发明内容
本发明的目的在于提供一种较纯的独一味有效成分,制备止痛止血药物,以便更好的控制产品质量。另一目的是提供这种提取物的制备方法。
本发明的技术方案是:由唇形科植物独一味药材用水提取乙醇沉淀法或乙醇提取水沉淀法或乙醇渗漉提取法得到的提取液,经大孔树脂吸附柱层析分离后得到的粗提物,再经聚酰胺柱和/或硅胶柱层析分离纯化得到的提取物,提取物以干品计含有苯丙素苷类活性成分的百分重量为22~90%。
苯丙素苷类物质具有抗肿瘤(中国药学杂志,1995,30(5):269)和抗血小板聚集等用途(第二军医大学学报,2004,25(8):920)。本发明从植物独一味中提取分离得到了含有苯丙素苷类的物质,并发现了其具有止痛止血的作用,可用于制备止痛、止血的药物。
本发明得到的苯丙素苷类物质,具体是指pedicularioside A,和lamiophlomioside A。从而可以用这两种物质作为对照品,来作定性和定量控制产品的质量。对照品pedicularioside A,和lamiophlomioside A的制备方法概述如下:
从下述实施例6中得到的含苯丙素苷活性成分的提取物,在C18制备型高效液相上反复上柱,以30%甲醇水溶液洗脱,依次收集含量最高的两个物质。测定该二个物质的光谱数据,确定其结构,其结构式见附图。
物质1的光谱数据与Phytochemistry,1991,30:3745-3747文献资料中pedicularioside A的光谱数据完全一致,得以确证结构,结构式见附图1,以下用此作对照品1。物质2的光谱数据与药学学报,1995,30(3):206-210文献资料中lamiophlomioside A的光谱数据完全一致,得以确证结构,结构式见附图2,以下用此作对照品2。
其定性定量控制产品的方法采用高效液相色谱法:以对照品制作工作曲线,待测物与对照品在同一保留时间处出峰,记录其峰面积,由工作曲线计算含量,从而苯丙素苷类成分得以定性和定量测定。
pedicularioside A含量测定:
对照品溶液的制备取经五氧化二磷干燥过夜的pedicularioside A对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含10μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取供试品150mg,精密称定,置25ml量瓶中,摇匀,滤过,转移至25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl,注入液相色谱仪,按中国药典附录HPLC法测定,即得。
lamiophlomioside A含量测定:
对照品溶液的制备取经五氧化二磷干燥过夜的lamiophlomioside A对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含10μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取本品内容物150mg,精密称定,置25ml量瓶中,摇匀,滤过,转移至25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl,注入液相色谱仪,按中国药典附录HPLC法测定,即得。
pedicularioside A和lamiophlomioside A的含量总和即为该供试品中苯丙素苷类成分的含量。
本发明所提供的植物提取物的制备方法,是采用以下步骤进行:
(1)提取:采用唇形科植物独一味为原料,经制药工艺通用的水提取乙醇沉淀法或乙醇提取水沉淀法或乙醇渗漉提取法得到的提取液;
(2)分离:将步骤(1)所得的提取液通过大孔树脂吸附,待提取液全部通过树脂柱后,用水或低于20%的乙醇溶液冲洗树脂柱,至洗脱液近无色为止,续以30~80%的乙醇溶液进行洗脱,收集乙醇洗脱液,
a.回收乙醇后的溶液,经粒度为80~200目的聚酰胺柱吸附,以10~95%乙醇溶液梯度洗脱,收集30~95%的乙醇溶液的洗脱液,回收溶剂后干燥即得苯丙素苷类活性成分的提取物;
或b.回收乙醇后的溶液,经粒度为80~200目的硅胶柱吸附,以10~95%乙酸乙酯的甲醇溶液梯度洗脱,收集10~80%乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液,回收溶剂后干燥即得苯丙素苷类活性成分的提取物;
或c.由a得到的30~95%乙醇溶液的洗脱液,回收乙醇后的溶液再按b步骤处理,得到含苯丙素苷类活性成分的提取物。
具体优选的提取工艺是:
步骤(1)提取a.水提取乙醇沉淀法:称取药材粗粉,加水煎煮1~3次,合并各次水煎液,浓缩至相对密度约1.02~1.12(24℃),加乙醇调节醇浓度到30~70%,静置,待沉淀完全后,倾出上清液,过滤,药液浓缩至相对密度在24℃时测为1.02~1.12,备用;
b.所说的乙醇提取水沉淀法:称取药材粗粉,加40~90%乙醇溶液回流提取,回收乙醇,药液浓缩至相对密度约1.02~1.12(24℃),加2~4倍量水混合搅拌均匀,静置,待沉淀完全后,倾出上清液,药液浓缩至相对密度在24℃时测为1.02~1.12,备用;
c.所说的乙醇渗漉提取法:称取独一味药材粗粉,加40~90%乙醇浸泡后,进行渗滤,收集渗漉液,回收乙醇,药液浓缩至相对密度约1.02~1.12(24℃),加2~4倍量水混合搅拌均匀,静置,待沉淀完全后,倾出上清液,药液浓缩至相对密度在24℃时测为1.02~1.12,备用。
步骤(2)分离时所用的大孔树脂优选为非极性或弱极性的大孔树脂。
本发明所提供的植物提取物的用途,是用于制备止痛、止血的药物。尤其是用于制备治疗外科手术后的刀口疼痛、出血,外伤骨折等各种疼痛与出血等病的药物。该药物是以常规的中药制剂方法,取含苯丙素苷类活性成分的独一味植物提取物,添加药学上允许的辅料制成任何一种口服制剂的药物,如片剂、分散片、颗粒剂、胶囊剂、合剂、口服液、糖浆剂、丸剂、滴丸剂。为降低生产成本,制成口服制剂所采用的提取物以含苯丙素苷类活性成分22~55%即可。
下面用本发明所提供的植物提取物通过药效学试验证明其可用于制备止痛、止血的药物,尤其是适用于制备治疗外科手术后的刀口疼痛、出血,外伤骨折等各种疼痛与出血等病的药物。
一.镇痛实验:
1材料
1.1动物:昆明种小白鼠,体重18-22g,醋酸扭体法雌雄各半,热板法全部为雌性。
1.2主要药品和试剂:杜冷丁为医院用药。
“独一味水提物”为自制:是采用中国药典一部所述的方法,用独一味药材以8倍量水煎煮三次,每次1.5小时,所得溶液浓缩到比重为1.2g/ml浓度的提取物。
试验样品:分别取下述实施例2、4、6的提取物,含苯丙素苷类活性成分分别为22%,52%和90%分别作试验组1、2、3。
2实验方法
2.1小鼠醋酸扭体法:
动物随机分为正常对照、杜冷丁、独一味水提物,试验组1、2、3,共六组。正常对照组以生理盐水给药;独一味水提物组以1.2g/kg(提取物/体重)剂量给药,试验组的给药剂量相同,都是0.06g/kg(提取物/体重)。连续灌胃给药3天,末次给药后30分钟,腹腔注射0.6%醋酸0.1ml/只,观察10分钟内引起的扭体次数。各组数据处理采用两样本均数比较的t检验,并在SPSS统计软件下进行计算。
2.2热板法:
动物随机分为正常对照、杜冷丁、独一味水提物,试验组1、2、3,共六组。各组按剂量连续灌胃给药7天,使用热板法,分别测定末次给药的小鼠痛阈值。各组数据处理采用两样本均数比较的t检验,并在SPSS统计软件下进行计算。
3结果
表1扭体实验测定不同提取物对小鼠的止痛作用(X±SD)
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数 |
扭体次数 |
P |
空白对照 |
|
12 |
42.33±9.3 |
|
杜冷丁 |
0.05 |
12 |
10.5±3.8 |
<0.01 |
独一味水提物 |
1.2 |
12 |
29.8±8.8 |
>0.05 |
试验组1 |
0.06 |
12 |
23.08±7.3 |
<0.01 |
试验组2 |
0.06 |
12 |
17.24±6.8 |
<0.01 |
试验组3 |
0.06 |
12 |
10.58±3.8 |
<0.01 |
表2热板法测定不同提取物对小鼠的止痛作用(X±SD)
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数 |
添足时间(S) |
P |
空白对照 |
|
12 |
15.4±8.6 |
|
杜冷丁 |
0.05 |
12 |
35.9±15.2 |
<0.01 |
独一味水提物 |
1.2 |
12 |
21.8±12.9 |
<0.01 |
试验组1 |
0.06 |
12 |
25.8±6.30 |
<0.05 |
试验组2 |
0.06 |
12 |
26.6±19.8 |
<0.05 |
试验组3 |
0.06 |
12 |
33.2±18.6 |
<0.05 |
结果显示苯丙素苷类活性成分可减少小鼠的扭体反应次数,有镇痛作用,与正常相比有明显差异,镇痛效果明显。
二、止血实验
1.1动物:昆明种小白鼠,体重18-22g,雌雄各半。
1.2主要药品和试剂:同镇痛实验。
2实验方法
2.1剪尾法:
动物随机分为正常对照、试验组1、2、3,共五组。正常对照组以生理盐水给药;独一味水提物组以1.2g/kg剂量给药,三个试验组的给药剂量相同,都是0.06g/kg。连续灌胃给药7天,末次给药后固定,测定鼠尾长度并标记,30-40min后分别将小鼠尾尖3mm处横断,待血液自行溢出开始计时,每隔30s用滤纸吸去血滴,直至血液自然停止,计算凝血时间。各组数据处理采用两样本均数比较的t检验,并在SPSS统计软件下进行计算。
2.2玻片法
动物随机分为正常对照、独一味水提物,试验组1、2、3,共五组。灌胃给药3天,末次给药后30分钟,于载玻片两端各滴一滴小鼠眼球血液,立即用秒表计时,每隔30秒观察是否有血丝产生,记录凝血时间,取其平均值。各组数据处理采用两样本均数比较的t检验,并在SPSS统计软件下进行计算。
3结果
表3不同提取物对正常小鼠出血时间的影响(X±SD)
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数 |
凝血时间(S) |
P |
空白对照 |
|
12 |
135.83±19.77 |
|
独一味水提物 |
1.2 |
12 |
85.6±20.8 |
<0.01 |
试验组1 |
0.06 |
12 |
80.4±18.4 |
<0.01 |
试验组2 |
0.06 |
12 |
74.61±12.3 |
<0.01 |
试验组3 |
0.06 |
12 |
62.6.2±18.6 |
<0.01 |
表4同提取物对正常小鼠凝血时间的影响(X±SD)
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数 |
凝血时间(S) |
P |
空白对照 |
|
12 |
135.83±19.77 |
|
独一味水提物 |
1.2 |
12 |
102.50±8.29 |
<0.01 |
试验组1 |
0.06 |
12 |
95.8±6.30 |
<0.01 |
试验组2 |
0.06 |
12 |
89.42±14.13 |
<0.01 |
试验组3 |
0.06 |
12 |
75.42±24.19 |
<0.01 |
结论:
从上述实验结果,可以看出:
1.将药材的粗提物进一步分离提纯到有效部位,提高了药物疗效,能显著减少病人的服用量,单位剂量相当于生药量高,提高疗效。
2.本药物的特点是:既可止痛又可止血。因此特别适合用于外科手术后的刀口疼痛、出血,以及外伤骨折等各种疼痛伴随出血等症。
本发明的有益效果是:1、独一味提取物的药用有效成分明确。2、产品质量的可控性高,可以用高效液相色谱法测定提取物中的苯丙素苷类含量。3、制备方法适用于工业化批量生产。
具体实施方式:
实施例1:
称取独一味药材粗粉100kg,加水800kg煎煮1.5小时,药渣再加水1000kg煎煮1.5小时,合并水煎液,浓缩至相对密度约1.02,加乙醇调节醇浓度到30%,静置。待沉淀完全后,取上清液过滤,并浓缩至相对密度约1.05。将此浓缩液过WLD大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用水冲洗树脂柱,至水洗脱液近无色为止,续以30%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。回收溶剂浓缩,烘干,用前述HPLC分析方法测得,含苯丙素苷类活性成分10%。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为80-200目的聚酰胺柱吸附,以30%乙醇梯度变化到95%洗脱,收集50~85%乙醇的洗脱液,回收溶剂后浓缩至相对密度1.12,烘干即得到提取物6kg。用前述HPLC分析方法测得,含苯丙素苷类活性成分40%(以干品重量计,下同)。
实施例2:
称取独一味药材粗粉100kg,加水900kg煎煮2小时,药渣再加水900kg煎煮2小时,合并水煎液,浓缩至相对密度约1.05,加乙醇调节醇浓度到50%,静置。待沉淀完全后,取上清液过滤,并浓缩至相对密度约1.07。将此浓缩液过ZTC-5大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用水冲洗树脂柱,至水洗脱液近无色为止,续以50%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为100-200目的硅胶柱吸附,以30%乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到85%洗脱,收集30~85%乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液,回收溶剂后浓缩至相对密度1.25,减压干燥即得到提取物8kg。测得含苯丙素苷类成分为22%。
实施例3:
称取独一味药材粗粉100kg,加水1000kg煎煮2小时,药渣再加水1000kg煎煮2小时,合并水煎液,浓缩至相对密度约1.09,加乙醇调节醇浓度到70%,静置。待沉淀完全后,取上清液过滤,并浓缩至相对密度约1.08。将此浓缩液过HPD-100大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用20%乙醇冲洗树脂柱,至洗脱液近无色为止,续以80%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为120-200目的聚酰胺柱吸附,以30%乙醇梯度变化到85%洗脱,收集40~80%乙醇的洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,再经粒度为80-100目的硅胶柱吸附,以30%乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到85%洗脱,收集40~80%乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液。回收溶剂后浓缩至相对密度1.06,喷雾干燥即得到提取物4.5kg。测得含苯丙素苷类成分为60%。
实施例4:
称取独一味药材的粗粉100kg,加40%乙醇800kg回流提取3次,合并醇提液,回收乙醇,药液浓缩至相对密度1.02,加适量水混合搅拌均匀,静置。待沉淀完全后,倾出上清液,过滤,药液浓缩至相对密度约1.04。将此浓缩液过HPD-450大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用水冲洗树脂柱,至洗脱液近无色为止,续以40%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为80-200目的聚酰胺柱吸附,以30%乙醇梯度变化到85%洗脱,收集40~85%乙醇的洗脱液,回收溶剂后浓缩至相对密度1.06,喷雾干燥即得到提取物4.9kg。测得含苯丙素苷类成分为52%。
实施例5:
称取独一味药材的粗粉100kg,加60%乙醇900kg回流提取3次,合并醇提液,回收乙醇,药液浓缩至相对密度1.05,加适量水混合搅拌均匀,静置。待沉淀完全后,倾出上清液,过滤,药液浓缩至相对密度约1.04。将此浓缩液过AB-8大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用10%乙醇冲洗树脂柱,至洗脱液近无色为止,续以60%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为100-200目的硅胶柱吸附,以30%乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到85%洗脱,收集40~90%乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液,回收溶剂后浓缩至相对密度1.07,喷雾干燥即得到提取物5.8kg。测得含苯丙素苷类成分为63%。
实施例6:
称取独一味药材的粗粉100kg,加80%乙醇1000kg回流提取3次,合并醇提液,回收乙醇,药液浓缩至相对密度1.08,加适量水混合搅拌均匀,静置。待沉淀完全后,倾出上清液,过滤,药液浓缩至相对密度约1.08。将此浓缩液过HPD-100大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用20%乙醇冲洗树脂柱,至洗脱液近无色为止,续以80%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为120-200目的聚酰胺柱吸附,以30%乙醇梯度变化到95%洗脱,收集40~80%乙醇的洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,再经粒度为120-200目的硅胶柱吸附,以30%乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到95%洗脱,收集40~80%乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液。回收溶剂后浓缩至相对密度1.08,喷雾干燥即得到提取物3.8kg测得含苯丙素苷类成分为90%。
实施例7:
称取独一味药材的粗粉10kg,加50%乙醇浸泡后,以3ml/分钟的速度进行渗滤,收集渗漉液,回收乙醇,药液浓缩至相对密度1.1,加适量水混合搅拌均匀,静置。待沉淀完全后,倾出上清液,过滤,药液浓缩至相对密度1.06。将此浓缩液过HPD-100大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用水冲洗树脂柱,至洗脱液近无色为止,续以40%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为80-200目的聚酰胺柱吸附,以30%乙醇梯度变化到95%洗脱,收集40~85%乙醇的洗脱液,回收溶剂后浓缩至相对密度1.05,喷雾干燥即得到提取物0.58kg。测得含苯丙素苷类成分为45%。
实施例8:
称取独一味药材的粗粉10kg,加70%乙醇浸泡后,以5ml/分钟的速度进行渗滤,收集渗漉液,回收乙醇,药液浓缩至相对密度1.08,加适量水混合搅拌均匀,静置。待沉淀完全后,倾出上清液,过滤,药液浓缩至相对密度1.08。将此浓缩液过AB-8大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用20%乙醇冲洗树脂柱,至洗脱液近无色为止,续以70%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为100-200目的硅胶柱吸附,以30%乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到95%洗脱,收集40~80%乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液,回收溶剂后浓缩至相对密度1.06,喷雾干燥即得到提取物0.6kg。测得含苯丙素苷类成分为43%。
实施例9:
称取独一味药材的粗粉10kg,加50%乙醇浸泡后,以3ml/分钟的速度进行渗滤,收集渗漉液,回收乙醇,药液浓缩至相对密度1.1,加适量水混合搅拌均匀,静置。待沉淀完全后,倾出上清液,过滤,药液浓缩至相对密度1.06。将此浓缩液过HPD-100大孔树脂,待浓缩液全部通过树脂柱后,用水冲洗树脂柱,至洗脱液近无色为止,续以40%乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱,收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,经粒度为80-200目的聚酰胺柱吸附,以30%乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到95%洗脱,收集40~85%乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液。减压回收乙醇后的溶液,再经粒度为80-200目的硅胶柱吸附,以30%乙醇梯度变化到95%洗脱,收集40~85%乙醇的洗脱液。回收溶剂后浓缩至相对密度1.05,喷雾干燥即得到提取物0.45kg。测得含苯丙素苷类成分为84%。
下面用上述实施例4制得的活性提取物制备各种口服剂型:
实施例A、片剂:
取所述的含有苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末约150克,加糖粉、糊精适量,与6%的羧甲基淀粉钠混合,过100目筛,用70%的乙醇湿法制粒,干燥整粒后加入适量硬脂酸镁混合压片。制成1000片,每片重约0.3g,相当于3g生药。每片含pedicularioside A约45mg,含lamiophlomioside A约33mg。口服,每次一片,每日3次。
实施例B、胶囊剂
取所述的含有苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末150g,加淀粉适量,与10%的羧甲基淀粉钠混合,过100目筛,制粒,烘干,灌入1号胶囊,制成1000粒,每粒重约0.25g,相当于3g生药。每片含pedicularioside A约45mg,含lamiophlomioside A约33mg。每次1粒,每日3次。
实施例C、分散片
取所述的含有苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末150克,与16%的羧甲基淀粉钠混匀,过100目筛,适量低取代羟丙基甲基纤维素,用聚乙烯吡咯烷酮乙醇液制软材,湿法制粒,干燥整粒后加入适量硬脂酸镁混合压片。制成1000片,每片重约0.3g,相当于3g生药。每片含pedicularioside A约45mg,含lamiophlomioside A约33mg。口服,每次一片,每日3次。按中国药典崩解时限方法检查,样品应在3分钟内崩解。
实施例D、口服液
取所述的含有苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末约150g,加入少量热水溶解,搅匀,加入适量单糖浆,加水至1000ml,调节pH值至6-7,滤过,灌封,灭菌,即得。规格:10ml/支,相当于3g生药。每支含pediculariosideA约45mg,含lamiophlomioside A约33mg。口服,每次一支,每日3次。
实施例E、滴丸剂
取所述的含有苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末150g,过120目筛,加入到约250g熔融的聚乙二醇6000与4000的混合液中,充分混合,于滴丸机上以70℃的药液温度滴制成10000粒滴丸,每粒重约50mg。每10粒相当于3g生药。每10粒含pedicularioside A约45mg,含lamiophlomiosideA约33mg。口服,每次6粒,每日3次。
实施例F、糖浆剂
取所述的含有苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末约150g,加入少量热水溶解,搅匀,加入适量单糖浆,加水至1000ml,调节pH值至6~7,滤过,灌封,灭菌,即得。规格:100ml/瓶,相当于30g生药。每10ml含pedicularioside A约45mg,含lamiophlomioside A约33mg。口服,每次口服10ml,每日3次。
实施例G、颗粒剂
取所述的含有苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末150g,加入适量乳糖与糊精混合均匀,湿法制粒,干燥整粒,分包装。制成1000g,每包2g。相当于3g生药。每包含pedicularioside A约45mg,含lamiophlomioside A约33mg。口服,每次一包,每日3次。