TWI743277B - 用於促進膽固醇分解之植物乳桿菌及包含該植物乳桿菌之組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供一種新穎的植物乳桿菌,其係用於促進膽固醇分解、抑制泡沫細胞形成以及預防動脈粥狀硬化形成之用途。
Description
本發明提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),特別係一種用於促進膽固醇分解之植物乳桿菌。
隨著飲食的西化及精緻度提升,造成現代人常有高膽固醇的問題,而高膽固醇體質容易引起高血壓、動脈硬化、心肌梗塞等心血管疾病。2008年,台灣十大死因的第二與第三位分別為心臟疾病與腦血管疾病。心臟疾病或腦血管疾病都是由許多因素交互作用所導致,這些因子包括高血壓、高血脂症、吸菸、肥胖症以及遺傳因素等。研究顯示動脈粥狀硬化(atherosclerosis)是這些血管疾病最主要的致病因素。動脈粥狀硬化是一種好發於動脈的慢性發炎疾病,由脂肪、結締組織、低密度脂蛋白及壞死的發炎細胞於血管內沉積形成血栓,使得動脈狹窄,動脈壁變硬變厚且失去彈性,造成臨床急性心血管疾病或中風的發生。
動脈粥狀硬化的研究已經指出,高血壓、糖尿病、肥胖、抽菸以及高膽固醇等都是重要的心血管危險因素,其中膽固醇可細分為高密度脂肪酸、低密度脂肪酸以及三酸甘油脂。而減少造成心血管疾病的危險因子可以大大的降低心血管疾病的發生率。戒菸、多運動以維持理想體重、服用藥物控制
血壓與血糖等,都是有效的預防方法。經常性的有氧運動加上健康的飲食習慣,可以改善血液中高密度與低密度脂蛋白的組成比例。維持血液總膽固醇濃度低於150mg/dL,亦能有效的消除罹患冠狀動脈性心臟病(coronary artery heart disease,CHD)的風險。因此,在注重養身保健、追求長壽生活品質的現代生活方式,以天然物作為日常保健食品來減少罹患冠狀動脈性心臟病風險,是一個逐漸流行的趨勢。
有鑑於此,本發明提供一種用於促進膽固醇分解之植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),其寄存編號為BCRC910805。
本發明另提供一種用於促進膽固醇分解之組合物,包含如本發明之植物乳桿菌以及一添加劑。
本發明又提供一種本發明之植物乳桿菌用於促進膽固醇分解之用途。
本發明又提供一種本發明之植物乳桿菌用於抑制泡沫細胞形成之用途。
本發明再提供本發明之植物乳桿菌用於製備促進膽固醇分解的藥物之用途。
在本發明之一實施例中,其中該促進膽固醇分解係為提升膽固醇分解基因表現量,且該膽固醇分解基因係為膽固醇酯轉運蛋白(cholesterol ester transfer protein,CETP)基因、低密度脂蛋白膽固醇接受器(LDL receptor,LDLR)基因、天門冬胺酸蛋白酶1(aspartic proteinase 1,APA1)基因或ATP結合盒蛋白1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)基因。
在本發明之一實施例中,其中該藥物進一步包含一醫藥上可接受之載體。
在本發明之一實施例中,其中該藥物係為一溶液、一明膠膠囊、一軟膠囊或一錠劑之型式。
在本發明之一實施例中,其中該藥物係經由口服方式給予。
本發明提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)TCI028用於促進膽固醇分解、抑制泡沫細胞形成以及預防動脈粥狀硬化形成的用途。因此,本發明所提供之植物乳桿菌TCI028為一種預防、治療心血管疾病的新策略。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式,下述所列舉的實施例係用以闡明本發明,並非用以限定本發明之範圍,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可做些許更動與潤飾,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係為本發明之植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)TCI028體外試管模擬促進膽固醇分解效果之數據圖。
圖2係為本發明之植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)TCI028對抑制泡沫細胞形成的油紅O染色(oil-red O stain)分析之影像圖及數據圖。與空白組比較:##p值<0.01;與oxLDL+LPS組比較**p值<0.01、***p值<0.001。
圖3係為本發明之植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)TCI028促進膽固醇酯轉運蛋白(cholesterol ester transfer protein,CETP)基因、低密度脂蛋白膽固醇接受器(LDL receptor,LDLR)基因、天門冬胺酸蛋白酶1(aspartic proteinase 1,APA1)基因以及ATP結合盒蛋白1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)基因表現量之數據圖。*p值<0.05、**p值<0.01、***p值<0.001。
植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)是一種能促進良好的消化健康的益生菌株(probiotic bacteria)。本發明一新穎之植物乳酸桿菌,本文命名為TCI028,於民國106年12月13日寄存於食品工業發展研究所,寄存編號BCRC 910805。本發明經由生化試管試驗證實植物乳酸桿菌TCI028可降低71%膽固醇;經由細胞實驗證實植物乳酸桿菌TCI 028可抑制泡沫細胞之形成,以及預防動脈粥狀硬化之形成;經由調節膽固醇酯轉運蛋白(cholesterol ester transfer protein,CETP)、低密度脂蛋白膽固醇接受器(LDL receptor,LDLR)、ATP結合盒蛋1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)以及天門冬胺酸蛋白酶1(aspartic proteinase 1,APA1)基因表現,以提升膽固醇代謝,促進高密度脂蛋白膽固醇生成。顯示本發明之植物乳酸桿菌TCI028能對促進膽固醇分解、抑制泡沫細胞形成以及預防動脈粥狀硬化形成之功效,可製成有預防或治療心血管疾病之乳製品、飲食補充物、醫藥組合物、保養品或食品。
使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示,個此之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。
如於本文中所使用數值為近似值,所有實驗數據皆表示在20%的範圍內,較佳為在10%的範圍內,最佳為在5%的範圍內。
本發明以體外試管模擬植物乳桿菌TCI028降低膽固醇之測試。首先,將植物乳桿菌培養TCI028於添加150ppm膽固醇的MRS培養基(包含10g/L蛋白腖3號、10g/L牛肉萃取物、5g/L酵母菌萃取物、20g/L葡萄糖、80g/L聚山梨酸酯、2g/L檸檬酸銨、5g/L醋酸鈉、0.1g/L硫酸鎂、0.05g/L硫酸
錳、2g/L磷酸二鉀;本發明另以從泡菜篩選植物乳桿菌L105菌株作為對照組,未添加任何菌株的MRS培養基為空白組。上述組別皆於37℃培養24小時之後,以5000rpm離心10分鐘,取上清液;使用膽固醇定量檢測試劑盒(cholesterol quantitation kit)(Sigma-Aldrich公司,美國)依據廠商的操作手冊進行膽固醇含量檢測。
結果如圖1所示,相較於空白組,本案植物乳桿菌TCI028可大幅下降膽固醇含量71%,較同屬同種之植物乳桿菌L105下降48%的膽固醇高出49%。顯示本案植物乳桿菌TCI028具有優異的促進膽固醇分解之功效。
由於已知泡沫細胞是一種含有大量脂肪的巨噬細胞,為導致動脈硬化的原因之一,並可能導致心臟病和腦梗塞。當低密度脂蛋白穿過動脈內膜進入血管壁之間時,膽固醇便會堆積於血管壁之間,而當膽固醇堆積一定量時,血管內膜的內皮細胞會釋放激素促使單核細胞聚集,聚集的單核細胞進一步分化為巨噬細胞,分化成熟後的巨噬細胞吞噬被氧化的膽固醇,並分解吞噬的膽固醇,而吞噬完脂肪的巨噬細胞則成為泡沫細胞。
本發明利用泡沫細胞進行植物乳桿菌TCI028測試處理後,以油紅O染色(oil-red O stain)確認植物乳桿菌TCI028之抑制泡沫細胞形成之效果。首先,在6孔培養盤(GeneDirexe公司,台灣)中每個孔洞接種1×105個人類單核球細胞株THP-1,該細胞購自美國標準生物品收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),編號HB-8065TM。將該細胞培養於添加10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(GIBCO公司,美國)與1%青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)(GIBCO公司,美國)的RPMI 1640基礎培養基(GIBCO公
司,美國)。給予該些細胞500nM的巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)(Sigma-Aldrich公司,美國)處理48小時,使該細胞分化為巨噬細胞。之後,更換新的培養基,以1%植物乳桿菌TCI028上清液處理1小時,然後與50μg/mL氧化低密度脂蛋白(oxLDL)(Athens research and technology公司,美國)與100ng/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma-Aldrich公司,美國)共培養24小時,使巨噬細胞吞噬oxLDL與LPS後,導致大量膽固醇蓄積而形成泡沫細胞;並以僅添加oxLDL與LPS(oxLDL+LPS組)、添加2.5μM已知可分解脂肪的白藜蘆醇(sigma公司,美國)、oxLDL與LP(白藜蘆醇組)、未添加oxLDL與LPS誘導形成泡沫細胞(空白組)以及僅為培養基的空培液進行比較。
接著,進行油紅染色(Oil red-O stain),油紅染劑為對中性脂肪細胞具有專一性的染劑;將培養基吸去,以磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)(GIBCO公司,美國)洗滌並以10%甲醛(Formaldehyde)(景明化工,台灣)固定細胞10分鐘,再以60%異丙醇(Isopropanol)(景明化工,台灣)浸潤15秒;以PBS洗滌細胞再以油紅O染劑(Sigma-Aldrich公司,美國)(溶於異丙醇(Isopropanol)在37℃染色一分鐘,最後以60%異丙醇退染15秒,以PBS洗滌3次,即可在顯微鏡下觀察。再用100%異丙醇將染色的油脂溶解,並以光譜分析儀(ELISA.Reader)於波長510nm下量測吸光值(OD)。
本發明使用油紅O染色(oil-red O stain)確認植物乳桿菌TCI028之抑制泡沫細胞形成之效果。結果如圖2所示,未添加oxLDL與LPS誘導形成泡沫細胞(空白組)未見油紅O染色;巨噬細胞加入oxLDL與LPS後油紅O強染色,巨噬細胞吞噬oxLDL與LPS轉化為泡沫細胞,相較於oxLDL+LPS組,植物乳桿菌TCI028組處理後的細胞比白藜蘆醇(sigma公司,美國)組處理的細胞之油紅O染色
更弱,表示抑制泡沫細胞形成的效果更好。因此,本發明經細胞實驗證實植物乳桿菌TCI028可有效抑制泡沫細胞的形成。
本發明進一步檢測膽固醇代謝相關基因表現量。首先,在6孔細胞培養盤(GeneDirexe公司,台灣)中每個孔洞接種0.5×105個肝癌細胞HepG2(購自ATCC,編號HB-8065TM),將該細胞培養於添加有10%胎牛血清與1%青黴素/鏈黴素的杜氏改良Eagle培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)(GIBCO公司,美國)中,分別於第6、24以及48小時添加0.125mg/ml植物乳桿菌TCI028或以培養基處理,未處理的細胞控制組;裂解緩衝液(Geneaid公司,台灣)懸浮並收集細胞。使用RNA萃取試劑組(Geneaid公司,台灣)萃取上述細胞的RNA,再利用反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司,美國)將RNA反轉錄為cDNA,接著使用KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(KAPA Biosystems公司,美國)以即時聚合酶鏈鎖反應儀(ABI StepOne PlusTM System(Applied Biosystems公司,美國)進行定量即時聚合酶連鎖反應(qPCR),偵測本發明之植物乳桿菌培養TCI028處理之肝癌細胞的膽固醇代謝相關基因之表現量;其中包含調節膽固醇酯轉運蛋白(cholesterol ester transfer protein,CETP)基因、低密度脂蛋白膽固醇接受器(LDL receptor,LDLR)基因、天門冬胺酸蛋白酶1(aspartic proteinase 1,APA1)基因以及ATP結合盒蛋白1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)基因,並每個基因標記以Beta肌動蛋白(Beta-actin,ACTB)基因表現量進行標準化(如表1所示),上述相同實驗條件皆以三重複進行。
結果如圖3所示,相較於控制組肝癌細胞的膽固醇相關基因的表現量,以植物乳桿菌TCI028處理比以MRSD處理的肝癌細胞的膽固醇相關基因的表現量皆明顯增加,表示本發明之植物乳桿菌TCI028確實具有提升膽固醇代謝的能力,具有促進膽固醇分解的效果。
綜上所述,本發明之植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)TCI028可透過提升CETP、LDLR、ABCA1、APA1基因的表現量,進而達到降低71%膽固醇、抑制泡沫細胞形成以及預防動脈粥狀硬化形成之效果;再者,本發明之植物乳桿菌TCI028抑制泡沫細胞形成之效果皆優於已知可分解脂肪的白藜蘆醇。因此,植物乳桿菌TCI028為一天然成分,不會產生傳統人工合成抑制劑所帶來的副作用,可應用治療心血管疾病之乳製品、飲食補充物、醫藥組合物、保養品或食品,其可以一溶液、一明膠膠囊、一軟膠囊或一錠劑之型式提供。
食品工業發展研究所、民國106年12月13日、寄存編號BCRC 910805。
<110> 大江生醫股份有限公司
<120> 用於促進膽固醇分解之植物乳桿菌及包含該植物乳桿菌之組合物
<130> 106B0542-I1
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<223> 合成引子
Claims (8)
- 一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)用於製備抑制巨噬細胞攝取脂肪的組合物之用途,其中該植物乳桿菌的寄存編號為BCRC 910805。
- 一種植物乳桿菌用於製備抑制巨噬細胞攝取脂肪的醫藥組合物之用途,其中該植物乳桿菌的寄存編號為BCRC 910805。
- 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途,其中該植物乳桿菌減少該巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白之攝取。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該組合物進一步包含一添加劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該組合物係為一溶液、一明膠膠囊、一軟膠囊或一錠劑之型式。
- 如申請專利範圍第2項所述之用途,其中該醫藥組合物進一步包含一醫藥上可接受之載體。
- 如申請專利範圍第2項所述之用途,其中該醫藥組合物係為一溶液、一明膠膠囊、一軟膠囊或一錠劑之型式。
- 如申請專利範圍第2項所述之用途,其中該醫藥組合物係經由口服方式給予。
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