KR101614145B1

KR101614145B1 - 토마토 추출물을 포함하는 유청배지 제조 및 유산균의 배양

Info

Publication number: KR101614145B1
Application number: KR1020130094385A
Authority: KR
Inventors: 윤성식; 강승범
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2013-08-08
Filing date: 2013-08-08
Publication date: 2016-04-20
Also published as: KR20150018013A

Abstract

본 발명은 토마토 추출물을 포함하는 배지 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명을 통하여 제조된 배지는 종래의 배지조성이 복잡하고 고가인 배지를 대체하여 저렴하게 미생물 또는 유산균을 배양할 수 있을 것이다.

Description

토마토 추출물을 포함하는 유청배지 제조 및 유산균의 배양{Preparation of the whey-based medium supplementing tomato extracts and cultivation of lactic acid bacteria thereof}

본 발명은 토마토 추출물을 포함하는 배지 및 이의 용도에 관한 것이다.

김치의 발효과정 중에 작용하는 다양한 미생물인 Weissella속, Leuconostoc속, Lactobacillus속 등의 유산균이 관여하여 숙성을 담당한다. 최근 연구에 따르면 유산균 프로바이오틱스는 호흡기 및 알러지 반응의 개선, 면역기능 향상, 항생제 투여로 인한 부작용 등에 대항하며, 병원성 미생물의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한 유산균은 콜레스테롤을 낮추는 기능(Huang Y. et al., 2013)와 , 암 예방 효과(Kumar. M, 2010), 유당불내증 치료(Saltzman J. R., 1999) 등 많은 연구가 이루어지고 있다. 최근들어 유산균의 면역 증진효과를 구명하려는 연구들이 크게 활성화되고 있다.

최근 국내외에서 웰빙식품의 수요가 증가함에 따라 산업체에서 건강기능성식품 개발에 많은 노력을 기울이고 있다. 그 중 프로바이오틱스 유산균을 이용한 미생물제제나 건강기능성식품의 개발이 늘어나는 추세를 보이고 있다. 특히 발효유나 유산균 음료는 대부분 프로바이오틱스를 사용하고 있다. 따라서, 프로바이오틱스의 대량배양 기술 개발이 필수적이다. 유산균을 배양하는 기본배지는 대체로 MRS배지를 사용하고 있다(De man et al, 1960). MRS배지는 유산균이 잘 자라는 배지이지만 배지조성이 복잡하고 비싸기 때문에 식용의 유산균 배양용 배지의 개발이 시급하다.

따라서, 본 발명은 다양한 김치에서 유산균을 분리동정하고, 프로바이오틱스 기능과 면역활성능력을 확인하며, 상기 유산균을 배양할 수 있는 저렴한 배지를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 토마토 추출물을 포함하는 미생물 배양용 배지를 제공하는데 목적이 있다. 보다 자세하게는 전체 배지 중량에 대하여, 토마토 추출액 10-20 중량부, 유청분말 20-30 중량부, 알칼라아제 0.05-0.2 중량부, 효모 추출물 5-15 중량부, 구연산 암모늄 1-3 중량부, 유화제 0.1-1.5 중량부, 및 MgSO₄ 0.01-0.5 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 전체 배지 중량에 대하여, 유청분말 20-30 중량부, 알칼라아제 0.05-0.2 중량부, 효모 추출물 5-15 중량부 및 구연산 암모늄 1-3 중량부, 유화제 0.1-1.5 중량부, 및 MgSO₄ 0.01-0.5 중량부를 혼합하여 미생물 배양용 배지를 제조하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명에서, 사이토카인은 백혈구간 정보 전달 언어이며 단핵구에서 분비되는 사이토카인을 모노카인(monokine), 임파구에서 분비되는 사이토카인을 임포카인(lymphokine)이라고 한다. 이때, 사이토카인과 인터루킨은 동의어로 사용된다. 백혈구에서 분비되는 사이토카인은 백혈구 세포 사이를 중개하는 생리 활성물질이기 때문에 사이를 의미하는 INTER와 백혈구의 백을 의미하는 LEU, 그리고 활성물질을 의미하는 KIN을 이어 인터루킨이라고 부른다. 아미노산 배열구조가 결정되면 인터루킨 뒤에 번호를 붙인다. 현재 IL-1에서 IL-19까지 있다. 인터루킨에 속하면서도 원래 이름을 그대로 사용하는 것이 있다.

특히, 본 발명에서, IL-1은 T세포를 활성화시키고, B세포를 분화증식시키며, NK 세포 작용을 항진시키므로, 면역강화효과를 유발할 수 있다. 본 발명에서, 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor:TNF)는 TNF 알파(Cachectin)의 경우, 활성화된 대식 세포에서 분비되고, TNF 베타(Lymphotoxin)의 경우 활성화된 T 세포에서 분비된다. TNF는 암세포를 죽일 뿐 아니라 정상세포에도 작용하여 식 세포의 세균 살해, T 세포의 활성 그리고 B 세포의 항체 생산을 위한 보조 인자로 작용한다. 즉, 이외에 TNF의 기능은 뇌의 발열 중추를 자극하여 열이 나도록 하고, 임파구를 포함한 면역 세포 활성화시키며, 수면, 통증, 식욕 조절하는 생리 작용을 한다.

본 발명에서 사용되는 "면역강화 (약학/식품) 조성물"이라는 용어는 대체적으로, 생체적합적 물질인 담체, 및 상기 담체 상에서 운반되는 항원 또는 항원-유도 물질, 및 원하는 경우, 추가로 하기에 기술되는 면역조절 물질 및/또는 하나 이상의 약학적 첨가제를 함유하는 조성물 또는 조제를 의미한다(한국 등록특허 10-0574216 참조). 본 발명의 면역강화 조성물에 의해서 강화되는 "면역 반응"은 상기 조성물 내에 함유된 항원, 또는 여기에 함유된 유도인자에 의해 유도된 항원에 특이적 면역 반응이다. 활성화되는 면역 반응은 체액 면역, 점막 면역 또는 세포성 면역, 또는 이들 의 조합일 수 있다. "항원"이라는 용어는, 항원으로부터 유래되는 항원-항체 반응을 유도할 수 있는 한, 어떠한 특정한 종에 국한되지 않는다. 일반적으로, 인간 또는 인간 이외의 포유류 또는 조류 질병의 예방 및/또는 치료에 효과적인 항체가 생성되는 항원들 중에서 선택된다.

본 발명에서, "면역조절 물질 (면역활성화, 면역자극 또는 면역조절 활성을 갖는 물질)" 은 임의의 특정 종에 국한되지 않으나, 특히, 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 보조 펩티드 및 DNA 서열, 명반, 프로인트 완전 보조액, 프로인트 불완전 보조액, 이스컴, 사포닌, 헥사데실아민, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, 애브리딘(Abridin), 세포벽 골격 성분, 콜레라 독소, 리포폴리사카리드 내독소, 사이토카인-함유 리포좀 및 월터 리드 리포좀-함유 리포좀, 1,25-디히드록시바이타민 D3, 및 카르복 실비닐 중합체, 알기닌 및 염화나트륨 유래의 겔화물을 들 수 있다. "사이토카인" 은 면역활성화 활성을 갖는한 임의의 특정종에 한정되지 않으며, 이에는 특히, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8,IL-12, TNF-α, TNF-β및 GM-CSF 가 포함된다. 예컨대, 면역강화 조성물 투여 부위 주위에 면역적격 세포의 축적, 및 항체 생성의 후속향상이 요구되는 경우, IL-1β및 IL-2 가 특히 바람직하다.

본 발명의 면역강화 조성물의 형태 또는 모양은, 예컨대, 용액형, 현탁액형, 겔형, 필름형, 스폰지형, 막대 또는 바형 또는 입자형의 형태일 수 있다. 적합한 형태를 선택하여 면역반응을 좀더 효과적으로 유도할 수 있다. 막대형 형태가 바람직하

다. EP 659,406 에 기재된 것과 같은 코팅되었거나 피복된 막대형 제제가 좀더 특히 바람직하다.

본 발명의 면역강화 조성물을 투여하는 방법에 특별한 제한을 두지는 않으나, 이에는 비경구투여, 경구투여, 비강 및/또는 폐로의 투여, 압축공기를 이용한 주사 및 절개부위에서의 포매(embeding) 또는 보존이 포함된다. 바람직한 투여 방법은

면역 반응이 좀더 효과적으로 유도될 수 있는 방식으로 면역강화 조성물의 형태에 따라 선택될 수 있다. 막대 또는 바형 조성물의 경우에는, 비경구투여 또는 절개부위에서의 보존이 바람직하나, 입자의 경우에서는, 보존을 위한 절개부위에 직접

적으로 적용하거나, 또는 일본 특허공보 (고코쿠) 03-72046 에 기재된 바와 같이 주사용 용매내에 입자를 현탁시켜 제조한 현탁액의 형태로 비경구투여하거나, 또는 문헌 [Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 93, 6291-6296 (1996)] 에 기재된 파워 건 또는 [Helios Gene Gun System(Bio-Rad)]를 이용하여 압축공기로 주사 (shooting) 투여할 수 있다.

일 구체예에서, 토마토 추출물을 포함하는 미생물 배양용 배지를 제공한다. 상기 구체예에서, 토마토 추출물은 토마토 주스를 여과 및 멸균하여 수득한 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공하고, 미생물 배양용 배지는 유청 분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공하며, 미생물 배양용 배지는 알칼라아제, 효모 추출물, 구연산 암모늄, 유화제 및 MgSO₄를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공하며, 미생물은 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P)인 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공한다.

일 구체예에서, 전체 배지 중량에 대하여, 토마토 추출액 10-20 중량부, 유청분말 20-30 중량부, 알칼라아제 0.05-0.2 중량부, 효모 추출물 5-15 중량부, 구연산 암모늄 1-3 중량부, 유화제 0.1-1.5 중량부, 및 MgSO₄ 0.01-0.5 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공한다. 상기 구체예에서,

토마토 추출액 20 중량부, 유청분말 25 중량부, 알칼라아제 0.1 중량부, 효모 추출물 10 중량부, 구연산 암모늄 2 중량부, 유화제 1.0 중량부, 및 MgSO₄ 0.05 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공하고, 유화제는 레시친인 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공하며, 유화제는 레시친인 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공하며, 미생물은 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P)인 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제공한다.

일 구체예에서, 전체 배지 중량에 대하여, 유청분말 20-30 중량부, 알칼라아제 0.05-0.2 중량부, 효모 추출물 5-15 중량부 및 구연산 암모늄 1-3 중량부, 유화제 0.1-1.5 중량부, 및 MgSO₄ 0.01-0.5 중량부를 혼합하여 미생물 배양용 배지를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 토마토 추출액을 추가로 첨가하는 미생물 배양용 배지를 제조하는 방법을 제공하고, 미생물은 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P)인 것을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, IL-1 알파를 생산량이 증가된 락토바실러스 플랜타룸을 제공한다. 또한, 상기 구체예에서, 락토바실러스 플랜타룸은 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸을 제공하고, 세포 생존율이 증가된 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸을 제공하며, TNF-알파의 생산량이 증가된 락토바실러스 플랜타룸을 제공한다.

본 발명에서 “토마토 추출물”은 토마토 분쇄물을 일정의 필터 용지로 여과하고, 일정시간동안 100℃이상의 고온 처리하여 멸균 처리한 것으로 토마토를 알콜 또는 이에 상응하는 용매로 추출한 것을 의미한지는 않는다.

재료 및 배지

본 발명에서 유산균의 분리와 계대배양을 위하여 MRS 배지(Difco, USA)를 이용하여 MRS 액체배지(Broth)와 MRS 한천배지(MRS 액체배지 + 1.5% 한천)를 만들어 사용하였다. 그람 양성균을 선택적으로 분리하기 위하여 소듐 아자이드(Sigma, USA)를 사용하였고(Liasi, S. A. et al, 2009), 분리균주의 산생성능을 확인하기 위하여 BCP (bromocresol purple, Sigma, USA)를 사용하였다(Bettache, G. et al, 2012).

유청배지를 제조하기 위하여 (주)삼익유가공에서 제공받은 유청분말을 이용하였다. 유청을 가수분해 하기 위하여 알칼라아제를 사용하였고 첨가제로 효모 추출물 (Taekyung food, Korea)과 구연산 암모늄(Shinyo pure chemicals, Japan)를 사용하였다(Song, T. S., 2011). 제조방법과 조성은 하기 표 1(Composition of whey-based medium for the growth of lactic acid bacteria (송태석, 2011))에 나타내었다.

유청 분말(Samik dairy co., Korea)	25 g
알칼라아제(Novozyme, Denmark)	0.1 g
효모 추출물(Taekyung food, Korea)	10 g
구연산 암모늄(Shinyo pure chemicals, Japan)	2 g
Distilled water(total)	1 L
* pH는 7.0로 조정

미생물 분리용 시료

유산균을 분리하기 위하여 김치를 구매하거나 수집하였다. 배추김치, 무김치, 파김치, 동치미, 백김치 등을 시중 음식점과 실험실 연구원으로부터 수집하여 4℃에 보존하면서 분리발명에 사용하였다. 시료는 생리식염수에 현탁하여 Stomacher (Homogenius, MAYO)를 이용하여 김치에 부착된 미생물을 떼어내고 희석하여 사용하였다(유광원 등, 2012).

유산균의 탐색 및 동정

유산균주의 분리방법

유산균의 분리하기 위하여 김치, 발효식품 등의 시료를 채취하여 분리하였다. 샘플 10g을 0.85% NaCl 용액에 순차적으로 십진 희석한 샘플을 BCP (0.1g/L, Yakuri pure chemicals co.)와 소듐 아자이드 (0.1g/L, Sigma)가 함유된 MRS 한천에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 콜로니 형태 및 그람 염색을 통해 1차적으로 유산균주를 분리하였다. BCP는 중성에서 보라색을 띄고 있지만 산성에서는 노랗게 변화하여 산생성 확인에 사용되고, 소듐 아자이드는 그람음성균을 증식을 억제한다. 하기 표 2는 변형된 MRS 배지의 조성이다.

조성물	함량 (g/L)
Dextrose	20.0
Protease peptone	10.0
Beef extract	10.0
효모 추출물	5.0
Sodium acetate	5.0
구연산 암모늄	2.0
Polysorbate 80	1.0
Magnesium sulfate	0.1
Manganese sulfate	0.05
Dipotassium phosphate	2.0
Agar	15.0
Bromocresol purple	0.1
소듐 아자이드	0.1

* pH는 6.5에 조정

유산균 분리주의 면역활성

유산균 시료의 제조

유산균 분리주를 24시간 배양 후 1ml씩 EP 튜브에 분주하여 원심분리기(vision 15000 CFNⅡ)를 이용하여 펠렛을 제외한 상등액을 제거하였다. 상등액 제거 후 생리 식염수를 이용하여 2번 세척 후 세포의 pH와 삼투압을 보호해주는 용액인 Hanks balanced salt solution(HBSS, Sigma)를 증류수와 1:9로 희석한 것을 펠렛과 혼합 후 80℃로 조정한 수욕조를 이용하여 30분간 열처리를 함으로써 유산균을 사멸시켰다(De Souza, B. D., 2010). 각 시료를 HBSS로 적당하게 희석하여 균체 농도가 0.1(OD @610㎚)이 되도록 조절하였다.

공시 대식세포주( RAW 264.7)의 준비

RAW 264.7 세포는 사이토카인을 분비하는 마우스 유래 대식세포이며 면역활성 측정에 널리 이용되며 활성화가 용이하여 현미경상으로 확인이 가능하다(Raschke W. C. et al., 1978). 연세대학교 분자약리학연구실에서 분양받아서 사용하였다. RAW 264.7 cell은 10% 불활성화시킨 Fetal bovine serum(FBS, Sigma, USA), Penicillin-streptomycin(Sigma, USA)를 첨가한 Dulbeccos modified Eagles minimal essential medium(DMEM, Sigma, USA) low glucose에서 배양하였다. 세포가 페트리 디쉬에 부착하여 배양되는 것을 현미경으로 관찰하고 3-4일 간격으로 계대배양을 하여 사용하였다.

세포 생존율 분석(Cell viability 측정법)

세포 생존율(cell viability)은 MTT 측정법을 이용하여 확인하였다. 분리한 유산균주의 세포에 대한 독성 측정은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetraxolium bromide(MTT, Sigma) 측정으로 분석하였다(Jin C. Y. et al,. 2007). MTT 측정법은 MTT가 탈수소 효소 작용으로 인해 포르마잔으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. 200,000 세포/ml의 RAW 264.7 세포를 180㎕씩 분주하고 미생물시료를 20㎕씩 처리하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 3일 배양하였다. 배양 후 MTT solution(2-5㎎/㎖, Sigma)을 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4시간 동안 처리하고 MTT solution을 제거하여 DMSO(Dimethyl sulfoxide, Sigma)를 100㎕씩 첨가한다. DMSO를 처리하는 이유는 포르마잔은 물에 녹지 않게 때문에 흡광도를 측정하려면 DMSO로 녹여야한다(Twentyman, P. R., 1987). DMSO 첨가 후, 30분 동안 rocker에서 흔들어 준 다음 @540㎚ 파장으로 OD값을 측정하여 비교하였다.

효소면역법(Enzyme-linked immunosorbent 측정법:ELISA)

MTT 측정법 결과에서 유산균 시료를 선택하였다. Sandwich ELISA는 1차 항체는 plate에 먼저 코팅하고 측정하고자 하는 시료를 처리하여 항체에 붙인다. 효소에 반응하는 2차 항체를 처리하고 효소를 통해 발색시킨다. 황산을 이용해 효소의 반응을 정지시켜 흡광도를 확인하여 분비량을 측정한다(John, R. C., 2000). ELISA kit는 Komabiotech의 EzWay^TM pink-ONE 사이토카인 ELISA Kit를 사용하여 TNF-α와 IL-1 α를 측정하였다. Microplate reader(Multiskan FC, Thermo)로 @450nm 파장을 이용하여 OD값을 측정하여 비교하였다.

유산균 분리주의 동정

유산균 분리주의 생화학적 동정

유산균 분리주를 당 이용성을 알아보기 위하여 API 50 CH kit(Biomerieux, France)를 사용하였다. 유산균 분리주를 MRS 한천에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 형성된 콜로니를 무균적으로 취하여 API CHL 배지에 현탁하고, API 50 CH kit 스트립에 분주하고 미네랄 오일을 첨가하여 혐기성 조건을 만든 후 37℃에서 48시간동안 배양하여 당이용 패턴을 확인하였다.

유산균 분리주의 유전학적 동정

유산균 분리주의 게놈 DNA의 추출은 5㎖ MRS 액체배지에서 37℃로 하루동안 미호기적 배양한 세포로부터 Silica 겔 멤브레인법(Dneasy Tissue Kit, Qiagen)을 이용하여 추출하였다. 배양한 균체를 1㎖를 EP 튜브에 분주하여 5,000×g에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하고 생리식염수를 이용하여 여러번 세척 후 20 ㎎/㎖ 라이소자임 완충액으로 현탁하였다. 37℃ 항온수로에서 30분 방치한 후 25 ㎕ 단백질 ㅂ부분해효소 K와 200㎕ AL 완충액를 순서대로 첨가하여 현탁한 다음 56℃ 항온수조에 30분간 방치하였다. 이 후부터는 DNA 티슈 키트 방법을 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 PCR 마스터 믹스와 27 정방향 프라이머(AGAGTTTGATCMTGGCT CAG), 1492 역방향 프라이머(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)를 이용하여 PTC 100™(MJ research inc)로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 최초 변성과정을 거친 뒤 94℃에서 1분동안 변성, 48℃에서 1분간 프라이머 붙이기, 72℃에서 1분간 DNA 연장을 30회 반복한 뒤 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 DNA 연장을 진행하였다. PCR한 DNA를 수탁업체(Cosmogenetech, Korea)에 16S rRNA 서열분석을 의뢰하여 실행하였으며 염기서열 분석은 Applied Biosystems Automatic Sequencer ABI 3730xlApplied를 이용하였다. 염기서열의 상동성 검사는 GenBank database의 정보를 대상으로 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLAST에 의해 실행하였다.

유산균 분리주의 프로바이오틱 특성

항생제 감수성

면역활성을 확인한 유산균 분리주의 항생제 감수성 발명을 하기 위하여 BBL BD사의 항생제 disk를 사용하였다. 항생제 종류로는 Ampicillin(10㎍), Streptomycin (10㎍), Gentamycin(10㎍), Erythromycin(15㎍), Tetraoxycycline (30㎍), Neomycin (30㎍), Colistin(10㎍)을 사용하였다. 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양한 유산균을 MRS 소프트 한천에 잘 섞어 중층 배양한 후 항생제 디스크를 조심스럽게 올려놓고 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하여 클리어 존(clear zone)을 확인하였다(김현주, 2004).

내산성과 내담즙성

유산균 분리주의 내산성을 확인하기 위하여 인공위액을 제조하였다. 인공위액은 MRS 액체배지에 1% Pepsin(Sigma, USA)을 첨가하고 pH를 2.5, 3.0, 4.0으로 HCl을 이용하여 제조하였다. MRS 액체배지에 FBT215를 37℃ 인큐베이터에 24시간 배양한 것을 원심분리하여 상등액을 제거하고 생리 식염수를 이용하여 2회 세척 후 동량의 인공위액을 첨가하여 1시간 간격으로 3시간동안 배양한 것을 십진희석하고 도말하여 유산균의 생존 콜로니수를 확인하였다(Jin. L. Z., 1998). 장내 분비된 담즙에 의해 미생물이 억제되거나 사멸된다. 프로바이오틱스의 기능을 가지려면 장내 담즙농도보다 높은 농도의 옥스갤(oxgall) 첨가 배지에서 견뎌야한다. 그래서 옥스갤이 0.3% 정도 함유된 배지에서 증식할 수 있을 정도의 내성을 가지고 있어야 한다(Gilliland. S. E. et al., 1984). 내담즙성 발명을 위해 MRS 액체배지에 0.3%의 옥스갤(Oxoid)을 첨가하여 배지를 제조하였다. 인공위액에서 2시간동안 처리된 유산균을 원심분리를 통해 인공위액을 제거하고 동량의 옥스갤이 첨가된 MRS 액체배지를 넣어 3시간 간격으로 생존 콜로니수를 확인하였다.

BSH 검출법

BSH의 기능은 결합된 담즙 염을 분리시키는 촉매작용을 한다. 결합된 담즙 염은 식이지방의 유화와 마이셀 형성에서 비결합 분자보다 더 효율적이다. 그렇기 때문에 유산균이 생성하는 BSH가 담즙 염을 분해해서 체내에 흡수할 수 없게 만든다. 그래서 유산균 분리주의 BSH(담즙 염 hydrolase) 활성을 확인하기 위하여 평판 검출법을 변형하여 발명하였다. 유산균을 MRS 액체배지에 배양한 것을 0.5%(w/v) taurodeoxycholic acid(TDCA, Sigma)와 0.035%(w/v) CaCl₂(Yakuri pure chemicals co, Japan)를 첨가한 MRS 한천에 스트리킹하였다. 혐기성 용기(Unaerobic jar)를 이용하여 37℃ 인큐베이터에 5일동안 배양하여 유산균 콜로니 주변의 불투명한 환을 확인하였다(Dashkevicz, M. 1989).

Bacteriocin 활성 측정

유산균 분리주가 생성하는 물질 중에 병원성미생물의 증식을 억제하는 효과가 있는 지에 대하여 확인하는 발명이다. 우선 MRS 액체배지에 24시간 배양한 분리유산균을 원심분리하여 상등액을 얻어내었다. 유산균이 배양되는 동안 생산한 젖산이 병원성미생물의 증식을 억제할 수 있기 때문에 1N NaOH로 pH 7.0으로 조절하고 진공농축기를 이용하여 10배 농축하였다(Kilic. A. O. et al, 1996). 지시균인 병원성 미생물인 E.coli O157 ATCC35150, Staphylococcus aureus ATCC25923, Listeria monocytogenes KCCM40307를 BHI 액체배지에 24시간동안 37℃, 200rpm의 진탕 인큐베이터로 배양한 후 BHI 연한 한천배지와 BHI 한천배지를 이용하여 증층배양하고 페이퍼 디스크(paper disk)법으로 유산균 배양산물의 증식억제 효과를 확인하였다.

API ZYM kit 를 이용한 효소 활성 측정

API ZYM Kit(Biomerieux)를 사용하여 20개의 효소 활성을 측정하였다. API ZYM kit는 특정미생물이 생산하는 효소를 색의 변화로 확인 가능한 kit이다. 유산균 분리주를 생리 식염수로 10⁵ CFU/ml 정도로 희석하여 스트립에 65㎕씩 접종하였다. 접종한 것을 37℃ 인큐베이터에 4시간 배양한 후 ZYM A와 ZYM B를 한방울씩 적가하였다. 최소 5분을 기다린 뒤 색의 변화를 확인하였다.

유산균 분리주의 대량배양

유산균 분리주의 배양( DCW , DNS , pH 측정)

유청배지 및 MRS 액체배지를 100ml씩 제조하고 유산균 분리주를 MRS 액체배지 5ml에 접종하여 24시간 37℃ 인큐베이터에 배양하여 10⁸ cfu/ml 이상의 배양액을 준비하였다. 제조한 배지에 유산균 배양액을 1%씩 접종하여 24시간동안 배양하였다. 접종한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양하면서 시간별로 일정량을 취하여 건조균체량(DCW)와 pH변화를 측정하였다. 그리고 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)법을 이용하여 배지의 환원당을 정량하였다. DNS법은 DNS와 Rochelle염으로 발색하여 흡광도를 측정하는 당정량법이다. (식품영양발명핸드북, 2000)

유청배지의 조성 변경

유청배지는 동물성 유산균의 배양에 맞춰진 조성으로 식물성 유산균이 자랄 수 있게 배지조성의 변화가 필요하였다. 유산균이 증식하기 위해서는 당과 단백질, 여러 미량원소, 비타민 등이 필요하다. 토마토에는 lycopene, provitamin A, ascorbic acid, vitamin E, folate, flavonoids, potassium 등의 성분을 함유하고 있다(Di Cagno, R. et al, 2009). 당과 비타민 등을 보충해 줄 수 있는 시판용 토마토주스(Woongjin, Korea)를 첨가하였다. 토마토주스를 0.45㎛ 필터 종이를 사용하는 감암여과기로 여과하고, 멸균기에서 121℃ 15분간 멸균을 하여 추출액을 얻어내어 함량별(1L 기준으로 0-20 부피%, 즉 0 내지 200g)로 유청배지에 첨가하여 비교발명을 하였다. 비교발명을 통하여 가장 증식능력이 좋은 조성을 N. B(2012)의 자료를 토대로 유화제인 Lecithin(0-1g/L, Duksan, Korea) 과 MgSO₄(0-0.05g/L, Junsei, Japan)와 조합하여 변형유청배지를 제조하였다(도 1 및 표 1 참조). 조성을 바꾼 유청배지를 이용하여 유산균 분리주를 배양하여 건조균체량와 환원당량, pH를 측정하였다.

본 발명을 통하여 제조된 배지는 종래의 배지조성이 복잡하고 값 비싼 배지를 대체하여 저렴하게 미생물 또는 유산균을 배양할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 일 구체예로 목적하는 미생물을 탐색을 위한 배지의 제조에 대한 개괄도이다.
도 2은 본 발명의 일 구체예의 탐색된 미생물이 생산한 Il-1알파의 농도이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예의 탐색된 미생물의 동정을 위해 blast 결과이다.
도 4은 본 발명의 일 구체예의 탐색된 미생물을 배양하고, 건조중량을 측정한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구체예의 탐색된 미생물을 배양하고, 환원당의 농도 변화를 표시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구체예의 탐색된 미생물을 배양하고, 610 nm에서의 흡광도를 측정한 결과이다.

이제 본 발명을 첨부된 도면 및 실시예를 참조로 하여 좀더 상세히 설명할 것이다. 그러나, 하기의 설명은 단지 예시하기 위한 것일 뿐 상술한 본 발명의 대요에 제한을 가하는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다.

실시예 1. 유산균 탐색 및 동정

유산균 분리

유산균을 분리하기 위하여 김치 시료를 채취하여 샘플 10g을 생리식염수에 순차적으로 십진 희석하였다. 십진 희석한 샘플을 BCP (0.1g/L)와 소듐 아자이드 (0.1g/L)가 함유된 MRS 한천에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 결과 BCP를 노랗게 변화시키는 20가지의 콜로니를 얻어내었다. 이 콜로니를 MRS 액체배지에 배양하고 50% 글리세롤과 배양액을 1:1로 혼합하여 영하 70℃ 저온 냉동고(Ilsin, Korea)에 보관하였다.

유산균 분리주의 생화학적 동정

면역활성을 확인한 FBT215를 동정하기 위하여 API 50 CH 키트를 사용하였다. FBT215를 MRS 한천에 스트리킹하여 콜로니를 얻어내어 CHL 배지에 잘 희석하여 스트립에 넣어 48시간동안 37℃ 인큐베이터에 배양한 뒤 확인하였다. 당 이용성을 조사한 결과 L-arabinose, ribose, galactose, glucose, fructose, mannose, mannitol, sorbitol, N-acetyl-glucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, cellobiose, maltose, lactose, melibiose, sucrose, trehalose, melezitose, gentiobiose, D-turanose, gluconate 등의 당에 대한 이용성이 양호하였다(표 3 참조). 99.4%의 확률로서 Lactobacillus plantarum으로 최종 동정되었다.

Carbohydrates	FBT215	Carbohydrates	FBT215
대조군	-	Esculin	+
Glycerol	-	Salicin	+
Erythritol	-	Cellobiose	+
D-Arabinose	-	Maltose	+
L-Arabinose	+	Lactose	+
Ribose	+	Melibiose	+
D-Xylose	-	Sucrose	+
L-Xylose	-	Trehalose	+
Adonitol	-	Inulin	-
β-Methyl-D-xylose	-	Melezitose	+
Galactose	+	Raffinose	-
Glucose	+	Strach	-
Fructose	+	Glycogen	-
Mannose	+	Xylitol	-
Sorbose	-	Gentiobiose	+
Rhamnose	-	D-Turanose	+
Dulcitol	-	D-Lyxose	-
Inositol	-	D-Tagatose	-
Mannitol	+	D-Fucose	-
Sorbitol	+	L-Fucose	-
a-Methyl-D-Mannoside	-	D-Arabitol	-
a-Methyl-D-glucoside	-	L-Arabitol	-
N-Acetyl-glucosamine	+	Gluconate	+
Amygdalin	+	2-Keto-gluconate	-
Arbutin	+	5-Ketogluconate	-

+, positive; -, negative

FBT215 의 유전학적 동정

Lactobacillus plantarum FBT215의 유전학적 동정을 위하여 16S ribosomal RNA를 분석하였다. 먼저 FBT 215의 게놈 DNA를 추출하고 PCR 프리믹스와 27 정방향 프라이머(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492 역방향 프라이머 (TACGGYTACCTTGTTACGACTT)를 이용하여 PCR을 하였다. 수탁업체(코스모진텍)에 16s rRNA 서열분석을 의뢰하여 염기서열 분석하였다. 염기서열의 상동성 검사는 GenBank database의 정보를 대상으로 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLAST에 의해 실행하였다(도 3 참조). Lactobacillus plantarum KCC-3과 동정 확률이 98% (1423/1450)가 나왔다.

실시예 2. 유산균 분리주의 면역활성 및 프로바이오틱 특성

세포 생존율 측정

분리한 유산균 20주로 MTT 검출법을 3회 반복 발명하였다. 마우스 유래 대식세포인 264.7 세포를 이용하여 확인한 결과 대조군의 생존율을 100%로 생각할 때 FBT208과 FBT215는 120%가 넘는 생존율을 보였고 FBT202과 FBT217 대조군보다 높은 생존율을 보였다. 그리고 FBT203, FBT211, FBT220의 3주가 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다.

유산균 분리주의 효소면역 활성

MTT 검출법 후 확인된 7개의 균주를 이용하여 마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포를 배양하였다. ELISA 키트를 통하여 TNF-α와 lL-1 α의 생성능을 비교 확인하였다. TNF-α는 FBT 202가 1105.3±30.5 pg/ml로 가장 높았고, lL-1α는 FBT215가 676.9±22.2 pg/ml로 가장 높았다. 종합적으로 FBT215가 사이토카인 생성능이 가장 좋은 것으로 확인되었다(도 2 참조)

FBT215 주의 프로바이오틱 특성

항생제 감수성

항생제 감수성을 확인하기 위하여 MRS 연한 한천에 Lactobacillus plantarum FBT215를 접종하여 MRS 한천에 중층한 뒤 항생제 paper disk(BBL™ Sensi-Disc™ , BD, USA)를 사용하여 항생제 감수성을 확인하였다. 7종의 항생제(Ampicillin, Streptomycin, Gentamycin, Erythromycin, Tetraoxycycline, Neomycin, Colistin 중 Colistin을 제외한 모든 항생제에 감수성을 가지고 있었다. Colistin에 대한 내성을 가지고 있는데, Colistin은 그람 음성균에 감수성을 가지고 있으므로 L. plantarum FBT215가 그람 양성균이라는 것을 알 수 있었다.

내산성과 내담즙성

FBT215의 내산성을 확인하기 위하여 인공위액을 제조하고 pH를 2.5, 3.0, 4.0으로 조절하여 실험하였다. 각 pH 조건의 인공위액에서 배양한 FBT215는 시간별로 생균수가 줄어들긴 했으나 대체적으로 산성에 잘 견디는 것을 확인할 수 있었다. 내담즙성을 확인하기 위하여 인공위액에 2시간 동안 처리하고 0.3%의 옥스겔을 첨가한 MRS 브포쓰로 배지를 교체하였다. FBT215는 담즙이 들어간 배지에서 3시간 정도 증식하였으나 그 후로 담즙의 영향을 받아 생균수의 양이 감소하는 것을 확인하였다.

BSH 활성

FBT215를 0.5%(w/v) taurodeoxycholic acid(TDCA)와 0.035%(w/v) CaCl₂를 첨가한 MRS 한천에 스트리킹하여 확인할 수 있다. FBT215의 콜리니 주변에 불투명한 환이 생성된 것을 확인하여, 담즙 분해효소가 있는 것으로 확인하였다.

Bacteriocin 활성

분리유산균의 상등액을 분리하여 pH를 중성으로 조절하고 40℃에서 10배 농축하였다. 농축한 상등액을 paper disk법을 이용하여 병원성 세균의 증식억제를 확인한 결과, E. coli O157 ATCC35150와 Staphylococcus aureus ATCC25923, Listeria monocytogenes KCCM40307를 억제하지 못하는 것을 확인하였다. L. plantarum FBT215는 병원성 세균의 증식을 억제할 수 있는 물질을 생산하지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

API ZYM kit를 이용한 효소 활성

효소활성은 프로바이오틱 균주를 선택하는데 중요한 역할을 한다. Lactobacillus plantarum FBT 215는 luecin arylamidase, valine arylamidase, acid phosphate, naphtol-AS-BI-phosphohydrolase, β-Galactosidase, α-Glucodiase, β-Glucodiase 등 총 7개의 효소활성을 보였다(표 4 참조).

Enzyme	FBT215	LP1
대조군	-	-
Alkaline phosphatase	-	-
Esterase	-	-
Esterase lipase	-	-
Lipase	-	-
Leucin arylamidase	+	+
Valine arylamidase	+	+
Crystine arylamidase	-	-
Trypsin	-	-
a-Chymotrypsin	-	-
Acid phosphate	+	+
Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase	+	+
a-Galactosidase	-	-
β-Galactosidase	+	+
β-Glucuronidase	-	-
a-Glucodiase	+	+
β-Glucodiase	+	+
N-Acetyl-β-glucosaminidase	-	-
a-Mannosidase	-	-
a-Fucosidase	-	-

+, positive; -, negative

실시예 3. FBT215 의 대량배양

유청배지와 MRS 배지 비교 실험

MRS와 유청배지에서 Lactobacillus plantarum FBT215의 증식능을 확인하였다. 각 배지에서 24시간동안 배양하고 하였다. 시간별로 pH, DNS환원당(g/L), 건조균체량(DCW, g/L)를 측정하여 비교하였다. 건조균체량는 2배 이상의 차이를 보였고(도 4 참조), pH의 변화는 비슷한 양상을 보였다. 배지의 초기 환원당량은 MRS가 유청배지의 2배 이상 많았고, FBT215의 배지 이용능력이 MRS에서 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 그러므로 유청배지 조성의 변화가 필요하다는 것을 확인하였다.

변형 유청배지의 배양

기본 유청배지에 토마토 주스 추출액을 함량별로 첨가하여 비교실험을 하였다. 토마토 주스 추출액을 20% 첨가한 배지에서 FBT215가 가장 잘 증식하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 토마토 주스 추출액 20%를 첨가한 유청배지에 레시틴(Lecithin)과 MgSO₄를 첨가하여 변형 유청배지를 제조하였다. L. plantarum FBT215를 변형 유청배지와 MRS를 이용하여 비교배양한 결과 MRS와 변형 유청배지가 비슷한 패턴으로 증식하는 것을 확인하였다(도 6 참조).

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11426P

20130612

Claims

전체 배지 중량에 대하여, 토마토 추출액 10-20 중량부, 유청분말 20-30 중량부, 알칼라아제 0.05-0.2 중량부, 효모 추출물 5-15 중량부, 구연산 암모늄 1-3 중량부, 유화제 0.1-1.5 중량부, 및 MgSO₄ 0.01-0.5 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P) 배양용 배지.
제 1항에 있어서,
토마토 추출액은 토마토 주스를 0.45㎛ 필터 종이로 여과하고, 121℃ 15분간 멸균한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P) 배양용 배지.
제 1항에 있어서,
토마토 추출액 20 중량부, 유청분말 25 중량부, 알칼라아제 0.1 중량부, 효모 추출물 10 중량부, 구연산 암모늄 2 중량부, 유화제 1.0 중량부, 및 MgSO₄ 0.05 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P) 배양용 배지.
제 1항에 있어서,
유화제는 레시친인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P) 배양용 배지.
전체 배지 중량에 대하여, 유청분말 20-30 중량부, 알칼라아제 0.05-0.2 중량부, 효모 추출물 5-15 중량부 및 구연산 암모늄 1-3 중량부, 유화제 0.1-1.5 중량부, 및 MgSO₄ 0.01-0.5 중량부를 혼합하고, 토마토 추출액 10-20 중량부를 추가로 첨가하여 락토바실러스 플랜타룸 FBT 215(KCCM11426P) 배양용 배지를 제조하는 방법.
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