CN108567802B - 一种黄蜀葵花黄酮类有效部位及其制备方法与应用 - Google Patents

一种黄蜀葵花黄酮类有效部位及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄蜀葵花黄酮类有效部位及其制备方法与应用。与现有技术相比，本发明的黄蜀葵花黄酮类有效部位，提高了黄蜀葵花提取物中肾脏保护有效成分的含量，在起到相同疗效的情况下减少患者给药剂量，改善患者依从性。

Description

一种黄蜀葵花黄酮类有效部位及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种黄蜀葵花黄酮类有效部位及其制备方法与应用。
背景技术
黄蜀葵花为锦葵科植物黄蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic.的干燥花冠。黄蜀葵花最早记载于《嘉祐本草》，现收载于《中国药典》2015版，具有清利湿热，消肿解毒的功效，用于湿热壅遏，淋浊水肿等。现代医学研究证明，黄蜀葵花具有较好的保护肾脏、改善肾功能、治疗慢性肾炎等作用。黄蜀葵花提取物已由江苏苏中药业集团股份有限公司开发生产黄葵胶囊，具有清利湿热，解毒消肿的功效，主要用于治疗慢性肾炎，临床疗效显著。但黄葵胶囊存在因给药剂量大而出现患者依从性较差的问题，因此亟需发现其中的有效部位，提高有效成分的含量，在起到相同疗效的情况下减少患者给药剂量，改善患者依从性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种黄蜀葵花黄酮类有效部位及其制备方法与应用，以解决现有技术存在的效果不佳等问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种黄蜀葵花黄酮类有效部位，总黄酮的质量百分比为65～85％，它包括如下黄酮类成分：
Figure BDA0001742426770000011
上述黄蜀葵花黄酮类有效部位的制备方法，它包括如下步骤：
(1)将黄蜀葵花用乙醇水溶液回流提取后，过滤，合并提取液后浓缩并静置；将静置后的提取液调pH后干燥，得到黄蜀葵花提取物干浸膏；
(2)将步骤(1)中制备得到的黄蜀葵花提取物干浸膏于水中加热溶解后，除去不溶物，得到上样液；
(3)将步骤(2)中所得的上样液经大孔吸附树脂柱洗脱后，所得洗脱液经浓缩、干燥后，即得黄蜀葵花黄酮类有效部位。
步骤(1)中，回流提取所用的乙醇水溶液中，乙醇的体积百分比为80～100％；其中，每次回流提取的时间为1～2h，共回流提取1～3次。
步骤(1)中，浓缩的方法为减压浓缩；静置的方法为在4℃下静置。
步骤(1)中，静置后的提取液先去除油层后，再调pH。
步骤(1)中，调pH所用试剂为氢氧化钠，pH调整至6.0～7.0；其中，干燥的方法为减压干燥。
步骤(2)中，所述的加热溶解的方法为：加热至70～90℃助溶10～60分钟。
步骤(3)中，所述大孔树脂的型号为HPD-100，购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。
步骤(3)中，大孔树脂柱吸附洗脱方法为：先将上样液以0.5-3个床体积/小时的流速通过大孔吸附树脂柱，静置0～8小时；用2～6个床体积的水以0.5-3个床体积/小时的流速冲洗；用2～6个床体积的25～35％乙醇以0.5-3个床体积/小时的流速冲洗；用4～8个床体积的45～60％乙醇以0.5-3个床体积/小时的流速冲洗；用1～4个床体积的95～100％乙醇以0.5-3个床体积/小时的流速冲洗；收集45～60％乙醇洗脱液。
步骤(3)中，洗脱液浓缩的方法为减压浓缩，干燥的方法为减压干燥。
其中，优选的制备方法为：
(1)黄蜀葵花用80％～100％乙醇回流提取1～3次，每次1～1.5小时，过滤，合并滤液回收乙醇至尽，浓缩液静置24～48小时，去除冷藏液的油层，调pH值6.0～7.0，快速干燥，得黄蜀葵花提取物干浸膏；
(2)将黄蜀葵花提取物干浸膏混悬于水中，70～90℃加热助溶20～60分钟，去除不溶物，得大孔吸附树脂上样液；
(3)将大孔吸附树脂上样液以1-3个床体积/小时的流速通过大孔吸附树脂柱，静置1～8小时；用2～5个床体积的水以1-3个床体积/小时的流速冲洗；用2～5个床体积的25～35％乙醇以1-3个床体积/小时的流速冲洗；用4～7个床体积的45～60％乙醇以1-3个床体积/小时的流速冲洗；用12～4个床体积的95～100％乙醇以1-3个床体积/小时的流速冲洗；收集45～60％乙醇洗脱液浓缩、干燥，即得黄蜀葵花黄酮类有效部位。
上述黄蜀葵花黄酮类有效部位在制备治疗肾病药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述的肾病为慢性肾炎。
上述黄蜀葵花黄酮类有效部位在抗阿霉素损伤HK-2细胞中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述黄蜀葵花黄酮类有效部位在减少脂多糖诱导RAW264.7细胞NO释放的应用也在本发明的保护范围之内。
进一步地，所述药物，由黄蜀葵花黄酮类有效部位和药学上可接受的载体组成。所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂等。
所述填充剂可采用淀粉、蔗糖或微晶纤维素；所述粘合剂可采用淀粉浆、羟丙纤维素、明胶或聚乙二醇；所述湿润剂可采用硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇类；所述吸收促进剂可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述表面活性剂可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外，还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
所属药物的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂；可制成常规、速释、缓释或延迟释放制剂。
本发明所述的药物还可以通过各种途径给予，包括：口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射、静脉注射等。
有益效果：
通过实验发现，黄蜀葵花黄酮类有效部位浓度在100μg/mL以下时，其对细胞的增殖无影响，故，作为优选，所述的应用中，黄蜀葵花黄酮类有效部位的浓度≤100μg/mL；更进一步地，所述黄蜀葵花黄酮类有效部位的浓度为6.3～100μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明提供了黄蜀葵花黄酮类有效部位、制备方法及其应用。其中黄蜀葵花黄酮类有效部位相比与黄蜀葵花提取物，有效成分的含量显著提高，可以在起到相同疗效的情况下减少患者给药剂量，改善患者依从性。黄蜀葵花黄酮类有效部位制备方法重复性好。
附图说明
图1为实施例6中黄葵浸膏及黄酮类部位对阿霉素损伤HK-2细胞的保护作用的比较；
其中，数据用均数±标准差表示，n＝3，##p<0.001vs.Control组，*p<0.05vs.Model组，**p<0.01vs.Model组；
图2为实施例7中黄葵浸膏及黄酮类部位对LPS诱导RAW264.7细胞NO释放的抑制作用的比较；
其中，数据用均数±标准差表示，n＝3，##p<0.001vs.Control组，*p<0.05vs.Model组，**p<0.01vs.Model组。
具体实施方式
下述实施例中，采用的材料与试剂，如下：
人肾近端小管上皮细胞系(Human kidney proximal tubular epithelial line,HK-2)和小鼠巨噬细胞RAW264.7均购自中科院上海细胞库；DMEM/F-12培养基、DMEM培养基、胰酶-EDTA购自Corning公司，胎牛血清(FBS)、抗生素(青霉素，链霉素)均购于Gibco公司；噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)购自Sigma公司；盐酸阿霉素购自阿拉丁公司；金丝桃苷购自上海融禾医药科技发展有限公司；乙腈(色谱纯)购自Merck公司；甲酸(色谱纯)购自ROC Scientific公司；水由Milli-Q超纯水系统制得；大孔吸附树脂HPD-100购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司；其它化学试剂均为分析纯。
实施例1、大孔树脂除杂过程
取HPD-100大孔树脂，湿法装柱(4cm*20cm)，床体积(BV)为250mL。上样4.0mg/mL黄蜀葵花提取物溶液250mL。先以4BV水洗脱，再以低浓度乙醇溶液除杂，最后以70％乙醇溶液4BV解吸。解吸液回收乙醇，取部分测固含量，用《一测多评法测定黄蜀葵花中7个黄酮类成分》中报道的UPLC法测定其中黄酮类成分的含量，下同。
选取除杂溶液乙醇浓度、除杂溶液体积、洗脱流速为考察因素，每个因素设计3个水平，进行正交试验，以洗脱液中7种黄酮类成分含量比例为评价指标，洗脱组成对纯化效果的影响，见表1。同时，考察了不同浓度、不同用量、不同流速乙醇溶液对除杂效果的影响，结果见表2。
表1
Figure BDA0001742426770000041
Figure BDA0001742426770000051
表2
Figure BDA0001742426770000052
可看出，纯化所用的乙醇浓度越大，纯化效果越好；乙醇用量越大，纯化效果越好；流速对纯化效果影响不大。
由上述结果可知，用30％乙醇溶液4BV，以60mL/(cm2·h)的流速纯化效果最佳。
实施例2、大孔树脂解吸过程
取HPD-100大孔树脂，湿法装柱(4cm*20cm)，床体积(BV)为250mL。上样4.0mg/mL黄蜀葵花提取物溶液250mL。先以4BV水洗脱，再以30％乙醇溶液除杂，最后以较高乙醇溶液解吸。解吸液回收乙醇，取部分测固含量，用UPLC法测定其中黄酮类成分的含量。
选取解吸溶液乙醇浓度、解吸溶液体积、洗脱流速为考察因素，每个因素设计3个水平，进行正交试验，见表3。
表3
Figure BDA0001742426770000061
采用正交设计，考察了不同浓度、不同用量、不同流速乙醇溶液在解吸过程中对纯度的影响，结果见表4。
表4
Figure BDA0001742426770000062
解吸所用的乙醇浓度越小，洗脱物的纯度越好；乙醇用量越大，洗脱物的纯度越好；流速对解吸过程影响不大。
由上述结果可知，用50％乙醇溶液6BV，以2BV/h的流速解吸，洗脱物的纯度最佳。
实施例3、大孔树脂纯化放大试验
取HPD-100大孔树脂，湿法装柱(9cm*45cm)，床体积(BV)为2.86L。上样25mg/mL黄蜀葵花提取物溶液5.72L。按优选的工艺条件进行纯化，收集解吸液，浓缩，干燥。
用UPLC法测定其中7种黄酮类成分的含量，达到51.43％；而在黄葵干浸膏中7种黄酮类成分含量为8.29％。用紫外分光光度法，以金丝桃苷为对照品，测定总黄酮含量，达到70.56％；而在黄葵干浸膏中总黄酮含量为20.25％。
说明该黄葵黄酮类部位纯化方法在放大后，仍具有较好的纯化黄酮类成分的效果。
实施例4、细胞的培养
HK-2细胞复苏后用含10％FBS的DMEM/F-12培养基，RAW264.7细胞用含10％FBS的DMEM培养基，均在37℃，5％CO2条件下培养。当细胞长至90％后，用胰酶-EDTA消化，传代。取对数生长期的细胞用于实验。
实施例5、对细胞增殖的影响
取对数生长期的HK-2细胞和RAW264.7细胞，分别以5000个细胞/孔及3000个细胞/孔接种于96孔培养板中，每孔体积100μL。
在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，换成含测试样的培养基继续培养24h。吸除上清液，每孔加入100μL含有终浓度为0.5mg/L的MTT培养液，培养箱中孵育4h。弃去上清液，每孔加入DMSO液100μL，37℃振摇10min，置酶标仪中，在580nm波长处测定吸光值。
结果发现在100μg/mL浓度下，黄葵黄酮类部位对HK-2细胞和RAW264.7细胞增殖没有明显影响。
实施例6、黄葵黄酮类部位对阿霉素损伤HK-2细胞的保护作用
取对数生长期的HK-2细胞以5000个细胞/孔接种于96孔培养板中，每孔体积100μL。
在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h备用。空白对照组，只加培养液；模型组，加入含有阿霉素(终浓度为10μM)的培养液；测试组，加入含有阿霉素(终浓度为10μM)及不同浓度测试样品的培养液。继续培养24h后，吸除上清液，每孔加入100μL含有终浓度为0.5mg/L的MTT培养液，培养箱中孵育4h。弃去上清液，每孔加入DMSO液100μL，37℃振摇10min，置酶标仪中，在580nm波长处测定吸光值。
结果见图1。发现黄葵黄酮部位对阿霉素损伤HK-2细胞的保护作用，在同样浓度下明显强于黄葵干浸膏。黄葵黄酮部位在25μg/mL浓度下对阿霉素损伤HK-2细胞的保护作用与黄葵干浸膏100μg/mL浓度下的作用相当。
实施例7、黄葵黄酮类部位对LPS诱导RAW264.7细胞NO释放的抑制作用
取对数生长期的RAW264.7细胞以20000个细胞/孔接种于96孔培养板中，每孔体积100μL。
在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h备用。空白对照组，只加培养液；模型组，加入含有200ng/mL的LPS的培养液；测试组，加入含有200ng/mL的LPS及不同浓度测试样品的培养液。继续培养24h后，用Griess法检测上清液中的NO含量。
结果如图2所示，可见黄葵黄酮部位在6.3-50μM浓度下具有显著的抗炎作用，在同样浓度下明显强于黄葵干浸膏。黄葵黄酮部位在6.3μg/mL浓度下的抗炎作用与黄葵干浸膏25μg/mL浓度下的作用相当。
实施例8、黄葵黄酮类部位对尿蛋白的影响
SD大鼠，雌性各半，体重250-300g，分为正常组(不切肾)、空白对照组(切肾)、模型组(切肾+尾静脉注射阿霉素)、雷公藤多甙组、本发明低剂量组、本发明中剂量组、本发明高剂量组。除正常组外，其余各组将大鼠麻醉后，行左肾摘除术。10天后，待大鼠伤口愈合，状态恢复，除空白对照组外，其余各组经尾静脉注射阿霉素5mg/kg，注射三周后将大鼠分组。从注射阿霉素第三周末开始给予本发明灌胃，灌胃一周后开始测定尿蛋白，每周一次，连续五周。结果如表5所示。
表5
Figure BDA0001742426770000081
Figure BDA0001742426770000091
从上表结果可以看出，本发明低、中、高剂量均能降低大鼠尿蛋白量，且高剂量组效果好于阳性对照组。

Claims (8)

1.一种黄蜀葵花黄酮类有效部位，其特征在于，它包括如下质量百分比的黄酮类成分：
Figure FDA0003103042200000011
总黄酮的质量百分比为65～85％；其通过以下制备方法制得，具体包括如下步骤：
(1)将黄蜀葵花用浓度为80～100％乙醇水溶液回流提取后，过滤，合并提取液后浓缩并静置；将静置后的提取液调pH6.0～7.0后干燥，得到黄蜀葵花提取物干浸膏；
(2)将步骤(1)中制备得到的黄蜀葵花提取物干浸膏于水中加热溶解后，除去不溶物，得到上样液；
(3)将步骤(2)中所得的上样液经大孔树脂柱吸附洗脱后，所得洗脱液经浓缩、干燥后，即得黄蜀葵花黄酮类有效部位；其中，大孔树脂柱吸附洗脱方法为：先将上样液以0.5-3个床体积/小时的流速通过大孔吸附树脂柱，静置0～8小时；用2～6个床体积的水以0.5-3个床体积/小时的流速冲洗；用2～6个床体积的25～35％乙醇以0.5-3个床体积/小时的流速冲洗；用4～8个床体积的45～60％乙醇以0.5-3个床体积/小时的流速冲洗；用1～4个床体积的95～100％乙醇以0.5-3个床体积/小时的流速冲洗；收集45～60％乙醇洗脱液。
2.根据权利要求1所述的黄蜀葵花黄酮类有效部位，其特征在于，步骤(1)中，每次回流提取的时间为1～2h，共回流提取1～3次。
3.根据权利要求1所述的黄蜀葵花黄酮类有效部位，其特征在于，步骤(1)中静置后的提取液先去除油层后，再调pH。
4.根据权利要求1所述的黄蜀葵花黄酮类有效部位，其特征在于，步骤(1)中，调pH所用试剂为氢氧化钠；其中，干燥的方法为减压干燥。
步骤(2)中，所述的加热溶解的方法为：加热至70～90℃助溶10～60分钟。
5.根据权利要1所述的黄蜀葵花黄酮类有效部位，其特征在于，步骤(3)中，洗脱液浓缩的方法为减压浓缩，干燥的方法为减压干燥。
6.根据权利要求1所述的黄蜀葵花黄酮类有效部位，其特征在于，其步骤包括：(1)黄蜀葵花用80％～100％乙醇回流提取1～3次，每次1～1.5小时，过滤，合并滤液回收乙醇至尽，浓缩液静置24～48小时，去除冷藏液的油层，调pH值6.0～7.0，快速干燥，得黄蜀葵花提取物干浸膏；
(2)将黄蜀葵花提取物干浸膏混悬于水中，70～90℃加热助溶20～60分钟，去除不溶物，得大孔吸附树脂上样液；
(3)将大孔吸附树脂上样液以1-3个床体积/小时的流速通过大孔吸附树脂柱，静置1～8小时；用2～5个床体积的水以1-3个床体积/小时的流速冲洗；用2～5个床体积的25～35％乙醇以1-3个床体积/小时的流速冲洗；用4～7个床体积的45～60％乙醇以1-3个床体积/小时的流速冲洗；用12～4个床体积的95～100％乙醇以1-3个床体积/小时的流速冲洗；收集45～60％乙醇洗脱液浓缩、干燥，即得黄蜀葵花黄酮类有效部位。
7.权利要求1所述的黄蜀葵花黄酮类有效部位在制备治疗肾病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肾病为慢性肾炎。
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