CN105246479B - 用于控制与体液免疫应答的过度激活相关的炎症过程的d-荞麦碱 - Google Patents

用于控制与体液免疫应答的过度激活相关的炎症过程的d-荞麦碱 Download PDF

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Abstract

本发明属于具有用于在粘膜水平上引发先天免疫应答机制的免疫刺激能力的营养制品或功能性试剂的领域。更确切地说，本发明提及化合物D‑荞麦碱作为该粘膜中的先天免疫应答的免疫刺激剂，并且用于防止或预防与体液免疫应答的过度激活相关联的炎症过程或疾病的用途。本发明还涉及一种用于以上提到的应用的包含D‑荞麦碱的组合物。

Description

用于控制与体液免疫应答的过度激活相关的炎症过程的D-荞 麦碱
技术领域
本发明属于具有用于在粘膜水平上引发免疫应答机制的免疫刺激能力的营养制品或功能性试剂的领域。更确切地说，本发明提及化合物D-荞麦碱作为该粘膜中的先天免疫应答的免疫刺激剂，并且用于防止或预防与机会病原体相关联的临床炎症过程、亚临床慢性炎症过程或疾病的用途。本发明还涉及一种用于以上提到的用途的包含D-荞麦碱的组合物。
背景技术
营养制品是源自或分离自天然来源或食物来源的产品，这些营养制品除了其基本营养价值之外，还为消费它们的个体的健康提供益处或防止或延迟某些病症或疾病发作。这是为什么消费者越来越需要这种产品并且为什么营养制品领域中的研究和开发在食品、药物和兽医工业中变得越来越重要的原因。
营养制品和功能性食品领域中的研究指向不同路线，如鉴定和开发可以赋予宿主健康益处的微生物(通常称为益生菌)或分离存在于天然产品或食物产品中的天然化合物或物质，这些天然化合物或物质对消费它们的个人的健康发挥有益作用。
已经证明对健康具有有益作用的天然化合物之一是D-荞麦碱。
D-荞麦碱((2R,3R,4R)-2-羟甲基哌啶-3,4-二醇)是一种天然的亚氨基环多醇，一种多羟基化的哌啶，它首先分离自甜荞(Fagopyrum esculentum Moench)的荞麦种子并且后来分离自其他植物来源如桑葚(桑(Morus alba)，桑科)、枸杞(gogi)(枸杞(Lyceumchinense))、栗豆树(Castanospermum australe)、赞比亚黄尾豆(Xhanthocerciszambesiaca)叶和鸡桑(Morus bombycis)叶。该D-荞麦碱((2R,3R,4R)-2-羟甲基哌啶-3,4-二醇)示于以下化学式中。
除了其他功能之外，D-荞麦碱已经被教导可降低餐后血糖水平而不刺激胰岛素分泌(戈麦斯L.(Gomez L.)等人，英国营养学杂志(Br.J.Nutr.)2012年6月；107(12):1739-46)。因此，D-荞麦碱已经被提出作为降低与过量摄入可快速消化的碳水化合物相关联的健康风险的有用膳食成分或功能性食品组分。
WO 2011117362披露了D-荞麦碱抑制细菌粘附到粘膜表面上的能力。因为细菌粘附到粘膜上是定殖和感染的重要前提，所以D-荞麦碱被认为是用于预防和/或辅佐治疗细菌感染的有价值的试剂。另外，这个文件披露了D-荞麦碱还有用于预防由肠道、口腔或呼吸道的病原菌引起的微生物区系失衡。这种作用是由于D-荞麦碱粘附到有害细菌上但不粘附到健康细菌如乳杆菌(Lactobacili)或双歧杆菌(Bifidobacteria)上的事实，这些有害细菌是如埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)或链球菌属(Streptococcus)的某些菌株。在这些意义上，健康细菌比病原体细菌更倾向于植入粘膜中。
所完成的研究(戈麦斯L等人)还确认了D-荞麦碱不显示抗微生物活性，这意味着虽然对一些细菌的粘附存在特定作用，但这些细菌的活力不受D-荞麦碱的存在影响。其他现有技术文件还提及D-荞麦碱和它的N-烷基化衍生物的生物功能(卡斯蒂洛J.A.(Castillo J.A.)等人：“有机合成中的果糖-6-磷酸醛缩酶：D-荞麦碱、N-烷基化衍生物的制备和初步生物测定(Fructose-6-phosphate aldolase in organic synthesis:preparation of D-fagomine；N-alkylated derivatives,and preliminary biologicalassays)”有机快报(Organic letter)2006第8卷(26):6067-6070)。卡斯蒂洛J.A等人描述了D-荞麦碱和N-烷基化衍生物C4、C6、C8、C9和Ph-CH2不显示抗微生物活性。
如今，本发明的作者已经发现D-荞麦碱的新生物功能。具体地说，他们已经发现D-荞麦碱具有在粘膜水平上引发先天免疫应答机制的能力。这些先天免疫应答机制的改进可帮助个体预防并且减少来自粘膜附近的潜在病原体微生物的感染。另外，在粘膜水平上的这种先天免疫系统保护的天然机制的改进避免了不希望的体液免疫应答过度激活，体液免疫应答是对抗微生物的第二相关防御。通过适应性免疫系统进行的所述体液免疫应答通常是更有效和更系统的。体液免疫应答过度激活促成慢性亚临床炎症情况发作。
先天免疫应答的改进是与不仅维持控制细菌而且维持控制病毒和其他寄生物相关。
在我们的先天免疫系统中，微生物被认为维持正确的活性水平。已经提出，免疫系统并且具体地先天免疫系统的非天然发展导致对自身免疫疾病的易感性增加。例如乳糜泻、克罗恩氏病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎与这种异常应答相关。先天免疫应答的缺乏或故障促成体液免疫应答过度激活，这可以导致不受控制的破坏性自身免疫应答。已经鉴定出高达100种类型的自身免疫疾病，包括哮喘、多发性硬化、狼疮、牛皮癣性关节炎和类风湿性关节炎以及糖尿病。
而且，对于肠微生物丛与宿主之间的相互作用改变而得到的慢性亚临床炎症被认为增强体液炎症应答，并且被视为控制代谢综合征和其他疾病如肥胖症、高血压、II型糖尿病、脂肪肝、老年痴呆症(Alzheimer)或癌症(例如，乳腺癌、结肠癌)的进展速率的原因。
然后，感兴趣地发现通过同时降低不希望的有效体液免疫应答的风险而在局部粘膜水平上天然加强先天免疫应答的新方法。
先天免疫系统代表生物体的第一道防线，并且包括以非特异性方式防卫宿主免遭由其他生物体引起的感染的细胞和机制。这意味着先天系统的细胞以通用方式识别并且响应于病原体，但与适应性免疫系统不同，适应性免疫系统不赋予宿主长久的或保护性的免疫。先天免疫系统针对感染提供立即防御。先天免疫系统通过不同类型的细胞如肥大细胞、噬菌细胞(巨噬细胞、嗜中性细胞和树突状细胞)、嗜碱性细胞和嗜酸性细胞以及自然杀伤细胞(NK细胞)，以及通过生物化学机制如补体系统来形成。
脊椎动物先天免疫系统的主要功能包括：
a)通过产生化学因子(包括特化的化学介质，称为细胞因子)，将免疫细胞募集到感染部位。
b)激活补体级联以便鉴定细菌、激活细胞并且以便促进死细胞或抗体复合物的清除。
c)通过专门的白细胞来鉴定并且去除存在于器官、组织、血液和淋巴中的外来物质。
d)通过称为抗原呈递的方法激活适应性免疫系统。
e)用作感染剂的物理和化学屏障。
本发明是基于发明人所做出的证明：在D-荞麦碱存在下，存在于粘膜中的先天免疫系统的细胞释放细胞因子如TNF-α。
因为粘膜中的先天免疫应答维持了天然防御，所以粘膜中的先天免疫应答增强表示对抗病原体的天然保护机制，该天然防御避免了针对能够避开或掩蔽粘膜的天然防御的病原体引发适应性免疫系统的更有效、侵略性和系统性的应答。“激活的”先天免疫系统的存在避免了针对某些病原体细菌引发急性应答机制，这些病原体细菌如此适应于介质以致于随着时间推移造成慢性亚临床炎症过程。
附图说明
图1：表示从结肠粘膜回收大肠杆菌(E.coli)434。使用了没有将大肠杆菌添加到制剂中的阴性对照。使用了具有大肠杆菌但不具有D-荞麦碱的一种样品作为阳性对照。另外，测试了具有大肠杆菌与不同剂量(50μg/ml、500μg/ml和5000μg/ml)下的D-荞麦碱的三种不同样品。结果证明，D-荞麦碱以剂量依赖性方式对大肠杆菌具有抗粘附特性。
图2：表示通过存在于结肠粘膜中的来自先天免疫系统的细胞所进行的TNF-α释放。从上清液中测量TNF。如在图1中，使用了没有将大肠杆菌添加到制剂中的阴性对照和具有大肠杆菌但不具有D-荞麦碱的阳性对照。再次测试了具有大肠杆菌与不同剂量(50μg/ml、500μg/ml和5000μg/ml)下的D-荞麦碱的三种不同样品。结果证明，D-荞麦碱具有刺激TNF-α释放的能力并且剂量越低，这种释放越有效。这直接表明，D-荞麦碱对先天免疫系统具有一种免疫刺激作用，从而帮助该免疫系统在粘膜水平上检测并且攻击微生物。
具体实施方式
本发明的一个第一方面提及化合物D-荞麦碱或其药学上可接受的盐、或其兽用盐或其可食用盐，用作粘膜水平上的先天免疫系统的免疫刺激剂并且作为用于预防与体液免疫应答的过度激活相关的炎症过程的试剂。
在该粘膜水平上的先天免疫系统的免疫刺激具有降低更有效和潜在破坏性体液免疫应答的发生率的优点。因此，D-荞麦碱帮助防止自身免疫疾病如糖尿病、牛皮癣、代谢综合征、克罗恩氏病、乳糜泻、多肌痛或类风湿性关节炎的发作，并且减少与异常体液炎症应答相关的疾病如代谢综合征和其他疾病如肥胖症、高血压、II型糖尿病、脂肪肝、老年痴呆症或癌症(例如乳房、结肠)的进展。
在本发明的上下文内可以使用的非限制性D-荞麦碱盐是酒石酸盐、半酒石酸盐、柠檬酸盐、半柠檬酸盐、盐酸盐、苹果酸盐或乙酸盐。
已经证明D-荞麦碱可在粘膜水平上产生先天免疫系统的免疫刺激应答，这是病原体在感染过程中面临的第一屏障。D-荞麦碱使所有类型的粘膜水平上的先天免疫系统的应答激活，这些所有类型的粘膜即口腔粘膜、食道粘膜、胃粘膜、肠道粘膜、结肠粘膜、鼻粘膜、支气管粘膜、尿道粘膜或子宫粘膜。
在一个特别优选的实施例中，先天免疫系统的激活应答发生在鼻粘膜中。鼻粘膜中的先天免疫应答的激活有助于作为用于改进对抗如链球菌性肺炎的细菌或如流感的病毒的鼻疫苗效力的辅佐方式。在另一个特别优选的实施例中，先天免疫系统的激活应答发生在肠道粘膜中。肠道粘膜中的先天免疫应答的激活有助于作为用于改进对抗一些微生物如弧菌属菌株、肺结核或脊髓灰质炎病毒的口腔疫苗效力的辅佐方式。
在最优选的实施例中，先天免疫系统的激活应答发生在结肠粘膜的水平上。出于不同原因，使用D-荞麦碱对在结肠的水平上局部引发先天免疫应答是尤其有意义的。第一个原因是，结肠是细菌浓度和存在更丰富的区域中的一个，并且还是存在更多机会病原体(包括在人体内普遍存在的大肠杆菌)的区域中的一个。在这个意义上，结肠还是更敏感并且具有更多感染可能性的区域中的一个，因此激活先天免疫系统并且在胃肠道的这个水平上处于监督之下是重要的。第二个原因是，虽然其他种类的碳水化合物可以具有类似种类的先天免疫系统的免疫刺激活性，但它们通常不能到达结肠，因为它们在其运送穿过胃肠道的过程中被肠道细菌消耗或降解。相反，D-荞麦碱是不能被肠道细菌代谢的亚氨基糖并且因此它能够到达结肠，在该结肠中它可以在局部水平上，甚至在非常低的浓度下发挥其免疫刺激功能。
事实上，虽然存在5000μg/ml或更少浓度的D-荞麦碱足以在粘膜中产生先天免疫系统的免疫刺激作用，但出人意料地观察到D-荞麦碱的浓度越低，先天免疫应答越有效。事实上，在一个优选的实施例中，使用500μg/ml或更少浓度的D-荞麦碱。在一个还更优选的实施例中，使用50μg/ml或更少浓度的D-荞麦碱。在50μg/ml或更少的浓度下，细胞因子TNF-α的产生出人意料地增加。TNF-α的产生直接表明先天免疫系统的激活，即其免疫刺激的激活。
作为能够使先天免疫系统维持在“警戒”之下的试剂，常规消费D-荞麦碱有助于预防和防止与机会病原体相关的炎症过程。具体地说，D-荞麦碱可以非常有用于预防由细菌引起的慢性或亚慢性炎症的情况，这些细菌能够通过形成可以掩蔽菌落不被免疫系统发现的生物膜从免疫系统逃逸。这种情况倾向于促进感染，并且不仅在粘膜水平上而且在浆膜水平上引发免疫应答。存在这种类型的浆膜应答是慢性炎症状态的根源。
在本发明的一个具体和优选的实施例中，D-荞麦碱有助于预防与细菌相关的炎症过程，这些细菌选自γ变形菌门(proteobacteria)如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tiphymurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或链球菌如变异链球菌(S.mutans)、缓症链球菌(S.mitis)、口腔链球菌(S.oralis)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、化脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)或粪肠球菌(Enteroccoccus faecalis)。
在本发明的该优选的实施例中，D-荞麦碱是有用于预防与通过大肠杆菌(Escherichia Coli)的某些病原菌株引起的体液应答过度激活相关的炎症过程，这些大肠杆菌的某些病原菌株非常倾向于通过形成生物膜或通过其他策略逃出免疫系统并且产生慢性临床和亚临床的炎症过程。
本发明的另一个方面涉及用作粘膜水平上的先天免疫系统的免疫刺激剂并且作为用于预防与机会病原体相关联的炎症过程的试剂的一种组合物，该组合物包含D-荞麦碱或其药学上可接受的盐、或其兽用盐或其可食用盐以及至少一种添加剂。
在本发明的该组合物中可以使用的非限制性D-荞麦碱盐是酒石酸盐、半酒石酸盐、柠檬酸盐、半柠檬酸盐、盐酸盐、苹果酸盐或乙酸盐。
本发明的该组合物可以是呈固体形式或呈一种液体组合物的形式，优选地一种水性组合物。
在液体组合物或优选地水性组合物的情况下，D-荞麦碱的浓度是5000μg/ml或更少、优选地500μg/ml或更少，并且更优选地50μg/ml或更少。
本发明的该组合物中的D-荞麦碱可以是合成的，或它可以具有天然来源，呈一种天然来源的富集的提取物形式。在来自天然来源的一种富集的提取物的情况下，D-荞麦碱优选地从以下物质中提取或是从以下物质中产生的食品：荞麦或苦荞麦(Fagopyrumtataricum)的种子、鸡桑或桑的叶子、枸杞的根、赞比亚黄尾豆的根和叶子、藤槐木(Angylocalyx pinaertii)的果实、非洲小叶紫檀(Baphia nitida)的叶子、栗豆树的种子或阔叶梭果(Lonchocarpus latifolius)的根。
在一个特别优选的实施例中，本发明的该组合物包含来自荞麦种子的提取物的D-荞麦碱。
本发明的该组合物可以被配制为药物、兽医或食品组合物，后者是优选类型的组合物。
在一个优选的实施例中，该药物组合物是漱口剂、凝胶、液体牙齿清洗剂、牙膏、口香糖、假牙清洁剂或假体粘附乳膏。在一个更优选的实施例中，该药物组合物是一种口香糖。
此外，可能使用D-荞麦碱作为营养组合物食品、宠物食品和饲料的部分。本发明的食品组合物还可以作为一种食品或一种饮料添加剂而呈现以产生功能性食品或功能性饮料。以这种形式，它可以被添加到液体食物产品或浓缩物或粉末中，如乳和液体乳样产品、不同饮料包括果汁、软饮、运动饮品、酒精饮料等。尤其有用于使根据本发明的D-荞麦碱的一种组合物作为婴儿用食品的部分，优选地作为婴儿配方的一部分。而且，当该D-荞麦碱组合物来自荞麦(buckwheat)(荞麦(Fagopyrum esculentum))纯化的提取物时，它可以是啤酒、无醇啤酒(non-alcohol beer)、茶叶样饮品、乳样饮品、酸奶、意大利面食、饼干、糕点、谷物棒、溶胀谷粒、面包、薄烤饼、蛋糕、奶油、甜点、早餐谷物以及其他食品的部分。本发明的该食品组合物或食品添加剂还可以一种天然方式，例如通过使家畜如奶牛或其他动物在其乳中产生D-荞麦碱来产生。这可以通过用荞麦、苦荞麦、桑或纯化的D-荞麦碱喂养动物来实现。
在另一个实施例中，本发明的该组合物还在其配方中包含芦丁或其他黄酮醇多酚类(即橙皮苷)。芦丁是黄酮醇槲皮素与二糖芦丁糖(α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6))-β-D-吡喃葡萄糖)之间的糖苷，并且具有以下化学式。
当口服给予芦丁时，它倾向于在上部肠道中是稳定的，但在结肠水平上被快速去糖基化以释放槲皮素(金姆H.(Kim H.)等人“用于治疗炎症性肠病的膳食槲皮素糖苷的芦丁的代谢特性和药理学特性(Metabolic and pharmacological Properties of rutin,adietary quercetin glycoside for treatment of inflammatory bowel disease)”药学研究(Pharmaceutical research)，2005，第22卷第9期)。槲皮素已经被教导尤其在治疗慢性炎症状态如炎症性肠病中具有抗炎作用，并且因此，在本发明的该组合物中使用芦丁作为槲皮素的来源在治疗和预防尤其是结肠水平上的炎症中提供协同作用，在该结肠中一方面释放槲皮素并且另一方面D-荞麦碱能够达到发挥其免疫刺激作用。芦丁的存在以某种方式帮助维持控制由D-荞麦碱引发的免疫应答。
此外，应指出的是，如同D-荞麦碱一样，芦丁存在于荞麦(buckwheat)(荞麦(Fagopyrum esculentum))并且还有苦荞麦中，通常该苦荞麦比荞麦呈现更高量的芦丁。在这个意义上，在本发明的该优选的实施例中，本发明的该组合物从富集D-荞麦碱和芦丁的荞麦提取物中加工获得。
当审查本说明时，本发明的另外的目的、优点以及特征对本领域技术人员而言将变得显而易见，或可以通过本发明的实践来获悉。通过说明提供了以下实例，并且它们并不意图限制本发明。此外，本发明覆盖在此描述的具体以及优选实施例的所有可能的组合。
实例
实例1：D-荞麦碱在人结肠样品中的生物活性
本研究的目的是为了确定D-荞麦碱对大肠杆菌向人结肠粘膜样品粘附的“离体”作用，以及它们在作为先天免疫应答激活的指示的剂量范围上可能对炎症介质释放的影响。
该方法包括使用通过手术获得的粘膜结肠样品对一种大肠杆菌菌株进行孵育。意图是为了保存粘膜样品的整个结构，这些粘膜样品包括多种细胞群如上皮细胞和具有免疫能力的细胞(巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞和淋巴细胞)，所有这些细胞保持它们的原始结构和布置用于细胞与细胞相互作用。换言之，该方法意图用于模拟结肠粘膜的“体内”条件。
在研究的设计中，测试了0μg/ml、50μg/ml、500μg/ml和5000μg/ml的剂量。
使用大肠杆菌的病原菌株。大肠杆菌的病原菌株与其他非病原菌株的主要差异涉及它们避开免疫系统的能力。
材料和方法
器官培养：在手术下从对于结肠癌经受结肠切除术的患者中获得肉眼可见的正常结肠粘膜的样品。将没有疾病的区域收集在冰冷盐水中，并且立即转移到瓦尔德西布伦大学医院(Hospital’s Vall d’Hebron)(巴塞罗那(Barcelona))的消化研究中心实验室。在用盐水洗涤之后，从肌层解剖粘膜，并且将25mg与30mg之间的小片表面向上放置于培养孔(具有500μm底部筛网的15mm直径孔，Netwell培养系统，柯仕达公司(Costar)，剑桥(Cambridge)，MA)中，并且定向以致于上皮表面在最上面。将滤光片悬浮在含有1.5ml的RPMI培养基(CanSera，加拿大安大略省多伦多米西索加(Rexdale,Ontario,Canada))的孔上方，该培养基补充有10％胎牛血清(FCS；Gibco-BRL，德国埃根斯泰因(Eggenstein,Germany))、谷氨酰胺2mM和抗生素：100U/ml青霉素、100微克/毫升链霉素和50微克/毫升庆大霉素(所有均来自Normon，西班牙马德里(Madrid,Spain))。这个体积正好用于维持表面湿度，但不用于下沉到表面之下。
在37℃下，在95％O2+5％CO2气氛下孵育活检物，并且在1小时的过程中使用PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯)和离子霉素(100/1000ng/mL)(这两者均可获自西格玛公司(Sigma))进行刺激。
此后，用24mmol/L下的补充有10％FCS和碳酸氢钠的新鲜RPMI 1640培养基(不具有葡萄糖)替换培养基。
将细菌菌株大肠杆菌(10-8CFU/ml)和荞麦碱(50μg/mL、500μg/mL和5000μg/mL)小心地添加到外植体中。在用大肠杆菌对组织进行培养4h之后，收集上清液用于测量大肠杆菌回收、TNF-α的释放、LDH(活力)以及pH。此外，冲洗这些组织，均质化并且测定大肠杆菌回收和LDH(以便研究组织活力)。
细菌菌株：由玛丽亚洛杉矶卡尔沃博士(Dr.Maria Angeles Calvo)(西班牙巴塞罗那自治大学，兽医学院，微生物学实验室(Microbiology Laboratory,Faculty ofVeterinary,Autonomous University of Barcelona,Spain))提供病原大肠杆菌参比菌株(CECT 434，(Migula 1895)卡斯泰拉尼(Castellani)和查尔默斯(Chalmers)1919)。
大肠杆菌接种物：在对组织进行实验的前一天，在37℃下在好氧条件下将大肠杆菌菌株接种于Luria Bertani肉汤(西班牙巴塞罗那自治大学瓦尔德西布伦医院药房)中持续24h。在实验那天，在稳定时期收获细菌，通过在600nm处吸光度的光学密度来估计细菌悬浮液中的细菌计数，并且在适当稀释下将细菌添加到组织培养孔中。
组织冲洗：为了在培养结束时仅定量粘附的大肠杆菌细菌，回收组织并且在2分钟的过程中在一个轨道混合器中以低速用2ml的盐水冲洗。在冲洗之后，在1ml的盐水中对每个组织进行均质化，并且制备稀释物以定量固体琼脂选择性培养基中的大肠杆菌回收。
在实验结束时回收大肠杆菌：通过在用于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的选择性固体培养基中培养的实验之后，立即定量大肠杆菌的上清液和组织回收。对于每个样品进行至少3次不同稀释。24小时之后，手动计数菌落的数目。结果已经被归一化成30mg的标准尺寸。
TNF-α定量：使用用于人细胞因子TNF-α(Ready to Set，美国e-Bioscience公司(e-Bioscience))的商业上可获得的ELISA测定系统来测量上清液中的TNF-α浓度。细胞因子浓度表示为pg(TNF-α)/30mg组织。
结肠活力：为了估计组织活力，我们计算了上清液中的LDH(乳酸脱氢酶)活性释放。这个方法由范妮(Finnie)(消化道(Gut)1995)验证。计算了上清液中的LDH活性相对于组织匀浆中的总LDH活性的比率，并且该比率用来估计成活组织的百分比。在Tris/HCl(100mmol/L，pH 7.4)中对组织样品进行均质化，并且使用分光光度法分析上清液的LDH。组织活力被评价为每毫克组织的LDH的释放。
统计分析：结果通过平均值和sem，或通过曲线图中的各个数据来表达。
结果
在实验结束时组织中的大肠杆菌的回收：
组织样品中的大肠杆菌的回收结果提供于表1和图1中：
表1
如可以清楚地观察到，在对照样品中显示在结肠组织中存在很多大肠杆菌并且随着D-荞麦碱浓度增加，粘附到组织上的细菌的存在减少。换言之，可以推断，D-荞麦碱针对大肠杆菌对结肠上皮具有一种抗粘附作用。当D-荞麦碱浓度增加时，该抗粘附作用更有效。
细胞因子释放：
细胞因子释放的结果示于表2和图2中：
表2
结果清楚地证明，相对于具有大肠杆菌的对照或相对于不具有大肠杆菌的对照，D-荞麦碱的存在具有刺激TNF-α释放的作用。另外，显著的是，TNF-α的释放取决于D-荞麦碱浓度。令人感兴趣地看到，D-荞麦碱的浓度最低，细胞因子释放更有效。在50μg/mL剂量下的TNF-α释放是出人意料地有效，因为它诱导了高于500μg/mL剂量5倍并且高于5000μg/mL剂量接近8倍的TNF-α释放。
简单地说，这个测定证明了D-荞麦碱以一种剂量依赖性形式诱导先天免疫应答的激活，并且所述诱导在50μg/mL或更少的较低浓度下更有效。
对活力的控制：
结肠组织的细胞活力的结果表示于表3中：
表3
结果表明具有大肠杆菌或荞麦碱的共培养物不影响组织的活力。
实例2：包含D-荞麦碱的组合物
制备了以下具有D-荞麦碱的组合物：
·补充有D-荞麦碱(50mg)和芦丁(500mg)的饮用饮料。
·补充有D-荞麦碱(50mg)和芦丁(500mg)的片剂。
·由荞麦面粉制成的饼干，该荞麦面粉天然包含D-荞麦碱、芦丁以及益生元制剂，该制剂含有植物纤维、FOS(寡果糖)和XOS(寡木糖)
·从具有8ppm的D-荞麦碱和50ppm芦丁的含量的荞麦中制得的无醇啤酒。
·基于来自奶牛的乳的婴儿配方，这些奶牛用显示10ppm含量的D-荞麦碱的荞麦喂养。
·用于刺激口腔粘膜中的先天免疫应答并且预防龋齿和牙周病的具有D-荞麦碱(50mg)的无糖口香糖。
·作为咽喉中或消化道中细菌感染过程中的辅佐剂的具有D-荞麦碱(20mg)的糖果。
·作为用于制备功能性食品或药物配制品的添加剂以改进结肠中的生物利用率的具有D-荞麦碱(50mg)和芦丁(500mg)的丸状微囊化制剂。
·作为用于对抗肺炎链球菌、流感病毒等的免疫过程中的鼻疫苗的辅佐剂的具有D-荞麦碱(10mg)的鼻喷雾。
·连同益生元(乳酸杆菌、双歧杆菌)一起作为肠道感染过程中的辅佐剂的具有50-100mg D-荞麦碱的口服粉末配制品。

Claims (9)

1.化合物D-荞麦碱或其药学上可接受的盐、或其兽用盐或其可食用盐在制造用于刺激先天免疫系统的细胞产生TNF-α的试剂中的应用。
2.包含D-荞麦碱或其药学上可接受的盐、或其兽用盐或其可食用盐以及至少一种添加剂的组合物在制造用于刺激先天免疫系统的细胞产生TNF-α的试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中该组合物是一种固体或水性组合物。
4.根据权利要求2所述的应用，其中该水性组合物包含浓度等于或小于5000 µg/ml的D-荞麦碱。
5.根据权利要求4所述的应用，其中该水性组合物包含浓度等于或小于50 µg/ml的D-荞麦碱。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的应用，其中该D-荞麦碱是来自天然来源或精细化学品的富集的提取物形式。
7.根据权利要求5所述的应用，其中D-荞麦碱的该天然来源是荞麦、苦荞麦的种子、鸡桑或桑的叶子、枸杞的根、赞比亚黄尾豆的根和叶子、藤槐木的果实、非洲小叶紫檀的叶子、栗豆树的种子以及阔叶梭果的根。
8.根据权利要求2至5中任一项所述的应用，其中该组合物是药物、兽医或食品组合物。
9.根据权利要求2至5中任一项所述的应用，其中该组合物进一步包含芦丁。
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