KR102118343B1 - 장 도달력이 우수하고 장내 염증 예방 효과를 가지는 우유와 발효유 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 장 도달력이 우수하고 장내 염증 예방 효과가 향상된 우유 및 발효유에 관한 것으로, LB-9 복합 유산균을 유효성분으로 포함하고, 상기 LB-9 복합 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주를 포함하는, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유, 및 LB-9 복합 유산균을 유효성분으로 포함하고, 상기 LB-9 복합 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주를 포함하는, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유에 관한 것이다.
Description
본 발명은 장 도달력이 우수하고 장내 염증 예방 효과가 향상된 우유 및 발효유에 관한 것이다.
현대에는 급속한 식생활의 서구화, 과도한 스트레스로 인해 한 끼 식사를 빠르게 해결할 수 있는 인스턴트식품 및 고칼로리 식품의 섭취가 증가한 반면, 야채류 및 섬유질의 섭취가 감소하는 등 잘못된 식습관과 불규칙적인 생활습관으로 인한 변비 및 성인병 등의 질병을 호소하는 인구가 점점 증가하고 있는 추세이다. 특히나 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)은 장에 만성적인 원인 불명의 염증을 일으키는 질환으로 궤양성 대장염과 크론병으로 나눌 수 있다. 염증성 장 질환의 발생 원인이나 병태생리에 대해서는 아직까지도 명확히 알려져 있지 않지만, 유전적 요인, 장내 세균이나 음식물 등의 환경적 요인, 면역학적 요인 등이 복합적으로 발생기전에 관여하리라 추정되고 있다.
최근 염증성 장질환의 치료에 있어서 프로바이오틱스를 이용한 예방 및 개선에 대하여 많은 연구가 이루어지고 있다. 프로바이오틱스 (Probiotics)는 WHO/FAO의 정의에 따르면, “적당량 섭취 시 숙주에게 건강상 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물”이라고 알려져 있으며 국내 건강기능식품 기준에 따르면 주로 유산균으로 구성되어 있다. Herias M. V. 등은 DSS (Dextran sulfate sodium)로 궤양성 대장염 (UC, Ulcerative colitis)을 일으킨 다음 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus case)를 투여하였을 때 염증이 줄어드는 것으로 보고하였으며, Ghouri Y. A. 등은 IBD 환자에게 프로바이오틱스와 프리바이오틱스, 신바이오틱스를 투여하였던 다양한 연구들에 대하여 review 형식으로 정리한 바 있다.
장관 내 존재하는 면역 세포들은 자극 혹은 스트레스를 받게 되면, 다양한 염증성 사이토카인 (Cytokine, 세포 전달 물질)을 분비하게 되며 이를 통해 염증반응이 일어나게 된다. 유산균을 대표로 하는 많은 프로바이오틱스들은 이러한 염증성 사이토카인의 발현 억제를 통하여 염증을 완화시키는 것으로 알려져 있다.
다만 현재까지 알려진 수많은 장내 염증 예방을 위한 프로바이오틱스들은 주로 외국의 전통식품 유래 혹은 분변 유래 유산균으로 알려져 있으며, 이들의 대부분은 동물성 유산균에 해당한다. 대표적인 예로 우유발효 유산균이 있으며, 동물성 유산균(우유발효 유산균)은 배지 영양분으로 탄수화물과 함께 단백질, 지방 등을 사용한다. 따라서 장시간의 발효과정에서 단백질과 지방에 의해 부패하는 균주의 수가 증가하는 단점이 있다.
또한 장 건강을 위한 제품의 경우엔 주로 발효물로 첨가하거나 건강기능식품용 분말로 첨가하는 경우가 많았다.
그러나, 한국의 전통발효식품인 김치로부터 분리된 식물성 유산균을 일반 소비자가 쉽게 접근할 수 있는 식품에 첨가하여 장내 염증 예방 효과를 극대화 할 수 있는 연구는 미진한 실정이다.
1. M.V. Herias, J.F. Koninkx, J.G. Vos, J.H. Huis in't Veld, J.E. van Dijk., Probiotic effects of Lactobacillus casei on DSS-induced ulcerative colitis in mice, Int J Food Microbiol 103 (2005) 143-155.
2. Y.A. Ghouri, D.M. Richards, E.F. Rahimi, J.T. Krill, K.A. Jelinek, A.W. DuPont, Systematic review of randomized controlled trials of probiotics, prebiotics, and synbiotics in inflammatory bowel disease, Clin Exp Gastroenterol 7 (2014) 473-487.
이에 본 발명의 발명자들은 전통발효식품인 김치로부터 분리한 식물성 유산균을 이용하여 한국인에 적합한 유산균 제품으로 적용하고자 연구하였다.
본 발명자들은 특허 등록된 2종의 식물성 유산균을 우유 및 발효유와 함께 첨가하였을 때의 장내 염증 예방효과를 검증하고, 이 유산균 혼합 우유와 발효유를 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명의 일측면은, LB-9 복합 유산균을 유효성분으로 포함하고, 상기 LB-9 복합 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주를 포함하는, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주는 기탁번호가 KCCM11598P인 균주이며, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주는 기탁번호가 KCCM11696P인 균주인, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 LB-9 복합 유산균은 LLP5193 및 LLP5273 균주의 생균수가 10:1 내지 1:10인, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 장내 염증 예방 또는 경감용 우유는 우유 전체 부피(ml)에 대하여 상기 LB-9 복합 유산균이 1.0x10^6 CFU/ml 이상 포함되어 있는, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, LB-9 복합 유산균을 유효성분으로 포함하고, 상기 LB-9 복합 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주를 포함하는, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주는 기탁번호가 KCCM11598P인 균주이며, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주는 기탁번호가 KCCM11696P인 균주인, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 발효유는 발효유 전체 중량에 대하여 LB-9 복합 유산균 분말이 0.1중량% 이상으로 포함된, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 어느 하나의 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유의 제조 방법에 있어서, 발효유 제조용 스타터 균을 우유에 첨가하는 단계; 스타터 균이 첨가된 우유를 발효시키는 단계; 및 상기 발효된 우유에 LB-9 복합 유산균을 첨가하여 혼합하는 단계;를 포함하는 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 발효시키는 단계는 40℃ 내지 45℃의 온도조건에서 4시간 내지 12 시간 동안 발효하는 것인, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 발효시키는 단계는 최종 pH가 3.5 내지 4.5 이고, 스타터 균수가 1.0x10^8 CFU/ml 이상이 될 때까지 발효하는 것인, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 우유 또는 본 발명의 다른 측면에 따른 발효유는 한국인의 체질에 맞는 식물성 복합 유산균을 유효성분으로 포함하여, 한국인의 장내 환경에 적합한 우유 또는 발효유를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 우유 또는 본 발명의 다른 측면에 따른 발효유는 식물성 유산균의 장내 도달력이 우수하다.
본 발명의 일 측면에 따른 우유 또는 본 발명의 다른 측면에 따른 발효유는 장관세포 부착능이 뛰어나 장내에서 안정적으로 정착할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 우유 또는 본 발명의 다른 측면에 따른 발효유는 장내 염증 예방 또는 경감 효과가 우수하다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명에서 사용한 2종의 유산균과 2종을 혼합한 LB-9 복합 유산균의 인공위액, 인공장액 및 장관세포 부착률을 측정한 결과이다.
도 2는 LB-9 복합 유산균과 형광염색용액인 Rhodamine 123을 혼합하여 쥐에게 급여한 다음, 형광현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험 진행 방법을 표현한 그림이다.
도 4는 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험 중 체중 감소율을 초기 대비 비율로 나타낸 결과이다.
도 5는 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 해부하여 각 실험군마다의 장 길이를 측정한 결과이다.
도 6은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 해부하여 각 실험군마다 대장조직의 조직학적 관찰 결과이다.
도 7은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 각 실험군마다 염증성 세포 침윤을 측정한 결과이며, Ly6에 대한 분석 결과이다.
도 8은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 각 실험군마다 염증성 세포 침윤을 측정한 결과이며, CD11b에 대한 분석 결과이다.
도 9는 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 각 실험군마다 세포 사멸 정도를 측정하고자 TUNEL assay를 수행한 결과이다.
도 10은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 실험군 내 단백질 종류별 발현량을 Western blot을 통하여 측정한 결과이다.
도 11은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 실험군 내 단백질 종류별 발현량을 Western blot을 통하여 측정한 결과를 객관적인 수치화하여 비교한 결과이다.
도 12는 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 실험군 내 단백질 종류별 발현량에 대한 Western blot 측정 및 수치화 분석 결과를 토대로 세포 사멸 기작을 유추한 모식도이다.
도 2는 LB-9 복합 유산균과 형광염색용액인 Rhodamine 123을 혼합하여 쥐에게 급여한 다음, 형광현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험 진행 방법을 표현한 그림이다.
도 4는 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험 중 체중 감소율을 초기 대비 비율로 나타낸 결과이다.
도 5는 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 해부하여 각 실험군마다의 장 길이를 측정한 결과이다.
도 6은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 해부하여 각 실험군마다 대장조직의 조직학적 관찰 결과이다.
도 7은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 각 실험군마다 염증성 세포 침윤을 측정한 결과이며, Ly6에 대한 분석 결과이다.
도 8은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 각 실험군마다 염증성 세포 침윤을 측정한 결과이며, CD11b에 대한 분석 결과이다.
도 9는 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 각 실험군마다 세포 사멸 정도를 측정하고자 TUNEL assay를 수행한 결과이다.
도 10은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 실험군 내 단백질 종류별 발현량을 Western blot을 통하여 측정한 결과이다.
도 11은 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 실험군 내 단백질 종류별 발현량을 Western blot을 통하여 측정한 결과를 객관적인 수치화하여 비교한 결과이다.
도 12는 LB-9 복합 유산균과 이 유산균을 넣은 우유 및 발효유 제품의 대장염 예방 효과를 검증하기 위한 동물실험이 종료된 후 실험군 내 단백질 종류별 발현량에 대한 Western blot 측정 및 수치화 분석 결과를 토대로 세포 사멸 기작을 유추한 모식도이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
일반적으로 우유에서 유래된 균주 혹은 발효유에서 유래된 균주를 동물성 식품인 유제품에 첨가하는 것은 충분히 예상 가능하지만, 보통 이러한 유산균을 우유에 첨가하게 되면 발효과정이 일어나게 되어 발효유가 되어 우유인 채로 유지시키기 위해선 별도의 공정이 추가되어야한다. 그러나 식물성 유산균, 특히 본 발명에 사용된 식물성 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주의 경우 우유에 첨가하고 약 4주간 보관하여도 발효가 되지 않았으며 이는 우유에 있는 탄소원 (유당 등) 이용성이 매우 낮은 이유인 것으로 추정된다.
또한 본 발명에 사용된 식물성 유산균인 락토발실러스 플랜타럼 LLP5193 균주는 내산성, 내담즙성 및 장관세포 부착능이 다소 우수한 균주이다.
그러나, 본 발명에 사용된 식물성 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주는 내산성, 내답증성 및 장관세포 부착능에 대한 효과에 대하여 전혀 알려지지 않았으며, 등록특허인 10-1683686 에서는 담즙산 분해능 및 간 세포 내 HMG-CoA 환원효소 활성 억제능이 우수하다는 점만이 개시되어 있을 뿐이다. 상기와 같은 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주의 장 도달력 및 장내 염증 예방 효과에 대하여는 전혀 개시가 없으며, 본 기술분야의 통상의 기술자는 상기 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273를 장 도달력 및 장내 염증 예방 효과를 위해 사용하는 것을 전혀 예상하기 어려울 것이다. 또한, 식물성 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273를 동물성 식품인 유제품에 첨가하여 상기 장도달력과 장내 염증 예방 효과가 향상된 유제품을 예상하는 것은 전혀 예상하기 어려울 것이다.
본 발명의 발명자들은 이와 같은 특이적인 유산균인 락토발실러스 플랜타럼 LLP5193 균주와 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주를 우유 또는 발효유에 첨가하여, 특정 생리활성 기능인 장 도달력이 우수하고 장내 염증 예방 효과가 향상된 우유 및 발효유에 대한 연구를 하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명은 식물성 유산균인 락토발실러스 플랜타럼 LLP5193 균주와 락토바실러스 플랜타럼 LLP5273 균주를 우유 또는 발효유에 첨가하여, 유산균의 장 도달력이 우수하고 장내 염증 예방 효과가 향상된 우유 및 발효유를 제공하고자 한다.
이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.
본 발명의 일측면은, LB-9 복합 유산균을 유효성분으로 포함하고, 상기 LB-9 복합 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주를 포함하는, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주는 기탁번호가 KCCM11598P인 균주이며, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주는 기탁번호가 KCCM11696P인 균주인, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 LB-9 복합 유산균은 LLP5193 및 LLP5273 균주의 생균수가 10:1 내지 1:10인, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유를 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 장내 염증 예방 또는 경감용 우유는 우유 전체 부피(ml)에 대하여 상기 LB-9 복합 유산균이 1.0x10^6 CFU/ml 이상 포함되어 있는, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, LB-9 복합 유산균을 유효성분으로 포함하고, 상기 LB-9 복합 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주를 포함하는, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주는 기탁번호가 KCCM11598P인 균주이며, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주는 기탁번호가 KCCM11696P인 균주인, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 발효유는 발효유 전체 중량에 대하여 LB-9 복합 유산균 분말이 0.1중량% 이상으로 포함된, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 어느 하나의 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유의 제조 방법에 있어서, 발효유 제조용 스타터 균을 우유에 첨가하는 단계; 스타터 균이 첨가된 우유를 발효시키는 단계; 및 상기 발효된 우유에 LB-9 복합 유산균을 첨가하여 혼합하는 단계;를 포함하는 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 발효시키는 단계는 40℃ 내지 45℃의 온도조건에서 4시간 내지 12 시간 동안 발효하는 것인, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 발효시키는 단계는 최종 pH가 3.5 내지 4.5 이고, 스타터 균수가 1.0x10^8 CFU/ml 이상이 될 때까지 발효하는 것인, 장내 염증 예방 또는 경감용 발효유의 제조 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다.
실시예 1 - 엘비나인 (LB-9) 복합 유산균의 제조
본 발명자들이 기존에 발명하여 특허등록된 2종의 유산균 락토바실러스 플랜타럼 LLP5193과 LLP5273을 (주)메디오젠 (Mediogen co. Ltd., 제천, 충청북도, 한국)에 의뢰하여 발효 및 동결건조를 거친 다음 분말로 제조하였다. 각각의 유산균 분말은 g당 생균수 기준 1.5 x 10^11 CFU/g으로 제조한 다음, 분석된 생균수를 기준하여 혼합하여 1.0 x 10^11 CFU/g의 복합 유산균 분말로 제조하였고, 이를 엘비나인 (LB-9) 복합 유산균이라 명명하였다.
실시예 2 - 엘비나인 (LB-9) 복합 유산균의 인공소화액 안정성 측정
2종의 유산균이 인공소화액, 즉 위액과 장액을 거쳤을 때의 안정성을 측정하고자 하였으며 이를 통하여 LB-9 유산균을 실제 섭취하였을 때 장에 도달할 수 있는지 예측하고자 하였다. 인공위액은 0.1M 인산염완충액 (sodium phosphate buffer)를 10% 황산 (H2SO4)를 이용하여 pH가 2.5가 되게 조정한 다음 autoclave (121℃, 20분)한 다음, 60℃이하로 식히고 나서 pepsin (Pepsin from porcine gastric mucosa, Sigma, 미국)을 180U/ml 되게 첨가하여 주었다. 인공장액 역시 인공위액과 유사하게 0.1M 인산염완충액 (sodium phosphate buffer)를 이용하였으며, 소 유래 담즙산 (Oxgall, Sigma, 미국)을 0.3% 되게 첨가한 다음 pH 6.8±0.2로 조정하여 autoclave ((121℃, 20분) 하였다. Autoclave 후 60℃이하로 식히고 나서 pancreatin (Pancreatin from porcine pancreas, Sigma, 미국)을 180U/ml 되게 첨가하여 인공장액을 완성하였다.
LLP5193과 LLP5273 유산균 2종과 이 유산균을 혼합한 LB-9 복합 유산균 분말 각각 1g씩 채취한 다음, 각각 인공위액과 인공장액 20ml씩에 투여하였다. 투여시점을 기준하여 1시간 간격으로 3시간까지 1ml씩 시료를 채취하여 다단희석법 및 도말법을 이용하여 생균수를 분석하였으며, 이를 통하여 0, 1, 2, 3까지의 생균수 안정성을 측정하였다. 인공위액 및 장액에 대한 생존율 실험을 위한 대조군으로 사용하고자 ATCC로부터 락토바실러스 람노서스 ATCC53103을 분양받았으며, 분양받은 균주 역시 동일하게 메디오젠에 의뢰하여 1.5 x 10^11 CFU/g 이상의 분말로 제조하였으며 동일한 방법에 따라 생존율을 측정하였다. 본 발명에서 인공위액과 인공장액에 대한 생존율은 (pH 처리 후 생균수 / 초기 생균수 x 100)으로 산출하였다.
인공위액에 대한 생존율 측정 결과는 표 1에, 인공장액에 대한 생존율 측정결과는 표 2에 나타내었다.
| 시간 | ATCC53103 | LLP5193 | LLP5273 | LB-9 | ||||
| CFU/ml | 생존율(%) | CFU/ml | 생존율(%) | CFU/ml | 생존율(%) | CFU/ml | 생존율(%) | |
| 0 | 1.18x1011 | - | 1.31x1011 | - | 1.28x1011 | - | 1.18x1011 | - |
| 1 | 1.16x1011 | 98.3 | 1.29x1011 | 98.5 | 1.08x1011 | 84.4 | 1.16x1011 | 97.2 |
| 2 | 1.13x1011 | 95.8 | 1.24x1011 | 94.7 | 1.06x1011 | 82.8 | 1.13x1011 | 91.7 |
| 3 | 1.13x1011 | 95.7 | 1.22x1011 | 92.7 | 1.02x1011 | 79.1 | 1.13x1011 | 87.7 |
| 시간 | ATCC53103 | LLP5193 | LLP5273 | LB-9 | ||||
| CFU/ml | 생존율(%) | CFU/ml | 생존율(%) | CFU/ml | 생존율(%) | CFU/ml | 생존율(%) | |
| 0 | 1.24x1011 | - | 1.19x1011 | - | 1.31x1011 | - | 1.15x1011 | - |
| 1 | 1.01x1011 | 81.5 | 1.15x1011 | 96.6 | 1.32x1011 | 100.8 | 1.14x1011 | 99.1 |
| 2 | 9.20x1010 | 74.2 | 1.17x1011 | 98.3 | 1.27x1011 | 96.9 | 1.12x1011 | 97.4 |
| 3 | 6.60x1010 | 53.2 | 1.16x1011 | 97.5 | 1.25x1011 | 95.4 | 1.11x1011 | 96.5 |
상기의 결과에 나타낸 것처럼, L. rhamnosus ATCC53101의 경우 인공위액에서는 95.7%로 가장 높은 생존율을 나타내었으나, 인공장액에서 다른 균주에 비하여 매우 낮은 53.2%의 생존율을 보였다.
LLP5193과 LLP5273의 경우, 각각 92.7%와 79.1%로 서로 다른 생존율을 보였으나, 인공장액에서는 생존율에서 큰 차이를 보이지 않았다.
두 가지 유산균을 혼합하여 제조한 LB-9 복합 유산균의 경우 인공위액 생존율 87.7%, 인공장액 생존율 96.5%를 보였다.
실시예 3 - 엘비나인 (LB-9) 복합 유산균의 장관세포 부착능 측정
유산균이 장까지 전달되어도 장관세포에 부착되지 않으면 그대로 유실되어 버리기 때문에 제대로 효과를 발휘할 수 없다. 따라서 세포 부착능 역시 내산성 및 내담즙성 못지 않게 매우 중요한 특성으로 알려져 있다.
따라서 대조군인 L. rhamnosus ATCC53103을 비롯하여 L. plantarum LLP5193과 LLP5273, 그리고 이 2종의 유산균을 혼합한 LB-9 복합 유산균의 장관세포 부착능을 측정하고자 하였다.
장관세포는 한국세포주은행 (KCLB, Korean Cell Line Bank)에서 분양받은 카코-2(Caco-2, 30030.1) 세포를 이용하였으며 6-웰 플레이트(6-well plate)에 2x105 cells/ml 농도로 접종한 뒤, 37℃, 5% CO2 조건을 유지하는 배양기에서 약 15일간 배양하여 단층(monolayer)을 형성한 것을 사용하였다.
유산균 4종을 MRS 액상배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, 원심분리(8,000rpm, 10분)하여 균체를 회수한 다음, 인산완충액(Potassium phosphate buffer)을 첨가하여 균주 현탁액을 준비하였다. 상기 유산균 현탁액을 카코-2 세포가 들어있는 6-웰 플레이트에 1㎖ 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 인산완충액으로 3회 반복하여 세척하였다.
반응이 종료된 6-웰 플레이트에 MRS 액상배지 2㎖을 첨가한 후 멸균된 스크래퍼(Scraper)를 이용하여 카코-2 세포와 균주를 긁어내었다. 이를 10㎖ 튜브에 옮긴 뒤 멸균 식염수를 이용하여 다단 희석하였다. 적정 배수의 희석액 0.1㎖를 MRS평판배지에 접종한 뒤, 37℃에서 48시간 배양하였다. MRS 평판배지 상에 배양된 콜로니 수를 확인하여 균수를 측정하였다.
균주의 최초 균체농도와 장관부착 반응 이후의 균체농도를 각각 측정하여 부착률(반응 후 균체농도 / 최초 균체농도)을 확인하였으며 표 3에 유산균 4종에 대한 측정 결과를 나타내었다.
| 유산균 | 생균수 (CFU/ml) | 부착률(%) | |
| 균주 투여 | 균주 부착 | ||
| L. rhamnosus ATCC53103 | 2.81x109 | 2.13x109 | 75.8 |
| L. plantarum LLP5193 | 3.30x109 | 2.20x109 | 66.7 |
| L. plantarum LLP5273 | 2.94x109 | 2.21x109 | 75.2 |
| LB-9 복합 유산균 | 1.31x109 | 9.30x108 | 71.0 |
3종의 유산균 즉, L. rhamnosus ATCC53103, L. plantarum LLP5193과 LLP5273에 대한 장관세포 부착률을 측정한 결과 3종 간에는 뚜렷하게 유의적인 차이는 확인되지 않았으나 LLP5193만이 다른 유산균들에 비하여 다소 낮은 부착률을 보였다.
실시예 2에서 확인 인공위액과 인공장액에서의 생존율 결과와 상기 장관세포 부착률 측정 결과를 토대로 도 1과 같이 최종 체내전달률을 예측하였다.
도 1에서 보는 것과 같이, 3종의 균주와 LB-9 복합 유산균의 최종 체내전달률은 ATCC53103이 38.6%, LLP5193이 60.2%, LLP5273이 56.8% 그리고 LB-9 이 60.2%로 예측되었다.
특히 ATCC53103의 경우, 인공위액에서 생존율이 가장 높았으나 인공장액에서의 생존율이 낮았던 이유로 인해 가장 낮은 체내전달률을 보였다. 반면 LLP5193과 LLP5273의 경우 56.8%~60.2%의 전달률을 나타내었다.
실시예 4 - 엘비나인 (LB-9) 복합 유산균의 장내 도달 관찰
LB-9 유산균이 실제로 장에 도달하는지를 육안으로 확인하기 위하여, 형광 이미지를 촬영하였다. LB-9 복합 유산균을 MRS broth에 각각 배양하고 혼합한 다음, 세포막 투과성 형광염색용액인 Rhodamine 123 (Sigma-Aldrich, 미국)을 0.05μg/ml 농도로 투여하고 1시간 동안 반응시켜 주었다. 반응 후 배양액을 12주령된 쥐에게 투여하여 주었고, 투여 시점을 기준하여 4시간 후 형광형미경을 이용하여 쥐 내부에 전달된 LB-9 유산균을 관찰하였다.
관찰 결과는 도 2에 나타내었으며, 개복 전과 후를 구분하여 촬영하였고 장내 분포된 LB-9 유산균 농도별로 시각화하여 농도가 높을수록 짙은 색의 적색으로 표시하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이 해부 전과 해부 후 모두 높은 농도의 LB-9 유산균이 체내에 전달된 것으로 보이며, 특히 해부 후 형광이미지의 경우, 실제 쥐의 장 조직에 고르게 분포되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 5 - LLP5193, LLP5273 및 LB-9 복합 유산균을 첨가한 우유의 발효 여부 확인
유산균을 우유 제품으로 제공하고자 하는 경우 유산균 첨가에 따라 발효과정이 일어나지 않아야 한다. 만약, 발효과정이 일어나게 되면 우유인 채로 유지시켜야 하기 때문에 별도의 공정이 추가되어야 하는 문제가 발생한다. 따라서, 본 발명의 유산균 균주를 우유에 첨가하였을 때 발효가 되는지의 여부를 curd의 형성 유무로 확인하였다.
본 발명 균주인 LLP5193, LLP5273 및 LR-9 균주를 대상으로 우유에 첨가한 경우의 curd 형성 유무를 확인하였다. 롯데푸드 파스퇴르로부터 생산된 우유 750ml에 해당 균주를 10^7 CFU/ml 의 양으로 해당 균주를 첨가하였고, 10℃보관하면서, 21일 간 curd의 형성 유무를 확인하였다. 대조군으로 하기 표 4와 같은 균주를 대조군으로 하여 상기와 동일하게 curd를 형성하는 지 확인하였다.
실험결과는 하기 표 4와 같았다.
표 4는 보관기간에 따른 Curd 형성 유무이다. (O: Curd형성함, X: Curd형성하지 않음, 10℃보관)
| 균주 | 보관기간(일) | ||||||
| 0 | 2 | 3 | 5 | 7 | 14 | 21 | |
| L. plantarum LLP5193 | X | X | X | X | X | X | X |
| L. plantarum LLP5273 | X | X | X | X | X | X | X |
| LB-9(LLP5193+5273) | X | X | X | X | X | X | X |
| L. rhamnosus ATCC53103 | X | X | X | O | O | O | O |
| S. thermophilus MG510 | X | X | O | O | O | O | O |
| L. acidophilus ATCC314 | X | X | X | O | O | O | O |
상기 표 4에서와 같이 본원발명의 균주는 우유에 첨가시 curd를 형성하지 않았으므로, 유산균이 첨가된 우유 제품으로 제공하기에 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6 - LB-9 복합 유산균을 첨가한 우유 및 발효유 제조
LB-9 복합 유산균이 첨가된 우유의 경우엔, 롯데푸드 파스퇴르로부터 생산된 우유 750ml에 LB-9 복합 유산균이 10억 CFU/750ml, 즉 ml당 생균수가 1.3x10^6 CFU/ml 이상 되게 첨가하여 제조하였다.
LB-9 복합 유산균 발효유의 경우엔 발효유 제조용 스타터를 이용하여 먼저 발효유를 만든 다음, LB-9 복합 유산균 분말을 투여하였다. 즉, 우유 중량 대비하여 크리스챤 한센의 ABT-5를 0.01 중량% 첨가한 다음 42℃에서 8시간 발효하여 발효유를 제조하였으며 이 때의 최종 pH는 3.9, 유산균수는 3.5x10^8 CFU/ml인것으로 확인되었다. 제조된 발효유에 LB-9 복합 유산균 분말을 중량 대비하여 0.2% 첨가한 다음 혼합하여 주어 LB-9 복합 유산균 발효유를 완성하였다.
실시예 7 - 대장염 유도 모델을 이용한 장 건강 및 면역 기능성 확인
LB-9 복합 유산균과 이 유산균이 첨가된 제품의 대장염 기능성을 검증하기 위하여 도 3과 같은 실험 프로세스에 따라 표 4와 같이 실험군을 구성하여 실험을 진행하였다.
실험동물은 실험군마다 12마리씩 진행하였으며, 초기 실험군 편성 시 약 1주간의 적응기간을 거쳐 연령, 무게, 질병 증상 등을 동일하게 한 후 진행하였다. 처음 1주일 간은 PBS와 LB-9 유산균 등 시료만을 투여하였으며, 진행 8일차부터 DSS (Dextran sulfate sodium)을 음용수에 3% 되게 혼합한 다음 급여하여 인위적으로 대장염을 유도하여 주었다. 총 14일 간의 급여가 끝난 후 분변 상태 확인 및 해부 후 조직 검사를 통하여 실험군간의 대장염 증상 정도를 비교하였으며, 특히 해부 후 대장 길이 측정, 조직학적 검사, 염증성 세포 침윤 및 세포 사멸 기작 등을 확인하였다.
| 실험군 | 투여시료 | ||
| 대장염유발 | 처리시료 | ||
| 일반 대조군 | X | PBs | |
| 대장염 | 대조군 | Dextran sulfate sodium 3% (음용수 혼합 급여) |
PBS |
| 일반 우유 | |||
| 유산균 | LB-9 유산균 분말 (1.0 x 109 CFU/1일) |
||
| LB-9 우유 (1.0 x 106 CFU/1일) |
|||
| LB-9 발효유(1.0 x 106 CFU/1일) | |||
(1) 대장염 유도 후 체중 감소량
3% DSS에 의한 대장염 유도 이후 매일 1회씩 실험동물의 체중을 측정하였으며, 측정 기간의 체중감소량을 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 것처럼, 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 체중 감소가 발생하지 않았으며, 실험기간 동안 매일 약 0.5~4% 정도 체중이 증가한 것으로 확인되었다.
반면 DSS만을 처리한 경우엔 5일 이후 체중이 감소하는 것으로 확인되었으며 6일차엔 9% 이상 체중이 줄어든 것으로 나타났다. 또한 DSS를 처리하고, 일반 우유를 급여한 경우 DSS만을 유도한 실험군에 비하여 다소 낮긴 하지만 역시 6일차에 약 5% 정도의 체중감소가 확인되었다. 이는 일반 우유만으로도 대장염을 다소 예방할 수 있다는 선행연구들과 유사한 결과가 나타난 것으로 확인된다.
LB-9 유산균을 넣은 제품 즉, 분말과 우유, 발효유의 경우 6일차 체중감소량이 약 2~3% 정도로 DSS만을 처리한 실험군 및 우유만을 넣은 실험군에 비하여 다소 낮은 체중감소량으로 나타났으며 분말이 다소 높기는 하였으나, 큰 유의차가 나타나지는 않았다.
(2) 대장 길이 비교
7일간의 대장염 유도 후 실험동물을 해부하여 장 길이를 측정하였다. 이는 일반적으로 장이 길게 형성될수록 소화흡수에 매우 유리하여 결국 건강한 장 환경 조성확률이 높다고 알려져 있는 결과를 확인하고자 하였다.
대조군 및 LB-9 유산균을 투여한 실험군의 장 길이 비교 결과는 도 5에 나타내었다. 결과에 나타낸 것처럼 대조군, 즉 대장염을 유도하지 않은 실험군에서 가장 장 길이가 길게 형성된 것으로 나타났으며, 다른 5가지 실험군에서는 크게 유의적인 차이가 확인되지는 않았다. 다만 경향성만을 비교하였을 땐, DSS만을 투여한 대조군이 가장 짧았고 그 다음으로 대조군-우유, LB-9 분말, LB-9 우유, Lb-9 발효유의 순서로 장 길이가 길어지는 것으로 확인되었다.
(3) 조직학적 관찰
급여 실험이 종료된 후 실험동물을 해부하여 대장 조직의 절편을 제작한 다음 장 내부의 구조 변화를 확인하여 도 6에 나타내었다.
일반 대조군의 경우, 빈 공간이 많지 않고 내부 융모 역시 촘촘한 행태로 잘 형성되어 있는 반면 대조군 DSS의 경우, 융모가 파괴된 형태이며 내부 공간 역시 많이 비어 있는 것으로 나타났다. 반면 LB-9 유산균과 LB-9 발효유의 경우엔 대조군과 유사한 수준을 유지하고 있었으며, 특히 LB-9 발효유에서 더 우수한 조직형태를 확인하였다.
(4) 염증성 세포 침윤
백혈구와 대식 세포 자료를 통해 DSS 투여 및 대장염 유발에 따른 염증성 세포 침윤 정도를 확인하였다. 대식 세포 지표로는 Ly6, CD11b를 측정하였으며 DAPI를 이용하여 형광 염색 후 형광현미경 관찰을 통하여 염색된 발광 정도를 비교하였다.
측정 결과는 도 7과 도 8에 나타내었으며, 도 7의 경우 LB-9 우유를 섭취하였을 경우 백혈구 침윤이 다른 실험군에 비하여 적게 일어나는 경향을 확인할 수 있었다. 도 8은 CD11b를 염색하여 측정한 결과이며 LB-9 분말과 LB-9 발효유에서 가장 적은 대식 세포 침윤을 확인할 수 있었다.
(5) 세포 사멸 기작
DNA 파편의 지표 (Terminal deoxy-nucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL) 분석을 통해 세포 사멸 정도를 확인하여 도 9에 나타내었다.
도 9의 결과에 나타낸 것처럼, LB-9 유산균 분말과 LB-9 우유에서 세포 사멸이 유의적으로 적게 일어난 것을 확인하였으며 LB-9 발효유 역시 DSS 대조군에 비하여서는 다소 낮은 수준의 세포 사멸이 일어난 것으로 확인되었다.
도 9의 결과를 바탕으로 세포 사멸 기작을 확인하고자 하였으며, Western blot을 통하여 세포 사멸 기작에 관여하는 단백질의 발현 정도를 측정하였다.
도 10은 세포 사멸에 관여하는 단백질 종류별 발현량을 Western blot을 통하여 측정한 결과이고, 도 11은 도 10에서 측정된 단백질을 객관적인 수치화하여 나타낸 결과이다.
도 10과 11에 나타낸 것처럼, LB-9 유산균과 LB-9 우유를 섭취한 실험군에서 p-ERK의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며 이 결과를 토대로 상기 세포 사멸 경로를 예상하면 도 12와 같이, p-IkB, p-p65로 이어지는 염증성 싸이토카인 경로에 관여하는 p-ERK의 발현을 감소시킴으로써 결과적으로 p-p65 감소를 유도시키는 것으로 추정된다. 감소된 p-p65는 결국 FAS/FADD 혹은 Bax, Bcl-2를 감소시킴으로서 세포 사멸 역시 감소시키는 것으로 추정된다.
결과적으로 DSS를 처리하면 장 상피 세포 내에서의 p-IKK 혹은 IkB 분해에 대한 유도를 증가시키고 결국 capsase-3까지 이어져 세포 사멸을 증가시키는 것으로 추정되나, LB-9 유산균 혹은 LB-9 우유가 관련 경로에 관여하는 p-ERK 발현을 억제시킴으로써 결국 세포 사멸을 억제하는 것으로 보인다.
Claims (10)
- 장내 염증 예방 또는 경감용 우유에 있어서,
상기 우유는 유효성분으로서 LB-9 복합 유산균을 우유 전체 부피(ml)에 대하여 1.0x10^7 CFU/ml 의 양으로 포함되고,
상기 LB-9 복합 유산균은 김치로부터 분리한, 수탁번호 KCCM11598P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5193 균주 및 수탁번호 KCCM11696P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) LLP5273 균주의 생균수가 2:1 내지 1:2의 비율로 포함하며,
0 내지 21일 동안 보관시 커드(curd)를 형성하지 않는, 장내 염증 예방 또는 경감용 우유.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |