Isolate in der Herstellung von Milchsäure-Getränken und Joghurt-Getränken, unter Bezugnahme auf das Referenzbeispiel 1 und das Referenzbeispiel 2, welche im USP 5 516 684 offenbart sind, verwendet werden. Tabelle 14. Vergleich der Isolate der vorliegenden Erfindung mit bekannten Stämmen, welche in Patenten und Literaturstellen des Stands der Technik offenbart sind.

Stämme	Isolierungs-Quellen	Merkmale	Patent/Literatur
L. acidophilus GG (ATCC 53103)	Mensch	1. Gallensalz-Toleranz Kann in einer 0,15% Gallensäuren enthaltenden Umgebung wachsen. 2. Säuretoleranz Kann in einer Umgebung mit pH 6 bis zu 10⁸ CFU wachsen. Kann in einer Umgebung mit pH 3 bis zu 10⁷ CFU wachsen. Population sank innerhalb von 2 log-Werten nach Kultivieren in pH 2,5-Magensaft während 30 Minuten. Überlebende Zellen nach Behandlung bei pH 1–2 während 2 Stunden wurden als 10³ CFU gemessen. 3. Senkung von Cholesterol. Verringerte die Ausscheidungsmenge an Cholesterol in humanen Fäzes.	US 4839281 US 5032399
L. acidophilus LA16	Männliches Schwein	1. Senkung von Cholesterol Erniedrigung von Serumcholesterol um 80% (in einem System, enthaltend 0,4% Ochsengalle und 10 mg Cholesterol). Tierversuche zeigten, dass das Serumcholesterol nach einer Fütterungszeit von 56 Tagen um 10,5% gesunken war, und der LDL-Cholesterol-Gehalt um 9% gesunken war. (Anmerkung: LA16 ist ein L. acidophilus-Stamm, der aus den Fäzes von Schweinen isoliert wurde, welche mit L. acidophilus DDS-1 (humane Quelle) enthaltendem Joghurt gefüttert worden waren, und besitzt die Fähigkeit zum Senken von Cholesterol.)	Danielson et al., 1989
L. acidophilus ATCC 43121 ATCC 4356	Schwein Mensch	1. Gallensalz-Toleranz Die OD_{620 mm}-Werte der zwei Stämme waren um 0,3 Einheiten erhöht nach Kultivieren in einer Umgebung, welche 0,3% Ochsengalle enthielt, während 2,93 bzw. 7,4 Stunden. 2. Senkung von Cholesterol Verringerung des Serumcholesterols um 55,4% bzw. 12,9% nach Kultivieren in einem System, das 0,3% Ochsengalle und 0,1% PPLO enthielt, während 14 Stunden.	Gilliland und Walker, 1990
L. gasseri SBT 0274 SBT 0270	Mensch	1. Gallensalz-Toleranz Die zwei Stämme können in einer Umgebung wachsen, welche 0,3% Ochsengalle enthält. 2. Säuretoleranz Die Population sank um 2 log-Werte nach Kultivieren während 3 Stunden bei pH 2,5, 37°C. Die Population sank um 4–5 log-Werte nach Kultivieren während 2 Stunden bei pH 1,5, 37°C. 3. Senkung von Cholesterol Verringerung des Cholesterolgehalts um 47% bzw. 38% nach Kultivieren in einem System, das 0,3% Ochsengalle und 100 μg Cholesterol-Mizellen/ml enthielt, während 20 Stunden.	Usman und Hosono, 1999
L. gasseri B21T1 B21T6 C21T1 X21B7 B38T38 L. acidophilus B6T7	Gesunde Kinder	1. Gallensalz-Toleranz 80% Überlebende, d. h. die Population sank um 0,5–2 log-Werte nach Wachstum in einer Umgebung, welche 0,3% Ochsengalle enthielt, während 24 Stunden. 2. Säuretoleranz Population sank um 3–4 log-Werte nach Behandlung bei pH 2, 37°C während 2 Stunden (0,85% NaCl/0,01 N HCl-System) 3. Erniedrigung von Cholesterol Verringerung des Cholesterolgehalts um 93% oder mehr nach anaerober Kultur in MRS-Nährbrühe, welche 0,3% Ochsengalle und 12% Pferdeserum enthielt, während 24 Stunden. Verringerung des Cholesterolgehalts um 25–45% nach anaerober Kultur in MRS-Nährbrühe, welche 0,3% Ochsengalle und 12% Cholesterolmizellen enthielt, während 24 Stunden. Die Cholesterol-Assimilations-Rate erreichte 12–40%.	erfindungsgemäße Stämme

Anmerkung: ATCC 43121 = CCRC 17064 ATCC 4356 = CCRC 10695 PPLO (BACT PPLO SERUM-FRAKTION) wurde von DIFCO LABORATORIES produziert, aber dieses Produkt wird gegenwärtig nicht hergestellt.

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isolierter Stamm von Lactobacillus sp., wobei der Stamm: (i) ein hinterlegter Stamm, gewählt aus: (a) Lactobacillus gasseri B21T1, hinterlegt in der Amerikanischen Kultur-Typ-Sammlung (American Type Culture Collection) unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4483; (b) Lactobacillus gasseri B21T6, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4484; (c) Lactobacillus gasseri C21T1, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4479; (d) Lactobacillus gasseri X21B7, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4480; (e) Lactobacillus gasseri B38T38, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4481; oder (f) Lactobacillus acidophilus B6T7, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC PTA-4482; (ii) der subkultivierte Abkömmling des hinterlegten Stamms (i); oder (iii) ein von dem hinterlegten Stamm (i) abgeleitete Mutante ist; wobei der/die subkultivierte Abkömmling (ii) oder Mutante (iii) die folgenden bakteriologischen Charakteristika zeigt: eine Populationsabnahme von etwa 0,5 bis 2 log-Werten nach dem Wachstum in einer 0,3% Ochsengalle enthaltenden Umgebung während 24 Stunden; eine Säuretoleranz, wie durch eine Populationsabnahme mit einem 3- bis 4-log-Wert nach der Behandlung bei einem pH-Wert von 2 bei 37°C während 2 Stunden in einem 0,85% NaCl/0,01 N HCl-System; die Fähigkeit zur Senkung des Cholesterolgehalts um 93% oder mehr nach der anaeroben Kultivierung in Kulturbrühe, enthaltend 0,3% Ochsengalle und 12% Pferdeserum, während 24 Stunden; und eine Cholesterol-Assimilationsrate von 12 bis 40%.
Lebensmittelprodukt, umfassend ein essbares Material und einen isolierten Stamm von Lactobacillus sp. gemäß Anspruch 1.
Lebensmittelprodukt gemäß Anspruch 2, weiterhin umfassend mindestens einen probiotischen Mikroorganismus, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: Lactobacillus sp., wie Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus causasicus und Lactobacillus rhamnosus; Streptococcus sp., wie Streptococcus thermophilus und Streptococcus lactis; Hefen, wie Candida Kefyr, und Saccharomyces florentinus; oder eine Kombination hiervon.
Lebensmittelprodukt gemäß Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei das essbare Material gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: flüssigen Milchprodukten, fermentierter Milch, Milchpulver, Eiscreme, Rahmkäse, Trockenkäse, Bohnenmilch und fermentierter Bohnenmilch, Frucht-Gemüse-Säften, Fruchtsäften, Sportgetränken, Dessert, Kandiszucker, Kinder(fertig)nahrungen, Gesundheits-Nahrungsmittelprodukten, Tierfutter und dietätischen Ergänzungen.
Lebensmittelprodukt gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4, das in der Form einer Fertignahrung hergestellt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine probiotisch wirksame Menge eines isolierten Stamms von Lactobacillus sp. gemäß Anspruch 1.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung zu einer oralen Dosierungsform formuliert ist, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Lösung, Emulsion, Pulver, Tablette und Kapsel.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei die Zusammensetzung als ein die Verdauung verbessernder Arzneistoff hergestellt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei die Zusammensetzung als ein Arzneistoff zur Senkung von Serumcholesterol hergestellt wird.
Verwendung eines Stamms von Lactobacillus sp. gemäß Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prävention von gastrointestinalen Erkrankungen oder für die Senkung von Serumcholesterol.