CN114574391A - 一种促长高提高免疫力的菌剂及其在配方奶粉上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种促长高提高免疫力的菌剂及其在配方奶粉上的应用。菌剂包括发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16，所述发酵乳杆菌LG1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCN0.7121；所述长双歧杆菌LTBL16，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019028。发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16均为安全的益生菌，都是安全性很高的食品用菌，成分确切，安全有保障，可以直接做成口服液，也可以做成奶粉制品，食用方便；本发明提供的菌剂不仅能提高免疫力，同时还能促进钙吸收、骨骼生长，从而促进长高。

Description

一种促长高提高免疫力的菌剂及其在配方奶粉上的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一种促长高提高免疫力的菌剂及其在配方奶粉上的应用。
背景技术
儿童是祖国的未来、民族的希望，儿童的生长发育不仅是家长十分关心的问题，也是我国政府、专家学者及全社会十分关注的问题。儿童的身体处于生长发育时期，需要吸收大量的营养素，且调节免疫力、改善骨骼状况是重要关注焦点。
钙是生命元素，钙对促进人体骨骼的发育起着至关重要的作用，钙也是人体内含量最多、最活跃的金属元素，在人体的生理过程中有举足轻重的作用，几乎参与一切生命现象和细胞功能。钙在人体的各个阶段都起着重要的生理作用，尤其是在儿童及青少年时期，更是保证健康成长发育必不可少的元素。根据儿童青少年生长发育的需求，中国营养学会提出了相应的膳食钙摄入推荐的供给量，即1～2岁为每日600毫克，3～9岁为800毫克。但国内大规模的人群调查显示，国人钙的摄入量与中国营养学会推荐的供给量相差一半左右，儿童缺钙的状况更严重些，摄入量仅为推荐量的40％左右。目前市场上补钙食品种类很多，但对钙的吸收营造的环境比较单一，使钙很难吸收或吸收不完全，因此，儿童补钙最好遵循“食补”的原则，通过食物补充营养物质的同时，补充钙和其他协同物质，也可起到良好的钙补充效果，并且作用更为温和，对于大多数的儿童来说，是更为合理的选择。
益生菌制剂是一类对人体及哺乳动物基本无毒副作用的微生物，具有无污染、无残留、改善肠道菌群的平衡、促进生长发育、增强机体免疫能力、降低肠道内有害物质等优点。但是益生菌对骨骼生长方面的研究还是比较少。
本发明旨在提供一种具有促长高提高免疫力的菌剂，其不仅能够有效提高免疫力，并且该菌剂能促进小肠对钙离子的吸收和利用，从而促进骨骼生长，进而达到长高和提高免疫力的效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种促长高提高免疫力的菌剂及其在配方奶粉上的应用，其在有效地提高免疫力的同时，还能促进小肠对钙离子的吸收，从而促进长高，达到良好的促长高提高免疫力的效果，以解决上述技术背景中提出的问题。
张经坤等在《人体钙吸收理论探讨》（科学通报，第45卷第10期，2000年5月）中提出：人体吸收钙的位置在小肠处，小肠的刷状缘相同于植物根毛的作用，能自动分泌小分子量的氨基酸或短肽链，它们就是螯合剂，在遇到由胃里经过消化的食物中的钙离子(Ca2+)时，就会立刻发生螯合反应，生成氨基酸螯合钙，氨基酸螯台钙以整体形式被刷状缘细胞吸收，进入细胞之后，在细胞液作用下，又自动断开螯台键，重新分解成钙离子和氨基酸，钙离子通过门静脉进入血液，被输送到各个器官，包括在骨骼上的沉积。人体缺钙的原因是由于小肠分泌氨基酸不足所致，和钙的摄入量没有线性关系。基于这个理论，本发明团队致力于筛选出能在肠道一系列生理生化的影响下促进小肠吸收钙的菌剂。
中国专利201310260616.8（申请人为黑龙江八一农垦大学）公开了发酵乳杆菌LG1及其应用，该菌株的保藏编号为CGMCCNo.7121；该发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum）LG1CGMCCNo.7121应用于制作传统黄米发酵面团。
中国专利201910259092.8（申请人为广西大学）一株长双歧杆菌菌株LTBL16及其应用。该长双歧杆菌菌株的保藏编号是CCTCCM2019028，可以应用于发酵乳制品，或添加至食品、保健品、饲料、药品、食品补充剂中，用于调节人和动物的肠道菌群、提高机体免疫力。
本发明团队在研究和实践过程中，单独使用发酵乳杆菌LG1或长双歧杆菌LTBL16均无明显的促进钙吸收的效果，但是联合使用发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16可以有效增强对钙的吸收效果，显著促进骨骼生长，从而促进长高，与此同时还能增强免疫力。发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16均为安全的益生菌，作为口服试剂或粉体很有前景。目前尚不清楚该发酵乳杆菌LG1如何增强长双歧杆菌LTBL16的效果，推测是通过菌剂作用下，肠道内经一系列生理消化过程中生成可以与钙离子螯合的小分子量的氨基酸，小分子量的氨基酸与食物在胃里经过消化会出现钙离子螯合成氨基酸螯合钙，从而促进钙离子被人体吸收。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
一种促长高提高免疫力的菌剂，其包括发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16。
上述技术方案中，所述发酵乳杆菌LG1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCN0.7121。
上述技术方案中，所述长双歧杆菌LTBL16，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019028。
上述技术方案中，所述菌剂做成液态或粉状。
本发明还提供了上述所述的一种促长高提高免疫力的菌剂在保健食品上的应用。
进一步优选的，所述菌剂在配方奶粉上的应用。
更进一步优选的，所述菌剂在高钙配方奶粉上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明复合菌剂
（1）发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16均为安全的益生菌，都是安全性很高的食品用菌，成分确切，安全有保障，可以直接做成口服液，也可以做成奶粉制品，食用方便。
（2）不仅能提高免疫力，同时还能促进钙吸收、骨骼生长，从而促进长高。
附图说明
图1为实施例1中不同组别补钙对大鼠股骨的骨钙影响的柱形图；
图2为实施例1中不同组别补钙对大鼠股骨的股骨干重、骨矿物质含量、骨密度影响的柱形图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1对幼年大鼠钙吸收和骨骼生长研究
1、动物分组：取100只体重90~100g的4周的Wistar断乳雄性大鼠，分为10组，各组大鼠之间无统计学差异。10组分别为空白对照组（正常大鼠）、阴性对照组（低钙模型）、阳性对照组（低钙模型+适宜钙组）、高钙对照组（低钙模型+高钙组）、发酵乳杆菌LG1处理组、长双歧杆菌LTBL16处理组、普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组、发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组、阴性处理组、高钙处理组。每组小鼠10只。其中正常小鼠组作为空白对照，阴性对照组、阳性对照组、高钙对照组、处理组均均使用低钙造模大鼠。
建立低钙大鼠模型方法：将Wistar断乳大鼠适应性喂养7天后，喂养21天低钙大鼠饲料即可。建模期间空白对照组大鼠采用标准大鼠饲料喂食。
其中，所述发酵乳杆菌LG1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCN0.7121；
所述长双歧杆菌LTBL16，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019028；
所述普通发酵乳杆菌，该菌种购买和保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC1.1880。
2、将发酵乳杆菌LG1菌液、长双歧杆菌LTBL16菌液、发酵乳杆菌CGMCC1.1880菌液按照常规方法活化培养。培养基调整菌液浓度到108cfu/ml。再配2组混合组：将发酵乳杆菌LG1菌液、长双歧杆菌LTBL16菌液活化后按照菌体数量1:1的浓度，混合调整菌液总浓度到108cfu/ml；将发酵乳杆菌CGMCC1.1880菌液、长双歧杆菌LTBL16菌液活化后按照菌体数量1:1的浓度，混合调整菌液总浓度到108cfu/ml。
3、试验方法
建模后，每天喂养如下：第1组：空白对照组（正常模型+正常喂养），标准大鼠饲养饲料，饲料含钙量为1.2g%（正常值为1.0~1.8%）；
第2组：阴性对照组（低钙模型+低钙喂养）：低钙大鼠饲料饲养（含钙量为标准鼠饲养饲料的50%）；
第3组：阳性对照组（低钙模型+低钙喂养+适宜钙）：低钙大鼠饲料饲养，同时给予碳酸钙（朗迪碳酸钙D3颗粒）的混悬液进行灌胃，按70mg/(kg·d)灌胃给药；
第4组：高钙对照组（低钙模型+低钙喂养+高钙）：低钙大鼠饲料饲养，同时给予碳酸钙（朗迪碳酸钙D3颗粒）的混悬液进行灌胃，按140mg/(kg·d)灌胃给药；
第5组：发酵乳杆菌LG1处理组：低钙大鼠饲料饲养，同时给予发酵乳杆菌LG1菌剂1mL/d；
第6组：长双歧杆菌LTBL16处理组：低钙大鼠饲料饲养，同时给予长双歧杆菌LTBL161mL/d灌胃给药；
第7组：普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组：低钙大鼠饲料饲养，同时给予普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂1mL/d灌胃给药；
第8组：发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组：低钙大鼠饲料饲养，同时给予发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂1mL/d灌胃给药；
第9组：钙处理组：低钙大鼠饲料饲养，给予碳酸钙（朗迪碳酸钙D3颗粒）的混悬液进行灌胃，按70mg/(kg·d)灌胃给药，同时给予发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂1mL/d灌胃给药；
第10组：高钙处理组：标准大鼠饲养饲料饲养，给予碳酸钙（朗迪碳酸钙D3颗粒）的混悬液进行灌胃，按140mg/(kg·d)灌胃给药，同时给予发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂1mL/d灌胃给药。
试验大鼠按上述组别进行饲养，给药饲养12周后，处死，剥离出股骨（每只大鼠取左股骨），测试股骨的骨密度、骨矿物质含量、股骨干重、骨钙，统计结果如表1所示。
其中，骨密度、骨矿物质含量测试为：取大鼠股骨，剔除肌肉和筋膜后，用单光子骨密度仪测定骨密度和骨矿物质含量；股干重测试为：将股骨放置烤箱中80~100℃烤至恒重，称量骨干重；骨钙含量测试：大鼠股骨钙均经马福炉高温灰化后，用原子吸收分光光度计测定钙含量。
表1不同组别补钙对大鼠骨骼发育的影响
组别 骨钙（mg/g） 股骨干重（g） 股矿物质含量（g/cm） 骨密度（g/cm<sup>2</sup>）
1 242.324±8.312<sup>a</sup> 0.324±0.022 0.2464±0.0032<sup>a</sup> 0.4105±0.0054<sup>a</sup>
2 220.158±5.648 0.291±0.017 0.1832±0.0021 0.3077±0.0019
3 263.948±8.745<sup>ab</sup> 0.382±0.028<sup>ab</sup> 0.3183±0.0018<sup>ab</sup> 0.5241±0.0012<sup>ab</sup>
4 265.173±9.142 0.389±0.024 0.3231±0.0025 0.5344±0.0065
5 224.354±6.257 0.297±0.014 0.1854±0.0034 0.3107±0.0047
6 221.875±7.651 0.300±0.023 0.1924±0.0033 0.3085±0.0035
7 226.759±4.689 0.303±0.019 0.1974±0.0028 0.3217±0.0042
8 261.845±8.475<sup>ab</sup> 0.379±0.021<sup>ab</sup> 0.3047±0.0061<sup>ab</sup> 0.5185±0.0039<sup>ab</sup>
9 305.857±7.364<sup>abc</sup> 0.431±0.027<sup>abc</sup> 0.4127±0.0024<sup>abc</sup> 0.7051±0.0041<sup>abc</sup>
10 310.359±8.723<sup>abc</sup> 0.437±0.022<sup>abc</sup> 0.4248±0.0019<sup>abc</sup> 0.7251±0.0046<sup>abc</sup>
注：a：P<0.05(和阴性对照组—组2比较）；b：P<0.05(与空白对照组—组1比较)；c：P<0.05(和阳性对照组—组3比较)；
由表1、图1和图2可知，给以发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂的处理组（第8至10组）均可以增加大鼠股骨强度，增加股骨中钙离子含量，促进大鼠钙离子的吸收。
与阴性对照组（第2组）相比，阳性对照组（第3组）中碳酸钙颗粒对大鼠股骨的骨密度、骨矿物质含量、骨钙含量的影响具有显著性差异，发酵乳杆菌LG1处理组（第5组）、长双歧杆菌LTBL16处理组（第6组）、普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组（第7组）中菌剂对大鼠股骨的骨密度、骨矿物质含量、骨钙含量的影响无显著性差异；给予发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂（第8至10组）后对大鼠股骨的骨密度、骨矿物质含量、骨钙含量的影响具有显著性差异，这说明单独使用发酵乳杆菌LG1或长双歧杆菌LTBL16或其他的菌种均无明显的促进钙吸收的效果，但是联合使用发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16可以有效增强对钙的吸收效果，显著促进骨骼生长。
与正常饮食大鼠的空白对照组（第1组））相比，阳性对照组（第3组）、高钙对照组（第4组）中碳酸钙颗粒对大鼠股骨的骨密度、骨矿物质含量、骨钙含量的影响具有显著性差异，给以发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂的组别（第8至10组）也具有显著性差异。说明造成低钙模型后给予发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂（第8组）后体内钙含量高于正常饮食的实验大鼠（第1组）体内钙离子含量，说明发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂可以提高正常饮食大鼠骨钙含量；
与阳性对照组（第3组）相比，第4组、第8组无显著性差异，第9组和第10组具有显著性差异，说明造成低钙模型后给予发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂（第8组）后对大鼠股骨的骨密度、骨矿物质含量、骨钙含量与阳性对照组（第3组）中碳酸钙颗粒对大鼠股骨的骨密度、骨矿物质含量、骨钙含量水平相当，说明当大鼠缺钙时，可以通过碳酸钙颗粒补钙，也可以通过服用发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂（第8至10组）快速补钙；第4组与第3组相比，无显著性差异，给予高剂量碳酸钙大鼠体内钙离子水平相差不大，但是说明高剂量的钙离子不能被人体全部利用；而与高钙对照组（第4组）相比，第9组和第10组具有显著性差异，说明发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16混合菌剂可以促进钙的吸收；第9组和第10组相比，无显著性差异，说明当钙离子满足人体正常生理需求之后，就不再增加，多余的钙离子不沉积在骨骼上，而是被代谢排岀体外，因为钙的代谢受多种因素调节和影响，摄入的钙只有一部分能被肠道吸收，多余的都随粪便排岀体外。目前尚不清楚该发酵乳杆菌LG1如何增强长双歧杆菌LTBL16的效果，推测是通过菌剂作用下，肠道内经一系列生理消化过程中生成可以与钙离子螯合的小分子量的氨基酸，小分子量的氨基酸与食物在胃里经过消化会出现钙离子螯合成氨基酸螯合钙，从而促进钙离子被人体吸收。
实施例2免疫功能检测
1、动物分组：取210只体重22~26g的SPF级雄性小鼠，分为5个大组，5个大组分别为A、B、C、D、E组，5组试验项目分别为脏器/体重比值（A组）、小鼠迟发型变态反应测定（B组）、血清溶血素测定（C组）、小鼠碳廓清试验（D组）、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（E组）。
每个大组以6只小鼠为单位设置7个小组，各小组小鼠之间无统计学差异。每个大组中，7个小组分别为空白对照组（正常小鼠）、阴性对照组、阳性对照组（转移因子口服液）、发酵乳杆菌LG1处理组、长双歧杆菌LTBL16处理组、普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组、发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组。
其中，所述发酵乳杆菌LG1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCN0.7121；所述长双歧杆菌LTBL16，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019028；所述普通发酵乳杆菌，该菌种购买和保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC1.1880。
2、将发酵乳杆菌LG1菌液、长双歧杆菌LTBL16菌液、发酵乳杆菌CGMCC1.1880菌液按照常规方法活化培养。培养基调整菌液浓度到108cfu/ml。再配2组混合组：将发酵乳杆菌LG1菌液、长双歧杆菌LTBL16菌液活化后按照菌体数量1:1的浓度，混合调整菌液总浓度到108cfu/ml；将发酵乳杆菌CGMCC1.1880菌液、长双歧杆菌LTBL16菌液活化后按照菌体数量1:1的浓度，混合调整菌液总浓度到108cfu/ml。
空白对照组和阴性对照组不给药；阳性对照组给予转移因子口服溶液（万通，10ml*6支）进行灌胃，根据药品用药指导转换成小鼠用药量，以1.67ml/kg·d进行灌胃。发酵乳杆菌LG1处理组：每只小鼠600μL/d发酵乳杆菌LG1；长双歧杆菌LTBL16处理组：每只小鼠600μL/d长双歧杆菌LTBL16；普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组：每只小鼠300μL/d发酵乳杆菌CGMCC1.1880+300μL/d长双歧杆菌LTBL16；发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组：每只小鼠300μL/d发酵乳杆菌LG1+300μL/d长双歧杆菌LTBL16；所有组别连续灌胃１个月，测定各项指标；其中，每个大组中的阳性对照组、阴性对照组、处理组在实验的第14d、21d、28d进行50mg/kg氢化可的松肌内注射造模处理。正常小鼠组作为空白对照，给予等剂量的生理盐水，每只小鼠灌胃5mL，每天灌胃一次，连续灌胃30d，第30d进行各大组指标测试。具体为：
2.1 A组进行脏器/体重比值测定：饲养结束后称小鼠体重，处死小鼠，取胸腺和脾脏，去尽筋膜，吸干脏器表面的血污，称其重量，计算胸腺/体重比值以及脾脏/体重比值，其结果如表2所示。
表2 不同菌剂对小鼠脏器/体重比值的影响
组别 给药 胸腺/体重（mg/g） 脾脏/体重（mg/g）
1 空白对照组 4.56±0.31<sup>a</sup> 5.72±0.51<sup>a</sup>
2 阴性对照组 2.91±0.52 4.37±0.12
3 阳性对照组 4.46±0.17<sup>a</sup> 5.64±0.42<sup>a</sup>
4 发酵乳杆菌LG1处理组 3.12±0.11 4.61±0.18
5 长双歧杆菌LTBL16处理组 3.91±0.27<sup>a</sup> 5.30±0.45<sup>a</sup>
6 普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组 3.98±0.34<sup>a</sup> 5.62±0.15<sup>a</sup>
7 发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组 4.43±0.39<sup>a</sup> 5.78±0.48<sup>a</sup>
注：a：P<0.05(和阴性对照组比较）。
从表2可见，相对于阴性对照组，空白对照组的胸腺/体重和脾脏/体重比值明显升高，具有显著性差异，表明造模成功。各处理组与阴性对照组组比，除发酵乳杆菌LG1处理组外，其它组胸腺/体重和脾脏/体重比值都有明显升高，差异显著，说明长双歧杆菌LTBL16处理组及含长双歧杆菌LTBL16的混合菌剂处理组均可以抵制HY对小鼠脾脏、胸腺的损伤，使脏器指数恢复到正常。
2.2 B组进行小鼠迟发型变态反应测定：给药25天后腹腔注射2%（v/v）SRBC溶液（200ul/只）进行致敏，4天免疫后每鼠左右足跖部皮下注射20%（v/v）SRBC溶液（20ul/只）进行攻击，攻击24h后颈椎脱臼处死小鼠，分别测量攻击前和攻击后24h每鼠足跖同一部位厚度，多次测量取平均值。计算攻击前、后足跖厚度差值，其结果如表3所示。
表3 不同菌剂对小鼠迟发型变态反应的影响
组别 给药 足跖厚度差值（mm）
1 空白对照组 0.48±0.12<sup>a</sup>
2 阴性对照组 0.21±0.21
3 阳性对照组 0.47±0.21<sup>a</sup>
4 发酵乳杆菌LG1处理组 0.24±0.21
5 长双歧杆菌LTBL16处理组 0.30±0.21
6 普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组 0.35±0.21
7 发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组 0.46±0.27<sup>a</sup>
注：a：P<0.05(和阴性对照组比较）。
由表3可以看出，相对于阴性对照组，发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组足跖厚度差值明显增加，具有显著性差异，而其它处理组相较于阴性对照组不具有显著性差异，说明发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16联合使用对小鼠的足趾厚度影响较大。
2.3 C组进行血清溶血素的测定：样品小鼠在第25d时腹腔注射，注射20%（v/v）SRBC（50ul/只），于免疫后5d摘眼球采血，收集血清倍数稀释。将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100ul，再加入等量0.5%（v/v）SRBC悬液，混匀，于37℃温箱孵育3h进行血清溶血素测定，统计血球凝集度，计算相应抗体积数，其结果如表4所示。
Figure 385754DEST_PATH_IMAGE002
，式中，1、2、3......n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别；抗体积数越大，表示血清抗体越高。
表4 不同菌剂对小鼠血清溶血素水平的影响
组别 给药 血清溶血素（抗体积数）
1 空白对照组 178.46±18.58<sup>a</sup>
2 阴性对照组 94.42±18.71
3 阳性对照组 177.41±24.74<sup>a</sup>
4 发酵乳杆菌LG1处理组 103.51±21.64
5 长双歧杆菌LTBL16处理组 121.43±22.57
6 普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组 134.82±17.98
7 发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组 175.56±21.65<sup>a</sup>
注：a：P<0.05(和阴性对照组比较）。
由表4可以看出，相对于阴性对照组，发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组小鼠体内血清溶血素（抗体积数）明显增加，具有显著性差异，而其它处理组相较于阴性对照组不具有显著性差异，说明发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16联合使用能够有效提升小鼠的血清溶血素水平。
2.4 D组进行碳廓清试验：实验第30d，以0.01 g/mL 体重向小鼠尾静脉注入稀释后的印度墨汁。2 min、10min后，各于内眦静脉丛取血20μL，立即加入0.1%的2mL碳酸钠溶液中。酶标仪于600nm波长下测不同取血时间t1=120s、t2=600s对应的OD1和OD2值。处死小鼠，取肝脏和脾脏，除去筋膜和表面血污，称重。按以下公式计算吞噬指数，其结果如表5所示。
Figure 302894DEST_PATH_IMAGE004
Figure 82631DEST_PATH_IMAGE006
；
表5 不同菌剂对小鼠碳廓清的影响
组别 给药 吞噬指数
1 空白对照组 3.82±0.15<sup>a</sup>
2 阴性对照组 2.41±0.13
3 阳性对照组 3.71±0.24<sup>a</sup>
4 发酵乳杆菌LG1处理组 2.51±0.24
5 长双歧杆菌LTBL16处理组 2.72±0.17
6 普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组 2.85±0.41
7 发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组 3.65±0.27<sup>a</sup>
注：a：P<0.05(和阴性对照组比较）。
由表5可以看出，与阴性对照组相比，发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组的吞噬指数明显增加，具有显著性差异，而其它处理组相较于阴性对照组不具有显著性差异，而且发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16联合使用的吞噬指数明显高于单一菌剂或普通发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16，说明发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16联合使用对提高小鼠免疫活性的功效起到了一定的协同作用。
2.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：各组小鼠均腹腔注射20%（v/v）鸡红细胞悬液1ml/只，半小时后颈椎脱臼处死小鼠，经腹腔注入生理盐水2ml/只，转动鼠板1min后吸出腹腔洗液lml平均分滴于2片载玻片上，载玻片在37℃温育30min后，再用生理盐水漂洗、晾干。以1：1的丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗晾干。镜检，油镜下计数100个巨噬细胞，计按照以下公式求出吞噬率、吞噬指数，其结果如表6所示。
Figure 540158DEST_PATH_IMAGE008
Figure 354530DEST_PATH_IMAGE010
表6 不同菌剂对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响
组别 给药 吞噬率（%） 吞噬指数
1 空白对照组 26.31±0.31<sup>a</sup> 0.39±0.11<sup>a</sup>
2 阴性对照组 16.41±0.21 0.20±0.08
3 阳性对照组 26.21±0.15<sup>a</sup> 0.37±0.15<sup>a</sup>
4 发酵乳杆菌LG1处理组 17.34±0.32 0.23±0.14
5 长双歧杆菌LTBL16处理组 19.27±0.25 0.25±0.09
6 普通发酵乳杆菌+长双歧杆菌LTBL16处理组 20.34±0.24 0.26±0.06
7 发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组 26.35±0.18<sup>a</sup> 0.38±0.15<sup>a</sup>
由表6可以看出，与阴性对照组相比，发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组可以显著提高免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数，差异显著，而其它处理组相较于阴性对照组不具有显著性差异，说明发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16联合使用对小鼠腹腔的巨噬细胞吞噬能力有积极的影响效果。
综上所述，发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组的小鼠碳廓清功能、血清溶血素（抗体积数）和巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均显著提高（P＜0.05）。在免疫低下模型成立条件下，细胞免疫、体液免疫和单核-巨噬细胞功能测定，测定结果均为阳性，则表明发酵乳杆菌LG1+长双歧杆菌LTBL16处理组具有增强小鼠免疫力的作用。
实施例3
一种促长高提高免疫力的高钙配方奶粉，包含菌剂和配方奶，该菌剂包括发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16，所述发酵乳杆菌LG1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCN0.7121。所述长双歧杆菌LTBL16，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019028。
配方奶为高钙配方奶粉，每100g高钙配方奶粉中钙含量为800~820mg，每100g高钙配方奶粉中105~108CFU菌剂。
作为其中一种配方奶（配方奶一），其营养成分表如表7所示：
表7 配方奶一的营养成分表
项目 每100克 营养素参考值10%
ltems per100g NRV%
能量 1704kJ 20%
蛋白质 17.5g 29%
脂肪 12.0g 20%
碳水化合物 51.9g 17%
膳食纤维（以低聚异麦芽糖+低聚果糖计） 10.0g 40%
钠 480mg 24%
维生素A 485ugRE 61%
维生素D 7.5ug 150%
维生素E 3.80mg a-TE 27%
维生素K 51.0ug 64%
维生素B1 0.38mg 27%
维生素B2 1.00mg 71%
维生素B6 0.36mg 26%
维生素B12 1.80ug 75%
维生素C 50.0mg 50%
烟酸 3.10mg 22%
叶酸 110ug DFE 28%
泛酸 2.95mg 59%
生物素 5.2mg 59%
镁 80mg 27%
钙 820mg 103%
铁 8.0mg 53%
锌 10.10mg 67%
硒 10.0ug 20%
铜 0.40mg 27%
锰 0.80mg 27%
肌醇 22.0mg —
左旋肉碱 6.0mg —
牛磺酸 42.0mg —
花生四烯酸（ARA) 10.0mg —
二十二碳六烯酸（DHA) 10.0mg —
作为其中一种配方奶（配方奶二），其营养成分表如表8所示：
表8 配方奶二的营养成分表
项目 每100克 营养素参考值10%
ltems per100g NRV%
能量 1799kJ 20%
蛋白质 17.4g 29%
脂肪 12.0g 20%
碳水化合物 51.7g 17%
膳食纤维 10.0g 40%
（以低聚异麦芽糖+低聚果糖计）
钠 480mg 24%
维生素A 485ugRE 61%
维生素D 7.5ug 150%
维生素E 3.80mg a-TE 27%
维生素K 51.0ug 64%
维生素B1 0.38mg 27%
维生素B2 1.00mg 71%
维生素B6 0.36mg 26%
维生素B12 1.80ug 75%
维生素C 50.0mg 50%
烟酸 3.10mg 22%
叶酸 110ug DFE 28%
泛酸 2.95mg 59%
生物素 5.2mg 17%
镁 80mg 27%
钙 800mg 100%
铁 8.0mg 53%
锌 10.10mg 67%
硒 10.0ug 20%
铜 0.40mg 27%
锰 0.80mg 27%
胆醇 110.0mg 24%
肌醇 22.0mg —
左旋肉碱 6.0mg —
牛磺酸 42.0mg —
叶黄素 200.mg —
二十二碳六烯酸（DHA) 10.0mg —
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种促长高提高免疫力的菌剂，其特征在于，其包括发酵乳杆菌LG1和长双歧杆菌LTBL16。
2.根据权利要求1所述的一种促长高提高免疫力的菌剂，其特征在于，所述发酵乳杆菌LG1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCN0.7121。
3.根据权利要求1所述的一种促长高提高免疫力的菌剂，其特征在于，所述长双歧杆菌LTBL16，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019028。
4.根据权利要求1-3所述的一种促长高提高免疫力的菌剂，其特征在于，所述菌剂做成液态或粉状。
5.根据权利要求1-3所述的一种促长高提高免疫力的菌剂在保健食品上的应用。
6.根据权利要求5所述的一种促长高提高免疫力的菌剂，其特征在于，所述菌剂在配方奶粉上的应用。
7.根据权利要求6所述的一种促长高提高免疫力的菌剂，其特征在于，所述菌剂在高钙配方奶粉上的应用。
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