CN101129476B

CN101129476B - 桑枝生物碱有效部位在制备降血糖药物中的应用

Info

Publication number: CN101129476B
Application number: CN2006101116443A
Authority: CN
Inventors: 刘玉玲; 申竹芳; 汪仁芸; 孙素娟; 夏学军; 金笃嘉; 刘泉
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Beijing wuhebao Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2006-08-21
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2026-08-21
Also published as: WO2008025249A1; CA2696874A1; JP2010536804A; KR20100084617A; CN101129476A; EP2255822A4; US9066960B2; EP2255822A1; US20110130352A1; CA2696874C

Abstract

本发明涉及一种具有降血糖活性的有效部位，系由桑枝粉碎后用水和/或醇提取，或用酸水提取，经酒沉或絮凝去除杂质，浓缩，经树脂色谱法分离精制而得的淡黄色粉末。本发明所述的有效部位，降糖活性成分为一组多羟基生物碱，采用HPLC法测定，总生物碱占有效部位重量百分比在50％以上。降糖剂量为每人每次12.5-200mg(按总生物碱计)。

Description

桑枝生物碱有效部位在制备降血糖药物中的应用

技术领域

本发明涉及桑枝生物碱有效部位提取物在制备降血糖药物中的应用。

背景介绍

据有关资料报道，国内40岁以上人群糖尿病发病率高达4％，60岁以上人群超过11％。根据世界卫生组织的最新数据，在未来15年中，中国的糖尿病患者人数将达到目前的四倍。糖尿病已成为严重危害人民生活和健康的重大疾病。患病人群中，90％以上为2型糖尿病(非胰岛素依赖型，NIDDM)，需长期服用口服降糖药。20世纪50年代，用于治疗NIDDM的口服药物磺酰脲类和双胍类等药物上市，使2型糖尿病人的血糖得到了控制，寿命延长，生活质量有所提高。但磺酰脲类易引起低血糖危险，双胍类存在严重的胃肠道刺激。经过40多年的努力，科学家又发现了一类新型的抗糖尿病药物，即α-葡萄糖苷酶抑制剂。该种药物作用于小肠粘膜刷状缘的α-葡萄糖苷酶，抑制其对多糖和葡萄糖的分解，延缓葡萄糖的吸收，使餐后血糖峰值降低并后移，“血糖波动”幅度缩小，从而起到降低血糖、防止和延缓某些糖尿病慢性并发症的发生和发展。α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用已被国内外公认为是抗糖尿病的新途径。20世纪90年代初，德国拜尔公司推出了该类型药物拜糖苹(Acarbose)，并在世界50多个国家上市，获得了良好的治疗效果。1994年，该药进入我国市场，经10年的临床验证，表明本品用于2型糖尿病治疗，有效性好，安全性高，获得了很好的社会效益和显著的经济效益。

我国药用植物资源丰富，用于降血糖的粗制剂品种繁多，但均无明确作用机制，且质量不可控。桑枝为桑科植物桑的干嫩枝，桑枝中含有上百种化合物，包括多糖、单糖、植物蛋白、酚类、黄酮类及皂苷、有机酸、氨基酸、多羟基生物碱等。中国医学科学院药物研究所在20世纪90年代即发现桑枝水和/或醇提取物具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。并申请了专利“桑枝的醇和/或水浸膏在制备降血糖药物中的的应用”，申请号为97112359，该篇专利已于2002年4月10日获得国家专利局授权。由于醇和/或水浸膏粗制剂剂量过大(每次用量在3g以上)、且质量可控性不好，为此，中国医学科学院药物研究所又对桑枝有效部位进行了研究。对桑枝不同的提取部位进行α-葡萄糖苷酶的抑制活性考察，结果表明，水溶性生物碱部分活性最强，即降糖活性的有效部位存在于水溶性生物碱部分。桑枝粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性IC₅₀≈60μg/ml，而水溶性生物碱提取部位的IC₅₀＜0.1μg/ml。

本发明是在97112359基础上进行的进一步技术创新。

除本所申请的97112359专利外，尚检索到以下3篇与桑枝及具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的中药提取物的研究报道：

专利01113191：“具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的中药提取物及其制备方法和用途”，其中中药提取物是由桑白皮、桑叶和桑葚制备而得的总生物碱，未涉及桑枝，同时对生物碱的组成未进行描述。

专利02113004：“桑提取物及其提取方法和新用途”，内容涉及的成分为总黄酮，未涉及生物碱，用途为预防高尿酸血症和痛风，未涉及糖尿病。

专利200410018677.4：“具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的药物组合物及其用途”，药物组合物是由生物碱和黄酮类成分组成，生物碱系由蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱(含量未进行明确说明)。加入的黄酮类提取物为儿茶素、槲皮素、茶多酚中的至少一种。组合物中，生物碱提取物重量比为5-95％、黄酮类提取物重量比为10-95％。

从200410018677.4专利描述的实验结果和附图分析，在设定的实验条件下，生物碱提取物与黄酮类提取物合并用药，仅表现出剂量相加作用，而不具备协同作用。这与该专利的目标和结论不一致。

桑科植物包括桑白皮、桑枝和桑叶。桑白皮来源困难，且破坏植物再生，因此，不宜作为提取药材；桑叶和桑枝需每年进行修剪，其中桑叶用于养蚕，不易收购，而大量的桑枝则被桑农作为烧火用的柴料。因此，以桑枝为药材，来源广泛，方便易得，价格便宜。对桑枝中生物碱有效部位的降糖作用进行研究具有重大现实意义。

发明内容

以桑枝为药材，粉碎后经提取、分离、精制和浓缩，制备总生物碱含量在50％以上的有效部位，加入药剂学上允许的赋形剂，制成各种口服制剂，用于糖尿病患者餐后血糖的控制。桑枝总生物物有效部位提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性与拜糖苹相当，明显强于桑枝水和/或醇提取的粗制剂。

所述的生物碱有效部位，优选的含有的多羟基生物碱组合物由1-deoxynojirimycin(1)和N-methly-1-deoxynojirimycin(2)、fagomine(3)、3-epi-fagomine(4)、1，4-dideoxy-1，4-imino-D-arabinitol(5)、1，4-dideoxy-1，4-imino-D-ribitol(6)、calysteginB₂(7)、calysteginC₁(8)、2-O-(α-D-galactopyranosyl)-1-deoxynojirimyci n(9)、6-O-(β-D-glucopyranosyl)-1-deoxynojirimycin(17)、1，4-dideoxy-1，4-imino-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-D-arabinitol(18)中的至少一种组成，其中，1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于总生物碱的30％。

优选的所述的多羟基生物碱组合物中1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于总生物碱的40％。

更优选的所述的多羟基生物碱组合物中1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于总生物碱的50％。

1、有效部位制备

桑枝中生物碱有效部位的制备方法，系将桑枝粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加热回流提取，溶剂量为原药材的5-12倍，重复提取1-3次，合并提取液，浓缩至一定体积，加入50-80％的乙醇，沉淀去除杂质，离心，清液上阳离子交换树脂，以蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-1N的氨水洗脱，洗脱液浓缩后上阴离子交换树脂，收集不吸附部分，经减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得浅黄色有效部位提取物干粉，收率约为1-2‰。

2、有效部位含量测定

有效部位中的生物碱为多羟基生物碱及其苷类，无紫外吸收，为此，发明人选择合适的衍生化试剂，对提取物进行衍生化处理，采用HPLC方法对处理后的样品进行测定。经考察，所建立的方法专性强、灵敏度高、重复性好。

研究发现，有效部位的一组生物碱中，1-deoxynojirimycin含量最高，且活性最强。为此，发明人制备了1-deoxynojirimycin精制品以期用于含量测定的对照品。通过核磁、质谱、红外、紫外及热分析检测，对其进行了结构确证。经HPLC测定，1-deoxynojirimycin精制品含量大于98％，符合对照品质量要求。

按上述制备方法制备桑枝有效部位提取物，经柱前衍生化-HPLC方法测定，总生物碱占有效部位提取物的含量均在50％以上，化合物(1)即1-deoxynojirimycin占提取物的含量在27％以上。

3、有效部位提取物稳定性

对中试放大提取物密封室温保存，于不同时间取样，HPLC法测定含量，结果表明，贮存24个月，质量稳定，见表1.

表1：中试产品初步稳定性考察

4、有效部位提取物药效学研究

(1)离体试验

以拜糖苹(Arcarbose)为阳性对照药，观察实施例1提取物在不同浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制百分率，并求出IC₅₀。结果表明，在离体条件下，有效部位提取物对蔗糖酶的抑制作用强于拜糖苹，对麦芽糖酶的抑制作用与拜糖苹相当，而对淀粉酶的抑制作用明显低于拜糖苹，提示桑枝有效部位降糖活性与拜糖苹相当，但胃肠道涨气的副作用可能小于拜糖苹。结果见表2。

表2.SZ-A对α葡萄糖苷酶活性的抑制作用(in vitro)

(2)整体动物试验

以拜糖苹为对照，考察了桑枝有效部位对正常小鼠蔗糖负荷后血糖曲线的影响和对四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖负荷后血糖变化的影响。

◆有效部位对正常小鼠蔗糖负荷后血糖升高的影响

有效部位试验组设三个剂量，即10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg；p.o.；另设阴性对照组(不用药)和阳性对照组(阳性对照药选用拜糖苹，10mg/kg；p.o.)。结果表明，桑枝有效部位在10mg/kg～40mg/kg剂量范围内，能使正常小鼠蔗糖负荷后血糖升高明显减少，血糖曲线下面积也明显小于对照组，试验组和阳性对照组结果无明显差异(图1)。

◆有效部位对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖升高的影响

五组四氧嘧啶糖尿病小鼠，分别设阴性对照组、阳性对照药拜糖苹组(10mg/kg)以及不同剂量给药组(10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg)。结果表明，桑枝有效部位使四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖负荷后血糖峰值降低并后移，血糖曲线下面积减少，20mg/kg与40mg/kg给药组效果优于阳性对照组(图2)。

附图说明

图1：桑枝有效部位对正常小鼠蔗糖负荷后血糖曲线的影响

图2：桑枝有效部位对四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖负荷后血糖变化的影响

图3：有效部位口嚼片对健康志愿受试者馒头实验血糖变化的影响(n＝8)

具体实施方式

以下将通过实施例进一步描述本发明，但这些实施例仅是说明本发明，而不应理解为对本发明范围的任何限制。

实施例1：总生物碱有效部位制备及测定

鲜嫩桑枝，粉碎，晾干，取350kg，加去离子水2000L，加热回流2小时，重复提取2次，合并提取液，浓缩至250L，加入700L乙醇，沉淀24小时，过滤，取上清液，上732^#阳离子树脂，以蒸馏水洗至中性，用0.5N的氨水洗脱，收集洗脱液，上Dowex1×2(OH-)阴离子交换树脂，收集不吸附部分，收集液经减压浓缩干燥，得淡黄色粉末530g，收率为1.51‰。

取上述干燥物，加水溶解，照柱前衍生化-HPLC法测定，以化合物(1)作对照，按外标法计算，生物碱总含量为55％，其中化合物(1)即1-deoxynojirimycin为29％。化合物(1)在一组生物碱中所占重量百分比为29％÷55％＝52.7％。

实施例2：桑枝降糖有效部位片剂制备

取实施例1制备的有效部位10g，加入磷酸二氢钙5g，乳糖15g，硬脂酸镁0.3g，分别过80目筛，混匀，用70％乙醇制软材，20目筛制粒，干燥，14目筛整粒，压片，片重约300mg，每片含有效部位提取物100mg，总生物碱50mg。

实施例3：桑枝降糖有效部位胶囊制备

取实施例1制备的有效部位10g，加入磷酸二氢钙5g，乳糖5g，硬脂酸镁0.3g，分别过80目筛，混匀，用70％乙醇制软材，20目筛制粒，干燥，40目筛整粒，装入2号硬胶囊，内容物约200mg，每片含有效部位提取物100mg，总生物碱50mg。

实施例4：桑枝降糖有效部位口服液制备

取实施例1制备的有效部位10g，加蒸馏水溶解并稀释至500ml，加入0.05％苯甲酸，亦可加入适量调味剂，分装于5ml或10ml的小瓶中，压盖，即得。每瓶含有效部位提取物100-200mg，总生物碱50-100mg。

实施例5：桑枝降糖有效部位滴丸制备

取聚乙二醇6000(PEG6000)50g，加热到100℃熔融，加入实施例1制备的有效部位10g，搅拌制备均匀的熔融液，恒温条件下将熔融液倾至滴丸机贮液缸中，滴液至液体石蜡中，冷却成形，洗去液体石蜡，干燥，即得。每粒滴丸重约30mg，含有效部位5mg，总生物碱2.5mg。

实施例6：桑枝降糖有效部位分散片制备

取实施例1制备的有效部位10g，加入磷酸二氢钙20g，乳糖5g，甘露醇15g，交联聚乙吡咯烷酮10g，硬脂酸镁0.3g，分别过80目筛，混匀，用70％乙醇制软材，20目筛制粒，干燥，14目筛整粒，压片，片重约600mg，每片含有效部位提取物100mg，总生物碱50mg。

实施例7：桑枝降糖有效部位口嚼片制备及降血糖作用

取实施例1制备的有效部位10g，加入磷酸二氢钙5g，乳糖5g，甘露醇15g，硬脂酸镁0.3g，分别过80目筛，混匀，用70％乙醇制软材，20目筛制粒，干燥，14目筛整粒，压片，片重约300mg，每片含有效部位提取物100mg，总生物碱50mg。

本研究组8名工作人员作为健康志愿受试者，先后进行3次馒头实验，一次仅食馒头(100g)作为对照，另两次分别食馒头与不同剂量(50mg/人、100mg/人)的有效部位口嚼片。实验前空腹过夜，食馒头前(作为“0”时)及后1小时及2小时测血糖水平。结果表明，口嚼片在每人50mg和100mg剂量下，能使健康志愿受试者馒头餐后血糖峰值明显降低，曲线下面积减少(图3)。

Claims

1.一种具有降血糖活性的生物碱有效部位，其特征在于，该有效部位是从桑枝中提取、分离和精制后得到的淡黄色或浅棕色粉末，有效部位中的活性成分为一组多羟基生物碱组合物，总生物碱含量占提取物的重量百分比在50％以上，其中多羟基生物碱组合物由1-deoxynojirimycin(1)和N-methly-1-deoxynojirimycin(2)、fagomine(3)、3-epi-fagomine(4)、1，4-dideoxy-1，4-imino-D-arabinitol(5)、1，4-dideoxy-1，4-imino-D-ribitol(6)、calysteginB₂(7)、calysteginC₁(8)、2-O-(α-D-galactopyranosyl)-1-deoxynojirimycin(9)、6-O-(β-D-glucopyranosyl)-1-deoxynojirimycin(17)、1，4-dideoxy-1，4-imino-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-D-arabinitol(18)中的至少一种组成，其中，1-deoxynojirimycin的重量百分比不低于总生物碱的50％。

2.一种具有降血糖活性的药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的权利要求1的生物碱有效部位和药剂学上允许的赋形剂。

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为普通片、分散片、口嚼片、胶囊、颗粒剂、冲剂、滴丸或口服液。

4.根据权利要求3的药物组合物，其特征在于，其中生物碱有效部位按有效部位提取物计为25-400mg/片。

5.根据权利要求4的药物组合物，其特征在于，其中生物碱有效部位按有效部位提取物计为50-200mg/片。

6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于，其中生物碱有效部位按有效部位提取物计为100-200mg/片。