KR100472865B1 - 생리활성이 뛰어난 한국형 비피도박테리움 인판티스 pl9506 - Google Patents

생리활성이 뛰어난 한국형 비피도박테리움 인판티스 pl9506 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장상피세포 부착능, 면역 증가능, 콜레스테롤 저하능, 항돌연변이능이 우수한 유산균에 관한 것으로 내산, 내담즙능이 뛰어나고 각종 식중독균 억제능을 보이는 유아의 분변에서 분리한 Bifidobacterium infantis PL9506 (KCCM-10406)을 제공한다. 본 발명의 균주는 유산균제제, 발효유제품, 식품첨가제, 의약품, 화장품, 생균제 등의 다양한 제품에 활용될 수 있다.

Description

생리활성이 뛰어난 한국형 비피도박테리움 인판티스 PL9506 {Korean Isolate Bifidobacterium infantis PL9506 with High Nutraceutical Activity}
본 발명은 내산, 내담즙이 우수한 Bifidobacteria 들을 유아의 분변에서 분리한 후 장내 유해효소로 알려진 β-glucosidase 비보유 Bifidobacteria 중에서 대장상피세포 부착능과 면역 증가능 (마크로파아지 활성능), 돌연변이 억제능, 식중독균 억제능, 콜레스테롤 소화능 등이 뛰어난 Bifidobacterium infantis PL9506을 선발하여 유산균제제, 발효유제품, 건강보조식품, 사료첨가제, 의약품, 화장품, 생균제등의 다양한 제품의 첨가제로 사용하고자 한다.
1899년 Tisser 에 의해 비피도 박테리아가 분리된 이래 비피도 박테리아는 정장 작용 및 장내 균총의 정상화등 인체에 유익한 균주로 여겨지고 있다(Benno, Y., K. Sawada and T. Mitsuoka. 1984. The intestinal microflora of infants; composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants. Microbiol. Immunol, 28:975-986). 분리된 초기에는 생리적 특성이 Lactobacillus와 유사하여 Lactobacillus라 불려지다가(Weiss, J.E. and Rettger L. F. 1938. Lactobacillus bifidus. J. Bacteriology. 28:501-527) 현재는 Bifidobacterium으로 따로 분류되어져 있다. 보통 성인의 장내에 분포하는 혐기성 장내 미생물인 비피도박테리아는 와 Lactobacillus와 Streptococcus보다 약 1,000배 이상 존재하는 유산균으로 fructose-6-phosphate phosphoketolase(FPPK)의 특이 대사계 (Scardovi, V. and L.D. Trovatelli. 1965. The fructose-6-phosphate shunt as a peculiar pattern of hexose degradation in genus Bifidobacterium. Ann. Microbiol. Enzymol. 15:19-29)를 통하여 아세트산와 젖산 등의 유기산을 생성하여 장내의 pH를 약 산성으로 낮추어 산에 예민한 유해균의 증식을 억제 (Collins, E.B and B.J. Hall. 1984. Growth of bifidobacteria in milk and preparation of Bifidobacterium infantis for a dietary adjunct. J. Dairy Sci. 7:1376-1380)하고 H2O2와 유용항생물질을 생산하여 장질환을 예방한다. 또한 비타민을 합성하여 영양학적으로 도움이 되며(Shahani, K.M. and R.C. Chandan. 1979. Nutritional and healthful aspects of cultured and culture-cintaining dairy foods. J. Dairy. Sci. 62: 1685-1694), 단백질을 분해하여도 암모니아, 아민, 황화 수소등 독성 물질의 생산이 거의 없기 때문에 우리의 건강에 유익한 균주로 여겨지고 있다. 최근에는 항암작용이나 숙주 면역체제의 강화 등 면역 기능의 활성화 측면에서도 많은 연구가 진행되고 있다 (Sasaki, T., S. Fukami, and S. Namioka. 1994. Enhanced resistance of mice to Esherichia coli infection induced by administration of peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum. J. Vet. Med. Sci. 53:433-437). 이와 같이 최근 주요 생리학적 기능을 갖는 비피더스균은 기능성 식품의 소재로 부각되면서 이전부터 사용되고 있는 유산균 Lactobacillus, Streptococcus와 더불어 유제품 및 정장제품에 널리 이용되고 있다.
따라서 본 발명은 내산, 내담즙능이 우수한 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 대장 상피세포(Caco-2 cell )에 부착이 잘 되는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 면역증강에 효과적인 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 콜레스테롤 분해능이 우수한 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 돌연변이 억제능을 보이는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 식중독균의 성장을 억제할 수 있는 균주를 제공하는 것으로 목적으로 한다.
[실시예]
[실험예 1] 비피도박테리움의 분리 및 동정
실험 대상자 (한국영유아)의 분변을 받아 멸균 식염수에 십 배수로 순차적 희석을 하여 Bifidobacterium 선택배지인 TP 배지(표1)를 사용하여 균주를 분리하였다. 혐기 배양을 위하여 Gas-pak을 사용한 Cold catalyst system(Palladium coated alumina pellets: BBL)을 이용하여 37℃에서 3일간 혐기 배양하였다. TP 배지에서 생성된 콜로니 중 일차적으로 Y 혹은 V자형, 곤봉형의 그람양성 간균을 선택하였고 편성 혐기성균을 재확인하였다.
Bifidobacterium은 fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK)의 특이적 대사계를 통해 포도당을 초산과 젖산을 1.5 : 1의 비율로 생성하므로 F-6-PPK 반응이 양성인 균주를 Bifidobacterium 속으로 동정하였으며 이들 균주를 다시 API 50 CHL동정 kit (bioMerieux Vitex, Inc, France)을 사용하여 선발균주의 탄수화물 발효 패턴을 결정하였고 Bergy's manual of systematic bacteriology 및 Roy와 Ward (Roy, D. and P. Ward. 1990. Evaluation of rapid methods for differentiation of Bifidobacterium species. J. Appl. Bac. 69:739-749)에 의한 방법에 준하여 균주를 분석하였고, 최종적으로 16S rRNA 유전자의 염기서열을 Microseq 16S rRNA gene kit(Perkin Elmer Applied Biosystem)을 분석하여 동정하였다. 그람 염색 후 광학 현미경과 전자 현미경으로 도 1( PL9506의 그람염색 사진)과 도 2(PL9506의 전자현미경사진)와 같은 형태를 확인하였다. 분리된 Bifidobacterium infantis PL9506의 당 발효패턴은 표 2와 같다. 또한 PL9506의 16S rRNA는 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) PL9506의 16S rRNA의 염기서열은 Bifidobacterium infantis (D86184.1)와 99%로 동일하였으며 Genbank에 등록하여 Accession No. BankIt 484334 AF538862 를 부여받았다 (표 3). 상기 균주는 Bifidobacterium infantis PL9506 (KCCM 10406)으로 한국미생물보존센터에 국제기탁하였다.
표 1. TP 배지 성분
표 2. Bifidobacterium PL9506의 당 발효패턴
표 3 Bifidobacterium PL9506의 16S rRNA 유전자 염기서열
[실험예 2] 내산성실험 (Acid resistance)
균주의 내산성을 측정하기 위하여 PL9506을 TP broth에 24시간 배양한 후 균체 농도가 108-1010 CFU/ml이 되도록 십진 희석한 후 중성 TP 배지(pH 7.0)와 산 첨가 TP 배지에 도말하여 혐기적 배양기 (anaerobic jar system)에서 37℃, 48시간 배양하여 most probable number method (MPN)으로 균수를 측정하였다. 산성 배지는 염산을 사용하여 TP 배지의 pH를 5.0으로 맞추어 제조하였다. 중성배지에서 생육된 균수에 대한 산성배지에서 생육한 균수의 백분율을 생존율로 정의하여 산에 대한 내성을 측정하였다. 표 4는 PL9506에 대한 내산성을 나타낸 것이다 (Conway, P.L., S.L. Gorback, and B.R. Goldin. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy. Sci. 70:1-12).
표 4. Viability(CFU/ml) of Bifidobacteria strains in acidic condition
[실험예 3] 내담즙 실험 (Bile resistance)
균주의 내담즙성을 측정하기 위하여 실험 균주를 TP broth에 24시간 배양한 후 혐기 희석액에 균체 농도가 108-1010 CFU/ml이 되도록 현탁한 후 십진희석하여 TP 평판배지와 OX-BILE (OXOID, Hampshire, England)를 0.25%함유한 TP 평판배지에 각각 도말한 후 혐기 배양기를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하였다. TP 평판배지에서 생육한 균수에 대해 OX-BILE를 0.25% 함유한 TP 평판배지에서 생육한 균수의 백분율을 생존율로 정의하여 이를 비교하여 균주의 내담즙성을 측정하였다. 표 5는 PL9506의 내담즙성을 나타낸 것이다(Ibrahim, S.A. and Bezkorovainy, A. 1993. Survival of bifidobacteria in the presence of bile salt. J. Sci. Food Agric. 62 : 351-354).
표 5. Viability(CFU/ml) of Bifidobacterium strains in the presence of 0.25% bile salt.
[실험예 4] 항생제 내성 실험
PL9506의 항생제 내성을 측정하였다. PL9506을 MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe) 평판배지에 면봉을 이용하여 도말한 후 항생제가 포함된 필터(직경 6 mm)을 올려놓고 37℃에서 48시간 혐기적으로 배양하였다. 항생제에 의한 성장 억제환의 크기를 측정하였다. 이때 억제환의 크기가 작을수록 항생제에 대한 내성이 크다는 것을 보여준다. 표 6은 Bifidobacterium infantis PL9506에 대한 항생제 내성정도를 나타낸 것이다.
표 6. Diameter of Inhibited gorwth zone (mm).
[실험예 5] β-Glucosidase 활성실험
안전성을 확인하기 위하여 Bifidobacterium이 가질 수 있는 발암성 효소 β-glucosidase를 조사하였다. β-Glucosidase는 배당체를 분해하는 효소로 배당체가 분해되면 당과 비배당체 부분으로 나뉘어진다. 섭취된 식품중의 배당체는 분해되면 반응성이 증가하고 분해된 배당체는 반응성이 증가하면서 체내 흡수가 증가되는 것으로 알려져 있다. 특히 amygdalin과 같은 청산 배당체와 쿠마린 배당체는 분해 후 독성기가 유리되어 너무 많은 양이 생성되면 바람직하지 않다. β-Glucosidase의 활성 확인은 Ferhak와 Pey (Ferhak J. D. and Pey E.K., 1983. Effect of glucose and other sugars on the β-1,4-glucosidase of Thermonospora fusca. Biotech. Bioeng. 25:2855-2864)의 방법을 이용하여 측정하였다. BHI 배지에 약 12시간 균주를 배양한 뒤 원심분리하여 균체를 수집하고 0.1 M 인산완충용액(pH 6.0)으로 두 번 세척한 뒤 acetone-toluene (9:1)이 1/50 (v/v) 포함된 같은 인산완충용액 0.4 ㎖에 현탁시킨다. 여기에 기질인 PNPG( p-nitro-phenyl-β-D-glucopyranoside)를 최종농도가 1 mM 되도록 넣어준 뒤 45℃에서 일정시간 반응을 시켰다. 반응을 정지시키기 위해 0.5 M Na2CO3를 0.6 ㎖ 첨가하였고 이때 유리되는 PNP (p-nitrophenol)의 양은 400 nm에서 흡광도로 측정하였다. 이때 1 unit는 45℃에서 1분간 유리되는 PNP의 ㎛ole 수로 정의하였다.
측정 결과 Bifidobacterium infantis PL9506은 β-glucosidase 비보유 균주로 선별되었다.
[실험예 6] 각종 식중독균 억제능
Bifidobacterium infantis PL9506 균주의 각종 식중독 균의 억제능을 측정하기 위하여 PL9506의 MRS 배양여액과 2배 농도의 BHI(Brain Heart Infusion) 배양액을 동량 혼합하고, 여기에 BHI에서 배양한 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteriditis), 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes), 에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), Escherichia coli O157:H7을 최종농도가 1% 되도록 접종하여 37℃에서 배양하였다. 24시간 후 배양액내의 각각의 식중독 균의 수를 MPN 방법으로 측정하였다. 이때 리스테리아 모노시토제네스는 혈액한천배지에, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 엔테리티디스, 에로모나스 히드로필라, E. coli O157:H7는 MacConkey 배지에 접종하여 생균수를 측정하였다. 표 7은 Bifidobacterium infantis PL 9506 배양여액에 의한 각종 식중독 균주 성장 생균수를 측정하여 log 값으로 나타낸 것이다. 표 7에서 관찰되듯이 Bifidobacterium infantis PL 9506 은 식중독균을 억제하는 물질들을 생산하여 식중독균의 성장을 억제하였다. 상기에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 PL균주는 식중독을 유발하는 균주의 성장을 억제하는 물질들을 생산함을 확인할 수 있었다.
표 7. Bifidobacterium infantis PL 9506 배양액의 각종 식중독균 억제능
[실험예 7] 혐기성 세균 성장 억제능
감염증 치료를 위해 다량의 항생제 섭취나 장기간의 항생제 치료시 장내 유산균의 수가 감소되면 장내에 소수로 존재하던 혐기성 세균인 클로스트리디움 디피실 (Clostridium difficile) 균주가 압도적으로 증가하게 된다. 클로스트리디움 디피실은 설사등의 장염을 유발하여 항암환자의 치료를 더욱 어렵게 만든다. PL9506의 클로스트리디움 디피실 억제능력을 측정하였다. 먼저 클로스트리디움 디피실을 헤민(Hemin, 0.01g/ℓ)과 L-시스테인(0.5g/ℓ)이 함유된 Thio-glycolate 액체배지에 접종하고 37℃에서 48시간 혐기적으로 배양하였다. PL 9506 MRS 배양여액과 2배 농도의 BHI 배양액을 동량 혼합하고 여기에 BHI에서 배양한 클로스트리디움 디피실의 최종농도가 1% 되도록 접종한 후 배양액 위에 파라핀 오일을 덮어 혐기적으로 37℃에서 배양하였다.
24 시간 후 배양액을 희석하여 혈액한천배지에 접종하여 혐기적 배양기에서 37℃, 48시간 배양한 후 생균 수를 측정한 결과를 표 8에 나타내었다.
표 8. Bifidobacterium infantis PL9506 배양액의 Cl. difficile의 억제능 (24 h).
[실험예 8] SOS chromotest를 이용한 항돌연변이 실험
PL9506이 돌연변이원에 대해 어떠한 영향을 미치는 지 알아보기 위하여 SOS chromotest를 실시하였다. 항돌연변이 효과를 검색하기 위한 시험법으로 Radman (Radman M. 1975. SOS repair hypothesis: Phenomenology of inducible DNA repair which is accompanied by mutagenesis. pp335-367. In Molecular Mechanisms Repair of DNA. Hanawalt, P. and Setlow R.B.(ed.) Plenium, New York, U.S.A)등에 의해 개발된 SOS chromotest를 실시하였다. 이 방법은 박테리아 유전자가 해를 입게 되면 작용하게 되는 error-prone 수복체제인 SOS 반응을 응용하여 실험 목적에 맞게 분자생물학적으로 개량된 E, coli PQ37 균주를 사용하는 것이다. 이 균주는 SOS 반응에 억제자로 관여하는 단백질인 LexA의 조절을 받아 SOS 반응시 발현되는 sfiA 유전자에 β-galactosidase의 구조 유전자인 lacZ를 융합시킨 유전자를 지님으로써 DNA 손상에 의해 유도되는 SOS반응이 β-galactosidase 효소를 발현시키므로 이 효소에 대해 발색 반응을 일으키는 기질을 가하여 SOS 반응 유도 정도를 효소정량으로 측정한다. E. coli PQ37를 하룻밤 배양하고 이를 LB 배지에 1:4(v/v) 희석하여 2시간 진탕 배양한 다음 O.D.를 0.7로 맞추고 이것을 다시 LB 배지에 1:10로 희석하였다. 이것과 돌연변이원인 4-NQO(4-nitroquinoline 1-oxide)와 PL9506 상등액을 시험관에 넣어 SOS 반응을 유도한 다음 37℃에서 2시간 진탕 배양한 후 β-galactosidase와 alkaline phosphatase활성을 측정하였다. β-galactosidase 활성측정은 0.3 ㎖ 세포 배양액에 2.7 ㎖의 B 완충용액 (1 liter 당 Na2HPO4 16.1 g, NaH2PO4 · H2O 5.5 g, KCl 0.75 g, MgSO4 · 7H2O 0.25 g, Sodium dodecyl sulfate(SDS)1 g, β-mercaptoethanol 2.7 ml 그리고 pH 7.0)을 넣어 37℃에서 약 10분간 두어 온도를 균일화 한 뒤 ONPG (o-nitrophenyl -β-D-galactopyranoside)용액 0.6 ㎖을 첨가하여 약 1시간 정색반응을 진행시킨 뒤 1 M Na2CO3 용액 2 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Alkaline phosphatase활성은 ONPG 대신 PNPP (p-nitrophenyl-phosphate disodium) 용액을 사용하였다. 반응을 정지시키기 위해 1 ㎖ 의 0.25 M HCl을 첨가하고 5분 후 2 M Tris(tris-hydroxymethyl aminomethane) 1 ㎖를 첨가하였다. 이때의 enzyme unit 및 ratio는 아래와 같다.
Enzyme unit = O.D.420×1000 / T(min)
Ratio = β-galactosidase unit/Alkaline phosphatase
표 9는 PL9506에 대한 항 돌연변이원성을 실험한 결과로 PL9506은 우수한 항 돌연변이원성을 가지고 있었다.
표 9. SOS Chromotest
[실험예 9] Macrophage 세포의 면역 활성에 미치는 영향
인체에 침투한 외부의 해로운 물질을 인식하고 대응하는 것이 면역계로 특이적 면역에 대응하는 인체의 세포는 B세포, T세포, macrophage등을 들 수 있다. Bifidobacterium은 면역세포인 macrophage을 직접 활성화하고 이로 인해 생성된 cytokine등의 생산을 증가시키는 것으로 보고되어 있다 (Yasui, H. and M. Ohwaki. 1991. Enhancement of immune responses in Peyer's patch cells cultured with Bifidobacterium breve. J. Dairy. Sci. 74:1187-1195; Hatcher, G.E. and R.S. Lambrecht. 1993. Augmentation of macrophage phagocytic activity by cell-free extracts of selected lactic acid-producing bacteria. J. Dairy. Sci. 76: 2485-2492). 비피도박테리아의 면역 자극물질로는 세포벽의 구성성분인 peptidoglycan과 세포 내외에 있는 polysaccharide 등이라는 주장이 있다. 이러한 면역자극은 외부에서 침입한 병원성 세균의 사멸이나 감염에 대한 저항을 강화시킬 수 있는 데 Macrophage에서 생산된 TNF-α(tumor necrosis factor)나 IL(interleukin)-6와 같은 여러 종류의 매개물질의 생산을 통한 면역조절에 관여한다 (Laskin, D.L. and J. Pendino. 1995. Macrophages and inflammatory mediators in tissue injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35:655-677). TNF-α는 암세포 파괴능을 지니며 호중구 활성으로 염증반응을 유도하며 혈관 내피세포에 작용하여 백혈구 부착 항진과 다른 cytokine의 생성을 하고 IL-6는 활성화 B세포의 분화과정에 관여한다. PL9506의 면역활성능을 측정하기 위해 Macrophage cell line RAW 264.7 세포의 IL-1, IL-6, TNF-α 생산능력을 살펴 보았다.
Mouse macrophage cell line RAW 264.7(American Type Tissue Collection)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco Lab., Chagrin falls, IL)에서 37℃, 5-8% CO2 상태에서 2-3일 배양하고 macrophage 최종 농도가 5×105 cells/ml이 되도록 조절하여 96 well flat-bottomed tissue culture plate (Corning, New York)에서 3회 반복 배양하였다. TNF-α와 IL-6의 정량은 Dong의 방법을 (Dong, W., J.I. Azona-Olivera, K.H. Brooks, J.E. Linz, and J.J. Pestka. 1994. Elevated gene expression and production of interleukins-2, 4, 5, and during exposure to vomitoxin(deoxyhivalene) and cycloheximide in the EL-4 thymoma. Toxicol. Appl. Pharmacol. 127:282-290) 변형하여 이용하였다. Purified rat anti TNF-α나 IL-6(PharMingen., SanDiego, CA)를 함유한 IL-coating buffer를 50 ㎕씩 Microtiter strep well (Immunolon Removawell: Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VG)에 분주한 후 4℃에서 하룻동안 방치한다. PBST (phosphate buffered saline containing Tween 80) 용액을 이용하여 세척하고 30% BSA-PBST를 이용하여 block을 시킨다. 37℃에서 30분간 방치한 후 다시 세척하고 미리 배양해 두었던 macrophage와 Bifidobacterium infantis PL9506 배양여액을 50 ㎕ 첨가한다. 37℃에서 한 시간 반응 후 biotinylated rat anti TNF-α나 IL-6 항체를 50㎕씩 첨가하여 상온에서 한 시간 반응시킨 후 streptavidin peroxidase를 첨가하여 다시 한 시간 반응시킨다. 여기에 기질로써 TMB (3,3',5,5-tetramethylbenzidine)을 첨가하고 상온에서 방치한 후 색이 변화하면 6 N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 표 10은 PL9506균주가 Macrophage 세포의 면역활성에 미치는 영향을 나타내었다.
표 10. Effect of Bifidobacterium infantis PL9506 on TNF-α, IL-1, IL-6 production by macrophage cell Raw 264.7 (ng/ml).
[실험예 10] 대장 상피세포(Caco-2 cell)의 부착능
Caco-2 세포주를 2.7 g/L의 소듐 바이카보네이트, 20%(v/v) FBS (Fetal bovine serum) 및 항생제를 포함한 DMEM 배지(pH 7.0)에서 배양하였다.
직경이 30 mm인 배양접시에 3x105 세포를 2 ml의 배지에 접종하여 세포 단일층으로 배양하였다. 배지는 2일에 한번 교환해 주었다. 6일간 배양 후 2ml의 PBS로 세포 단일층을 2회 세척하였다. PL9506 (1×107 CFU)을 첨가하여 37℃, 5% CO2-95% 공기조건상에서 배양하였다. 60-90분간 배양한 후 배양접시를 멸균 PBS로 2회 세척하고 메탄올로 10분간 고정시켰다. 그람 염색후 광학현미경하에서 관찰하였다. 정량적 측정을 위해 100배 현미경하에서 20개의 필드를 관찰하였으며 부착된 균수를 세어 Caco-2 세포 100개에 부착된 균수로 표기하였다 (R. Bibiloni, P.F. Perez and G.L. DeAntoni (1999) Factors involved in adhesion of Bifidobacterial strains to epithelial cells in culture. Anaerobes 5:483-485; Gibson, G.R., J.M, Saavedra, S. MacFarlane and G.T. MacFarlane (1997) Probiotics and intestinal infections. pp10-22. In Probiotics, Edited by R. Fuller, London, UK) 표 11는 장세포에 부착된 Bifidobacterium PL9506의 수를 나타낸 것이고 도 3은 PL균주가 장 세포주인 Caco-2 세포에 결합된 것을 그람염색후 광학 현미경으로 관찰한 사진이다.
표 11. Adhesion of the Bifidobacterium infantis PL 9506 to Caco-2 cells
[실험예 11] 콜레스테롤 억제능
유산균이 혈중 콜레스테롤을 저하시킬 수 있다는 다수의 보고가 있다. 유산균이 시험관내 콜레스테롤 첨가배지에서 자라면서 콜레스테롤을 소화분해 또는 흡착한다는 보고 (Gilliland, S.E., C.R. Nelson and C. Maxwell. 1985. Assimilation of Cholesterol by Lactobacillus acidophillus. Appl. Environ. Microbio. 49:377-381)와 유산균이 bile salt hydrolase를 분비함으로써 소장으로 분비되는 담즙산을 deconjugation시켜서 glycine이나 taurine이 분리된 유리 bile acid로 전환되는 것이 확인되고 있으며 (Klaver, F.A.M. and R. van der Meer. 1993. The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt deconjugating activity. Appl. Environ. Microbio. 59:1120-1124) 유리된 bile acids는 conjugated bile acids보다 재흡수력이 떨어지므로써 재흡수되는 콜레스테롤량이 적어지고 따라서 간의 콜레스테롤 수요를 증가시키므로써 혈중 콜레스테롤의 함량이 적어진다는 보고가 있다.
In vitro assay
가용성 콜레스테롤이 함유된 MRS 배지에 균주를 37℃에서 배양하였다. 24시간 배양한 후 원심분리하여 (4℃, 13,000 rpm) 0.5 ml의 상등액을 분리하고 분리된 상등액을 50% KOH 2 ml와 95% Ethanol 3 ml를 첨가하여 60℃에서 10분간 유지한다. 이것을 냉각한 후 5 ml의 hexane을 첨가하여 잘 혼합하고 다시 3 ml의 증류수를 첨가한 후 잘 섞어준다. 이것을 상온에서 15분간 방치하면 층분리현상이 일어나는 데 이 때 hexane층을 질소가스를 이용하여 60℃에서 증발시키고 o-phthaladehyde reagent ( 0.5 mg o-phthalaldehyde/glacial acetic acid 1 ml) 4 ml를 첨가하고 10분간 방치하여 둔다. 여기에 진한 황산 2 ml를 천천히 첨가하여 잘 섞어주고 10분 후 550 nm에서 흡광도(Optical Density)를 측정한다. 표 12는 PL9506균주의 콜레스테롤 억제능을 나타내었다.
표 12. Bifidobacterium infantis PL 9506 의 콜레스테롤 억제능a
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 유아에서 분리한 Bifidobacterium infantis PL9506 균주는 우수한 식중독 억제효과, 면역증강효과, 항알레르기 효과, 콜레스테롤 억제효과 항암효과와 장 부착력을 동시에 가지고 있어 여러 가지 목적을 위한 프로바이오틱으로 사용할 수 있다.
도 1는 Bifidobacterium infantis PL9506 균주의 그람염색 사진
도 2은 Bifidobacterium infantis PL9506 균주의 전자현미경 사진
도 3은 Bifidobacterium infantis PL9506가 장 세포주인 Caco-2 세포에 결합된 것을 그람염색 후 광학 현미경으로 관찰한 사진

Claims (10)

  1. 국제 기탁번호 KCCM 10406 (2002. 7. 20)의 비피도박테리움 인판티스 PL9506 의 생물학적 순배양물.
  2. 제1항에 있어서, 순배양물은 생균, 건조균, 사균 또는 배양액 조성물.
  3. 면역촉진 농도의 제1항의 비피도박테리움 인판티스 PL9506 의 생물학적 순배양물과 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제 조성물.
  4. 콜레스테롤 저하능 농도의 제1항의 비피도박테리움 인판티스 PL9506 의 생물학적 순배양물과 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제 조성물.
  5. 장기능 활성능 농도의 제1항의 비피도박테리움 인판티스 PL9506 의 생물학적 순배양물과 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제 조성물.
  6. 제3항 내지 제5항에 있어서, 생리학적으로 허용할 수 있는 부형제 또는 희석제는 식품인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식품은 발효유, 요구르트, 치즈, 우유, 두유, 발효식품, 두부, 음료, 분유, 이유식, 생식, 선식 또는 건강보조식품 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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