KR20170002164A - 내산성, 내담즙성 및 세포 부착능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 llp5193, 및 이를 유효성분으로 포함하는 제품 - Google Patents

내산성, 내담즙성 및 세포 부착능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 llp5193, 및 이를 유효성분으로 포함하는 제품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 김치로부터 분리한 신규한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193 및 이를 유효성분으로 포함하는 제품에 관한 것이다. 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 식물성 유산균으로서 한국인의 장내 환경에 적합하고, 내산성 및 내담즙성이 우수하여 장내에 무사히 도달할 수 있으며, 장관세포 부착능이 뛰어나 장내에서 안정적으로 정착할 수 있다. 또한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193에 부형제를 일정 농도로 첨가하여 제조한 식품은 식감 및 마손율이 좋아 제형에 유리하고, 분말이 많이 생기지 않으며 섭취하기 편리하다.

Description

내산성, 내담즙성 및 세포 부착능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193, 및 이를 유효성분으로 포함하는 제품{LACTOBACILLUS PLANTARUM LLP5193 HAVING HIGH RESISTANCE ABILITY OF ACID AND BILE AND HIGH CELL ADHESION ABILITY, AND PRODUCT COMPRISING IT AS EFFECTIVE FACTOR}
본 발명은 김치로부터 분리한 신규한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193 및 이를 유효성분으로 포함하는 제품에 관한 것이다. 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 식물성 유산균으로서 한국인의 장내 환경에 적합하고, 내산성 및 내담즙성이 우수하여 장내에 무사히 도달할 수 있으며, 장관세포 부착능이 뛰어나 장내에서 안정적으로 정착할 수 있다. 또한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193에 부형제를 일정 농도로 첨가하여 제조한 식품은 식감 및 마손율이 좋아 제형에 유리하고, 분말이 많이 생기지 않으며 섭취하기 편리하다.
인간은 기원전부터 유산균을 식품으로 이용하였다. 유산균은 영양이 풍부하고 다양한 생리활성물질을 포함하고 있다. 유산균은 정장작용을 도와 설사·변비를 예방하고, 유해 세균의 생장을 억제하여 장암·노화를 방지하며, 비타민을 생성하여 발육을 촉진하고, 콜레스테롤을 조절하여 성인병을 예방하고 면역력을 증강하는 효과가 있다.
또한 유산균으로 만든 식품은 유산을 함유하고 있기 때문에 보존 기간이 길고, 특유의 상쾌한 신맛이 있으며, 유해한 미생물의 생장을 억제하고, 유단백질의 소화율을 높이며, 칼슘·철·인의 흡수를 촉진하는 등 많은 장점이 있다.
현재 국내에서 사용하는 유산균은 대부분 외국에서 들여온 것으로서, 동물의 장내, 원유 등으로부터 분리한 동물성 유산균이다. 한국인은 서양인과 달리 식물성 식품을 주식으로 하기 때문에 장내 환경이 다르고, 장의 길이가 길다. 따라서 동물성 유산균보다 채소·과일 등의 식물, 김치 등의 과채류를 발효한 식품에서 분리해 낸 식물성 유산균을 섭취하는 것이 효과가 더 좋다.
대한민국 공개특허 제10-2001-0075577호는 김치에서 분리한 락토바실러스 플랜타럼 균주에 관한 것이다. 본 종래기술에 따른 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus Plantarum)은 식물성 유산균으로서 한국인에게 잘 적용될 수 있고, 내산성 및 내담즙성이 좋아 장내에 무사히 도달할 수 있다는 장점을 가진다. 그러나 유산균의 장관세포 부착능에 대한 연구가 부족하다는 한계가 있었다. 또한 유산균의 생존률을 높이기 위해서는 내산성 및 내담즙성을 더욱 향상시킬 필요가 있다.
대한민국 공개특허 제10-2001-0075577호
본 발명은 김치로부터 분리하여 한국인의 장내 환경에 맞아 적응성이 높은 식물성 유산균인 락토바실러스 플랜타럼을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 우수한 내산성 및 내담즙성을 가져 장내에 무사히 도달할 수 있는 락토바실러스 플랜타럼을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 장관세포 부착능이 뛰어나 유산균의 효과를 제대로 발휘할 수 있는 락토바실러스 플랜타럼을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼에 부형제를 첨가하여 식감 및 마손율이 좋은 식품을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 아래와 같은 구성을 포함한다.
본 발명은 내산성, 내담즙성 및 장관세포 부착능이 우수한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193 (KCCM11598P)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193을 유효성분으로 포함하는 발효유 및 동결건조물을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼은 김치로부터 분리된 식물성 유산균이므로 한국인의 장내 환경에 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼은 내산성 및 내담즙성이 우수하여 장내에 무사히 도달할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼은 장관세포 부착능이 뛰어나 장내에서 안정적으로 정착할 수 있으므로 유산균으로서의 효과를 제대로 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼으로 제조한 제품은 식감 및 마손율이 좋아 제형에 유리하고, 섭취하기 편리하다.
도 1은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 당이용성 측정 결과이다.
도 2는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 서열 상동성 분석 결과이다.
도 3은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 카코-2 세포에 대한 세포 부착능 결과이다.
도 4는 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193에 부형제를 첨가하여 제조한 동결건조물이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 발명의 요지가 변경되지 않는 한 다양한 형태로 변형될 수 있다. 그러나 본 발명의 권리범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되면 공지 구성 및 기능에 대한 설명은 생략한다. 본 명세서에서 "포함"한다는 것은 특별한 기재가 없는 한 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명은 김치로부터 분리한 새로운 식물성 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193 (기탁번호 KCCM11598P)을 제공한다.
최근에는 채소나 과일 등의 식물, 김치 등의 과채류를 발효한 식품에서 분리한 식물성 유산균이 동물성 유산균에 비하여 좋은 효과를 가진다는 연구결과가 잇달아 발표되고 있다.
동물성 유산균(우유발효 유산균)은 배지 영양분으로 탄수화물과 함께 단백질, 지방 등을 사용한다. 따라서 장시간의 발효과정에서 단백질과 지방에 의해 부패하는 균주의 수가 증가하는 단점이 있다. 반면에 식물성 유산균은 배지 영양분으로 탄수화물만을 사용하므로 발효시 부패하지 않는다.
또한 식물성 유산균은 동물성 유산균에 비하여 영양분이 부족한 곳에서 생존하기 때문에 낮은 pH, 높은 염 농도 등의 척박한 환경에서도 강한 생존력을 보여 배양이 용이하고, 장내에 안정적으로 도달할 수 있다는 장점이 있다. 게다가 한국인은 식물성 식품을 주식으로 하기 때문에 식물성 유산균에 적합한 장내 환경을 가진다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 우수한 내산성, 내담즙성 을 가진다.
유산균이 정장작용 및 정균작용을 돕기 위해서는 장내에 무사히 도달해야 한다. 따라서 위산에 사멸하지 않고 위를 통과하기 위해서 우수한 내산성을 가져야 하고, 십이지장 상부에서 분비되는 담즙산에 대해서도 내성이 있어야 한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플래타룸 LLP5193은 뛰어난 세포 부착능을 가진다. 유산균이 장내에서 효과를 발휘하기 위해서는 장관세포(Intestinal cell)에 부착되어야 하므로 세포 부착능이 중요하다.
본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193에 부형제를 일정 함량으로 첨가하여 식감이 좋아 섭취하기에 적합하고, 마손율이 낮아 제형에 유리한 동결건조물을 제공한다.
특히 영유아는 분말이 많이 날리거나 딱딱한 식품을 섭취하기 어렵기 때문에, 본 발명에 따른 동결건조물을 사용하면 영유아를 위한 유산균 함유 제품을 제조하는데 큰 도움이 될 수 있다.
본 발명은 김치 시료를 채취하고, 이로부터 내산성, 내담즙성 및 세포 부착능이 뛰어난 균주를 선별하는 과정을 거쳐 선택된 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193을 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193을 특정한 조건에서 배양한 뒤, 특정한 조건에서 발효하여 발효유를 제조한다. 또한 상기 발효유에 일정 함량의 부형제를 첨가하고 특정한 조건에서 동결건조하여 동결건조물을 제조한다.
상기 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 MRS 배지 또는 탈지분유가 2 내지 10 중량%(Skim milk 20~100g/L) 포함된 상용 우유 배지에서 25 내지 42℃에서 18 내지 36 시간 동안 배양될 수 있다.
상기 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 배양액 0.5 내지 2 중량%를 탈지분유가 2 내지 10 중량% 포함된 상용 우유 배지에 첨가한 뒤, 25 내지 42℃에서 12 내지 24시간 동안 발효하여 발효유를 제조할 수 있다.
상기 발효유에 타피오카 전분 1 내지 5 중량%를 첨가하고 영하 70℃에서 2 내지 6 시간 동안 동결시킨 뒤, 50 mtorr 및 영하 80℃가 유지되는 동결건조기에서 18 내지 36 시간 동안 동결건조하여 동결건조물을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 - 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 선별
(1) 시료의 채취
이하의 [표 1]과 같이 전국 각지의 전통재래시장에서 약 150종의 김치 시료를 채취하였다.
분리지역 서울 경기도 충청남도 충청북도 전라남도
채취시료(김치) 29 46 18 26 31
채취한 시료에 멸균 증류수를 첨가하여 희석액을 만든 뒤, 분쇄균질기(Stomacher, Pro-Media SH-001, ELMEX)로 시료 내부를 균질화하였다.
상기 희석액을 멸균 식염수로 단계별로 희석한 뒤 0.1㎖를 취하였다. 이를 0.002중량%의 BCP(Bromocresol purple)와 1.5중량%의 한천 (Agar)이 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 37℃가 유지되는 배양기에서 48시간 배양하였다.
배양 후 노란색의 환이 나타나는 콜로니(Colony)를 선별하여 개체별로 동일한 배지에 2~3회 계대배양함으로써 각 균주를 순수 분리하였다.
상기 균주를 개체별로 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 재배양한 뒤 4℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
(2) 균주의 선별
카코-2(Caco-2) 세포를 이용하여 상기 균주 중 장관세포 부착능이 우수한 균주를 선별하였다.
카코-2 세포는 6-웰 플레이트(6-well plate)에 2x105 cells/ml 농도로 접종한 뒤, 37℃, 5% CO2 조건을 유지하는 배양기에서 약 15일간 배양하여 단층(monolayer)을 형성한 것을 사용하였다.
상기 균주를 MRS 액상배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, 원심분리(8,000rpm, 10분)하여 균체를 회수한 다음, 인산완충액(Potassium phosphate buffer)을 첨가하여 균주 현탁액을 준비하였다.
상기 균주 현탁액을 카코-2 세포가 들어있는 6-웰 플레이트에 1㎖ 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 인산완충액으로 3회 반복하여 세척하였다.
반응이 종료된 6-웰 플레이트에 MRS 액상배지 2㎖을 첨가한 후 멸균된 스크래퍼(Scraper)를 이용하여 카코-2 세포와 균주를 긁어내었다. 이를 10㎖ 튜브에 옮긴 뒤 멸균 식염수를 이용하여 다단 희석하였다. 적정 배수의 희석액 0.1㎖를 MRS 평판배지에 접종한 뒤, 37℃에서 48시간 배양하였다. MRS 평판배지 상에 배양된 콜로니 수를 확인하여 균수를 측정하였다.
균주의 최초 균체농도와 장관부착 반응 이후의 균체농도를 각각 측정하여 부착율(반응 후 균체농도 / 최초 균체농도)을 확인하였다. 가장 우수한 부착율을 나타낸 균주를 최종 선별하였다.
최종 선별된 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하여 증식시키고, 원심분리(10,000g, 10분)하여 균체를 획득하였다. 상기 균체를 MRS 액체배지 : 글리세롤(Glycerol)이 4 : 1 비율로 포함된 냉동보관용액(Freezing solution)에 1ml 첨가한 뒤, 크라이오튜브(Cryo-tube)에 넣어 -70℃에서 냉동보관하였다. 냉동된 균주를 이 후의 테스트를 위한 스타터로 사용하였다.
실시예 2 - 균주의 특징 분석 및 동정
(1) 특징 분석
선별된 균주의 형태학적 및 생화학적 특징을 분석하였다. 이하 [표 2]를 참조하면, 상기 균주는 그람 양성, 간균으로 포자형성능 및 카탈라아제(Catalase) 음성으로 확인되었다.
특징 결과분석
콜로니 형태(Colony shape) 소형의 둥근 형태
콜로니 색(Colony color) 밝은 아이보리
세포형태(shape) 간균(Rod)
그람염색(Gram staining) 그람 양성
호기조건 통성 혐기성
포자 형성능(Endospore) 음성
포자 형태(Spore shape) 음성
카탈라아제 테스트(Catalase test) 음성
(2) 균주 동정
상기 균주의 당이용성을 API 50 CHL 키트(Biomerieux® France)를 이용하여 분석하였다. 이하 [표 3] 및 도 1을 참조하면, 락토바실러스 플랜타럼 표준 균주(Lactobacillus pantarum 1)와 99.7% 일치하지만, 트레할로스(Trehalose)에 대한 이용성은 96% 다른 것으로 확인되었다.
스트립(Strip) 0-19
튜브/기질		 +/- 스트립(Strip) 20-39
튜브/기질		 +/- 스트립(Strip) 40-49
튜브/기질		 +/-
0 대조군 - 20 α-메틸-D-만노시드
(Mannoside)		 - 40 D-투라노스
(TURanose)		 +
1 글리세롤 - 21 α-메틸-D-글루코시드 - 41 D-리로스
(LYXose)		 -
2 에리트리톨
(ERYthritol)		 - 22 N-아세틸-글루코사민 + 42 D-타가토스
(TAGatose)		 -
3 D-아라비노즈
(Arabinose)		 - 23 아미그달린
(AMYgdalin)		 + 43 D-푸코스
(FUCose)		 -
4 L-아라비노즈 + 24 알부틴 (ARButin) + 44 L-푸코스 -
5 리보스 (Ribose) + 25 에스쿨린 (Esculin) + 45 D-아라비톨
(ArabitoL)		 -
6 D-자일로스
(XYLose)		 - 26 살리신 (SALicin) + 46 L-알비톨 -
7 L-자일로스 - 27 셀로비오스
(CELobiose)		 + 47 굴루코나테
(GlucoNaTe)		 -
8 아도니톨
(ADOnitol)		 - 28 말토스 (MALtose) + 48 2-게톤-글루코네이트 -
9 β-메틸-D-자일로스 - 29 락토스 (LACtose) + 49 5-게토-글루코네이트 -
10 갈락토스
(GALactose)		 + 30 멜리비오스
(MELibiose)		 +
11 글루코스
(GLUcose)		 + 31 수크로스
(Sucrose)		 +
12 프럭토스
(FRUctose)		 + 32 트레할로스
(TREhalose)		 +
13 만노스 (MANose) + 33 이눌린 (INUline) -
14 스로보스
(SroBose)		 - 34 멜리지토스
(MeLeZitose)		 +
15 람노스
(RHAmnose)		 - 35 라프피노스
(RAFfinose)		 +
16 둘시톨(DULcitol) - 36 전분 -
17 이노시톨
(INOsitol)		 - 37 글리코겐
(GLYcoGen)		 -
18 만니톨(MANitol) + 38 자일리톨
(XyLiTol)		 -
19 솔비톨(SORbitol) + 39 젠티오비오스
(GENtiobiose)		 +
상기 균주의 16s rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같다. 염기서열 분석 결과 상기 균주는 락토바실러스 속 균주와 최대 99% 상동성을 가진다. 이는 도 2에서 확인할 수 있다.
이에 본 발명자는 상기 균주를 새로운 락토바실러스 플랜타럼 균주로 동정하였고, 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193으로 명명하여 한국미생물보존센터에 2014년 11월 3일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM11598P).
실시예 3 - 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 내산성 및 내담즙성 측정
구강으로 유산균을 섭취하면 위산과 담즙에 의해 상당수가 사멸한다. 따라서 소장 및 대장까지 전달되는 유산균의 수를 높이려면 우수한 내산성 및 내담즙성이 필요하다.
락토바실러스 플랜타럼 LLP5193을 MRS 평판배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 콜로니를 채취하여 MRS 액상배지에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양하여 종균 배양액을 제조하였다.
(1) 내산성 시험
종균 배양액 1%를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 수득한 배양액에 10% H2SO4를 첨가하여 pH 3.0의 강산성 조건으로 만들고 2시간 동안 방치하였다. 이 후 시료를 다단희석한 희석액을 MRS 평판배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여, 초기 생균수와 pH 3.0 처리 후의 생균수를 측정하였다. 본 발명에서 내산성은 (초기 생균수 / pH 처리 후 생균수)의 비율로 나타낸다.
(2) 내담즙성 시험
담즙(bile)을 0.1, 0.3, 0.5 중량%로 첨가하여 제조한 MRS 평판배지를 준비하였다. 각 MRS 평판배지에 종균 배양액을 접종한 뒤 37℃에서 24시간 동안 배양하여 생장여부를 확인하였다.
(3) 시험 결과
각 실험의 비교군으로 락토바실러스 플랜타럼 표준균주(Lactobacillus plantarum KCTC21004, Lactobacillus plantarum ATCC14917)를 사용하였다. 내산성 시험 및 내담즙성 시험의 결과는 이하의 [표 4]와 같다.
시료 내산성(%) 내담즙성
락토바실러스 플랜타럼 LLP5193 99.6 >0.5% 생존
락토바실러스 플랜타럼 표준균주(ATCC14917) 82.4 >0.5% 생존
락토바실러스 플랜타럼 표준균주(KCTC21004) 0.04 >0.3% 생존
락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 pH 3.0의 강산성으로 약 2시간 처리하여도 99.6%의 생존율을 보였다. 또한 0.5 중량%의 담즙이 첨가되었을 때에도 생육이 가능한 것을 확인하였다.
따라서 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 우수한 내산성 및 내담즙성을 가지므로 장까지 도달할 확률이 높기 때문에, 식품 또는 건강기능식품으로 섭취할 경우 유산균의 다양한 효능을 효과적으로 발휘할 수 있다.
실시예 4 - 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 장관세포 부착능 측정
이상의 실시예 3을 통해 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 내산성 및 내담즙성이 우수하여 장까지 전달되는 비율이 다른 유산균들에 비해 높다는 것을 확인하였다.
그러나 유산균이 장까지 전달되어도 장관세포에 부착되지 않으면 유실되어 버리기 때문에 제대로 효과를 발휘할 수 없다. 따라서 세포 부착능이 내산성 및 내담즙성보다 더 중요한 특성이라고 할 수 있다.
락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 장관세포 부착능을 정량적으로 측정하는 한편, 부착된 모습을 현미경으로 관찰하였다.
(1) 정량적 측정
상기 실시예 1에서 카코-2 세포를 이용한 장관세포 부착능 실험과 동일한 방법으로 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 장관세포 부착능을 측정하였다. 그 결과는 이하의 [표 5]와 같다.
횟수 반응이전(균주 투여농도) 반응이후(균주 부착농도)
생균수(CFU/ml) Log CFU 생균수(CFU/ml) Log CFU
1 2.9×109 9.46 3.2×108 8.51
2 3.2×109 9.51 5.0×108 8.70
3 3.7×109 9.57 3.0×108 8.48
4 7.3×109 9.86 5.4×108 8.73
5 3.7×109 9.57 6.2×108 8.79
6 5.9×109 9.77 7.9×108 8.90
평균 4.5×109 9.65 5.1×108 8.71
총 6번의 반복 실험을 수행하였다. 평균치로 살펴보면, 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193이 약 4.5×109 CFU/㎖ 투여되었을 때, 부착 반응 후 약 5.1×108 CFU/㎖이 부착되었다. 이를 일반적으로 미생물의 농도를 나타내는 로그값을 취해 부착률을 계산하면, 약 90.2% [(9.65 log / 8.71 log) * 100]로 매우 높다.
일반적인 프로바이오틱스 유산균 제품의 섭취 기준이 108 CFU/ml(8.0 log)임을 감안하면, 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 장관세포 부착능이 굉장히 뛰어남을 알 수 있다.
(2) 현미경 관찰
카코-2 세포를 이용한 부착실험에서 부착 반응 종료 후 배양액을 일부 채취하였다. 상기 배양액을 슬라이드 글라스에 적정량 옮긴 뒤 그람 염색(Gram staining)으로 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193을 염색하였다. 그 결과는 도 3과 같다.
염색된 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193이 카코-2 세포 주변에 굉장히 많이 부착된 것을 확인할 수 있다.
락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 내산성 및 내담즙성이 우수하므로 장까지 안정적으로 전달될 수 있고, 뛰어난 세포 부착능을 가지므로 장관세포에 많은 수가 부착될 수 있다. 따라서 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193은 유산균으로서의 효과를 굉장히 잘 발휘할 수 있다.
실시예 5 - 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193을 유효성분으로 포함하는 제품의 제조
(1) 발효유의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LLP5193을 MS 고체(agar) 배지에 접종한 뒤 37℃에서 24시간 동안 배양하여 활성화하였다. 활성화한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193의 콜로니를 우유 100㎖에 탈지분유를 5 중량% 첨가한 배지에 접종하여 커드(curd)가 만들어질 때까지 37℃에서 약 12시간 배양하였다. 종균 배양물 1 중량%를 탈지분유가 5 중량% 첨가된 우유 1L와 혼합한 뒤 커드(curd)가 형성될 때까지 37℃에서 약 12시간 배양하여 발효유를 제조하였다.
(2) 동결건조물의 제조
상기 발효유에 일정 농도의 부형제를 첨가하여 만든 동결건조물의 생균수, 식감 및 마손율을 측정하였다.
상기 발효유에 덱스트린, 쌀가루, 타피오카전분을 1, 3, 5 중량%로 첨가하였다. 그 혼합물을 성형을 위한 몰드에 투여하여 극저온냉동기(영하 70℃ 유지)에서 2시간 동안 급속 냉동시켰다. 이를 동결건조기(일신바이오베이스, MCFD Series, 한국)로 옮긴 뒤 50mtorr, 영하 80℃에서 18시간 동안 동결 건조하여 동결건조물을 제조하였다.
동결건조물의 생균수를 측정하였다. 동결건조물을 멸균식염수로 희석한 뒤, 적정 수준의 희석액을 취하였다. 이를 MRS 고체 배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 뒤 콜로니를 계수하였다.
동결건조물의 식감을 측정하였다. 임의로 5명을 선별하여 동결건조물을 섭취한 뒤 딱딱하거나 부드러운 순서에 따라 구분하였다.
동결건조물의 마손율을 측정하였다. 동결건조물을 롤링기에 투여한 뒤 50회전을 실시하였다. 회전 전의 동결건조물의 중량과, 회전 후의 중량을 측정하였다. 마손율은 (회전 전 중량-회전 후 중량)/회전 전 중량 × 100으로 나타내었다.
부형제를 첨가한 동결건조물의 생균수, 식감 및 마손율의 결과는 이하의 표 6과 같다.
부형제 첨가농도 생균수 (CFU/g) 마손율 (%) 식감*
무첨가 - 3.8×108 66.7 4.4

덱스트린		 1 중량% 8.4×1010 42.1 4.6
3 중량% 5.2×1010 34.2 3.4
5 중량% 3.6×1010 21.3 1.8

쌀가루		 1 중량% 8.2×1010 33.1 3.4
3 중량% 4.3×1010 13.5 2.8
5 중량% 4.2×1010 9.3 2.0

타피오카전분		 1 중량% 8.6×1010 13.7 4.4
3 중량% 5.5×1010 2.5 3.8
5 중량% 2.3×1010 2.0 2.2
* 1: 딱딱함 -> 5: 부드러움
부형제를 첨가하면 무첨가한 경우에 비하여 생균수가 높게 나타났다. 다만 부형제의 종류에 따른 차이는 크지 않은 것으로 확인되었다.
부형제의 첨가에 따른 마손율과 식감을 살펴보면, 부형제 무첨가의 경우 식감은 부드러운 편이었으나 마손율이 66.7%로 너무 높아 동결건조된 형태를 거의 보존하지 못하였다.
덱스트린과 쌀가루의 경우 동일한 농도의 타피오카전분에 비하여 식감은 비슷한 정도였으나 마손율이 높았다. 가장 우수한 마손율과 식감을 나타낸 것은 타피오카전분을 3 중량% 첨가한 동결건조물이었다.
따라서 타피오카전분 3 중량%를 첨가하였을 때 마손율이 좋아서 분말이 많이 발생하지 않으며, 식감이 좋기 때문에 영유아를 위한 식품으로 제조할 수 있다는 장점이 있다.
동결건조물에 타피오카전분을 3 중량%를 첨가한 실제 제품을 도 4에 나타내었다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼은 김치로부터 분리된 식물성 유산균으로서 한국인의 장내 환경에 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼은 내산성 및 내담즙성이 우수하여 장내에 무사히 도달할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼은 장관세포 부착능이 뛰어나 장내에서 안정적으로 정착할 수 있으므로 유산균으로서의 효과를 제대로 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼으로 제조한 제품은 식감 및 마손율이 좋아 제형에 유리하고, 분말이 많이 생기지 않으며 섭취하기 편리하다.
이상으로 본 발명에 대해 상세히 설명하였다. 다만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 않고, 이하의 특허청구범위에 의해 정해진다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11598P
수탁일자 : 20141103
<110> LOTTE CONFECTIONERY CO.,LTD <120> LACTOBACILLUS PLANTARUM LLP5193 HAVING HIGH RESISTANCE ABILITY OF ACID AND BILE AND HIGH CELL ADHESION ABILITY, AND PRODUCT COMPRISING IT AS EFFECTIVE FACTOR <130> 2014-0591 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1404 <212> RNA <213> LACTOBACILLUS PLANTARUM LLP5193 <220> <221> rRNA <222> (1)..(1404) <223> 16s rRNA <400> 1 ggttacccca ccgactttgg gtaatacaaa ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 60 ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccgacttca 120 tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagaatggc tttaagagat tagcttactc 180 tcgcgagttc gcaactcgtt gtaccatcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag 240 gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtctcacca 300 gagtgcccaa cttaatgctg gcaactgata ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac 360 ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtatcca tgtccccgaa 420 gggaacgtct aatctcttag atttgcatag tatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt 480 agcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 540 ttcagccttg cggccgtact ccccaggcgg aatgcttaat gcgttagctg cagcactgaa 600 gggcggaaac cctccaacac ttagcattca tcgtttacgg tatggactac cagggtatct 660 aatcctgttt gctacccata ctttcgagcc tcagcgtcag ttacagacca gacagccgcc 720 ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcatttcacc gctacacatg gagttccact 780 gtcctcttct gcactcaagt ttcccagttt ccgatgcact tcttcggttg agccgaaggc 840 tttcacatca gacttaaaaa accgcctgcg ctcgctttac gcccaataaa tccggacaac 900 gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta 960 aataccgtca atacctgaac agttactctc agatatgttc ttctttaaca acagagtttt 1020 acgagccgaa acccttcttc actcacgcgg cgttgctcca tcagactttc gtccattgtg 1080 gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc 1140 cgattaccct ctcaggtcgg ctacgtatca ttgccatggt gagccgttac cccaccatct 1200 agctaatacg ccgcgggacc atccaaaagt gatagccgaa gccatctttc aagctcggac 1260 catgcggtcc aagttgttat gcggtattag catctgtttc caggtgttat cccccgcttc 1320 tgggcaggtt tcccacgtgt tactcaccag ttcgccactc actcaaatgt aaatcatgat 1380 gcaagcacca atcaatacca gagt 1404

Claims (4)

  1. 김치로부터 분리한 내산성, 내담즙성 및 장관세포 부착능이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193 (KCCM11598P).
  2. 제 1 항의 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193을 유효성분으로 포함하는 동결건조물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 동결건조물은 덱스트린, 쌀가루 및 타피오카전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 더 포함하는 동결건조물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 부형제는 타피오카전분 3 내지 5 중량%인 동결건조물.
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