WO2016186246A1 - 성장 촉진을 위한 비피도박테리움 비피둠 cbt bf3 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물 - Google Patents

성장 촉진을 위한 비피도박테리움 비피둠 cbt bf3 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물 Download PDF

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WO2016186246A1
WO2016186246A1 PCT/KR2015/007228 KR2015007228W WO2016186246A1 WO 2016186246 A1 WO2016186246 A1 WO 2016186246A1 KR 2015007228 W KR2015007228 W KR 2015007228W WO 2016186246 A1 WO2016186246 A1 WO 2016186246A1
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WO
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bifidobacterium
cbt
strain
growth
kctc
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PCT/KR2015/007228
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English (en)
French (fr)
Inventor
정명준
서재구
Original Assignee
주식회사 쎌바이오텍
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention is for promoting growth Bifidobacterium Bifidum CBT BF3 ( Bifidobacterium bifidum CBT BF3) strain and a growth-promoting functional food composition comprising the same, and more particularly, it is possible to promote the growth of newborns, infants, children, and growing children by aiding digestion of breast milk and synthesizing vitamins. Bifidobacterium Bifidum CBT BF3 strain and a growth promoting functional food composition comprising the same.
  • An object of the present invention is to provide a suitable Bifidobacterium bipyridinium placing CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3) strain for newborns, infants, children and grown in growing children promoted.
  • Another object of the present invention is to provide a functional food composition that can promote the growth of newborns, infants, children, and growing children by helping to digest the milk oligosaccharide, promoting the synthesis of vitamins, and inhibiting the growth of harmful bacteria. .
  • Bifidobacterium vipium CBT BF3 deposited internationally as accession number KCTC 12199BP to the Korea Collection for Type Culture (KCTC) to promote growth
  • KCTC Collection for Type Culture
  • Bifidobacterium bifidum CBT BF3 relates to bifidus bacteria.
  • Another aspect of the present invention is to provide a functional food composition that can promote the growth and development of infants, children, infants and growing children comprising a strain of Bifidobacterium bipyridinium placing CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3) of the present invention will be.
  • Bifidobacterium strains of bifidobacteria placing CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3) of the present invention is an industrial scale can not be mass-produced, and digestion was fed breast milk oligosaccharides (Human Milk Oligosaccharide) that are not digested by human enzymes, vitamins It promotes biosynthesis, inhibits the growth of harmful bacteria in the intestine, promotes the growth of beneficial bacteria and regulates the immune system, and has excellent growth promoting effects.
  • Functional food composition for growth promotion of the present invention can promote the development of the brain as well as to help the growth and development by balancing the activation of the body metabolism of the newborn and infants, children and growing children in a balanced manner.
  • the functional food composition for growth promotion of the present invention can improve growth slowness, poor growth, stamina, low weight.
  • Figure 2 is a result of RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) analysis of genome DNA of Bifidobacterium bipidum CBT BF3 strain of the present invention.
  • RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
  • Figure 3 is a Bifidobacterium bipyridinium placing CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3) PFGE of genomic DNA of the strain KCTC 12199BP (Pulsed Field Gel Electrophoresis) analysis of the present invention.
  • Figure 4 shows a phylogenetic tree of the Bifidobacterium bipidum CBT BF3 strain and related Bifidobacterium strains of the present invention.
  • Figure 5 is a diagram showing the number of genes associated with breast milk oligosaccharide metabolism of Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain of the present invention.
  • Figure 6 is a graph showing the growth promoting effect on the growth of the mouse Bifidobacterium Bifidum CBT BF3 strain of the present invention.
  • Bifidobacterium bifidoum CBT BF3 strains of the present invention are not decomposed by human enzymes, but are very diverse and complex in structure and are difficult to mass-produce industrially produced breast milk oligosaccharides (HMOs), and infants taking such strains. It can be supplied to children, and it can also promote growth and development by producing metabolites that can function as nutrients in the body such as vitamins.
  • HMOs breast milk oligosaccharides
  • Human milk is known to contain more than 200 different oligosaccharides with beneficial functions. Human Milk Oligosaccharides promote the growth and reproduction of beneficial intestinal microflora, inhibit the growth of harmful bacteria, function as regulators of cellular responses, regulate the immune system, and are essential for the development of brain growth in newborns and infants. It is known to contribute to the brain development of newborns and infants by supplying energy of brain activity as an ingredient.
  • breast milk oligosaccharides are resistant to enzymatic digestion in the upper gastrointestinal tract and small intestine and reach intact to the colon, where they function as substrates for colonic fermentation.
  • Human milk is thought to contain several factors that promote the proliferation of the desired intestinal flora, which inhibits the growth of pathogenic microorganisms.
  • Methods that breast milk oligosaccharides can increase the number of beneficial bacteria and reduce the number of potentially pathogenic bacteria include competition for cell surface receptors, competition for essential nutrients, production of antimicrobial agents, and lowering the pH of feces and potentially pathogenic bacteria. It occurs through the production of inhibitory compounds, such as short chain fatty acids (SCFAs) which can inhibit.
  • SCFAs short chain fatty acids
  • SCFAs such as acetic acid, propionic acid, and butyric acid.
  • SCFAs are believed to contribute to calories, function as a major energy source for the intestinal epithelium, promote the absorption of sodium and water in the colon, and enhance digestion and absorption of the small intestine.
  • SCFA contributes to overall gastrointestinal health by regulating gastrointestinal development and immune function.
  • HMO Breast milk oligosaccharides consist of oligosaccharides of various structures, mainly five monosaccharides: D-glucose (Glc), D-galactose (Gal), N-acetylglucosamine (GlcNAc), L-fucose (Fuc) and salicylic acid (Sia; N-acetyl neuranic acid [Neu5Ac]).
  • the genome of the Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain of the present invention is the most diverse encoding the digestive enzymes of breast milk oligosaccharides (HMO), except for the gene encoding the ⁇ -mannosidase that hydrolyzes alpha-type mannose. Contains the genes.
  • Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strains of the present invention include ⁇ - N-arabinofuranosidase, ⁇ - L-fucosidase, L-xylulose / 3-keto-L-gulonate kinase, L Xylulose 5-phosphate-3-epimerase, glucosamine-6-phosphate deaminase, exo- ⁇ -galactosidase, lacto-N-biosidase, ⁇ - N-acetylglucosaminidase , Endogalactanase, aminoglycoside phosphotransferase, ⁇ -hexamiminidase A, glycerophosphodiester phosphodiesterase, sugar kinase, galactose-1-phosphate uridilyltransferase, N- Genes encoding acetylhexoseamine kinase, hy
  • ⁇ -N- acetyl-glucoside is the Sami
  • ⁇ - N - acetyl-glucoside is the Sami
  • ⁇ -N- is the amino-acetyl-glucose is the dual activity of ⁇ -N -Contains a gene encoding acetyl hexosamiminidase.
  • the genome of the Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain of the present invention has a gene for synthesizing vitamins, particularly the vitamin B group.
  • the genome of the Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain of the present invention there are genes capable of synthesizing two types of vitamins.
  • Folate (B9) can be synthesized from corrismate
  • folate (B9) can be synthesized from GTP
  • nicotinic acid (B3) can be synthesized from L-aspartate.
  • the Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain of the present invention may be used as a probiotic bifidus or may be used in various dairy products and other fermented products.
  • Another aspect of the present invention relates to a growth promoting functional food composition
  • a growth promoting functional food composition comprising the Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain of the present invention.
  • Breast milk oligosaccharides are currently unavailable in mass production or commercial use and are lacking in most formulas or formulas.
  • Breast milk oligosaccharides (HMOs) are essential nutrients for infants but are not digested by human enzymes and are excreted in feces if not digested.
  • the functional food composition for growth promotion of the present invention can promote brain development and growth development of newborns and infants by digesting and supplying breast milk oligosaccharides.
  • the food composition is a food, nutraceutical, supplement, probiotic or symbiotic.
  • probiotic when supplied in a suitable amount, means a living microorganism that is beneficial to the health of the host organism.
  • symbiotic refers to foods containing a mixture of prebiotic and probiotic.
  • compositions of the present invention according to an embodiment Bifidobacterium bipyridinium placing CBT BF3 strains other than Lactobacillus raised Bari right switch (Lactobacillus salivarius), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis), Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus fur lactofermentum (Lactobacillus fermentum), Lactobacillus para-casein is (Lactobacillus paracasei), Lactobacillus Kasei (Lactobacillus casei), Lactobacillus del Brew Station (Lactobacillus delbrueckii), Lactobacillus Leu Terry (Lactobacillus reuteri), Lactobacillus boots Tenerife (Lactobacillus buchneri), Lactobacillus joined Lee (Lactobacillus gasseri), Lactobacillus Jones you (Lactobacill
  • Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain of the present invention can be grown and recovered by culturing under the conditions normally used using a medium commonly used for culturing Bifidobacteria.
  • the culture obtained after the culture may be used as it is, or further, solid-liquid separation or sterilization by centrifugation or the like may be carried out as necessary.
  • centrifugation is performed to recover only the cells of Bifidus bacteria.
  • the bifidus bacteria used in the present invention may be wet cells or dry cells. For example, it can be prepared and used in probiotic form by lyophilization.
  • composition of the present invention may further include a conventional carrier or excipient in addition to the Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain, and is also formulated with various commonly used additives such as binders, disintegrating agents, coating agents, lubricants, and the like. Can be formulated.
  • composition of the present invention may be formulated in the form of powder, granules, tablets, capsules or liquids by mixing the Bifidobacterium bifidum CBT BF3 strain with a suitable carrier, excipient, auxiliary active ingredient, and the like.
  • the strains of the present invention can be commercialized by enteric coating so as to reach the large intestine after passing through the stomach, and to rapidly release the active ingredient Bifidus bacteria into the intestine, using known methods.
  • Excipients usable in the present invention include sugars such as sucrose, lactose, mannitol, glucose and the like, starches such as corn starch, potato starch, rice starch, partially pregelatinized starch and the like.
  • the binder is a polysaccharide such as dextrin, sodium alginate, carrageenan, guar gum, acacia, agar, naturally-occurring macromolecular substances such as tragacanth, gelatin, gluten, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, Cellulose derivatives such as ethyl cellulose, hydroxypropyl ethyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium, and polymers such as polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyvinylacetate, polyethylene glycol, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and vinyl acetate resin Include.
  • Degrading agents include cellulose derivatives such as carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, low-substituted hydroxypropyl cellulose, sodium carboxymethyl starch, hydroxypropyl starch, corn starch, potato starch, rice starch and partially pregelatinized starch. Starch can be used.
  • lubricants examples include talc, stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate, colloidal silica, hydrosilicic dioxide, various types of waxes and hydrogenated oils, and the like.
  • Coating agents include dimethylaminoethyl methacrylate-methacrylic acid copolymer, polyvinyl acetal diethylamino acetate, ethyl acrylate-methacrylic acid copolymer, ethyl acrylate-methyl methacrylate-chlorotrimethylammoniumethyl methacrylate.
  • Water-insoluble polymers such as copolymers, ethyl cellulose, methacrylic acid-ethyl acrylate copolymers, hydroxypropyl methyl cellulose phthalates, hydroxypropyl methyl cellulose acetate succinate, and other polymers such as methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose Water-soluble polymers such as polyvinylpyrrolidone and polyethylene glycol, but are not necessarily limited thereto.
  • the content of the Bifidobacterium bipidum CBT BF3 strain as an active ingredient in the growth promoting composition of the present invention may be appropriately determined in consideration of weight, age or gender.
  • the composition of the present invention comprises a Bifidobacterium bipidum CBT BF3 strain as an active ingredient, with respect to the total weight of the composition in a nutritionally effective concentration, preferably in a content of 10 8 to 10 12 cfu / g Or cultures with an equal number of viable cells.
  • 1 ⁇ 10 6 or more live bacteria preferably 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 12 live bacteria, may be taken once or several times as needed.
  • the growing functional food composition for the promotion of the present invention is non-blooming gambling Te Solarium ronggum Infante tooth CBT BT1 (Bifidobacterium longum bv. Infantis CBT BT1) (KCTC 11859BP), Bifidobacterium breve BR3 (KCTC 12201BP) ), And one or more other prebiotic selected from the group consisting of Bifidobacterium longum BG7 (KCTC 12200BP).
  • Such a composition may contain each bifidus bacterium in the same ratio.
  • API 50 CHL Carbohydrate Test Kit (bioMerieux Co., France) was used to determine the sugar availability of the selected strains. After incubating for 17 hours at 37 ° C. in 10 ml of MRS (Man-Rogosa-Sharpe) liquid medium, 1 ml of the culture was recovered and washed twice with CHL solution. The cells were then collected by centrifugation (MICRO-17, Hanil, KR) and resuspended in 9 ml of CHL solution. 150 ⁇ l of strain suspension was placed in each well of the API 50 CHL kit, and then autoclaved paraffin oil was dispensed onto strain suspensions in the wells. After culturing at 37 ° C. for 3 days, the sugar availability was compared. The use of each carbon source was observed by observing the change in color by microbial growth for 49 carbon sources, and the final identification results were analyzed using the API web for identification and the results are shown in Table 1 below.
  • Genome DNA was extracted from the isolated strain and 16s rRNA sequences were analyzed. Genome DNA was extracted from 1 ml of pure culture medium of fecal isolates using Accuprep genome extraction kit (Bioneer, Korea). Using the extracted DNA as a template, PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA) was performed using a primer F (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3 ') 3 and primer R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3') 3 as a template. .
  • PCR products were linked to the pGEM-Teasy vector (Promega, USA) to provide E. coli Strain DH5 ⁇ was transformed and then plated on LB / x-gal / ampplate and incubated overnight at 37 ° C. After screening the recombinant plasmid containing the insert from the transformant, DNA sequencing was performed. DNA sequencing was performed on the Bifidobacterium using the Cluster V method of the DNA star program. BP was compared for homology with the doom T (DSM 20456). 16s rRNA sequences of the isolated strain showed 98.7% homology with B. bifidum T ( DSM 20456), as shown in FIG.
  • the strain isolated from feces from the above results is Bifidobacterium It was confirmed that it is a novel strain different from the non-pipi T (DSM 20456).
  • Lane 1 in Fig. 2 is Bifidobacterium The result of the BP Doom T (DSM 20456), lane 2 Bifidobacterium The results of the BP placing CBT BF3 (KCTC 12199BP).
  • the strain was identified as “ Bifidobacterium.
  • BP Doom CBT BF3 Bactidobacterium bifidum CBT BF3
  • KCTC microbial resource center
  • Isolated Bifidobacterium The safety of the BP placing CBT BF3 (KCTC 12199BP) was analyzed to verify antibiotic resistance. Antibiotic resistance tests were performed using the micro-dilution method recommended by the European Food Safety Authority (EFSA), and 10 antibiotics used in the experiment were ampicillin (AMP), vancomycin (VAN), gentamicin (GEN), and kanamycin. (KAN), streptomycin (STM), erythromycin (ERM), cinnaside (Q / D), clindamycin (CLM), tetracycline (TET) and chloramphenicol (CP).
  • EFSA European Food Safety Authority
  • clindamycin broth mixed with 10% ISO-sensitest broth and 90% MRS broth was added at a concentration of 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 ⁇ g / ml, Since clindamycin has an EFSA breakpoint value of less than 0.25 ⁇ g / ml for the Lactobacillus group, antibiotic concentrations of 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, and 0.03125 ⁇ g / ml are used. It was. In addition, cinnaside proceeded using an E-test strip of BioMeriux.
  • Isolated Bifidobacterium The non-pipi CBT BF3 was found to meet the stability criteria for antibiotics of EFSA because the resistance to all antibiotics used in the experiment was lower than the EFSA antibiotic resistance criteria.
  • EFSA does not require the MIC value of a drug for bifidobacterium because bifidobacteria have been reported to be resistant to aminiglycosides such as kanamycin due to lack of a cytochrome-mediated drug transport system.
  • Bifidobacterium BP chapters of Doom CBT BF3 fixing performance measurement Bifidobacterium
  • the non-pipi T (DSM 20456) was used as a control in HT-29 cell line derived from human colon epithelial cells. Each strain of the HT-29 cell line was treated for 1 hour, and then Gram staining and viable cell counts were compared.
  • Bifidobacterium The Bifidom CBT BF3 strain is Bifidobacterium It was confirmed that the strain showed superior intestinal fixability than the non-pipi T (DSM 20456) strain. These results indicate that the strain of the present invention can be attached to intestinal epithelial cells to improve the intestinal environment.
  • Bifidobacterium of the present invention In order to verify the safety of the non-pipi CBT BF3 strain, an acute toxicity test was conducted on experimental animals. Six-week-old male and female Sprague-Dawley (SD) rats were orally administered a lyophilized strain of the present invention at 1.0 ⁇ 10 11 cfu / kg. The control group was administered 0.85% saline in the stomach. Clinical symptoms for all experimental animals were observed once a day for 14 days from day 1 to day of autopsy. The observation results are shown in Table 5 below.
  • Bifidobacterium BP placing CBT BF3 (KCTC 12199BP) genome sequencing of the strain was carried out using a PacBio RS II System (DNA Link, Republic of Korea). For genomes, a 10 kb library was made and genome sequencing was performed using one of the SMRTcells with C2-P4 chemistry. Genome sequencing gave a long sequence of 337,655,282 bp. De by SMRTpipe HGAP performing novo assembly and was subjected to the scaffolding and gap filling by SMRTpipe AHA. Structural gene prediction was made with Glimmer3, and gene annotation was performed by AutoFACT (Koski et al.
  • Genome metabolic pathway analysis was performed using a KEGG automatic annotation server (Moriya et al. 2007). Secondary metabolite biosynthesis gene analysis was performed using antiSMASH version 3.0.0 (Blin et al. 2013; Blin et al. 2014) ( http://antismash.secondarymetabolites.org/ ).
  • Bifidobacterium of the present invention Gene content analysis of the genome of the non-pipi CBT BF3 strain showed ⁇ - N-arabinofuranosidase, ⁇ - L-fucosidase, L-xylulose / 3-keto-L-gulonate kinase, L Xylulose 5-phosphate-3-epimerase, glucosamine-6-phosphate deaminase, exo- ⁇ -galactosidase, lacto-N-biosidase, ⁇ - N-acetylglucosaminidase , Endogalactanase, aminoglycoside phosphotransferase, ⁇ -hexamiminidase A, glycerophosphodiester phosphodiesterase, putative sugar kinase, galactose-1-phosphate freedilyltransferase, N It has been found to include various types of genes involved in carbohydrate metabolism such as
  • the non-pipi CBT BF3 strain contains genes encoding ⁇ - N -acetylglucosaminidases, ⁇ - N -acetylglucosaminidases, and ⁇ -N-acetyl hexosaminidases among breast milk oligosaccharide metabolism related genes. It was confirmed. It can be seen that the strain of the present invention can digest and supply breast milk oligosaccharides that are not digested by human enzymes.
  • bifidum CBT BF3 Alpha-N-acetylglucosaminidase RY70_1650 B.
  • bifidum CBT BF3 Beta-N-acetylglucosaminidase RY70_1661 B.
  • bifidum CBT BF3 Beta-N-acetylglucosaminidase RY70_1784 B.
  • Bifidobacterium The non-pipi CBT BF3 strain was found to have all the genes for biosynthesis of vitamins, in particular vitamin B group. Bifidobacterium of the present invention
  • the genome of the non-pipi CBT BF3 strain contains genes capable of synthesizing two types of vitamins. It was confirmed that the gene synthesized folate (B2) from corrismate, the gene synthesized folate (B2) from GTP, and the gene synthesized nicotinic acid (B3) from L-aspartate.
  • PAIs pathogenicity islands
  • REIs antimicrobial resistance islands
  • the non- pipi CBT BF3 strain (KCTC 12199BP) was incubated in BL broth (BD Diagnostics, Sparks, MD) for 24 hours at 37 ° C. and 10 11 CFU / in phosphate buffer solution (PBS, 10 mM sodium phosphate, 130 mM sodium chloride, pH 7.4). After dilution with ml and sonication, the supernatant was centrifuged and filtered through a filter of 0.45 ⁇ m pore size, lyophilized and stored at ⁇ 20 ° C. until in vivo testing.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the experimental animals purchased 6 weeks of male SD rats (10, 5 females, 5 males) from Sairon Bio Co., Ltd. in Uiwang, Korea, and had a period of acclimatization for 24 hours, followed by breeding for 17 days. In the rearing environment, the light cycle was maintained for 12 hours at 24 ⁇ 2 °C and 55 55% humidity.
  • barley feed (A04, UAR, Vilemoisson-Orge, France) was consumed for 17 days, and drinking water was freely consumed or Bifidobacterium.
  • the non-pipi CBT BF3 (10 7 CFU / head / day) was mixed with drinking water.
  • Bifidobacterium of the present invention In order to observe the growth promoting effect of the non-pipi CBT BF3 strain, the barley component feed was fed for 17 days to induce a basic diet, and the body weight and the amount of drinking water and feed consumed daily were measured until 17 days after the start of the experiment. The increase in body weight was calculated by subtracting the weight of the start date from the weight of the test date. Drinking water and feed were measured per cage and counted per head to calculate the total amount up to 17 days. The efficiency of weight gain was calculated by dividing the weight gain by the total amount of feed consumed.

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Abstract

본 발명은 성장촉진 효능이 우수한 신규한 비피더스균 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 모유 올리고당의 소화를 도와서 체력 증진과 함께 면역력을 강화하여 성장발육 촉진에 유용한 효과가 있다.

Description

성장 촉진을 위한 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물
본 발명은 성장 촉진을 위한 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3) 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모유의 소화를 돕고 비타민을 합성하여 신생아, 영유아, 소아, 및 성장기 어린이의 성장을 촉진할 수 있는 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
사람의 성장은 대부분 성장판이 열려 있는 사춘기까지의 시기에 일어난다. 성장을 의학적으로 정의하면, 성숙에 수반되는 크기의 변화라고 할 수 있으며, 특히 소아의 성장이라 함은 신장의 증가뿐만 아니라 신체의 각 기관의 크기와 기능의 증대를 포괄적으로 포함하는 개념이다.
일반적으로 사람의 성장은 유전적 영향이 가장 크게 영향을 미치는 것으로 인식되고 있지만, 실제로는 유전적인 영향은 23% 정도 밖에 해당되지 않으며, 나머지 77%는 후천적 영향에 의해 결정된다. 최근 지속적인 경제 성장과 식습관의 서구화, 영양상태의 개선 등으로 인해 소아 및 청소년의 성장발육이 크게 증가되는 추세이다. 또한 외모와 큰 키를 선호하는 사회적 분위기가 고조됨에 따라서 성장에 대한 관심이 증대되고 있다.
지금까지 알려진 성장을 촉진하기 위한 방법으로는 성장 호르몬 제제 투여 요법이 있다. 그러나 성장 호르몬 사용 시, 비용 부담이 클 뿐만 아니라 주사부위의 소양감, 발작, 지방위축과 고혈압, 당 불내성(glucose intolerance), 췌장염, 전신 알레르기 반응, 성장 호르몬 항체 양성, 암 발생 및 남성에게 여성화 유방 등의 증상과 같은 부작용이 있을 수 있다. 따라서 성장에 근본적으로 도움을 줄 수 있는, 안전하고 효과적인 식품 소재에 대한 개발이 절실히 필요한 실정이다.
국내 특허 제0887377호(유아 및 청소년을 위한 건강보조식품), 국내 특허 제10530211호(학습능력을 향상시키는 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법), 국내 특허 제0561286호(건조효모, 천연물 추출분말 및 영양성분 혼합분말을 함유하여 성장발육에 도움을 주는 건강기능성 조성물) 등이 이러한 성장촉진용 식품을 제안하고 있으나, 이들은 성장 촉진 효과가 기대에 미치지 못하는 한계가 있다.
본 발명자들은 성장촉진 효능이 우수한 프로바이오틱스를 발굴하기 위해서 예의 연구한 결과, 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(Bifidobacterium bifidum CBT BF3) 균주의 성장 촉진 제품으로서의 적용가능성을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 목적은 신생아, 영유아, 소아 및 성장기 어린이의 성장 촉진용으로 적합한 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(Bifidobacterium bifidum CBT BF3) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 모유 올리고당의 소화를 돕고, 비타민의 합성을 촉진하며, 유해 세균의 증식을 억제함으로써, 신생아, 영유아, 소아 및 성장기 어린이들의 성장을 촉진할 수 있는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 성장 촉진을 위한 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12199BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3) 비피더스균에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3)의 균주를 포함하는 영유아, 어린이, 소아 및 성장기 어린이들의 성장발육을 촉진할 수 있는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(Bifidobacterium bifidum CBT BF3)의 균주는 산업적 규모로 대량 생산이 안 되고, 인간 효소에 의해서 소화되지 않는 모유 올리고당(Human Milk Oligosaccharide)을 소화시켜 공급하고, 비타민의 생합성을 촉진하며, 장내 유해세균의 증식을 억제하고, 유익균의 성장을 촉진하며 면역계를 조절하여 성장 촉진 효능이 우수하다.
본 발명의 성장촉진용 기능성 식품 조성물은 신생아 및 영유아, 소아 및 성장기 어린이들의 체내 대사를 균형적으로 활성화시키고 면역계를 조절하여 성장 발육에 도움을 줄뿐만 아니라 두뇌 발달도 촉진할 수 있다. 또한 본 발명의 성장촉진용 기능성 식품 조성물은 성장부진, 발육부진, 체력저하, 저체중을 개선할 수 있다.
도 1은 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3) KCTC 12199BP 균주의 16S rRNA 서열, 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3과 관련 종들의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계(phylogenetic relationship)를 비교 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 지놈 DNA의 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3) KCTC 12199BP 균주의 지놈 DNA의 PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis) 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주 및 관련 비피도박테리움 균주들의 계통발생 트리를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 모유 올리고당 대사와 관련된 유전자의 수를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 마우스 생장에 미치는 성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
이하에서 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 하나의 양상은 성장촉진 효능이 우수한 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12199BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(Bifidobacterium bifidum CBT BF3) 비피더스균이다.
본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주는 인간 효소에 의해서는 분해되지 않고, 구조가 매우 다양하고 복잡하여 산업적으로 대량생산이 어려운 모유 올리고당(HMO)을 분해하여 그러한 균주를 복용하는 유아나 소아에게 공급하고, 또한 비타민과 같은 인체 내에서 영양소로 기능할 수 있는 대사산물을 생산하여 성장발육을 촉진시킬 수 있다.
사람의 모유는 유익한 기능을 갖는 200 종류 이상의 다양한 올리고당을 포함하는 것으로 알려져 있다. 모유 올리고당(Human Milk Oligosaccharide)은 유익한 장내 미생물총의 증식 및 번식을 촉진하고, 유해 세균의 증식을 저해하며, 세포 반응의 조절자로 기능하고, 면역계를 조절하고, 신생아 및 유아의 두뇌 성장 발달의 필수성분으로 두뇌활동의 에너지를 공급함으로써 신생아 및 유아의 두뇌발달에 기여하는 것으로 알려져 있다.
상기 모유 올리고당은 상부 위장관 및 소장에서의 효소 소화에 저항성이 있어서 결장까지 손상되지 않고 도달하여, 거기서 결장 발효에 대한 기질로서 기능한다. 사람의 모유는 병원성 미생물의 증식을 저지하는 바람직한 장내 세균총의 증식을 촉진하는 몇 개의 인자를 포함한다고 생각되고 있다. 모유 올리고당이 유익균의 수를 증가시키고 잠재적으로 병원성인 세균수를 감소시킬 수 있는 방법은 세포 표면 수용체에 대한 경쟁, 필수 영양소에 대한 경쟁, 항균제의 생성, 및 배설물의 pH를 낮추고 잠재적으로 병원성인 세균을 억제할 수 있는 단쇄 지방산 (SCFA)과 같은 억제성 화합물의 생성을 통해 일어난다. 모유 올리고당은 발효되어 아세트산, 프로피온산, 및 부티르산과 같은 SCFA를 생성한다. 이러한 SCFA는 열량에 기여하고, 장 상피에 대한 주요 에너지원으로서 기능하고, 결장 내 나트륨 및 물의 흡수를 촉진하며, 소장의 소화 및 흡수를 강화시키는 것으로 생각된다. 또한, SCFA는 위장의 발달 및 면역 기능을 조절함으로써 전반적인 위장 건강에 기여한다.
모유 올리고당(HMO)은 다양한 구조의 올리고당으로 구성되는데, 주로 다섯 개의 단당류: D-글루코오스 (Glc), D-갈락토오스 (Gal), N-아세틸글루코사민(GlcNAc), L-푸코스(Fuc)와 살리실산(Sia; N-아세틸 뉴라미닉 애시드[Neu5Ac])으로 구성되어 있다.
본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 지놈은, 알파형의 만노오스를 가수분해하는 α-만노시다제를 코드화하는 유전자를 제외하고, 모유 올리고당(HMO)의 소화 효소를 코드화하는 가장 다양한 유전자를 포함한다. 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주는 α-N-아라비노푸라노시다제, α-L-푸코시다제, L-자일룰로오스/3-케토-L-굴로네이트 키나제, L-자일룰로오스 5-포스페이트-3-에피메라제, 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제, 엑소-α-갈락토시다제, 락토-N-비오시다제, α-N-아세틸글루코스아미니다제, 엔도갈락타나제, 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제, β-헥소아미니다제 A, 글리세로포스포디에스테르 포스포디에스테라제, 슈가 키나제, 갈락토오스-1-포스페이트 유리딜일트랜스페라제, N-아세틸헥소스아민 키나제, 히알루로니다제, 및 α-아세토락테이트 디카르복실라제를 코드화하는 유전자를 포함한다. 또한 특이하게 α-N-아세틸글루코사미니다제, β-N-아세틸글루코사미니다제, β-N-아세틸글루코스아미니다제 및 β-N-아세틸글루코스아미니다제의 이중활성을 갖는 β-N-아세틸 헥소스아미니다제를 코드화하는 유전자를 포함한다.
또한 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 지놈은, 비타민, 특히 비타민 B 군을 합성하는 유전자를 갖는다. 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 지놈에는 2 종류의 비타민을 합성할 수 있는 유전자가 존재한다. 코리스메이트로부터 폴레이트(B9)를 합성하고, GTP로부터 폴레이트(B9)를 합성하고, L-아스파테이트로부터 니코틴산(B3)을 합성할 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주는 프로바이오틱 비피더스균으로 사용되거나, 다양한 유제품 및 기타 발효 제품에 사용할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다. 모유 올리고당(HMO)은 현재로서는 대량 생산이나 상업적 이용이 불가능하여 대부분의 조제유 또는 조제식에는 결핍되어 있다. 모유 올리고당(HMO)은 영유아의 필수 영양원이지만 인간 효소에 의해서는 소화가 되지 않고, 소화되지 않을 경우 분변으로 배설된다. 본 발명의 성장촉진용 기능성 식품 조성물은 모유 올리고당을 소화시켜서 공급함으로써 신생아 및 영유아의 두뇌발달 및 성장발육을 촉진할 수 있다. 상기 식품 조성물은 식품, 건강기능식품(nutraceutical), 보충제(supplement), 생균제 또는 공생제(symbiotic)이다. 본 명세서에서 "생균제"라는 용어는 적합한 양으로 공급되는 경우, 숙주 생물의 건강에 유익한 살아있는 미생물을 의미한다. 본 명세서에서, "공생제"라는 용어는 프리바이오틱(prebiotic) 및 생균제의 혼합물을 함유하는 식품들을 의미한다.
본 발명의 조성물은 실시예에 따라서 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주 이외에 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로바이오틱 유산균 또는 비피더스균을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주는 비피더스균의 배양에 통상 이용되는 배지를 사용하여 통상 사용되는 조건 하에서 배양함으로써 증식하여 회수할 수 있다. 배양 후 얻어지는 배양물을 그대로 사용해도 되고 나아가 필요에 따라 원심분리 등에 의한 조(粗)정제 및/또는 여과 등에 의한 고액분리나 멸균조작을 행해도 된다. 바람직하게는 원심분리를 행하여 비피더스균의 균체만을 회수한다. 아울러 본 발명에서 사용하는 비피더스균은 습윤 균체여도 되고 또는 건조 균체여도 된다. 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주 이외에 통상적인 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 제형화되어 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주와 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐 또는 액상의 형태로 제형화될 수 있다. 또한 본 발명의 균주는 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 대장에 도달하여 활성 성분인 비피더스균이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복되어 제품화될 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 부형제는 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 다당류, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필 에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스소듐 등의 셀룰로오스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다.
분해제로는 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다.
코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로오스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 성장촉진용 조성물에서 유효성분인 상기 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 함량은 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일례로, 본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주를 영양적으로 유효한 농도로 포함하는데, 바람직하게는 108 내지 1012 cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함한다. 일반적으로, 성인의 경우, 1×106 이상의 생균, 바람직하게는 1×108 내지 1×1012의 생균을 필요에 따라 한번 또는 수차례에 걸쳐서 나누어서 복용할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 성장촉진용 기능성 식품 조성물은 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1)(KCTC 11859BP), 비피도박테리움 브레베 BR3(KCTC 12201BP)), 및 비피도박테리움 롱굼 BG7(KCTC 12200BP)으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 다른 프리바이오틱 (prebiotic)을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 각각의 비피더스균을 동일한 비율로 포함할 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3( Bifidobacterium bifidum CBT BF3) 균주의 분리 및 동정
1-1. 균주의 선발
사람의 분변 1g을 멸균 혐기수에 연속 희석(serial dilution)한 후 각 희석액 1㎖을 Man-Rogosa-Sharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어서 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 MRS에 BCP(Bromocresol purple, 0.17g/L)가 첨가된 비피더스균 선택배지(BL 고체배지)에 옮긴 후 같은 조건에서 3일간 배양하였다. BCP 지시약은 비피더스균이 젖산을 형성하여 주변 pH가 낮아지면 보라색에서 노란색으로 변하게 된다. 콜로니 주변의 색이 노란 색으로 변한 콜로니를 선택한 후 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이 후 균주의 기능성 및 안정성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.
1-2. 선발된 균주의 동정
1) API 키트를 이용한 생화학적 동정
선발된 균주의 당 이용성을 알아보기 위하여 API 50 CHL Carbohydrate Test Kit(bioMerieux Co., France)를 이용하였다. 10 ㎖의 MRS(Man-Rogosa-Sharpe) 액체배지에서 37℃에서 17시간 배양한 후, 1 ㎖의 배양액을 회수하여 CHL 용액으로 2회 세정하였다. 이어서 원심분리(MICRO-17, Hanil, KR)에 의해 균체를 모아 9 ㎖의 CHL 용액에 재현탁시켰다. 150 ㎕의 균주 현탁액을 API 50 CHL 키트의 각 웰에 넣은 후, 오토클레이브한 파라핀 오일을 웰 내의 균주 현탁액 위에 분주하였다. 37℃에서 3일간 배양한 후 각각의 당 이용성을 비교하였다. 49가지 탄소원에 대하여 미생물 증식에 의한 색의 변화 여부를 관찰하여 각 탄소원의 이용 여부를 관찰하였고, 최종 동정 결과는 동정용 프로그램 API web을 이용하여 해석하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
No Carbohydrates Utilized No Carbohydrates Utilized
0 Control - 25 Esculine -
1 Glycerol - 26 Salicine -
2 Erythritol - 27 Cellobiose -
3 D-Arabinose - 28 Maltose -
4 L-Arabinose - 29 Lactose +
5 Ribose - 30 Melibiose -
6 D-Xylose - 31 Saccharose -
7 L-Xylose - 32 Trehalose -
8 Adonitol - 33 Inuline -
9 β-Methyl-xyloside - 34 Melezitose -
10 Galactose + 35 D-Raffinose -
11 D-Glucose + 36 Amidon -
12 D-Fructose + 37 Glycogene -
13 D-Mannose - 38 Xylitol -
14 L-Sorbose - 39 β-Gentiobiose +
15 Rhamnose - 40 D-Turanose -
16 Dulcitol - 41 D-Lyxose -
17 Inositol - 42 D-Tagatose -
18 Mannitol - 43 D-Fucose -
19 Sorbitol - 44 L-Fucose -
20 α-Methyl-D-mannoside - 45 D-Arabitol -
21 α-Methyl-D-glucoside - 46 L-Arabitol -
22 N-Acetyl glucosamine + 47 Gluconate -
23 Amygdaline - 48 2-Ceto-gluconate -
24 Arbutine - 49 5-Ceto-gluconate +
2) 16s rDNA 유전자 염기서열 결정을 통한 동정
분리된 균주로부터 지놈 DNA를 추출하여 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 분변에서 분리한 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')3와 프라이머 R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')3을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다.
PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여 E. coli 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/ampplate에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V method를 이용하여 비피도박테리움 비피둠 T (DSM 20456)과 상동성을 비교하였다. 분리된 균주의 16s rRNA 염기서열은, 도 1에 도시된 바와 같이, B. bifidum T (DSM 20456)와 98.7%의 상동성을 보였다.
3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA )에 의한 DNA 지문 분석
RAPD 분석은 분변에서 분리한 균주로부터 지놈 DNA를 추출하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)5 (5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3') 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. 최종 산물인 PCR 산물은 EtBr (ethidium bromide)에 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. RAPD 결과에서 분리한 균주는, 도 2에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 비피둠 T (DSM 20456)와 다른 밴드 패턴을 보이고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 위 결과로부터 분변에서 분리한 균주는 비피도박테리움 비피둠 T (DSM 20456)와 다른 신규 균주임을 확인하였다. 도 2에서 레인 1은 비피도박테리움 비피둠 T(DSM 20456)의 결과이고, 레인 2는 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(KCTC 12199BP)의 결과를 나타낸다.
4) PFGE ( Pulsed Field Gel Electrophoresis )에 의한 DNA 지문 분석
MRS broth에서 순수 배양된 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3과 비피도박테리움 비피둠 T (DSM 20456)의 O.D.를 측정한 후 2% Low Melting Agarose를 이용하여 최종 O.D600=4에 맞춰 플러그(plug)를 제작하였다. 제작된 플러그를 1㎖ 라이소자임 완충액(2 mg/㎖ Lysozyme (Sigma), 0.05% N-lauorylsarcosine (Sigma))에 넣고 4 mg/㎖ Lysostaphin(sigma) 10 ㎕을 가한 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 플러그를 조심스럽게 꺼내 NDS 완충액(1 ㎖ 1M Tris-HCl(pH=8.0), 10 ㎖ 100% SDS, 89 ㎖ 0.5M EDTA(pH=8.5) 4 ㎖에 넣고 50℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 가볍게 진탕하면서 50mM EDTA(pH 8.5) 10 ㎖에서 플러그를 6번 세정한 후 처리하고자 하는 효소 완충액 400 ㎕에 플러그를 조심스럽게 옮기고 상온에서 30분 방치한다. 플러그를 새로운 효소 완충액 400㎕에 옮긴 후 제한효소(20U)를 넣고 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이 때 제한효소는 NotI을 사용하였다. 전기영동은 CHEF 시스템(BIO-RAD, USA)을 이용하여 0.5X TBE에서 5.3cm/V, 1s~15s 펄스 타임, 20 시간 동안으로 실시하였다.
전기영동이 완료된 후, EtBr 용액으로 염색한 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 밴드 패턴을 관찰하였다. NotI을 이용한 PFGE 결과, 분변에서 분리한 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3은 비피도박테리움 비피둠 T (DSM 20456)와 상이한 밴드패턴을 보이는 새로운 균주임을 확인하였다. 도 3에서 레인 1은 비피도박테리움 비피둠 T(DSM 20456)의 결과이고, 레인 2는 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(KCTC 12199BP)의 결과를 나타낸다.
5) 기타 균학적 특성
본 발명에 따른 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3의 특성은 다음과 같다.
표 2
1) 균의 형태
MRS 한천평판 배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성①세포의 형태: 간균②운동성: 없음③포자형성능: 없음④그람(Gram) 염색: 양성
2) 균락의 형태
MRS 한천평판 배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태①형상: 원형②융기: 볼록③표면: 매끄러움(Smooth)
3) 생리적 성질
① 생육온도: 생장가능 생육온도 15~40℃ 최적 생장온도 37℃② 생육 pH: 생장가능 생육 pH 5.0~7.5 최적 pH 6.0~6.5③ 산소에 대한 영향: 혐기성
4) 카탈라제 -
5) 가스형성여부 -
6) 15℃에서 생육 -
7) 45℃에서 생육 +
8) 인돌 생산 -
9) 젖산 생산 +
이상의 결과를 토대로 상기 균주를 "비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3)"균주로 명명하고, 2012년 5월 7일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12199BP를 부여받았다.
1-3. 기능성 및 안정성
1) 항생제 내성 실험
분리된 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(KCTC 12199BP)의 안전성을 검증하기 위해 항생제 내성을 분석하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였으며, 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다.
클린다마이신을 제외한 항생제에 대해서는 ISO-sensitest broth 10%와 MRS broth 90%를 혼합한 broth에 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 클린다마이신은 락토바실루스 그룹의 EFSA 브레이크 포인트 값이 0.25 ㎍/㎖ 이하이기 때문에 항생제의 농도는 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 ㎍/㎖의 농도로 첨가해 사용하였다. 또한, 시너시드는 BioMeriux 사의 E-테스트 스트립을 이용하여 진행하였다.
마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (Bifidobacterium bifidum CBT BF3)가 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 하기 표 3에 나타내었다.
표 3
균주 항생제 (μg/ml)
AMP VAN GEN KAN STM ERM CLM QU+DA TET CP
MIC of B. breve CBT BF3 <0.5 <0.5 <8 <64 <32 <0.5 <0.03 <0.50 <8 <2
EFSA break point 2 2 64 nr 128 0.5 0.25 1 8 4
분리된 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3은 실험에 사용된 모든 항생제에 대한 내성이 EFSA 항생제 내성기준 보다 낮게 나타났기 때문에 EFSA의 항생제에 대한 안정성 기준에 적합한 것으로 확인되었다. 비피도박테리아는 사이토크롬-매개 약물 수송 시스템의 결여로 카나마이신과 같은 아미니글리코사이드에 대해서 내성이 있는 것으로 보고되었기 때문에, EFSA는 비피도박테리움에 대한 약제의 MIC 값을 요구하지 않는다.
2) 장정착성 실험
비피도박테리움 비피둠 CBT BF3의 장 정착성 측정은 비피도박테리움 비피둠 T (DSM 20456)를 대조군으로 하여 사람의 대장 상피세포에서 유래한 HT-29 세포주에서 실시하였다. HT-29 세포주에 각 균주들을 1시간 처리한 후 그람 염색과 생균수를 측정함으로써 균주들의 장 정착능을 비교하여 하기 표 4에 타내었다.
표 4
비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 비피도박테리움 비피둠T
장정착률(%) 90.53 80.35
장 정착성 측정 결과, 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주는 비피도박테리움 비피둠 T (DSM 20456) 균주 보다 우수한 장 정착성을 보이는 균주임을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 상기 균주가 장 상피세포에 부착하여 장내 환경을 개선할 수 있음을 나타낸다.
3) 급성독성실험
본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주에 대한 안전성을 검증하기 위하여, 실험동물을 대상으로 급성독성실험을 실시하였다. 6주령의 암수 Sprague-Dawley (SD)계 쥐에게 본 발명의 동결 건조된 균주를 1.0 x 1011 cfu/kg로, 경구투여하였다. 대조군에는 0.85% 염수를 위내에 투여하였다. 모든 실험동물에 대한 임상 증상은 시료 투여 1일부터 부검일까지 1일 1회씩 14일간 관찰하였다. 관찰 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주를 투여한 후, 모든 대조군 및 투여군에서 폐사율을 관찰할 수 없었으며, 또한 특이적인 임상증상을 나타내는 개체를 발견할 수 없었다. 또한 투여 후 14일 간 먹이와 물의 섭취량 및 체온을 관찰한 결과, 투여군과 대조군 사이에 통계학적으로 유의적인 차이를 발견할 수 없었다.
표 5
성별 균주 투여 후 경과 일수 폐사율 (%) LD50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
수컷 CBT BF3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 >1011cfu/kg
대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
암컷 CBT BF3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 >1011cfu/kg
대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
* 상기 표에서 숫자는 폐사된 두수를 나타냄
실시예 2. 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 유전자 분석
비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (KCTC 12199BP) 균주의 지놈 시퀀싱은 PacBio RS II System (DNA Link, Republic of Korea)을 이용하여 행하였다. 지놈에 대해서, 10 kb 도서관을 만들고, C2-P4 chemistry를 가지는 SMRTcell 중 하나를 이용하여 지놈 시퀀싱을 실시하였다. 지놈 시퀀싱에 의해서 337,655,282 bp의 긴 서열이 수득되었다. SMRTpipe HGAP에 의해 De novo 조립을 실시하고, SMRTpipe AHA에 의해서 스캐폴딩과 갭 필링을 행하였다. 구조 유전자 예측은 Glimmer3로 하였고, 유전자 annotation은 Pfam, Uniref100, KEGG, COG 및 GenBank NR 데이터베이스에 대해서 BLASTP에 의해서 얻은 결과를 이용하여 AutoFACT (Koski et al. 2005)에 의해서 행하였다. Transfer RNA 및 리보좀 RNA는 각각 tRNAscan-SE (Lowe and Eddy 1997) 및 RNAmmer (Lagesen et al. 2007)를 이용하여 행하였다. Clusters of Orthologous Groups (COGs) category에 의한 유전자의 기능적 분류는 e-value cutoff를 1e-2 미만으로 하여 RPS-BLAST를 이용하여 행하였다(Mavromatis et al. 2009).
지놈 상의, 특수한 유전자의 존재는 수집된 데이터세트에 대해서 서열 상동성 ≥ 50%의 파라미터로 BLASTP를 이용하여 행하였다. 지놈의 대사 경로 분석은 KEGG automatic annotation server를 이용해서 행하였다 (Moriya et al. 2007). 2차 대사산물 생합성 유전자 분석은 antiSMASH version 3.0.0 (Blin et al. 2013; Blin et al. 2014) (http://antismash.secondarymetabolites.org/)을 이용해서 행하였다 .
2-1. HMO ( Human Milk Oligosaccharide ) 대사 관련 유전자
본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 지놈의 유전자 컨텐츠 분석 결과, α-N-아라비노푸라노시다제, α-L-푸코시다제, L-자일룰로오스/3-케토-L-굴로네이트 키나제, L-자일룰로오스 5-포스페이트-3-에피메라제, 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제, 엑소-α-갈락토시다제, 락토-N-비오시다제, α-N-아세틸글루코스아미니다제, 엔도갈락타나제, 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제, β-헥소아미니다제 A, 글리세로포스포디에스테르 포스포디에스테라제, putative 슈가 키나제, 갈락토오스-1-포스페이트 유리딜일트랜스페라제, N-아세틸헥소스아민 키나제, 히알루로니다제, 및 α-아세토락테이트 디카르복실라제를 코드화하는 유전자와 같은 탄수화물 대사에 관련된 다양한 종류의 유전자를 포함하는 것으로 확인되었다. 또한 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주는 모유 올리고당 대사 관련 유전자 가운데 α-N-아세틸글루코사미니다제, β-N-아세틸글루코사미니다제, 및 β-N-아세틸 헥소스아미니다제를 코드화하는 유전자를 포함하는 것으로 확인되었다. 이로써 본 발명의 균주가 인간 효소에 의해서 소화되지 않는 모유 올리고당을 소화시켜 공급할 수 있다는 것을 알 수 있다.
표 6
Strain Enzyme Accession number
B. bifidum CBT BF3 Beta-galactosidase RY70_234
B. bifidum CBT BF3 Endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase RY70_335
B. bifidum CBT BF3 Endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase RY70_539
B. bifidum CBT BF3 Sialidase RY70_1677
B. bifidum CBT BF3 Sialidase RY70_1956
B. bifidum CBT BF3 Alpha-fucosidase RY70_1497
B. bifidum CBT BF3 Alpha-N-acetylglucosaminidase RY70_1650
B. bifidum CBT BF3 Beta-N-acetylglucosaminidase RY70_1661
B. bifidum CBT BF3 Beta-N-acetylglucosaminidase RY70_1784
B. bifidum CBT BF3 Beta-N-acetylhexosaminidase RY70_1064
B. bifidum CBT BF3 Beta-N-acetylhexosaminidase RY70_1677
2-2. 비타민 생합성 유전자
유전자 분석 결과, 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주는 비타민, 특히 비타민 B 군의 생합성을 위한 모든 유전자를 갖는 것으로 확인되었다. 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 지놈에는 2 종류의 비타민을 합성할 수 있는 유전자가 존재한다. 코리스메이트로부터 폴레이트(B2)를 합성하는 유전자, GTP로부터 폴레이트(B2)를 합성하는 유전자, L-아스파테이트로부터 니코틴산(B3)을 합성하는 유전자를 갖는 것으로 확인되었다.
표 7
A. Folate biosynthetic genes from GTP
KO number K01495 K01077 K13940 K13940
EC number 3.5.4.16 E3.1.3.1 4.1.2.25 2.7.6.3
B. bifidum CBT BF3 RY70_148 RY70_818 RY70_1580 RY70_666
B. Folate biosynthetic genes from Chorismate
KO number K01664 K02619 K13940 K11754
EC number 2.6.1.85 4.1.3.38 2.5.1.15 6.3.2.12
B. bifidum CBT BF3 RY70_148 RY70_818 RY70_1580 RY70_666
C. Nicotinate biosynthetic Genes from L-aspartate
KO number K00278 K03517 K00767 K00763
EC number 1.4.3.16 2.5.1.72 2.4.2.19 6.3.4.21
B. bifidum CBT BF3 RY70_693 RY70_692 RY70_694 RY70_424
2-4. 병원성 유전자의 부재
PAIs (Pathogenicity islands) 및 REIs(Antimicrobial resistance islands)에 대한 분석은 PAI 데이터베이스 (Yoon et al. 2007; Yoon et al. 2015)의 PAI finder를 이용하여 행하였다. 분석 결과, 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 지놈에는 PAI (Pathogenicity islands) 및 PAI-유사 영역은 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 성장 촉진 효과
이하 실시예에서 본 발명의 균주의 특성과 성장촉진용 효능을 입증한다. 모든 실시예의 실험 결과는 평균(mean)ㅁ표준편차(SD)로 표시하였고, 실험 결과의 통계처리는 GraphPad PrismTM 6.0을 이용하였으며 실험군 간 평균의 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인한 후 Tukey's multiple range test를 이용하여 사후 검증하였다.
3-1. 본 발명의 균주의 배양물 및 그를 포함하는 조성물의 제조
비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주(KCTC 12199BP)를 BL 브로스(BD Diagnostics, Sparks, MD)에서 24시간 37℃에서 배양하였고, 인산염 버퍼 용액(PBS, 10mM 인산나트륨, 130mM 염화나트륨, pH 7.4)에 1011 CFU/ml로 희석하여 초음파처리 후, 상청액을 원심 분리하여 0.45 ㎛ 포어 사이즈의 필터로 여과하고, 동결 건조한 후 -20℃에 생체내 실험 전까지 보관하였다.
3-2. 비만 동물 모델 및 샘플링
동물실험은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 Animal use and Care Protocol을 준수하여 진행하였다. 실험동물은 ㈜새론바이오 (Uiwang, Korea)에서 수컷 SD 실험용 쥐 6주령을 (그룹당 10 마리, 암컷 5마리, 수컷 5마리) 구입하여 24시간 동안 적응기간을 가진 후, 17일간 사육이 진행되었고, 사육환경은 24ㅁ2℃, 습도 55ㅁ15%에서 light cycle이 12시간 유지되었다. 기초 식이를 위해 17일간 보리 성분의 사료 (barley feed, A04, UAR, Vilemoisson- sur-Orge, France)를 섭취하도록 하였으며, 음용수는 자유롭게 섭취하거나 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 (107 CFU/head/day)를 음용수에 섞어 섭취하도록 하였다.
3-3 본 발명의 균주의 성장발육 촉진 효과
본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 성장 촉진 효능을 관찰하기 위해, 보리 성분의 사료를 17일 동안 먹여 기초식이를 유도하고, 실험 시작 후 17일까지 매일 체중과 섭취한 음용수 및 사료의 양을 측정하였다. 체중의 증가는 실험 날짜의 체중에서 실험 시작 날짜의 체중을 빼서 계산하였다. 음용수와 사료는 케이지 별 측정 후, 마리당 계산하여 17일까지의 총 양을 계산하였다. 체중증가의 효율은 총 섭취한 사료의 양에서 증가한 체중을 나누어 계산하였다.
비피도박테리움 비피둠 CBT BF3을 음용수에 섞어 먹인 그룹(CBT BF3)의 경우, 일반 음용수를 정상적으로 먹인 그룹(NC)에 비해 12일부터 유의성 있게 체중이 증가하는 것을 관찰하였다 (12day; p<0.05, 13 to 17 days; p<0.01) (도 6(A)). 그러나 17일 동안 섭취한 총 사료의 섭취량(FI)과 음용수의 양(WI)은 두 그룹간 특별한 차이를 보이지 않았다(도 6(B)). 본 발명의 균주의 투여가 사료 섭취에 영향을 미치지 않았고, 체중(WG)의 증가가 사료 섭취량(FI)의 차이에 기인하지 않았음을 확인할 수 있다. 이와 같이 섭취한 사료의 양 대비 체중증가의 효율(FI/WG)은, 정상 그룹에 대비하여 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3을 섭취한 그룹에서 유의미한 결과가 나타나, 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3 균주의 투여에 의해 성장이 촉진되는 것이 확인되었다.
이상에서 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 또는 변경된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호범위는 전술한 실시예가 아니라 이하의 특허청구범위 및 그와 균등한 범위로 해석되어야 할 것이다.
Figure PCTKR2015007228-appb-I000001
Figure PCTKR2015007228-appb-I000002
Figure PCTKR2015007228-appb-I000003
Figure PCTKR2015007228-appb-I000004
Figure PCTKR2015007228-appb-I000005
Figure PCTKR2015007228-appb-I000006
Figure PCTKR2015007228-appb-I000007
Figure PCTKR2015007228-appb-I000008

Claims (7)

  1. 성장촉진을 위한 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 12199BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(Bifidobacterium bifidum CBT BF3) 비피더스균.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비피더스균은 α-N-아라비노푸라노시다제, α-L-푸코시다제, L-자일룰로오스/3-케토-L-굴로네이트 키나제, L-자일룰로오스 5-포스페이트-3-에피메라제, 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제, 엑소-α-갈락토시다제, 락토-N-비오시다제, α-N-아세틸글루코스아미니다제, 엔도갈락타나제, 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제, β-헥소아미니다제 A, 글리세로포스포디에스테르 포스포디에스테라제, 슈가 키나제, 갈락토오스-1-포스페이트 유리딜일트랜스페라제, N-아세틸헥소스아민 키나제, 히알루로니다제, 및 α-아세토락테이트 디카르복실라제를 코드화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 비피더스균.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비피더스균은 모유 올리고당을 분해하는 유전자를 가지고 있고, 상기 유전자는 α-N-아세틸글루코사미니다제, β-N-아세틸글루코사미니다제, 및 β-N-아세틸 헥소스아미니다제를 코드화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 비피더스균.
  4. 제1항에 있어서, 상기 비피더스균은 코리스메이트로부터 폴레이트(B2)를 합성하는 유전자, GTP로부터 폴레이트(B2)를 합성하는 유전자, 및 L-아스파테이트로부터 니코틴산(B3)을 합성하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 비피더스균.
  5. 제1항에 따른 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(Bifidobacterium bifidum CBT BF3)(KCTC 12199BP)의 균주를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식품 조성물은 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(수탁번호: KCTC 12199BP) 균주의 생균 또는 건조균을 108 내지 1012 cfu/g 포함하는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 식품 조성물이 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(Bifidobacterium longum subsp. infantis CBT BT1)(KCTC 11859BP), 비피도박테리움 브레베 CBT BR3 (KCTC 12201BP)), 및 비피도박테리움 롱굼 CBT BG7 (KCTC 12200BP)으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 다른 프리바이오틱 (prebiotic)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 기능성 식품조성물.
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