WO2016186243A1 - 신규한 비피더스 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물 - Google Patents

신규한 비피더스 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물 Download PDF

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WO2016186243A1
WO2016186243A1 PCT/KR2015/007225 KR2015007225W WO2016186243A1 WO 2016186243 A1 WO2016186243 A1 WO 2016186243A1 KR 2015007225 W KR2015007225 W KR 2015007225W WO 2016186243 A1 WO2016186243 A1 WO 2016186243A1
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WO
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cbt
bifidobacterium
strain
infantis
growth
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PCT/KR2015/007225
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정명준
서재구
Original Assignee
주식회사 쎌바이오텍
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a novel bifidus strain and a growth-promoting functional food composition containing the same, and more particularly to a novel bifidus strain having a growth promoting effect by holding a milk oligosaccharide metabolism-related gene and a vitamin biosynthetic gene, and the same. It relates to a growth promoting composition.
  • the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art, one object of the present invention is to provide a novel Bifidobacteria strains to help the growth of newborns, infants, children and growing children.
  • Another object of the present invention is to promote the growth of infants, children and adolescents by helping digestion of breast milk oligosaccharides, promote the synthesis of vitamins, contribute to the recycling of nitrogen sources, and inhibit the growth of harmful bacteria. To provide.
  • Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 ( Bifidobacterium longum ) internationally deposited as Korean Collection for Type Culture (KCTC) accession number KCTC 11859BP bv. infantis CBT BT1) related to bifidus bacteria.
  • Another aspect of the present invention provides a functional food composition capable of promoting the growth of infants, children and adolescents comprising a strain of Bifidobacterium longum bv. Infantis CBT BT1 ( Bifidobacterium longum bv. Infantis CBT BT1) of the present invention. will be.
  • Bifidobacterium longum infantis CBT BT1 ( Bifidobacterium longum bv. Infantis CBT BT1) strain of the present invention is not mass production on an industrial scale, by digesting human milk oligosaccharides (Human Milk Oligosaccharide) that is not digested by human enzymes It is supplied, promotes the biosynthesis of vitamins, inhibits the growth of harmful bacteria in the intestine, and regulates the immune system is excellent in growth promoting efficacy.
  • human milk oligosaccharides Human Milk Oligosaccharide
  • Functional food composition for growth promotion of the present invention can promote the development of the brain as well as to promote the growth and development by balancing the activation of the body metabolism of the newborn and infants, children and adolescents and regulate the immune system.
  • the functional food composition for growth promotion of the present invention can improve growth slowness, poor growth, stamina, low weight.
  • Figure 1a is a 16S rRNA sequence of the Bifidobacterium ronggum Infante tooth BT1 CBT (Bifidobacterium longum bv. Infantis CBT BT1) KCTC 11859BP strain of the present invention.
  • 1B-C show the homology and phylogenetic relationship of the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 of the present invention with 16S rRNA sequences of related species.
  • Figure 2 is a result of RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) analysis of genome DNA of Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention.
  • RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
  • Figure 3 is a Bifidobacterium ronggum Infante CBT tooth BT1 of the invention (Bifidobacterium longum bv. Infantis CBT BT1) is PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) analysis of the genomic DNA of the strain KCTC 11859BP.
  • PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis
  • Figure 4 is a haemolytic activity (hemolytic activity) The results of the Bifidobacterium ronggum Infante tooth BT1 CBT (Bifidobacterium longum bv. Infantis CBT BT1) KCTC 11859BP strain of the present invention.
  • Figure 5 shows a phylogenetic tree of Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain and related Bifidobacterium longum strains of the present invention.
  • Figure 6 is a diagram showing the number of genes associated with breast milk oligosaccharide metabolism of Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention.
  • Figure 7 is a schematic diagram showing the number of genes related to urea metabolism of Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram showing the secondary metabolite biosynthesis gene of Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention.
  • Figure 9a-b is a graph showing the growth promoting effect on the mouse growth of Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention.
  • Bifidobacterium longum infantis CBT BT1 Bifidobacterium longum bv., Internationally deposited as Accession No. KCTC 11859BP in the Korea Collection for Type Culture (KCTC), excellent growth promoting effect. infantis CBT BT1) bifidus.
  • Bifidobacterium longgum Infantis CBT BT1 strains of the present invention are not degraded by human enzymes, and the infants consume such strains by decomposing human milk oligosaccharides (HMOs), which are very diverse and complex in structure and are difficult to mass-produce industrially.
  • HMOs human milk oligosaccharides
  • Human milk is known to contain more than 200 different oligosaccharides with beneficial functions. Human Milk Oligosaccharides promote the growth and reproduction of beneficial intestinal microflora, inhibit the growth of harmful bacteria, function as regulators of cellular responses, regulate the immune system, and are essential for the development of brain growth in newborns and infants. It is known to contribute to the brain development of newborns and infants by supplying energy of brain activity as an ingredient.
  • breast milk oligosaccharides are resistant to enzymatic digestion in the upper gastrointestinal tract and small intestine and reach intact to the colon, where they function as substrates for colonic fermentation.
  • Human milk is thought to contain several factors that promote the proliferation of the desired intestinal flora, which inhibits the growth of pathogenic microorganisms.
  • Methods that breast milk oligosaccharides can increase the number of beneficial bacteria and reduce the number of potentially pathogenic bacteria include competition for cell surface receptors, competition for essential nutrients, production of antimicrobial agents, and lowering the pH of feces and potentially pathogenic bacteria. It occurs through the production of inhibitory compounds, such as short chain fatty acids (SCFAs) which can inhibit.
  • SCFAs short chain fatty acids
  • SCFAs such as acetic acid, propionic acid, and butyric acid.
  • SCFAs are believed to contribute to calories, function as a major energy source for the intestinal epithelium, promote the absorption of sodium and water in the colon, and enhance digestion and absorption of the small intestine.
  • SCFA contributes to overall gastrointestinal health by regulating gastrointestinal development and immune function.
  • HMO Breast milk oligosaccharides consist of oligosaccharides of various structures, mainly five monosaccharides: D-glucose (Glc), D-galactose (Gal), N-acetylglucosamine (GlcNAc), L-fucose (Fuc) and salicylic acid (Sia; N-acetyl neuranic acid [Neu5Ac]).
  • the genome of the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention contains various kinds of genes encoding the digestive enzymes of breast milk oligosaccharides (HMO).
  • Genome of the Bifidobacterium ronggum Infante CBT tooth BT1 strain of the present invention ⁇ - manno let kinase, manno ⁇ - let kinase, Endo - ⁇ - N - acetyl glucosyl Sami
  • the kinase, endo - ⁇ - N - acetyl galactosyl Genes encoding saminidase, sialidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ - N -acetylglucosaminidase, ⁇ - N -acetylglucosaminidase, and ⁇ - N -acetylhexosaminidase do.
  • the genome of the Bifidobacterium longgum Infantis CBT BT1 strain of the present invention has a gene for synthesizing vitamins, particularly the vitamin B group.
  • the genome of the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention there are genes capable of synthesizing three types of vitamins. Synthesize folate from guanosine 5'-triphosphate (GTP), synthesize folate (B9) from corimate, synthesize nicotinic acid (B3) from L-aspartate, and synthesize D-ribulose 5-phosphate and Riboflavin (B2) can be synthesized from GTP.
  • GTP guanosine 5'-triphosphate
  • B9 synthesize folate
  • B3 synthesize nicotinic acid
  • B2 D-ribulose 5-phosphate and Riboflavin
  • Fermentation of breast milk oligosaccharides by the Bifidobacterium longgum Infantis CBT BT1 strain of the present invention can also reduce the concentrations of ammonia, amines and phenols of excreta that have been associated as major malodorous components in excreta.
  • the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention has an ure gene encoding urease protein and an urt gene encoding urea transfer protein. These genes are not found in other Bifidobacterium strains, suggesting that the strains of the present invention are more efficiently available for nutrients than other strains and are involved in the recycling of nitrogen sources.
  • the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention encodes proteins for biosynthesis of bacteriocins, lentipeptides , and non-ribosomal peptides and polyketides.
  • the strain of the present invention has a bacteriocin-encoding gene, a gene encoding a protein for phenazine biosynthesis, a gene encoding a polyketide and a non-ribosome peptide.
  • the Bifidobacterium longgum Infantis CBT BT1 strain of the present invention may be used as a probiotic bifidus or may be used in various dairy products and other fermented products.
  • Another aspect of the present invention relates to a growth promoting functional food composition
  • a growth promoting functional food composition comprising the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention.
  • Breast milk oligosaccharides (HMO) are currently unavailable in mass production or commercial use and are lacking in most formulas or formulas.
  • Breast milk oligosaccharides (HMOs) are essential nutrients for infants but are not digested by human enzymes and are excreted in feces if not digested.
  • the functional food composition for growth promotion of the present invention can promote brain development and growth development of newborns and infants by digesting and supplying breast milk oligosaccharides.
  • the food composition is a food, nutraceutical, supplement, probiotic or symbiotic.
  • probiotic when supplied in a suitable amount, means a living microorganism that is beneficial to the health of the host organism.
  • symbiotic refers to foods containing a mixture of prebiotic and probiotic.
  • compositions of the present invention bipyridinium gambling according to the embodiment te Solarium ronggum Infante tooth CBT BT1 strains other than Lactobacillus raised Bari right switch (Lactobacillus salivarius), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis), Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus Bacillus spread lactofermentum (Lactobacillus fermentum), Lactobacillus para-casein is (Lactobacillus paracasei), Lactobacillus Kasei (Lactobacillus casei), Lactobacillus del Brew Station (Lactobacillus delbrueckii), Lactobacillus Leu Terry (Lactobacillus reuteri), Lactobacillus boots Tenerife ( Lactobacillus buchneri), Lactobacillus joined Lee (Lactobacillus gasseri), Lactobacillus
  • the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention can be grown and recovered by culturing under normal conditions using a medium commonly used for culturing Bifidobacteria.
  • the culture obtained after the culture may be used as it is, or further, solid-liquid separation or sterilization by centrifugation or the like may be carried out as necessary.
  • centrifugation is performed to recover only the cells of Bifidus bacteria.
  • the bifidus bacteria used in the present invention may be wet cells or dry cells. For example, it can be prepared and used in probiotic form by lyophilization.
  • composition of the present invention may further include a conventional carrier or excipient in addition to the Bifidobacterium longgum Infantis CBT BT1 strain, in addition to the formulation with various commonly used additives such as binders, disintegrating agents, coatings, lubricants, etc. Can be prepared.
  • composition of the present invention may be formulated in the form of powder, granules, tablets, capsules or liquids by mixing the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain with a suitable carrier, excipient, auxiliary active ingredient, and the like.
  • the strains of the present invention can be commercialized by enteric coating so as to reach the large intestine after passing through the stomach, and to rapidly release the active ingredient Bifidus bacteria into the intestine, using known methods.
  • Excipients usable in the present invention include sugars such as sucrose, lactose, mannitol, glucose and the like, starches such as corn starch, potato starch, rice starch, partially pregelatinized starch and the like.
  • the binder is a polysaccharide such as dextrin, sodium alginate, carrageenan, guar gum, acacia, agar, naturally-occurring macromolecular substances such as tragacanth, gelatin, gluten, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, Cellulose derivatives such as ethyl cellulose, hydroxypropyl ethyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium, and polymers such as polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyvinylacetate, polyethylene glycol, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and vinyl acetate resin Include.
  • Degrading agents include cellulose derivatives such as carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, low-substituted hydroxypropyl cellulose, sodium carboxymethyl starch, hydroxypropyl starch, corn starch, potato starch, rice starch and partially pregelatinized starch. Starch can be used.
  • lubricants examples include talc, stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate, colloidal silica, hydrosilicic dioxide, various types of waxes and hydrogenated oils, and the like.
  • Coating agents include dimethylaminoethyl methacrylate-methacrylic acid copolymer, polyvinyl acetal diethylamino acetate, ethyl acrylate-methacrylic acid copolymer, ethyl acrylate-methyl methacrylate-chlorotrimethylammoniumethyl methacrylate.
  • Water-insoluble polymers such as copolymers, ethyl cellulose, methacrylic acid-ethyl acrylate copolymers, hydroxypropyl methyl cellulose phthalates, hydroxypropyl methyl cellulose acetate succinate, and other polymers such as methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose Water-soluble polymers such as polyvinylpyrrolidone and polyethylene glycol, but are not necessarily limited thereto.
  • the content of the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain which is an active ingredient in the growth promoting composition of the present invention, may be appropriately determined in consideration of weight, age or gender.
  • the composition of the present invention contains a Bifidobacterium longgum Infantis CBT BT1 strain as an active ingredient in a nutritionally effective concentration, based on the total weight of the composition, preferably 10 8 to 10 12 cfu / g content Or cultures with an equal number of live bacteria.
  • 1 ⁇ 10 6 or more live bacteria preferably 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 12 , can be administered once or several times as needed.
  • the growing functional food composition for the promotion of the present invention is non-blooming gambling Te Solarium breve CBT BR3 (Bifidobacterium breve CBT BR3) (KCTC 12201BP), Bifidobacterium bipyridinium placing CBT BF3 (KCTC 12199BP)), and It may further comprise one or more other prebiotic selected from the group consisting of Bifidobacterium longum CBT BG7 (KCTC 12200BP).
  • Such a composition may contain each bifidus bacterium in the same ratio.
  • API 50 CHL Carbohydrate Test Kit (bioMerieux Co., France) was used to determine the sugar availability of the selected strains. After incubating for 17 hours at 37 ° C. in 10 ml of MRS (Man-Rogosa-Sharpe) liquid medium, 1 ml of the culture was recovered and washed twice with CHL solution. The cells were then collected by centrifugation (MICRO-17, Hanil, KR) and resuspended in 9 ml of CHL solution. 150 ⁇ l of strain suspension was placed in each well of the API 50 CHL kit, and then autoclaved paraffin oil was dispensed onto strain suspensions in the wells. After culturing at 37 ° C. for 3 days, the sugar availability was compared.
  • MRS Man-Rogosa-Sharpe
  • the sugar availability of the strains of the invention was compared with the sugar availability of B. infantis T (ATCC 27920) and B. longum T (ATCC 15707).
  • B. infantis T ATCC 27920
  • B. longum T ATCC 15707
  • bifidose bacteria that fail to ferment arabinose and melezitose are non- fermented . It is classified as Infante Tees and bifidobacteria that all the bilateral non-fermentation. Longum strains should be classified. Since the strain of the present invention does not use arabinose and melezitose as carbon and energy sources as shown in Table 2 below, B. a. It is certain to belong to Infantis .
  • Genome DNA was extracted from the isolated strain and 16s rRNA sequences were analyzed. Genome DNA was extracted from 1 ml of pure culture medium of fecal isolates using Accuprep genome extraction kit (Bioneer, Korea). Using the extracted DNA as a template, PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA) was performed using a primer F (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3 ') 3 and primer R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3') 3 as a template. .
  • the PCR product was transformed into E. coli strain DH5 ⁇ by linking to a pGEM-Teasy vector (Promega, USA) and plated on LB / x-gal / ampplate and incubated overnight at 37 ° C. After screening the recombinant plasmid containing the insert from the transformant, DNA sequencing was performed. DNA sequencing was performed to compare homology with Bifidobacterium infantis T (ATCC 15697) using the Cluster V method of the DNA star program. 16s rRNA sequences of the isolated strain showed 99.5% homology with Bifidobacterium infantis T (ATCC 15697), as shown in Figure 1b.
  • the isolated strain and Bifidobacterium infantis T can be bundled into one, and the isolated strain is BifiBambling. It can be seen that it is more closely related to the Terium Infantis T.
  • lane 1 is the result of Bifidobacterium Infante tooth T (ATCC 15697)
  • lane 2 represents the results of the Bifidobacterium ronggum Infante tooth BT1 CBT (KCTC 11859BP).
  • lane 1 is the result of Bifidobacterium Infante tooth T (ATCC 15697)
  • lane 2 represents the results of the Bifidobacterium ronggum Infante tooth BT1 CBT (KCTC 11859BP).
  • the properties of the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 according to the present invention are as follows.
  • the isolated strain was named " Bifidobacterium longum infantis CBT BT1 ( Bifidobacterium longum bv . Infantis CBT BT1) " strain, and on March 2, 2011, the microbial resource center, which is a depository institution of the Korean patent strain ( KCTC) was given accession number KCTC 11859BP.
  • Antibiotic resistance was analyzed to verify the safety of the isolated Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 (KCTC 11859BP). Antibiotic resistance tests were performed using the micro-dilution method recommended by the European Food Safety Authority (EFSA), and 10 antibiotics used in the experiment were ampicillin (AMP), vancomycin (VAN), gentamicin (GEN), and kanamycin. (KAN), streptomycin (STM), erythromycin (ERM), cinnaside (Q / D), clindamycin (CLM), tetracycline (TET) and chloramphenicol (CP).
  • EFSA European Food Safety Authority
  • clindamycin broth mixed with 10% ISO-sensitest broth and 90% MRS broth was added at a concentration of 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 ⁇ g / ml, Since clindamycin has an EFSA breakpoint value of less than 0.25 ⁇ g / ml for the Lactobacillus group, antibiotic concentrations of 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, and 0.03125 ⁇ g / ml are used. It was. In addition, cinnaside proceeded using an E-test strip of BioMeriux.
  • Microplates were incubated for 48 hours under anaerobic conditions at 37 ° C., and then MIC was measured at the lowest antibiotic concentration at which no visible growth was observed. That for each of the antibiotics on the basis of the EFSA breakpoint, Bifidobacterium ronggum Infante tooth BT1 CBT (Bifidobacterium longum bv. Infantis CBT BT1) and to determine whether the resistance is shown in Table 4.
  • the isolated Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 was found to meet EFSA's stability criteria for antibiotics because resistance to all antibiotics used in the experiments was lower than that of the EFSA antibiotics.
  • EFSA does not require a drug's MIC value for Bifidobacterium because Bifidobacteria have been reported to be resistant to aminiglycosides such as kanamycin due to lack of a cytochrome-mediated drug transport system. .
  • Intestinal fixation of Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 was performed in HT-29 cell line derived from human colon epithelial cells using Bifidobacterium infantis T (ATCC 15697) as a control. Each strain of the HT-29 cell line was treated for 1 hour, and then Gram staining and viable cell counts were compared.
  • the hemolysis test is to confirm that the bifidus bacteria have no hemolytic toxicity in the human body, and examined whether hemolysis, a phenomenon in which red blood cells are destroyed or degraded.
  • test strains were grown in MRS medium supplemented with 5% horse blood and incubated for 48 hours at 37 degrees under anaerobic conditions. Hemolysis was determined by the generation of transparent rings around the cells.
  • the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain was confirmed to be harmless to the human body because hemolytic activity against horse blood.
  • Genome sequencing of Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 (KCTC 11859BP) strain was performed using the PacBio RS II System (DNA Link, Republic of Korea). For genomes, a 10 kb library was made and genome sequencing was performed using one of the SMRTcells with C2-P4 chemistry. Genome sequencing gave a long sequence of 337,655,282 bp. De novo assembly was performed by SMRTpipe HGAP, and scaffolding and gap peeling were performed by SMRTpipe AHA. Structural gene prediction was made with Glimmer3, and gene annotation was performed by AutoFACT (Koski et al.
  • Genome metabolic pathway analysis was performed using a KEGG automatic annotation server (Moriya et al. 2007). Secondary metabolite biosynthesis gene analysis was performed using antiSMASH version 3.0.0 (Blin et al. 2013; Blin et al. 2014) ( http://antismash.secondarymetabolites.org/ ).
  • HMO Human milk oligosaccharide
  • the Bifidobacterium longgum Infantis CBT BT1 strain of the present invention had all genes for biosynthesis of vitamins, especially vitamin B group.
  • the genome of the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention there are genes capable of synthesizing three types of vitamins. Synthesizes folate from guanosine 5'-triphosphate (GTP), synthesizes folate (B2) from corismate, synthesizes nicotinic acid (B3) from L-aspartate, D-ribulose 5-phosphate and It was found to have a gene that synthesizes riboflavin (B2) from GTP.
  • the black and yellow arrows represent genes encoding urea transport protein and urease, respectively, and the genes represented by gray arrows encode nickel-transport proteins.
  • the numbers on the arrows are the gene position tag numbers and the numbers between the genes are urtA (urea transport system substrate-binding protein) between ATCC 15697 and BT1 strains; urtB and urtC (urea transport system permease protein); urtD and urtE (urea transport system ATP-binding protein); ureAB (urea subunit gamma / beta); ureC (urease subunit alpha); amino acid sequence homology of ureE , ureF , ureG , and ureD (urease accessory protein).
  • urtA urea transport system substrate-binding protein
  • urtB and urtC urea transport system permease protein
  • urtD and urtE urea transport system ATP-binding protein
  • ureAB urea sub
  • the Bifidobacterium longgum infantis CBT BT1 strain of the present invention includes a gene encoding two or more kinds of bacteriocins and a lentopeptide gene encoding lentibiotics . It was confirmed to include. As shown in FIG. 8, the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention encodes proteins for biosynthesis of bacteriocins, lentipeptides , and non-ribosomal peptides and polyketides. Has a gene.
  • the strains of the present invention were identified as having bacteriocin-encoding genes, genes encoding proteins for phenazine biosynthesis, genes encoding polyketides and non-ribosome peptides. From these results, it can be seen that the Bifidobacterium longum Infantis CBT BT1 strain of the present invention can inhibit the growth of pathogens by the production of antimicrobial compounds such as bacteriocin.
  • PAIs pathogenicity islands
  • REIs antimicrobial resistance islands
  • Bifidobacterium longgum Infantis CBT BT1 strain (KCTC 11859BP) was incubated in BL broth (BD Diagnostics, Sparks, MD) for 24 hours at 37 ° C, phosphate buffer solution (PBS, 10 mM sodium phosphate, 130 mM sodium chloride, pH 7.4) After diluting to 10 11 CFU / ml and sonicating, the supernatant was centrifuged and filtered through a filter of 0.45 ⁇ m pore size, lyophilized and stored at ⁇ 20 ° C. until in vivo experiment.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the experimental animals purchased 6 weeks of male SD rats (10, 5 females, 5 males) from Sairon Bio Co., Ltd. in Uiwang, Korea, and had a period of acclimatization for 24 hours, followed by breeding for 17 days. In the rearing environment, the light cycle was maintained for 12 hours at 24 ⁇ 2 °C and 55 55% humidity.
  • barley feed (A04, UAR, Vilemoisson sur-Orge, France) was taken for 17 days, and drinking water was freely consumed or Bifidobacterium longum infantis CBT BT1 (10 7 CFU / head / day) was mixed with drinking water.
  • the body weight and the amount of drinking water and feed consumed daily were measured until 17 days after the start of the experiment.
  • the increase in body weight was calculated by subtracting the weight of the start date from the weight of the test date.
  • Drinking water and feed were measured per cage and counted per head to calculate the total amount up to 17 days.
  • the efficiency of weight gain was calculated by dividing the weight gain by the total amount of feed consumed.
  • the diet of barley was fed for 17 days to induce a basic diet.
  • the body weight was significantly increased from 12 days compared to the group fed normal drinking water (NC) (12day; p ⁇ 0.05) , 13 to 17 days; p ⁇ 0.01) (FIG. 9A).
  • the total feed intake (FI) and the amount of drinking water (WI) consumed for 17 days did not show any significant difference between the two groups (FIG. 9B).

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Abstract

본 발명은 성장촉진 효능이 우수한 신규한 비피더스균 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 모유 올리고당의 소화를 도와서 체력 증진과 함께 면역력을 강화하여 성장발육 촉진에 유용한 효과가 있다.

Description

신규한 비피더스 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물
본 발명은 신규한 비피더스 균주 및 그를 함유하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모유 올리고당 대사 관련 유전자 및 비타민 생합성 유전자를 보유하여 성장 촉진 효과를 갖는 신규한 비피더스 균주 및 이를 포함하는 성장촉진용 조성물에 관한 것이다.
사람의 성장은 대부분 성장판이 열려 있는 사춘기까지의 시기에 일어난다. 성장을 의학적으로 정의하면, 성숙에 수반되는 크기의 변화라고 할 수 있으며, 특히 소아의 성장이라 함은 신장의 증가뿐만 아니라 신체의 각 기관의 크기와 기능의 증대를 포괄적으로 포함하는 개념이다.
일반적으로 사람의 성장은 유전적 영향이 가장 크게 영향을 미치는 것으로 인식되고 있지만, 실제로는 유전적인 영향은 23% 정도 밖에 해당되지 않으며, 나머지 77%는 후천적 영향에 의해 결정된다. 최근 지속적인 경제 성장과 식습관의 서구화, 영양상태의 개선 등으로 인해 소아 및 청소년의 성장발육이 크게 증가되는 추세이다. 또한 외모와 큰 키를 선호하는 사회적 분위기가 고조됨에 따라서 성장에 대한 관심이 증대되고 있다.
지금까지 알려진 성장을 촉진하기 위한 방법으로는 성장 호르몬 제제 투여 요법이 있다. 그러나 성장 호르몬 사용 시, 비용 부담이 클 뿐만 아니라 주사부위의 소양감, 발작, 지방위축과 고혈압, 당 불내성(glucose intolerance), 췌장염, 전신 알레르기 반응, 성장 호르몬 항체 양성, 암 발생 및 남성에게 여성화 유방 등의 증상과 같은 부작용이 있을 수 있다. 따라서 성장에 근본적으로 도움을 줄 수 있는, 안전하고 효과적인 식품 소재에 대한 개발이 절실히 필요한 실정이다.
국내 특허 제0887377호(유아 및 청소년을 위한 건강보조식품), 국내 특허 제10530211호(학습능력을 향상시키는 건강기능식품 조성물 및 그 제조방법), 국내 특허 제0561286호(건조효모, 천연물 추출분말 및 영양성분 혼합분말을 함유하여 성장발육에 도움을 주는 건강기능성 조성물) 등이 이러한 성장촉진용 식품을 제안하고 있으나, 이들은 성장 촉진 효과가 부족한 한계가 있다.
본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해소하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 신생아, 영유아, 소아 및 성장기 어린이의 성장에 도움이 되는 신규한 비피더스균 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 모유 올리고당의 소화를 돕고, 비타민의 합성을 촉진하며, 질소원의 리사이클링에 기여하고, 유해 세균의 증식을 억제함으로써, 영유아, 어린이 및 청소년들의 성장을 촉진할 수 있는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11859BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1) 비피더스균에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1)의 균주를 포함하는 영유아, 어린이 및 청소년들의 성장을 촉진할 수 있는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1)의 균주는 산업적 규모로 대량 생산이 안 되고, 인간 효소에 의해서 소화되지 않는 모유 올리고당(Human Milk Oligosaccharide)을 소화시켜 공급하고, 비타민의 생합성을 촉진하며, 장내 유해세균의 증식을 억제하고, 면역계를 조절하여 성장 촉진 효능이 우수하다.
본 발명의 성장촉진용 기능성 식품 조성물은 신생아 및 영유아, 어린이 및 청소년의 체내 대사를 균형적으로 활성화시키고 면역계를 조절하여 성장 발육에 도움을 줄뿐만 아니라 두뇌 발달도 촉진할 수 있다. 또한 본 발명의 성장촉진용 기능성 식품 조성물은 성장부진, 발육부진, 체력저하, 저체중을 개선할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 (Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1) KCTC 11859BP 균주의 16S rRNA 서열이다.
도 1b-c는 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1과 관련 종들의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계(phylogenetic relationship)를 비교 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈 DNA의 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 (Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1) KCTC 11859BP 균주의 지놈 DNA의 PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis) 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 (Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1) KCTC 11859BP 균주의 용혈성 활성(hemolytic activity) 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주 및 관련 비피도박테리움 롱굼 균주들의 계통발생 트리를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 모유 올리고당 대사와 관련된 유전자의 수를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 우레아 대사와 관련된 유전자의 수를 나타낸 모식도이다.
도 8은 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 2차 대사산물 생합성 유전자를 도시한 도면이다.
도 9a-b는 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 마우스 생장에 미치는 성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
이하에서 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 하나의 양상은 성장촉진 효능이 우수한 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11859BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 (Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1) 비피더스균이다.
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 인간 효소에 의해서는 분해되지 않고, 구조가 매우 다양하고 복잡하여 산업적으로 대량생산이 어려운 모유 올리고당(HMO)을 분해하여 그러한 균주를 섭취하는 유아나 소아에게 모유 올리고당을 공급함으로써 성장을 촉진시킬 수 있다.
사람의 모유는 유익한 기능을 갖는 200 종류 이상의 다양한 올리고당을 포함하는 것으로 알려져 있다. 모유 올리고당(Human Milk Oligosaccharide)은 유익한 장내 미생물총의 증식 및 번식을 촉진하고, 유해 세균의 증식을 저해하며, 세포 반응의 조절자로 기능하고, 면역계를 조절하고, 신생아 및 유아의 두뇌 성장 발달의 필수성분으로 두뇌활동의 에너지를 공급함으로써 신생아 및 유아의 두뇌발달에 기여하는 것으로 알려져 있다.
상기 모유 올리고당은 상부 위장관 및 소장에서의 효소 소화에 저항성이 있어서 결장까지 손상되지 않고 도달하여, 거기서 결장 발효에 대한 기질로서 기능한다. 사람의 모유는 병원성 미생물의 증식을 저지하는 바람직한 장내 세균총의 증식을 촉진하는 몇 개의 인자를 포함한다고 생각되고 있다. 모유 올리고당이 유익균의 수를 증가시키고 잠재적으로 병원성인 세균수를 감소시킬 수 있는 방법은 세포 표면 수용체에 대한 경쟁, 필수 영양소에 대한 경쟁, 항균제의 생성, 및 배설물의 pH를 낮추고 잠재적으로 병원성인 세균을 억제할 수 있는 단쇄 지방산 (SCFA)과 같은 억제성 화합물의 생성을 통해 일어난다. 모유 올리고당은 발효되어 아세트산, 프로피온산, 및 부티르산과 같은 SCFA를 생성한다. 이러한 SCFA는 열량에 기여하고, 장 상피에 대한 주요 에너지원으로서 기능하고, 결장 내 나트륨 및 물의 흡수를 촉진하며, 소장의 소화 및 흡수를 강화시키는 것으로 생각된다. 또한, SCFA는 위장의 발달 및 면역 기능을 조절함으로써 전반적인 위장 건강에 기여한다.
모유 올리고당(HMO)은 다양한 구조의 올리고당으로 구성되는데, 주로 다섯 개의 단당류: D-글루코오스 (Glc), D-갈락토오스 (Gal), N-아세틸글루코사민(GlcNAc), L-푸코스(Fuc)와 살리실산(Sia; N-아세틸 뉴라미닉 애시드[Neu5Ac])으로 구성되어 있다.
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈은, 모유 올리고당(HMO)의 소화 효소를 코드화하는 여러 가지 종류의 유전자를 포함한다. 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈은, α-만노시다아제, β-만노시다아제, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제, 엔도-α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 시알리다아제, α-푸코시다아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, β-N-아세틸글루코사미니다아제, 및 β-N-아세틸헥소사미니다아제를 코드화하는 유전자를 포함한다.
또한 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈은, 비타민, 특히 비타민 B 군을 합성하는 유전자를 갖는다. 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈에는 세 종류의 비타민을 합성할 수 있는 유전자가 존재한다. 구아노신 5'-트리포스페이트 (GTP)로부터 폴레이트를 합성하고, 코리스메이트로부터 폴레이트(B9)를 합성하고, L-아스파테이트로부터 니코틴산(B3)을 합성하며, D-리불로스 5-포스페이트 및 GTP로부터 리보플라빈(B2)을 합성할 수 있다.
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주에 의한 모유 올리고당의 발효는 또한 배설물 중 주요 악취 성분으로서 연관되어 왔던 배설물의 암모니아, 아민 및 페놀의 농도를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 우레아제 단백질을 코드화하는 ure 유전자 및 우레아 이송 단백질을 코드화하는 urt 유전자를 갖는다. 이러한 유전자는 다른 비피도박테리움속 균주에는 발견되지 않는 것으로, 본 발명의 균주가 다른 균주들에 비해 영양분을 더 효율적으로 이용가능하고, 질소원의 리사이클링에 관여한다는 것을 시사한다.
도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 박테리오신, 렌티펩타이드, 및 비-리보좀 펩타이드(non-ribosomal peptides) 및 폴리케타이드의 생합성을 위한 단백질을 코드화하는 유전자를 갖는다. 본 발명의 균주는 박테리오신-코드화 유전자, 페나진(phenazine) 생합성을 위한 단백질을 코드화하는 유전자, 폴리케타이드 및 비-리보좀 펩타이드를 코드화하는 유전자를 갖는다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 프로바이오틱 비피더스균으로 사용되거나, 다양한 유제품 및 기타 발효 제품에 사용할 수도 있다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다. 모유 올리고당(HMO)은 현재로서는 대량 생산이나 상업적 이용이 불가능하여 대부분의 조제유 또는 조제식에는 결핍되어 있다. 모유 올리고당(HMO)은 영유아의 필수 영양원이지만 인간 효소에 의해서는 소화가 되지 않고, 소화되지 않을 경우 분변으로 배설된다. 본 발명의 성장촉진용 기능성 식품 조성물은 모유 올리고당을 소화시켜서 공급함으로써 신생아 및 영유아의 두뇌발달 및 성장발육을 촉진할 수 있다. 상기 식품 조성물은 식품, 건강기능식품(nutraceutical), 보충제(supplement), 생균제 또는 공생제(symbiotic)이다. 본 명세서에서 "생균제"라는 용어는 적합한 양으로 공급되는 경우, 숙주 생물의 건강에 유익한 살아있는 미생물을 의미한다. 본 명세서에서, "공생제"라는 용어는 프리바이오틱(prebiotic) 및 생균제의 혼합물을 함유하는 식품들을 의미한다.
본 발명의 조성물은 실시예에 따라서 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주 이외에 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로바이오틱 유산균을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 비피더스균의 배양에 통상 이용되는 배지를 사용하여 통상 사용되는 조건 하에서 배양함으로써 증식하여 회수할 수 있다. 배양 후 얻어지는 배양물을 그대로 사용해도 되고 나아가 필요에 따라 원심분리 등에 의한 조(粗)정제 및/또는 여과 등에 의한 고액분리나 멸균조작을 행해도 된다. 바람직하게는 원심분리를 행하여 비피더스균의 균체만을 회수한다. 아울러 본 발명에서 사용하는 비피더스균은 습윤 균체여도 되고 또는 건조 균체여도 된다. 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주 이외에 통상적인 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 제형화되어 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주와 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐 또는 액상의 형태로 제형화될 수 있다. 또한 본 발명의 균주는 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 대장에 도달하여 활성 성분인 비피더스균이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복되어 제품화될 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 부형제는 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 다당류, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필 에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스소듐 등의 셀룰로오스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다.
분해제로는 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다.
코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로오스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 성장촉진용 조성물에서 유효성분인 상기 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 함량은 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일례로, 본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주를 영양적으로 유효한 농도로 포함하는데, 바람직하게는 108 내지 1012 cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함한다. 일반적으로, 성인의 경우, 1×106 이상의 생균, 바람직하게는 1×108 내지 1×1012의 생균이 필요에 따라 한번 또는 수차례에 걸쳐서 나누어서 투여될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 성장촉진용 기능성 식품 조성물은 비피도박테리움 브레베 CBT BR3(Bifidobacterium breve CBT BR3)(KCTC 12201BP), 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(KCTC 12199BP)), 및 비피도박테리움 롱굼 CBT BG7(KCTC 12200BP)으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 다른 프리바이오틱 (prebiotic)을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 각각의 비피더스균을 동일한 비율로 포함할 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1( Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1) 균주의 분리 및 동정
1-1. 균주의 선발
건강한 아기의 분변 1g을 멸균 혐기수에 연속 희석(serial dilution)한 후 각 희석액 1㎖을 Man-Rogosa-Sharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어서 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 MRS에 BCP(Bromocresol purple, 0.17g/L)가 첨가된 비피더스균 선택배지(BL 고체배지)에 옮긴 후 같은 조건에서 3일간 배양하였다. BCP 지시약은 유산균이 젖산을 형성하여 주변 pH가 낮아지면 보라색에서 노란색으로 변하게 된다. 콜로니 주변의 색이 노란 색으로 변한 유산균 콜로니를 선택한 후 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이 후 균주의 기능성 및 안정성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.
1-2. 선발된 균주의 동정
1) API 키트를 이용한 생화학적 동정
선발된 균주의 당 이용성을 알아보기 위하여 API 50 CHL Carbohydrate Test Kit(bioMerieux Co., France)를 이용하였다. 10 ㎖의 MRS(Man-Rogosa-Sharpe) 액체배지에서 37℃에서 17시간 배양한 후, 1 ㎖의 배양액을 회수하여 CHL 용액으로 2회 세정하였다. 이어서 원심분리(MICRO-17, Hanil, KR)에 의해 균체를 모아 9 ㎖의 CHL 용액에 재현탁시켰다. 150 ㎕의 균주 현탁액을 API 50 CHL 키트의 각 웰에 넣은 후, 오토클레이브한 파라핀 오일을 웰 내의 균주 현탁액 위에 분주하였다. 37℃에서 3일간 배양한 후 각각의 당 이용성을 비교하였다. 49가지 탄소원에 대하여 미생물 증식에 의한 색의 변화 여부를 관찰하여 각 탄소원의 이용 여부를 관찰하였고, 최종 동정 결과는 동정용 프로그램 API web을 이용하여 해석하여 그 결과를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다. 동정 결과, 선발된 균주는 B. infan tisT (ATCC 15697）와 99.9% 동일한 생화학적 특성을 보였다.
표 1
No Carbohydrates Utilized No Carbohydrates Utilized
0 Control - 25 Esculine -
1 Glycerol - 26 Salicine -
2 Erythritol - 27 Cellobiose -
3 D-Arabinose - 28 Maltose +
4 L-Arabinose - 29 Lactose +
5 Ribose + 30 Melibiose +
6 D-Xylose - 31 Saccharose +
7 L-Xylose - 32 Trehalose +
8 Adonitol - 33 Inuline -
9 β-Methyl-xyloside - 34 Melezitose -
10 Galactose + 35 D-Raffinose +
11 D-Glucose + 36 Amidon +
12 D-Fructose + 37 Glycogene +
13 D-Mannose + 38 Xylitol +
14 L-Sorbose - 39 β-Gentiobiose -
15 Rhamnose - 40 D-Turanose +
16 Dulcitol - 41 D-Lyxose -
17 Inositol - 42 D-Tagatose -
18 Mannitol + 43 D-Fucose -
19 Sorbitol + 44 L-Fucose +
20 α-Methyl-D-mannoside - 45 D-Arabitol -
21 α-Methyl-D-glucoside + 46 L-Arabitol -
22 N-Acetyl glucosamine + 47 Gluconate -
23 Amygdaline - 48 2-Ceto-gluconate -
24 Arbutine - 49 5-Ceto-gluconate -
본 발명의 균주의 당 이용성을 B. infantis T (ATCC 27920) 및 B. longum T (ATCC 15707)의 당 이용성과 비교하였다. Bergy's Manual 및 기타 문헌을 참고하면, 아라비노오스, 및 멜레지토오스를 발효시키지 못하는 비피더스균은 비. 인판티스로 분류되어야 하고, 양자를 모두 발효시키는 비피더스균은 비. 롱굼 균주로 분류되어야 한다. 본 발명의 균주는 하기 표 2와 같이 아라비노오스, 및 멜레지토오스를 탄소원 및 에너지원으로 이용하지 못하기 때문에, 비. 인판티스에 속하는 것이 확실하다.
표 2
　 B. longum infantis CBT BT B. infantis* B. longum*
(KCTC 11859BP) (ATCC 27920) (ATCC 15707)
L-Arabinose - - +
Lactose + + +
Cellobiose - - -
Melezitose - - +
Raffinose + + +
Sorbitol + - -
Gluconate - - -
2) 16s rDNA 유전자 염기서열 결정을 통한 동정
분리된 균주로부터 지놈 DNA를 추출하여 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 분변에서 분리한 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')3와 프라이머 R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')3을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다.
PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여 E.coli 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/ampplate에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V method를 이용하여 비피도박테리움 인판티스 T (ATCC 15697)와 상동성을 비교하였다. 분리된 균주의 16s rRNA 염기서열은, 도 1b에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 인판티스 T(ATCC 15697)와 99.5%의 상동성을 보였다.
상기 분리된 균주와 관련 종들을 이용하여 계통발생 트리를 제작해 본 결과, 도 1c에 도시된 바와 같이, 분리된 균주와 비피도박테리움 인판티스 T는 하나로 묶일 수 있어, 분리된 균주는 비피도박테리움 인판티스 T와 보다 밀접하게 관련되는 것을 알 수 있다.
3) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)에 의한 DNA 지문 분석
RAPD 분석은 분변에서 분리한 균주로부터 지놈 DNA를 추출하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)5 (5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3') 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. 최종 산물인 PCR 산물은 EtBr (ethidium bromide)에 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. RAPD 결과에서 분리한 균주는, 도 2에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 인판티스 T (ATCC 15697)와 다른 밴드 패턴을 보이고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 위 결과로부터 분변에서 분리한 균주는 비피도박테리움 인판티스 T (ATCC 15697)와 다른 신규 균주임을 확인하였다. 도 2에서 레인 1은 비피도박테리움 인판티스 T(ATCC 15697)의 결과이고, 레인 2는 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(KCTC 11859BP)의 결과를 나타낸다.
4) PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis)에 의한 DNA 지문 분석
MRS broth에서 순수 배양된 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1, 및 비피도박테리움 인판티스 T (ATCC 15697)의 O.D.를 측정한 후 2% Low Melting Agarose를 이용하여 최종 O.D600=4에 맞춰 플러그(plug)를 제작하였다. 제작된 플러그를 1㎖ 라이소자임 완충액(2mg/㎖ Lysozyme (Sigma), 0.05% N-lauorylsarcosine (Sigma))에 넣고 4mg/㎖ Lysostaphin(sigma) 10 ㎕을 가한 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 플러그를 조심스럽게 꺼내 NDS 완충액(1 ㎖ 1M Tris-HCl(pH=8.0), 10 ㎖ 100% SDS, 89 ㎖ 0.5M EDTA(pH=8.5) 4 ㎖에 넣고 50℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 가볍게 진탕하면서 50mM EDTA(pH 8.5) 10 ㎖에서 플러그를 6번 세정한 후 처리하고자 하는 효소 완충액 400 ㎕에 플러그를 조심스럽게 옮기고 상온에서 30분 방치한다. 플러그를 새로운 효소 완충액 400㎕에 옮긴 후 제한효소(20U)를 넣고 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이 때 제한효소는 NotI을 사용하였다. 전기영동은 CHEF 시스템(BIO-RAD, USA)을 이용하여 0.5X TBE에서 5.3cm/V, 1s~15s 펄스 타임, 20 시간 동안으로 실시하였다.
전기영동이 완료된 후, EtBr 용액으로 염색한 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 밴드 패턴을 관찰하였다. NotI을 이용한 PFGE 결과, 분변에서 분리한 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1은 비피도박테리움 인판티스 T (ATCC 15697)와 상이한 밴드패턴을 보이는 새로운 균주임을 확인하였다. 도 3에서 레인 1은 비피도박테리움 인판티스 T(ATCC 15697)의 결과이고, 레인 2는 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(KCTC 11859BP)의 결과를 나타낸다.
5) 기타 균학적 특성
본 발명에 따른 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1의 특성은 다음과 같다.
표 3
1) 균의 형태
비엘 (BL) 한천평판 배지에서 37℃, 2일간 무산소조건에서 배양했을 때 균의 특성①세포의 형태: 간균②운동성: 없음③포자형성능: 없음④그람(Gram) 염색: 양성
2) 균락의 형태
비엘 (BL) 한천평판 배지에서 37℃, 2일간 무산소조건에서 배양했을 때 균락의 형태①형상: 원형②융기: 볼록③표면: 매끄러움(Smooth)
3) 생리적 성질
① 생육온도: 생장가능 생육온도 15~40℃ 최적 생장온도 37℃② 생육 pH: 생장가능 생육 pH 5.0~7.5 최적 pH 6.0~6.5③ 산소에 대한 영향: 혐기성
4) 카탈라제 -
5) 가스형성여부 -
6) 15℃에서 생육 -
7) 45℃에서 생육 +
8) 인돌 생산 -
9) 젖산 생산 +
이상의 결과를 토대로 상기 분리된 균주를 "비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 (Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1)"균주로 명명하고, 2011년 3월 2일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11859BP를 부여받았다.
1-3. 기능성 및 안정성
1) 항생제 내성 실험
분리된 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(KCTC 11859BP)의 안전성을 검증하기 위해 항생제 내성을 분석하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였으며, 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다.
클린다마이신을 제외한 항생제에 대해서는 ISO-sensitest broth 10%와 MRS broth 90%를 혼합한 broth에 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 클린다마이신은 락토바실루스 그룹의 EFSA 브레이크 포인트 값이 0.25 ㎍/㎖ 이하이기 때문에 항생제의 농도는 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 ㎍/㎖의 농도로 첨가해 사용하였다. 또한, 시너시드는 BioMeriux 사의 E-테스트 스트립을 이용하여 진행하였다.
마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 (Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1)가 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 하기 표 4에 나타내었다.
표 4
균주 항생제 (μg/ml)
AMP VAN GEN KAN STM ERM CLM QU+DA TET CP
B.longum infantis CBT BT1 <2 <0.5 <8 <128 <16 <0.5 <0.06 <0.38 <4 <2
EFSA break point 2 2 64 nr 128 0.5 0.25 1 8 4
분리된 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1은 실험에 사용된 모든 항생제에 대한 내성이 EFSA 항생제 내성기준 보다 낮게 나타났기 때문에 EFSA의 항생제에 대한 안정성 기준에 적합한 것으로 확인되었다. 비피도박테리아는 사이토크롬-매개 약물 수송 시스템의 결여로 카나마이신과 같은 아미니글리코사이드(aminiglycosides)에 대해서 내성이 있는 것으로 보고되었기 때문에, EFSA는 비피도박테리움에 대한 약제의 MIC 값을 요구하지 않는다.
2) 장정착성 실험
비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1의 장 정착성 측정은 비피도박테리움 인판티스 T (ATCC 15697)를 대조군으로 하여 사람의 대장 상피세포에서 유래한 HT-29 세포주에서 실시하였다. HT-29 세포주에 각 균주들을 1시간 처리한 후 그람 염색과 생균수를 측정함으로써 균주들의 장 정착능을 비교하여 하기 표 5에 타내었다.
표 5
비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 비피도박테리움 인판티스T
장정착률(%) 90.85 78.45
장 정착성 측정 결과, 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 비피도박테리움 인판티스 T (ATCC 15697) 균주 보다 우수한 장 정착성을 보이는 균주임을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 상기 균주가 장 상피세포에 부착하여 장내 환경을 개선할 수 있음을 나타낸다.
3) 용혈성 테스트
용혈성 테스트(Hemolysis test)는 비피더스균이 인체 내에서 용혈성 독성이 없음을 확인하기 위한 것으로, 적혈구의 파괴 또는 분해되는 현상인 용혈성 여부를 검사하였다. Baumgartner 등의 방법에 의해서, 시험 균주를 5% 말 혈액이 보충된 MRS 배지에서 성장시키고 혐기성 조건 하에서 37도에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 균체 주위에 투명 환의 생성여부로 용혈성을 판단하였다. 본 발명의 균주의 용혈성 여부를 검사한 결과, 도 4를 통해서 확인되는 바와 같이, 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 말 혈액에 대해서 용혈성이 없어 인체에 무해한 것으로 확인되었다.
4) 급성독성실험
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주에 대한 안전성을 검증하기 위하여, 실험동물을 대상으로 급성독성실험을 실시하였다. 6주령의 암수 Sprague-Dawley (SD)계 쥐에게 본 발명의 동결 건조된 균주를 1.0 x 1011 cfu/kg로, 경구투여하였다. 대조군에는 0.85% 염수를 위내에 투여하였다.
모든 실험동물에 대한 임상 증상은 시료 투여 1일부터 부검일까지 1일 1회씩 14일간 관찰하였다. 관찰 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주를 투여한 후, 모든 대조군 및 투여군에서 폐사율을 관찰할 수 없었으며, 또한 특이적인 임상증상을 나타내는 개체를 발견할 수 없었다. 또한 투여 후 14일간 먹이와 물의 섭취량, 및 체온을 관찰한 결과, 투여군과 대조군 사이에 통계학적으로 유의적인 차이를 발견할 수 없었다.
표 6
성별 균주 투여 후 경과 일수 폐사율 (%) LD50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
수컷 BT1 0* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 >1011cfu/kg
대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
암컷 BT1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 >1011cfu/kg
대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
* 상기 표에서 숫자는 폐사된 동물의 두수를 나타냄.
실시예 2. 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 유전학적 분석
비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 (KCTC 11859BP) 균주의 지놈 시퀀싱은 PacBio RS II System (DNA Link, Republic of Korea)을 이용하여 행하였다. 지놈에 대해서, 10 kb 도서관을 만들고, C2-P4 chemistry를 가지는 SMRTcell 중 하나를 이용하여 지놈 시퀀싱을 실시하였다. 지놈 시퀀싱에 의해서 337,655,282 bp의 긴 서열이 수득되었다. SMRTpipe HGAP에 의해 De novo 조립을 실시하고, SMRTpipe AHA에 의해서 스캐폴딩과 갭 필링을 행하였다. 구조 유전자 예측은 Glimmer3로 하였고, 유전자 annotation은 Pfam, Uniref100, KEGG, COG 및 GenBank NR 데이터베이스에 대해서 BLASTP에 의해서 얻은 결과를 이용하여 AutoFACT (Koski et al. 2005)에 의해서 행하였다. Transfer RNA 및 리보좀 RNA는 각각 tRNAscan-SE (Lowe and Eddy 1997) 및 RNAmmer (Lagesen et al. 2007)를 이용하여 행하였다. Clusters of Orthologous Groups (COGs) category에 의한 유전자의 기능적 분류는 e-value cutoff를 1e-2 미만으로 하여 RPS-BLAST를 이용하여 행하였다(Mavromatis et al. 2009).
지놈 상의, 특수한 유전자의 존재는 수집된 데이터세트에 대해서 서열 상동성 ≥ 50%의 파라미터로 BLASTP를 이용하여 행하였다. 지놈의 대사 경로 분석은 KEGG automatic annotation server를 이용해서 행하였다 (Moriya et al. 2007). 2차 대사산물 생합성 유전자 분석은 antiSMASH version 3.0.0 (Blin et al. 2013; Blin et al. 2014) (http://antismash.secondarymetabolites.org/)을 이용해서 행하였다 .
2-1. HMO (Human Milk Oligosaccharide) 대사 관련 유전자
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈의 유전자 컨텐츠 분석 결과, 모유 올리고당 대사 관련 유전자 가운데 α-만노시다아제, β-만노시다아제, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제, 엔도-α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 시알리다아제, α-푸코시다아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, β-N-아세틸글루코사미니다아제, 및 β-N-아세틸헥소사미니다아제를 코드화하는 유전자를 포함하는 것으로 확인되었다. 이로써 본 발명의 균주가 인간 효소에 의해서 소화되지 않는 모유 올리고당을 소화시켜 공급할 수 있다는 것을 알 수 있다.
표 7
Strain Enzyme Accession number
B. longum bv. infantis CBT BT1 Beta-galactosidase RY67_106
B. longum bv. infantis CBT BT1 Beta-galactosidase RY67_1138
B. longum bv. infantis CBT BT1 Beta-galactosidase RY67_223
B. longum bv. infantis CBT BT1 Alpha-mannosidase RY67_1638
B. longum bv. infantis CBT BT1 Alpha-mannosidase RY67_1639
B. longum bv. infantis CBT BT1 Endo-beta-N-acetylglucosaminidase RY67_1645
B. longum bv. infantis CBT BT1 Sialidase RY67_1368
B. longum bv. infantis CBT BT1 Sialidase RY67_485
B. longum bv. infantis CBT BT1 Alpha-fucosidase RY67_1129
B. longum bv. infantis CBT BT1 Alpha-fucosidase RY67_476
B. longum bv. infantis CBT BT1 Alpha-fucosidase RY67_959
2-2. 비타민 생합성 유전자
유전자 분석 결과, 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 비타민, 특히 비타민 B 군의 생합성을 위한 모든 유전자를 갖는 것으로 확인되었다. 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈에는 세 종류의 비타민을 합성할 수 있는 유전자가 존재한다. 구아노신5'-트리포스페이트 (GTP)로부터 폴레이트를 합성하고, 코리스메이트로부터 폴레이트(B2)를 합성하고, L-아스파테이트로부터 니코틴산(B3)을 합성하며, D-리불로스 5-포스페이트 및 GTP로부터 리보플라빈(B2)을 합성하는 유전자를 갖는 것으로 확인되었다.
표 8
A. Nicotinate biosynthetic genes from L-aspartate
KO number K00278 K03517 K00767 K00763
EC number 1.4.3.16 2.5.1.72 2.4.2.19 6.3.4.21
B. longum bv. infantis CBT BT1 RY67_1692 RY67_1691 RY67_1693 RY67_1109
B. Riboflavin biosynthetic genes from D-ribulose 5-phosphate
KO number K14652 K00794 K14652 K11752 K11752 K00793
EC number 4.1.99.12 2.5.1.78 3.5.4.25 3.5.4.26 1.1.1.193 2.5.1.9
B. longum bv. infantis CBT BT1 RY67_1088 RY67_1089 RY67_1088 RY67_1086 RY67_1086 RY67_1087
2-3. 우레아 이송 시스템
비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주에 대한 종 특이적 유전자 분석 결과, 우레아제 단백질을 코드화하는 ure 유전자 및 우레아 이송 단백질을 코드화하는 urt 유전자를 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 유전자는 다른 비피도박테리움속 균주에는 발견되지 않는 것으로, 본 발명의 균주가 다른 균주들에 비해 영양분을 더 효율적으로 이용가능하고, 질소원의 리사이클링에 관여한다는 것을 시사한다.
도 7에서, 흑색 및 황색 화살표는 각각 우레아 이송 단백질 및 우레아제를 코드화하는 유전자를 나타내고, 회색 화살표로 표시되는 유전자는 니켈-수송 단백질을 코드화 한다. 화살표 상의 숫자는 유전자 위치 택 번호이고, 유전자 사이의 숫자는 ATCC 15697 및 BT1 균주들 간의 urtA(우레아 수송 시스템 기질-결합 단백질); urtB 및 urtC (우레아 수송 시스템 퍼미아제 단백질); urtD 및 urtE (우레아 수송 시스템 ATP-결합 단백질); ureAB (우레아 서브유니트 감마/베타); ureC (우레아제 서브유니트 알파); ureE, ureF, ureG, 및 ureD (우레아제 악세사리 단백질) 의 아미노산 서열 상동성을 나타낸다.
2-4. 유해 세균의 성장 억제
본 발명의 균주의 항균제의 생성에 의해서 유해균의 생장을 억제하는 효과를 확인하기 위하여, 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈 상에서 2차대사산물 생합성 및 항생제 생산과 관련된 유전자의 존재 여부를 분석하였다.
도 8을 참조하면, 2차 대사산물 생합성 조사 결과, 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 2종류 이상의 박테리오신을 코드화하는 유전자를 포함하고, 렌티바이오틱스를 코드화하는 렌티펩타이드 유전자를 포함하는 것으로 확인되었다. 도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 박테리오신, 렌티펩타이드, 및 비-리보좀 펩타이드(non-ribosomal peptides) 및 폴리케타이드의 생합성을 위한 단백질을 코드화하는 유전자를 갖는다. 본 발명의 균주는 박테리오신-코드화 유전자, 페나진(phenazine) 생합성을 위한 단백질을 코드화하는 유전자, 폴리케타이드 및 비-리보좀 펩타이드를 코드화하는 유전자를 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 볼 때, 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주는 박테리오신과 같은 항균화합물의 생산에 의해서 병원균의 증식을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있다.
2-5. 병원성 유전자의 부재
PAIs (Pathogenicity islands) 및 REIs(Antimicrobial resistance islands)에 대한 분석은 PAI 데이터베이스 (Yoon et al. 2007; Yoon et al. 2015)의 PAI finder를 이용하여 행하였다. 분석 결과, 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 지놈에는 PAI (Pathogenicity islands) 및 PAI-유사 영역은 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 성장 촉진 효과
이하 실시예에서 본 발명의 균주의 특성과 성장촉진용 효능을 입증한다. 모든 실시예의 실험 결과는 평균(mean)ㅁ표준편차(SD)로 표시하였고, 실험 결과의 통계처리는 GraphPad PrismTM 6.0을 이용하였으며 실험군 간 평균의 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인한 후 Tukey's multiple range test를 이용하여 사후 검증하였다.
3-1. 본 발명의 균주의 배양물 및 그를 포함하는 조성물의 제조
비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주(KCTC 11859BP)를 BL 브로스(BD Diagnostics, Sparks, MD)에서 24시간 37℃에서 배양하였고, 인산염 버퍼 용액(PBS, 10mM 인산나트륨, 130mM 염화나트륨, pH 7.4)에 1011 CFU/ml로 희석하여 초음파처리 후, 상청액을 원심 분리하여 0.45 ㎛ 포어 사이즈의 필터로 여과하고, 동결 건조한 후 -20℃에 생체내 실험 전까지 보관하였다.
3-2. 비만 동물 모델 및 샘플링
동물실험은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 Animal use and Care Protocol을 준수하여 진행하였다. 실험동물은 ㈜새론바이오 (Uiwang, Korea)에서 수컷 SD 실험용 쥐 6주령을 (그룹당 10 마리, 암컷 5마리, 수컷 5마리) 구입하여 24시간 동안 적응기간을 가진 후, 17일간 사육이 진행되었고, 사육환경은 24ㅁ2℃, 습도 55ㅁ15%에서 light cycle이 12시간 유지되었다. 기초 식이를 위해 17일간 보리 성분의 사료 (barley feed, A04, UAR, Vilemoisson- sur-Orge, France)를 섭취하도록 하였으며, 음용수는 자유롭게 섭취하거나 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(107 CFU/head/day)를 음용수에 섞어 섭취하도록 하였다.
3-3 본 발명의 균주의 성장발육 촉진 효과
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 성장 촉진 효능을 관찰하기 위해, 실험 시작 후 17일까지 매일 체중과 섭취한 음용수 및 사료의 양을 측정하였다. 체중의 증가는 실험 날짜의 체중에서 실험 시작 날짜의 체중을 빼서 계산하였다. 음용수와 사료는 케이지 별 측정 후, 마리당 계산하여 17일까지의 총 양을 계산하였다. 체중증가의 효율은 총 섭취한 사료의 양에서 증가한 체중을 나누어 계산하였다.
본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 마우스 성장 촉진 효과를 관찰하기 위해, 보리 성분의 사료를 17일 동안 먹여 기초식이를 유도하였다. 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1을 음용수에 섞어 먹인 그룹(BT1)의 경우, 일반 음용수를 정상적으로 먹인 그룹(NC)에 비해 12일부터 유의성 있게 체중이 증가하는 것을 관찰하였다 (12day; p<0.05, 13 to 17 days; p<0.01) (도 9a). 그러나 17일 동안 섭취한 총 사료의 섭취량(FI)과 음용수의 양(WI)은 두 그룹간 특별한 차이를 보이지 않았다(도 9b). 본 발명의 균주의 투여가 사료 섭취에 영향을 미치지 않았고, 체중(WG)의 증가가 사료 섭취량(FI)의 차이에 기인하지 않았음을 확인할 수 있다. 이와 같이 섭취한 사료의 양 대비 체중증가의 효율(FI/WG)은, 정상 그룹에 대비하여 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1을 섭취한 그룹에서 유의미한 결과가 나타나, 본 발명의 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1 균주의 투여에 의해 성장이 촉진되는 것이 확인되었다.
이상에서 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 또는 변경된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호범위는 전술한 실시예가 아니라 이하의 특허청구범위 및 그와 균등한 범위로 해석되어야 할 것이다.
Figure PCTKR2015007225-appb-I000001
Figure PCTKR2015007225-appb-I000002
Figure PCTKR2015007225-appb-I000003
Figure PCTKR2015007225-appb-I000004
Figure PCTKR2015007225-appb-I000005
Figure PCTKR2015007225-appb-I000006
Figure PCTKR2015007225-appb-I000007
Figure PCTKR2015007225-appb-I000008

Claims (7)

  1. 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11859BP로서 국제기탁된 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1) 비피더스균.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비피더스균은 모유 올리고당을 분해하는 유전자를 가지고 있고, 상기 유전자는 α-만노시다아제, β-만노시다아제, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제, 엔도-α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 시알리다아제, α-푸코시다아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, β-N-아세틸글루코사미니다아제, 및 β-N-아세틸헥소사미니다아제를 코드화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 비피더스균.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비피더스균은 리보플라빈(B2), 니코틴산(B3), 및 폴레이트(B9) 생합성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 비피더스균.
  4. 제1항에 있어서, 상기 비피더스균은 우레아제를 코드화하는 ure 유전자와 우레아 이송 단백질을 코드화하는 urt 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 비피더스균.
  5. 제1항에 따른 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(Bifidobacterium longum bv. infantis CBT BT1)(KCTC 11859BP)의 균주를 포함하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식품 조성물은 비피도박테리움 롱굼 인판티스 CBT BT1(수탁번호: KCTC 11859BP) 균주의 생균 또는 건조균을 108 내지 1012 cfu/g 포함하는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 기능성 식품 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 식품 조성물이 비피도박테리움 브레베 CBT BR3(Bifidobacterium breve CBT BR3)(KCTC 12201BP), 비피도박테리움 비피둠 CBT BF3(KCTC 12199BP)), 및 비피도박테리움 롱굼 CBT BG7(KCTC 12200BP)으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 다른 프리바이오틱 (prebiotic)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 성장촉진용 기능성 식품조성물.
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