DE60210497T2

DE60210497T2 - Bifidobacterium longum

Info

Publication number: DE60210497T2
Application number: DE60210497T
Authority: DE
Inventors: Kazuyoshi Zama-shi SOTOYAMA; Akinori Zama-shi HIRAMATSU; Jin-zhong Zama-shi XIAO; Noritoshi Zama-shi TAKAHASHI; Shizuki Zama-shi KONDO; Tomoko Zama-shi YAESHIMA; Sachiko Zama-shi TAKAHASHI
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2001-12-07
Filing date: 2002-11-21
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2022-11-22
Also published as: US20040202749A1; ATE322538T1; US7427499B2; JP3875237B2; DK1449915T3; EP1449915B1; WO2003048343A1; DE60210497D1; CN1585820A; CN1274809C; EP1449915A1; JPWO2003048343A1; EP1449915A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Bifidobacterium longum, das sich in Bezug auf die Fermentationseigenschaften, in Bezug auf die Haltbarkeit unter sauren Bedingungen und während der Verteilung und in Bezug auf die Beständigkeit gegen Magensaft hervorragend verhält und das bereitwillig physiologische Funktionen ausübt.
Ferner betrifft die Erfindung neue Bifidobacterium longum-Pulver, -Nahrungsmittel und -Getränke mit einem Gehalt an dem vorstehenden Bifidobacterium longum.
Stand der Technik
Bei Stämmen von Bifidobacterium, wie Bifidobacterium longum (nachstehend als Bifidus-Bakterien bezeichnet), handelt es sich um einige der vorherrschenden Bakterien der Darmmikroflora, die im Darmtrakt von Menschen entstehen kann. Es ist bekannt, dass die Aufnahme der Bakterien eine Verbesserung der Umgebung im Darm bewirkt. Neuerdings hat die Nachfrage nach Nahrungsmitteln mit einem Gehalt an Bifidus-Bakterien zugenommen und Bifidus-Bakterien werden in breitem Umfang in mit Kulturen versetzter Milch, Acidophilus-Milch und dergl. verwendet. Ferner gibt es verschiedene Berichte über die biologische Aktivität der Bifidus-Bakterien, z. B. über eine Antitumor-Aktivität. Es wurden Versuche gemacht, die biologische Aktivität für verschiedene gesunde Nahrungsmittel auszunützen. Wie vorstehend ausgeführt, wird zwar angenommen, dass Bifidus-Bakterien beispielsweise für die Aufrechterhaltung der Darmmikroflora und für deren Verbesserung wirksam sind, dass es aber notwendig ist, Bifidus-Bakterien aufzunehmen, damit die Bifidus-Bakterien ihre Wirkung entfalten können.
Jedoch zeigen die Bifidus-Bakterien kein gutes Wachstum auf einem Medium auf Milchbasis. Es dauert lange Zeit, bis der pH-Wert und die Anzahl der Bakterien einen bestimmten Wert erreichen. Da es ferner schwierig ist, Bifidus-Bakterien unter sauren Bedingungen aufzubewahren und die Bakterien leicht absterben, stellt es ein erhebliches Problem dar, die Anzahl der Bakterien während der Verteilung aufrechtzuerhalten.
Andererseits wird zwar behauptet, dass lebende Bifidus-Bakterien die größte biologische Aktivität besitzen, dass aber verschiedene Faktoren, die Milchsäurebakterien und Bifidus-Bakterien abtöten oder deren Wachstum hemmen, im Verdauungstrakt des Menschen vorliegen. Insbesondere müssen diese Bakterien im niederen pH-Wert des Magensaftes und in Gegenwart von Verdauungsenzymen überleben, wenn sie in den Magen gelangen, was die erste Hürde im Verdauungstrakt darstellt. Obgleich dieser Vorgang vom Mageninhalt und ähnlichen Faktoren abhängt, besagt eine der allgemeinen Hinweise über die Magensafttoleranz, dass die Überlebenszeit bei einem pH-Wert von 3,0 2 Stunden beträgt (Itoh et al., Nicchiku Kaihou, Bd. 63, Nr. 12 (1992), S. 1276–1289).
Jedoch sind die meisten Bifidus-Bakterien bei einem niederen pH-Wert anfällig. Es wird behauptet, dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein Bakterium den Magensaft passiert, geringer ist als bei Lactobacilli und dergl.
Demgemäß ist es auf dem Gebiet der Entwicklung von Nahrungsmitteln und Getränken mit einem Gehalt an Bifidus-Bakterien erstrebenswert, Bifidus-Bakterien zu entwickeln, die zum Wachstum bis zu einer bestimmten Anzahl innerhalb einer kurzen Zeitspanne befähigt sind (d. h. Fermentationseigenschaften), die mehr als eine bestimmte Anzahl an lebenden Bakterien während der Verteilung nach ihrer Bildung oder während der Aufnahme aufrechterhalten (d. h. Säuretoleranz) und ihre biologische Aktivität ausüben, indem sie den Verdauungstrakt (insbesondere den Darmtrakt) in lebendem Zustand erreichen, wobei sie sich ihrer Magensäureresistenz bedienen.
Angesichts der vorerwähnten Situation wurden Untersuchungen über die Fermentationseigenschaften, die Säurebeständigkeit und die Magensaftbeständigkeit von Bifidus-Bakterien durchgeführt. Beispielweise ist es bekannt, dass es eine Variante von Bifidobacterium bifidum gibt, die Säuretoleranz aufweist und in einem Milchgrundmedium Fermentationseigenschaften besitzt (JP-B-Sho 56-42250). Ferner ist bekannt, dass ein Stamm von Bifidobacterium longum säuretolerant ist (JP-B-Sho 59-53829 (nachstehend als zitiertes Dokument 1 bezeichnet) und JP-A-Hei 11-75830). Außerdem ist bekannt, dass Bifidobacterium breve in einem rekonstituierten Magermilchmedium wächst und säuretolerant ist (JP-A-Hei 9-320642).
Die vorerwähnten Stämme Bifidobacterium bifidum und Bifidobacterium breve brauchen jedoch für die Fermentation in einem Milchgrundmedium bis zur Erreichung eines bestimmten pH-Werts mehr als 15 Stunden. Ferner ist die Überlebensrate von vielen der säureresistenten Stämme bei Aufbewahrung in einem sauren Milchprodukt oder Fruchtsaft (pH-Wert 4,0– 4,8) im Kühlschrank nicht zufriedenstellend. Dies bedeutet, dass die Säuretoleranz der vorerwähnten Bakterienstämme nicht ausreichend ist. Ferner gibt es einen Bericht (JP-A-Hei 9-322762 (nachstehend als zitiertes Dokument 2 bezeichnet) (vergl. auch US-5 711 977 und US-6 306 638) über einen mutanten Stamm von Bifidobacterium longum mit einer starken Magensafttoleranz, von der behauptet wird, dass sie mit der Überlebensrate im Verdauungstrakt (Darmtrakt) im Zusammenhang steht, wobei aber die Haltbarkeit des mutanten Stammes nicht ausreichend ist, wie aus den nachstehenden Testergebnissen hervorgeht.
Weitere Beispiele für die Auswahl von Bifidobacteria zur Verwendung als diätetische Zusatzprodukte finden sich bei Martin et al., Cultured Dairy Products Journal, Bd. 27 (1992), S. 21–26. WO-00/42198 beschreibt einen Stamm von Bifidobacterium zur Verwendung bei der Prophylaxe oder Therapie von entzündlichen Erkrankungen.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Bifidus-Bakterien bereitzustellen, die eine hervorragende Wachstumsrate in einem Milchmedium sowie Säuretoleranz aufweisen und deren Zahl leicht über einer bestimmten Anzahl in einem mit Milchkulturprodukt und während der Zirkulation aufrechterhalten werden kann. Die Bakterien weisen ferner eine starke Magensafttoleranz auf und üben ihre biologische Aktivität aus, indem sie den Verdauungstrakt (Darmtrakt) in lebendem Zustand erreichen.
Aufgabe der Erfindung ist es ferner, Pulver, Nahrungsmittel und Getränke, die die Bifidus-Bakterien enthalten, bereitzustellen.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nach Durchführung eingehender Forschungsarbeiten zur Lösung der vorstehenden Aufgaben festgestellt, dass Bifidobacterium longum mit folgenden Eigenschaften:
(1) Fermentationscharakteristik, um ein Milchgrundmedium auf einen pH-Wert von 4,6 oder darunter zu bringen; (2) Überlebensrate von 50 % oder mehr nach Erreichen eines pH-Werts von 4,4 bis 4,6 in einem Milchgrundmedium, Abschrecken und 2-wöchiger Lagerung bei 10 °C; und (3) Magensafttoleranz, um eine Überlebensrate von 10 % oder mehr zu erzielen, wenn eine 2.-stündige Lagerung im künstlichen Magensaft beim pH-Wert 3,0 bei 37 °C vorgenommen wird,
so gezüchtet werden kann, dass die Anzahl an Zellen innerhalb einer kurzen Zeitspanne eine bestimmte Anzahl übersteigt, eine bestimmte Anzahl an lebenden Zellen während der Verteilung und der Einnahme nach deren Erzeugung aufrechterhalten werden kann und die Bakterien zur Ausübung einer biologischen Aktivität befähigt sind, indem sie den Verdauungstrakt (insbesondere den Darmtrakt) lebend erreichen, wobei sie ihre Magensafttoleranz ausnützen. Auf der Grundlage dieses Befunds wurde die Erfindung fertiggestellt.
Somit wird erfindungsgemäß Bifidobacterium longum mit folgenden Eigenschaften bereitgestellt:

(1) Fermentationseigenschaften, um ein Milchgrundmedium auf einen pH-Wert von 4,6 oder darunter zu bringen;
(2) Überlebensrate von 50 % oder mehr nach Erreichen eines pH-Werts von 4,4 bis 4,6 in einem Milchgrundmedium, Abschrecken und 2-wöchiger Lagerung bei 10 °C; und
(3) Magensafttoleranz, um eine Überlebensrate von 10 % oder mehr zu erzielen, wenn eine 2-stündige Lagerung im künstlichen Magensaft beim pH-Wert 3,0 bei 37 °C vorgenommen wird, wobei es sich beim Stamm von Bifidobacterium longum um Bifidobacterium longum FERM BP-7787 handelt.

Erfindungsgemäß werden ferner Pulver mit einem Gehalt an dem vorerwähnten Bifidobacterium longum bereitgestellt.
Erfindungsgemäß werden ferner Nahrungsmittel und Getränke mit einem Gehalt an dem vorerwähnten Bifidobacterium longum bereitgestellt.
Erfindungsgemäßes Bifidobacterium longum besitzt die vorerwähnten Eigenschaften (1), (2) und (3).
Die Eigenschaft (1) betrifft die fermentativen Eigenschaften. Im allgemeinen wachsen Bifidus-Bakterien nicht gut in einem Milchgrundmedium und es dauert lange, bis ein bestimmter pH-Wert und eine bestimmte Anzahl an Zellen erreicht werden. Wenn ein Bakterienstamm mit starkem Fermentationsvermögen zur Erreichung eines pH-Werts im Milchgrundmedium von 4,6 oder darunter verwendet wird, wird es möglich, die Fermentation innerhalb einer kurzen Zeitspanne zu beendigen, und eine bestimmte Anzahl an bakteriellen Zellen (z. B. 10 Millionen Zellen pro 1 ml des dem Züchtungsvorgang unterzogenen Milchprodukts) lässt sich in einem Nahrungsmittel oder Getränk leicht aufrechterhalten, indem man die Bakterien verwendet (beispielsweise saure Molkereiprodukte, wie Milchkulturprodukte und Fruchtsaftprodukte), wodurch der Produktwirkungsgrad gesteigert werden kann.
Die Eigenschaft (2) betrifft die Säuretoleranz, aufgrund derer eine bestimmte Anzahl an bakteriellen Zellen in einem gelagerten Milchkulturprodukt unter Verwendung von Bifidus-Bakterien aufrechterhalten werden kann, oder die Situation während der Verteilung. Im allgemeinen beträgt der pH-Wert eines Milchkulturprodukts oder eines Fruchtsaftprodukts 4,0–4,8 und sein Verkaufszeitraum beträgt im allgemeinen etwa 2 Wochen bei Lagerungsbedingungen von 10 °C oder darunter. Die Erfinder haben festgestellt, dass Bakterien, deren Überlebensrate 50 % oder mehr beträgt, wenn eine rasche Abkühlung auf 10 °C nach Erreichen eines pH-Werts des Milchgrundmediums von 4,4–4,6 und eine 2-wöchige Lagerung durchgeführt wird, eine starke Säuretoleranz aufweisen und eine bestimmte Anzahl an lebenden Zellen in einem Milchkulturprodukt und dergl. innerhalb des Verkaufszeitraums aufrechterhalten werden kann. Andererseits lässt sich bei Bakterien, deren Überlebensrate beispielsweise 5 % oder weniger beträgt, wenn sie in einer mit Citrat oder Malat gepufferten Lösung 4 Tage bei einem pH-Wert von 4 bei 10 °C gelagert werden, nicht feststellen, dass sie eine ausreichende Säuretoleranz besitzen. Es ist darauf hinzuweisen, dass unter einem Milchgrundmedium ein Medium mit einem Gehalt an Milchbestandteilen zu verstehen ist, z. B. Milch, Schlagsahne, Butter und Magermilch, wobei 3 % oder mehr Milchprotein enthalten sind.
Die Eigenschaft (3) betrifft die Magensafttoleranz, die für Bifidus-Bakterien erforderlich ist, dass sie den Verdauungstrakt (Darmtrakt) in lebendem Zustand erreichen. Bifidus-Bakterien weisen biologisch aktive Funktionen auf, wenn sie den Darmtrakt nach oraler Einnahme und Durchlaufen des Magens erreichen. Da jedoch der pH-Wert des Magens nieder ist, werden die meisten Zellen im Magen abgetötet und es gelingt nur sehr wenigen Zellen, den Darmtrakt zu erreichen. Wenn die Überlebensrate bei 2-stündigem Aufenthalt im künstlichen Magensaft vom pH-Wert 3,0 bei 37 °C 10 % oder mehr beträgt, gilt dies als eine hohe Magensafttoleranz der Bakterien, wobei viele Zellen den Darmtrakt in lebendem Zustand erreichen können.
Bei Einnahme von Bifidobacterium longum mit den vorerwähnten bakteriologischen Eigenschaften (1) bis (3) können zahlreiche Zellen den Darmtrakt in lebendem Zustand erreichen und die Ausübung der biologisch aktiven Funktion als Bifidus-Bakterien gelingt leicht.
Erfindungsgemäße Bifidobacterium longum-Bakterien lassen sich beispielsweise unter Anwendung des nachstehenden Verfahrens erhalten. Zunächst werden Stämme von Bakterien aus verschiedenen Proben abgetrennt. Zellen mit hervorragenden Fermentationseigenschaften auf einem Milchgrundmedium werden ausgewählt, d. h. Zellen mit Fermentationseigenschaften, die die Erzielung eines pH-Werts des Milchgrundmediums von 4,6 oder darunter ermöglichen. Anschließend wird ein Milchkulturprodukt unter Verwendung des ausgewählten Stammes als Starter hergestellt. Stämme mit hervorragender Überlebensrate bei Lagerung bei niederen Temperaturen, d. h. einer Überlebensrate von 50 % oder mehr nach Erreichen eines pH-Werts von 4,4 bis 4,6 in einem Milchmedium nach Abschrecken und 2-wöchiger Lagerung bei 10 °C werden ausgewählt. Anschließend wird der Stamm in künstlichem Magensaft 2 Wochen bei 37 °C bei einem pH-Wert von 3,0 gelagert. Ein Stamm mit hervorragender Magensafttoleranz, die sich durch eine Überlebensrate von 10 % oder mehr zeigt, wird ausgewählt, wodurch man den erfindungsgemäßen Stamm erhält.
Diese Vorgehensweise wird nachstehend ausführlich beschrieben.
1. Gewinnung eines Stammes
Die Erfinder haben mit dem Ziel, in der Natur Bakterienstämme mit den vorerwähnten Eigenschaften aufzufinden, Proben, die aus natürlichen Lebensräumen erhalten worden waren, unter Verwendung eines anaeroben Verdünnungspuffers verdünnt ("Chonaikin no sekai", Tomotari Mitsuoka, S. 322, veröffentlicht von Soubunsha, (1980), nachstehend als Druckschrift 1 bezeichnet), auf eine flache Platte mit BL-Agarmedium aufgesetzt (Druckschrift 1, S. 319) und anaerob bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden unter den erhaltenen Kolonien Stämme, die morphologische Eigenschaften von Bifidus-Bakterien aufwiesen und bei denen es sich um gram-positive Zellen mit einem stäbchenförmigen, schlägerförmigen oder Y-förmigen Erscheinungsbild bei mikroskopischer Betrachtung von aufgetragenen Proben handelte, gewonnen und auf eine flache BL-Agarplatte ausgestrichen, um die anaerobe Inkubation unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens zu wiederholen. Auf diese Weise wurden reine isolierte Stämme erhalten. Anschließend wurden Tests auf die Fermentation und Überlebensrate während der Aufbewahrung der Stämme unter Anwendung der nachstehend angegebenen Verfahren durchgeführt. Es wurden etwa 20 Stämme mit hervorragenden Ergebnissen erhalten. Sodann wurde ein Test auf Magensafttoleranz durchgeführt. Stämme mit einer hervorragenden Überlebensrate in künstlichem Magensaft vom pH-Wert 3,0 wurden erhalten. Darunter wurde ein Stamm, der sich als besonders hervorragend erwies, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7787 bei der Internationalen Hinterlegungsstelle für Patent-Mikroorganismen, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), am 31. Oktober 2001 hinterlegt. Nachstehend sind die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes angegeben.
2. Bakteriologische Eigenschaften

(1) Zellgestalt (72-stündige Inkubation unter anaeroben Bedingungen auf BL-Agarmedium bei. 37 °C und Betrachtung unter einem Lichtmikroskop) Größe: 0,3–0,8 μm × 4–10 μm Gestalt: Stäbchen (schlägerförmig oder Y-förmig)
(2) Gram-Färbung: positiv
(3) Kolonienmorphologie (bei anaerober Inkubation für 72 Stunden auf BL-Agarmedium bei 37 °C) Gestalt: vorstehend unter Ausbildung einer kreisförmigen, konvexkissenförmigen Gestalt Rand: vollständig Größe: 1–4 mm Farbe: dunkelbraun am Rand, aktivkohlebraun in der Mitte Oberfläche: glatt
(4) Endosporenbildung: negativ
(5) Gaserzeugung: keine
(6) Beweglichkeit: keine
(7) Katalase-Aktivität: negativ
(8) Molverhältnis von Essigsäure/L(+)Milchsäure: 1,5 oder mehr
(9) Fermentation von Zuckern durchgeführt unter Verwendung eines API 50CH-Systems (Japan Biomelue Co.) und eines Zuckerfermentationsmediums der Fa. Mitsuoka (vergl. Druckschrift 1, S. 323): positiv bei L-Arabinose, D-Xylose, Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Maltose, Lactose, Melibiose, Saccharose, Melezitose, Raffinose und D-Turanose; verzögerte Reaktion bei α-Methyl-D-glucosid: und negativ bei Glycerin, Erythrit, D-Arabinose, Ribose, L-Xylose, Adonit, Methylxylosid, L-Sorbose, Rhamnose, Dulcit, Inosit, Mannit, Sorbit, α-Methylmannosid, N-Acetylglucosamin, Amygdalin, Arbutin, Esculin, Salicin, Cellobiose, Trehalose, Inulin, Stärke, Glycogen, Xylit, Gentiobiose, D-Lyxose, D-Tagatose, D-Fucose, L-Fucose, D-Arabit, L-Arabit, Gluconat, 2-Ketogluconat und 5-Ketogluconat.
(10) DNA-Homologie: Chromosomale DNA der Stämme Bifidobacterium longum ATCC 15707^T und Bifidobacterium animalis R101-8^T (erhältlich als JCM1190^T bei der Aufbewahrungsstelle für Mikroorganismen des Instituts für physikalische und chemische Forschung) wurde extrahiert und mit chromosomaler DNA, die aus Bifidobacterium longum FERM BP-7787 extrahiert worden war, unter Anwendung einer Mikroplatten-Hybridisierung hybridisiert. Die chromosomale DNA, die aus Bifidobacterium longum FERM BP-7787 extrahiert worden war, zeigte eine 95%ige Homologie mit der chromosomalen DNA, die als Bifidobacterium longum ATCC 15707 extrahiert worden war, während die Homologie mit Bifidobacterium animalis R101-8^T 22 % betrug.

Wie vorstehend erläutert, wird aufgrund der Tatsache, dass Bifidobacterium longum FERM BP-7787 der vorliegenden Erfindung die Kriterien der Bifidus-Bakterien gemäß der Klassifikation in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 2 (1986) erfüllt, und aufgrund der Ergebnisse der Fermentationscharakteristik, der Eigenschaften und der DNA-Homologie der Stamm als Bifidobacterium longum identifiziert.
3. Fermentation auf Milchgrundmedium
Rekonstituiertes Magermilchpulver-Medium (11 %) mit einem Gehalt an 0,2 % Hefeextrakt (Produkt der Fa. Difco Co.) wurde 15 Minuten bei 115 °C pasteurisiert. Ein Starter von Bifidobacterium longum FERM BP-7787, der einer 2-maligen Subkultur auf dem gleichen Medium unterworfen worden war, und Vergleichsstämme (die in Tabelle 1 aufgeführten Stämme, die vom erfindungsgemäßen Stamm abweichen, wurden überimpft (5 %) und 6 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Anzahl der Zellen und der pH-Wert der Inkubationsflüssigkeit wurden gemessen. Die Zählung der Zellen wurde auf einem verstärkten Klostridienagar (RCA, Produkt der Fa. Oxoid Co.) in Form einer flachen Platte durchgeführt. Unter den vorstehenden Inkubationsbedingungen war Bifidobacterium longum FERM BP-7787 dazu befähigt, das Milchgrundmedium innerhalb einer kürzeren Zeitspanne zu verfestigen, verglichen mit den Vergleichsstämmen. Die höchste Anzahl an Bifidus-Bakterien war im Medium enthalten (Tabelle 1). Tabelle 1 Fermentative Eigenschaften der einzelnen Stämme auf Milchgrundmedium

Bifidobacterium longum FERM P-6548: Stamm gemäß Beschreibung im zitierten Dokument 1
Bifidobacterium longum ATCC 55817: Stamm gemäß Beschreibung im zitierten Dokument 2

4. Säuretoleranz
(1) Einzelfermentation
Rekonstituiertes Magermilchpulver-Medium (11%) mit einem Gehalt an 0,2 % Hefeextrakt (Produkt der Fa. Difco Co.) wurde in ein Glasröhrchen gegeben und 15 Minuten bei 115 °C pasteurisiert. Ein Starter von Bifidobacterium longum FERM BP-7787 und von Vergleichsstämmen (in Tabelle 2 aufgeführte Stämme, die sich vom erfindungsgemäßen Stamm unterscheiden) wurden überimpft (5 %) und bis zum Erreichen eines pH-Werts von 4,3–4,4 bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde rasch abgekühlt. Lagertests wurden bei 10 °C durchgeführt. Die Anzahl der Zellen unmittelbar nach dem Abkühlen, nach 1-wöchiger Lagerung und nach 2-wöchiger Lagerung wurden unter Verwendung einer flachen RCA-Agarplatte gemessen. Die Überlebensrate bei den einzelnen Lagerzeiten wurde berechnet.
Es wurde festgestellt, dass der Großteil von Bifidobacterium longum FERM BP-7787 die 2-wöchige Lagerung bei 10 °C auf dem fermentierten Medium beim pH-Wert 4,4 überlebte, was zeigte, dass sie eine sehr hohe Überlebensrate aufwiesen, die besser ist als die des Vergleichsstammes Bifidobacterium longum FERM P-6548 (Tabelle 2). Der Großteil von Bifidobacterium longum ATCC 55817, von dem bekannt ist, dass es Magensafttoleranz aufweist, und die übrigen Vergleichsstämme waren nicht zum Überleben der 2-wöchigen Lagerung befähigt. Tabelle 2 Überlebensrate der einzelnen Stämme auf Milchgrundmedium

(2) Mischfermentation
Rohmilchgrundlage mit einem Gehalt an 3,0 % (Gew./Gew.) Butterfett und 9 % (Gew./Gew.) Nichtfett-Milchfeststoffanteile (gleiche Zusammensetzung wie im nachstehend beschriebenen Beispiel 1) wurde auf 70 °C erwärmt, bei einem Druck von 15 MPa homogenisiert, 10 Minuten bei 90 °C pasteurisiert und auf 90 °C abgekühlt. Eine Mischkultur von Streptococcus thermophilus und Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (0,6 %), die gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde auf die pasteurisierte Grundlage überimpft. Ferner wurde ein Starter von Bifidobacterium longum FERM BP-7787 und von Vergleichsstämmen (in Tabelle 3 aufgeführte Stämme, die vom erfindungsgemäßen Stamm abweichen), die bei 37 °C unter Verwendung des vorerwähnten, 11%igen, rekonstituierten Magermilchpulver-Mediums mit einem Gehalt an 0,2 % Hefeextrakt (Produkt der Fa. Difco Co.) bis zum Erreichen eines pH-Werts von 4,3–4,4 gezüchtet worden waren, überimpft (5 %), in Teströhrchen gegeben, 5 Stunden bei 37 °C inkubiert und rasch zur Durchführung von Lagerungstests auf 10 °C abgekühlt. Die Anzahl der Zellen unmittelbar nach dem Abkühlen, nach 1-wöchiger Lagerung und nach 2-wöchiger Lagerung wurden unter Verwendung einer flachen RCA-Agarplatte gemessen. Die Überlebensrate für die einzelnen Lagerzeiten wurde berechnet. Mehr als 50 % Bifidobacterium longum FERM BP-7787 überlebten nach 2-wöchiger Lagerung bei 10 °C auf dem fermentierten Medium vom pH-Wert 4,6 oder darunter, was zeigt, dass ihre Säuretoleranz besser war als bei Bifidobacterium longum ATCC 55817, von dem bekannt ist, dass es Magensäuretoleranz aufweist, sowie besser als bei den übrigen Vergleichsstämmen (Tabelle 3). Tabelle 3 Überlebensrate der einzelnen Stämme auf Milchgrundmedium

5. Magensafttoleranz
Tests auf Magensafttoleranz wurden folgendermaßen durchgeführt. Eine Bakterienzellsuspension (0,1 ml) von Bifidobacterium longum FERM BP-7787 und Suspensionen von Vergleichsstämmen, die einer 2-maligen Aktivierungszüchtung (37 C, 24 Stunden) unter Verwendung von Briggs-Leberbrühe (Rinsho Kensa, Tomotari Mitsuoka, Bd. 18 (1974), S. 1163–1172 unterzogen worden war und 1-mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen worden war, wurden zu 9,9 ml künstlichem Magensaft (0,2 % NaCl, 0,35 % Pepsin (1:5000), gelöst in gereinigtem Wasser), dessen pH-Wert unter Verwendung von durch Filtration sterilisierter 1 M Salzsäure auf 3,0 eingestellt worden war, gegeben. Nach 2-stündigem Kontakt bei 37 °C wurde ein 1 ml-Anteil davon zu 9 ml Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,5, 67 mM) zugegeben, um den Vorgang zu beenden. Sodann wurde die Anzahl der Zellen, die ursprünglich und nach dem Kontakt vorhanden waren, unter Verwendung einer flachen RCA-Agarplatte gemessen. Die Überlebensrate wurde berechnet. Dabei zeigte sich, dass der erfindungsgemäße Stamm FERM BP-7787 eine starke Magensafttoleranz in gleicher Höhe wie ATCC 55817 aufwies, während die übrigen Stämme, einschließlich FERM P-6548, der eine relativ hohe Säuretoleranz besitzt, fast keine Toleranz zeigten (Tabelle 4). Tabelle 4 Toleranz der einzelnen Stämme gegen künstlichen Magensaft

Bifidobacterium longum FERM P-6598: Stamm gemäß Beschreibung im zitierten Dokument 1
Bifidobacterium longum ATCC 55817: Stamm gemäß Beschreibung im zitierten Dokument 2

Aufgrund der Tatsache, dass, wie vorstehend ausgeführt, Bifidobacterium longum FERM BP-7787 starke Fermentationseigenschaften auf einem Milchgrundmedium aufweist, eine hervorragende Überlebensrate bei Lagerung unter sauren Bedingungen zeigt und eine starke Toleranz gegen künstlichen Magensaft besitzt, ist es offensichtlich, dass er Eigenschaften aufweist, die bei den Vergleichsstämmen von Bifidobacterium longum oder bekannten Bakterienstämmen nicht gegeben sind. Demgegenüber waren die fermentativen Eigenschaften auf einem Milchgrundmedium und die Überlebensrate bei Lagerung unter sauren Bedingungen beim Stamm ATCC 55817, von dem bekannt ist, dass er Magensafttoleranz aufweist, deutlich schlechter und erheblich geringer als beim erfindungsgemäßen Stamm FERM BP-7787.
Erfindungsgemäßes Bifidobacterium longum ist ein Organismus, der unter den in der Natur vorkommenden Bifidobacterium longum-Organismen mit Fermentationseigenschaften, Säuretoleranz und Magensäuretoleranz ausgewählt wurde. Demzufolge kann erfindungsgemäßes Bifidobacterium longum rasch innerhalb kurzer Zeit inkubiert werden, wobei der Grad der Abnahme der Anzahl an lebenden Zellen in einer Kultursubstanz oder während der Lagerung eines bearbeiteten Produkts sehr gering ist. Demzufolge kann es innerhalb eines breiten Bereiches für Nahrungsmittel und Getränke eingesetzt werden.
Da ferner bestätigt wurde, dass die Überlebensrate von erfindungsgemäßem Bifidobacterium longum auch in eingefrorenem oder gefriergetrockneten Zustand gut ist, kann es in Form eines Pulvers. verwendet werden. Da erfindungsgemäßes Bifidobacterium longum ferner Magensäuretoleranz aufweist und somit in einem hohen prozentualen Anteil den Verdauungstrakt (Darmtrakt) zur Ausübung seiner biologischen Funktion bei Einnahme durch den Menschen oder ein Tier erreichen kann, ist es für gewerbliche Zwecke von äußerst hohem Wert. Beispielsweise kann es nicht nur als Substanz zur Steuerung der Darmfunktion beim Menschen oder bei Tieren verwendet werden (wie es seit vielen Jahren bekannt ist), sondern kann auch mit pulverförmigen Nahrungs- oder Futtermitteln versetzt oder vermischt werden oder es kann flüssigen oder halbfesten Futtermitteln oder Nahrungsmitteln zugesetzt werden.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Der erfindungsgemäße Stamm Bifidobacterium longum FERM BP-7787 wurde auf ein Medium (1000 ml) mit einem Gehalt an 0,2 % (Gew./Gew.) Hefeextrakt und 11 % (Gew./Gew.) Magermilchpulver, das 3 Stunden bei 90 °C pasteurisiert worden war, überimpft und 6 Stunden bei 37 °C inkubiert. Ferner wurde eine Mischkultur (50 ml) von Streptococcus thermophilus (Chr. Hansen) und Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Chr. Hansen) auf 10 % (Gew./Gew.) rekonstituiertes Magermilchmedium (1500 ml), das 30 Minuten bei 90 °C pasteurisiert worden war, überimpft und 5 Stunden bei 42 °C inkubiert.
Getrennt davon wurde Magermilch (50 Liter) mit einem Gehalt an 3,0 % (Gew./Gew.) Butterfett und 9 % (Gew./Gew.) Nichtfett-Milchfeststoffanteilen auf 70 °C erwärmt, bei einem Druck von 15 MPa homogenisiert, 10 Minuten bei 90 °C pasteurisiert und auf 40 °C abgekühlt. Eine Kultur (750 ml) des Stammes Bifidobacterium longum FERM BP-7787 gemäß der Erfindung, der auf die vorstehend beschriebene Weise vorinkubiert worden war, und die Mischkultur (300 ml) von Streptococcus thermophilus und Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus wurden auf die sterilisierte Grundlage überimpft, in einen 500 ml-Behälter gefüllt, verschlossen, 5 Stunden bei 37 °C inkubiert und rasch abgekühlt. Die Milchsäureazidität und der pH-Wert der erhaltenen Kulturmilch betrugen 0,81 % bzw. 4,55. Es waren 2,3 × 10⁸/ml Bifidobacterium longum Stamm FERM BP-7787, 6,8 × 10⁸/ml Streptococcus thermophilus und 3,4 × 10⁷/ml Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus darin enthalten. Die Anzahl an in der Kulturmilch enthaltenen Zellen von Bifidobacterium longum FERM BP-7787 nach 14-tägiger Lagerung bei 10 °C betrug 1,5 × 108/ml, was eine Überlebensrate von 85 % bedeutet.
Beispiel 2
Eine Anzuchtkultur (500 ml) des Stammes Bifidobacterium longum FERM BP-7787 gemäß der Erfindung, die 16 Stunden bei 37 °C auf einem Medium mit einem Gehalt an 50 g Fleischextrakt, 100 g Pepton, 200 g Milchzucker, 50 g K₂HPO₄, 10 g KH₂PO₄, 4 g Cystin und 9,5 Liter Wasser vorinkubiert worden war, wurde auf das vorstehende Medium (10 Liter) überimpft und 16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Ferner wurde die gesamte Menge des vorstehenden Mediums (10,5 Liter) auf ein Medium (200 Liter), das die gleiche Zusammensetzung wie das vorerwähnte Medium aufwies und 30 Minuten bei 90 °C pasteurisiert worden war, überimpft und 16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Anzahl an lebenden Zellen nach der Inkubation betrug 3,0 × 10⁹/ml.
Sodann wurden bakterielle Zellen unter Verwendung einer Sharpless-Zentrifuge (15 000 U/min) gewonnen, erneut in physiologischer Kochsalzlösung in einer dem Medium entsprechenden Menge, die vorher 30 Minuten bei 90 °C pasteurisiert worden war, suspendiert und erneut unter. Verwendung der gleichen Zentrifuge gewonnen. Die erhaltenen Zellen wurden in einer Lösung (20 Liter, 30 Minuten bei 90 °C pasteurisiert) mit einem Gehalt an 10 % (Gew./Gew.) Magermilchpulver, 1 % (Gew./Gew.) Saccharose und 1 % (Gew./Gew.) Mononatriumglutamat suspendiert und unter Anwendung eines herkömmlichen Verfahrens gefriergetrocknet. Man erhielt etwa 2,2 kg Pulver, das die erfindungsgemäßen Bakterien enthielt.
Beispiel 3
Pulver (20 g) mit einem Gehalt an dem in Beispiel 2 erhaltenen erfindungsgemäßen Stamm Bifidobacterium longum FERM BP-7787 wurde zu trocken sterilisierter Stärke (14 kg) und Milchzucker (6 kg) gegeben und gleichmäßig vermischt. Man erhielt etwa 20 kg eines Pulvers zur Steuerung der Darmfunktion mit einem Gehalt an 1,0 × 10⁸/g Zellen des erfindungsgemäßen Stammes.
Beispiel 4
Der erfindungsgemäße Stamm Bifidobacterium longum FERM BP-7787 wurde auf ein Medium (1000 ml.) mit einem Gehalt an 0,2 % (Gew./Gew.) Hefeextrakt und 11 % (Gew./Gew.) Magermilchpulver, das 3 Stunden bei 90 °C pasteurisiert worden war, überimpft und 6 Stunden bei 37 °C inkubiert. Ferner wurden eine Kultur (30 ml) von Streptococcus cremoris (Chr. Hansen) auf 10 % (Gew./Gew.) rekonstituiertes Magermilchmedium (1000 ml.) mit einem Gehalt an 0,6 % (Gew./Gew.) Hefeextrakt, das 30 Minuten bei 90 °C pasteurisiert worden war, überimpft und 16 Stunden bei 30 °C inkubiert.
Getrennt davon wurde Magermilch (50 Liter) mit einem Gehalt an 0,5 % (Gew./Gew.) Butterfett, 9 % (Gew./Gew.) Nichtfett-Milchfestanteile und 6,5 % Saccharose auf 70 °C erwärmt, bei einem Druck von 15 MPa homogenisiert, 10 Minuten bei 90 °C pasteurisiert und auf 33 °C abgekühlt. Eine Kultur (750 ml) des erfindungsgemäßen Stammes Bifidobacterium longum FERM BP-7787, die auf die vorstehend beschriebene Weise vorinkubiert worden war, und die Kultur (500 ml) von Streptococcus cremoris wurden auf die sterilisierte Grundlage überimpft, 16 Stunden bei 30 °C inkubiert und rasch unter Rühren abgekühlt. Die gekühlte Kulturmilch wurde einem Homogenisiervorgang bei 15 MPa Druck unterworfen, in einem 200 ml-Behälter gefüllt und verschlossen. Man erhielt ein Joghurtgetränk.
Die Milchsäureazidität und der pH-Wert der erhaltenen Kulturmilch betrugen 0,81 % bzw. 4,55. Es waren 1,5 × 10⁸/ml Zellen des Stammes Bifidobacterium longum FERM BP-7787 und 9,8 × 10⁸/ml Zellen von Streptococcus cremoris darin enthalten. Die Anzahl an Zellen von Bifidobacterium longum FERM BP-7787, die in der Kulturmilch nach 14-tägiger Lagerung bei 10 °C enthalten waren, betrug 8,5 × 10⁷/ml, was einer Überlebensrate von 57 % entspricht.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Erfindungsgemäßes Bifidobacterium longum erweist sich in Bezug auf die Fermentationseigenschaften und die Überlebensrate auf Milchgrundmedium hervorragend und zeigt Toleranz gegen künstlichen Magensaft. Demgemäß ist es möglich, rasch eine Kultur des erfindungsgemäßen Stammes herzustellen, wobei das Ausmaß der Abnahme der Anzahl an lebenden Zellen in der Kultur oder einem Produkt bei Lagerung gering ist. Demzufolge kann der Stamm für. Nahrungsmittel und Getränke innerhalb eines breiten pH-Bereiches eingesetzt werden. Ferner weist der erfindungsgemäße Stamm Magensafttoleranz auf und erreicht bei. Einnahme durch einen Menschen oder durch Tiere den Verdauungstrakt (Darmtrakt) in lebendem Zustand in einem hohen prozentualen Anteil, und kann physiologische Funktionen ausüben. Demzufolge ist der Organismus von erheblichem gewerblichem Wert.

Claims

Bifidobacterium longum mit folgenden Eigenschaften: (1) fermentative Eigenschaften, um ein Milchgrundmedium auf einen pH-Wert von 4,6 oder darunter zu bringen; (2) Überlebensrate von 50 % oder mehr nach Erreichen eines pH-Werts von 4,4 bis 4,6 in einem Milchgrundmedium, Abschrecken und 2-wöchiger Lagerung bei 10 °C; und (3) Magensafttoleranz, um eine Überlebensrate von 10 % oder mehr zu erzielen, wenn eine 2-stündige Lagerung in künstlichem Magensaft beim pH-Wert 3,0 bei 37 °C vorgenommen wird, wobei es sich beim Stamm von Bifidobacterium longum um Bifidobacterium longum FERM BP-7787 handelt.
Pulver, umfassend Bifidobacterium longum nach Anspruch 1.
Nahrungsmittel oder Getränke, umfassend Bifidobacterium longum nach Anspruch 1.