CN116270775B - 一种黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物及其产业化大生产制备工艺 - Google Patents
一种黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物及其产业化大生产制备工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药有效部位提取技术领域，公开了一种黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物及其产业化大生产制备工艺，该制备工艺是从中药黄蜀葵花中提取分离纯化得到的总黄酮有效部位提取物，其总黄酮含量为50wt%～80wt%，金丝桃苷含量为6.4wt%～19.0wt%，异槲皮苷含量为4.4wt%～14.0wt%。该提取分离纯化工艺及大孔树脂自动层析柱应用于数十批黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的产业化大生产中，结果表明，生产工艺稳定、操作简便、过程可控、生产周期短，并可节约成本，所得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的总黄酮含量高，同批药材所得提取物批次间质量均一稳定。
Description
技术领域
本发明涉及中药有效部位提取技术领域，具体地说是从锦葵科植物黄蜀葵花的干燥花冠——黄蜀葵花中，采用产业化大生产工艺制备得到的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物。
背景技术
黄蜀葵花为锦葵科植物黄蜀葵花Abelmoschus manihot(L.)Medic.的干燥花冠，在我国历代医籍中均有记载，其药用历史久远，民间使用亦很普遍，《嘉佑本草》：“其花气味甘、寒、滑、无毒，主治小便淋及催生，治诸恶疮、脓水久不痤者，作末敷之即愈，为疮家要药，消痈疽，浸油涂烫火伤等”。我国古代也有用黄蜀葵花治疗口腔溃疡的记载，《肘后方》：“小儿口疮，烧末敷之”。现代药理学证明，黄蜀葵花中的总黄酮(TFA)具有良好的清热利湿解毒功效，进一步实验显示该药具有明显的抗炎，抑菌，镇痛，促进愈合等药理作用。
有关黄蜀葵花总黄酮作为药物用途的制备工艺，最早见于在本发明人2004年9月16日申请的中国专利“治疗口腔溃疡、胃溃疡、烧烫伤、外伤感染的药物及制备方法”(专利号：200410035741.X)中，该专利首次公开了黄蜀葵花总黄酮提取物在治疗口腔溃疡、胃溃疡、烧烫伤、外伤感染中的药物中的用途及其制备工艺，其授权文本中公开的制备工艺为：将黄蜀葵花加70～80％乙醇适量，提取1～2次，每次1～4小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩成60℃时相对密度为1.13～1.16的浓缩液；加适量水水沉24h，抽滤，浓缩至相应体积，通过大孔吸附树脂柱，采用醇水梯度洗脱，水洗脱3个柱体积，10％及30％乙醇各洗脱3个柱体积，70％乙醇洗脱1个柱体积。洗脱液浓缩、干燥、粉碎后得到总黄酮提取物，其总黄酮含量为5～95％。
上述专利申请后，发明人在按照上述专利授权文本中公开的制备工艺进行黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的产业化大生产中发现，在醇提浓缩液的密度为1.13～1.16(60℃)条件下，加适量水水沉后，还需要进一步浓缩至相应体积才可以上样，操作繁复，增加了工序和工时；其次在柱分离纯化步骤中，采用中柱(直径约10cm)分离纯化工艺研究时，树脂高度为26cm左右，加入相当约3kg药材的上柱药液，为保证树脂吸附完全，将上柱药液加入树脂柱后，用特制的不锈钢棒轻轻搅动使树脂和上柱药液混匀，再开始洗脱进行分离纯化；大生产时采用大柱(直径约25cm)，树脂高度为70cm左右，加入相当约26kg药材的上柱药液后，人工操作无法将树脂搅动起来达到上柱药液和树脂混匀的效果，若不按中试采用搅匀处理，则会产生上层树脂饱和、中层树脂半饱和、下层树脂吸附较低的现象，但稍微用力搅匀容易造成柱体树脂泄漏或沟流，影响了黄蜀葵花总黄酮提取物的质量，也影响了树脂的分离纯化效果。
在该专利200410035741.X于2008年授权之后至今，陆续检索到涉及采用大孔树脂分离纯化黄蜀葵花总黄酮提取物及/或制备方法的已授权发明专利及文献报道，对这些公开的现有技术进行分析对比，发明人发现，现有公开的制备方法均仅限于实验室阶段的研究数据，尽管上述专利及文献中的提取分离纯化工艺均不相同，但都没有产业化放大生产数据，若按照其各自公开的制备工艺进行黄蜀葵花总黄酮提取物的产业化生产，很难克服上面分析的制备工艺中的不足之处。
鉴于上述情况，需解决现有提取分离纯化工艺在产业化大生产中存在的问题，研究将原制备工艺优化改进为更加适合产业化大生产的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的制备工艺。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的黄蜀葵花总黄酮制备方法在产业化大生产中存在的上述问题，提供一种黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物及其产业化大生产制备工艺，通过优化产业化提取分离纯化工艺的系列工艺参数，结合大孔吸附树脂自动层析柱的配套操作系统，实现了黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的产业化大生产，该工艺可以显著提高黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的含量，降低生产成本，并符合GMP要求。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的产业化大生产制备工艺，包括如下步骤：
(1)将黄蜀葵花用体积分数为70％～90％的乙醇提取1～2次，每次1～4小时，滤过，得到醇提液；
(2)醇提液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.18～1.20的清膏，静置，去油，加水至相对密度为1.10～1.12，-2～4℃下冷藏20～30小时，滤过；
(3)步骤(2)所得滤液通过大孔吸附树脂自动层析柱，上柱药液与树脂的重量比为1.8～2.3:1，进行自动上样，自动混匀；
(4)水洗脱3个柱体积，体积分数为15％～25％、30％～40％、60％～70％的乙醇各洗脱3～5个柱体积；
(5)步骤(4)所得醇洗脱液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.25～1.30的稠膏，真空干燥、粉碎、过筛、混匀后即得。
本发明中的制备工艺在不改变本发明人2004年申请的中国专利“治疗口腔溃疡、胃溃疡、烧烫伤、外伤感染的药物及制备方法”(专利号：200410035741.X)授权文本中公开的黄蜀葵花总黄酮提取物制备工艺流程的前提下，①针对原发明工艺中黄蜀葵花醇提取液浓缩、水沉、又浓缩的繁琐工序，本发明筛选优化了黄蜀葵花醇提取液的浓缩密度，在保持黄酮成分含量基本一致的同时提高了除杂效果(本发明工艺浓缩密度的去油率与原发明工艺密度的去油率相比，高出约4倍)；②通过考察筛选不同上柱药液的密度，确定水沉上柱药液的适宜密度，从而去除了原发明专利中水沉后再一步的浓缩工序，减少了工时(约4～5个工时)；③针对树脂层析柱操作过程中的树脂填充、上样、洗脱等各个主要环节，本发明采用市售的自动层析树脂柱设备，实现了自动装柱、自动上样、自动混匀，克服了手工装填大柱的不均匀性、气泡、壁效应或沟流的种种问题，并根据设备特点，本发明以总黄酮含量为指标，深入研究了不同上柱药液加入量对树脂总黄酮泄漏率、提取物总黄酮含量的影响，筛选出适合自动层析树脂柱的上柱药液加入量的范围；④针对上述研究后的上柱药液加入量增加，以及树脂泄漏率明显降低的正向变化，若仍按原工艺的不同乙醇浓度梯度洗脱，则洗脱不完全，因此以总黄酮含量及总黄酮柱转移率为指标，对乙醇洗脱液的不同浓度梯度范围和用量范围工艺参数进行了深入研究和优化，研究结果表明，采用产业化大生产筛选的上柱药液加入量及乙醇洗脱梯度和用量范围，总黄酮含量和柱转移率均明显提高。通过上述工艺参数的筛选研究及自动层析柱的配套操作应用，最终建立了一整套适合黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物大生产的产业化生产工艺，经数十批产业化大生产，结果表明，该生产工艺稳定、操作简便、过程可控、生产周期短、并可节约成本，所得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的总黄酮含量高，同批药材所得提取物批次间的质量更加均一稳定，能够真正将黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的制备工艺实现自动化、产业化、规模化。
作为优选，步骤(1)中的乙醇体积分数为80％～90％，提取次数为2次，每次加醇重量分别为12～14倍、8～12倍。
作为优选，步骤(2)中采用清膏中总黄酮转移率及金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、棉皮苷、槲皮素3′-葡萄糖苷5种黄酮成分的含量作为提取分离纯化工艺的检测指标；清膏中总黄酮转移率≥70％，金丝桃苷含量≥1.19wt％，异槲皮苷含量≥0.87wt％，槲皮素含量≥0.05wt％，棉皮苷含量≥2.04wt％，槲皮素3′-葡萄糖苷含量≥0.97wt％；清膏中总黄酮转移率是清膏总黄酮总重量与药材总黄酮总重量的比值。
作为优选，步骤(2)中醇提液回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度为1.18～1.20的清膏，静置，去油，加水至20～25℃下相对密度为1.10～1.12，-2～2℃下冷藏24小时，滤过。
作为优选，步骤(3)中大孔吸附树脂的型号为AB-8、HPD-100、LSA-10、LSA-40、LSA-21、D101中的一种。
作为更优选，树脂型号为AB-8或LSA-21。
作为优选，步骤(3)中上柱药液与树脂的重量比为2.1～2.3:1。
作为优选，步骤(4)中的洗脱方式为水洗脱3个柱体积，体积分数为25％、30％、70％的乙醇各洗脱3～5个柱体积。
作为优选，步骤(5)中醇洗脱液回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度为1.25～1.30的稠膏；真空干燥温度为60～70℃；过80目筛。
本发明还提供了一种采用上述的产业化大生产制备工艺制备得到的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物。
作为优选，以质量百分数计，提取物中总黄酮含量为50wt％～80wt％，金丝桃苷含量为6.4wt％～19.0wt％，异槲皮苷含量为4.4wt％～14.0wt％；提取物中还含有棉皮苷、槲皮素3′-葡萄糖苷、槲皮素、芦丁、杨梅素、棉皮素-3′-O-β-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素-3-O-β-D-木糖(1-2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷。
作为优选，总黄酮含量为50wt％～78wt％，金丝桃苷含量为7.0wt％～17.0wt％，异槲皮苷含量为6.0wt％～12.0wt％。
与现有技术中公开的制备方法相比，本发明具有以下技术优势及有益效果：
(1)本发明的技术优势如下：
①通过优化和改进浓缩密度的工艺参数，去杂效果显著提高：
首先，本发明将黄蜀葵花的乙醇提取液的浓缩密度工艺参数进行了优化和改进，取得了意料不到的除杂效果：
在生产中发现，提高浓缩至合适密度范围后，清膏上层会析出一层厚重结实的油层，分析是黄蜀葵花所含叶绿素、果胶及油脂成分，因此操作中去除该油层，即可将上述杂质成分最大限度地去除(去油率与原工艺的去油率相比高出约4倍)；同时在对提取物所含杂质成分的检测时意外地发现，提取物中所含脂溶性甾醇(含量0.1wt％～0.3wt％)杂质成分的含量，较黄蜀葵花药材中脂溶性甾醇(含量1.7wt％～2.1wt％)杂质含量明显降低，表明该类杂质成分是随着油层的去除而去除了80％以上，因此有效避免了下一步在上柱分离纯化工序过程中该类杂质成分对提取物质量的影响。
其次，对加水水沉配制上柱药液的密度进行了研究筛选，明确了适宜的上柱药液密度。
对采用上述产业化大生产分离纯化工艺制备所得的提取物的其他杂质成分还进行了分析，结果表明，提取物中所含多糖(含量0.01wt％～0.05wt％)杂质成分的含量较黄蜀葵花药材中多糖(含量6.5wt％～10.6wt％)杂质含量显著降低了95％以上，表明本发明产业化大生产的工艺可有效去除脂溶性及水溶性杂质，保证了提取物的质量。
②与2004年申请的专利200410035741.X中的制备工艺相比，本发明采用了市售自动层析柱进行上样吸附，经对相应的自动柱分离纯化工艺参数进行深入研究，使得上柱药液加入量(上柱药液与树脂的重量比)提高，树脂总黄酮泄漏率降低，柱转移率提高，提取物总黄酮含量提高约10％，同批次药材所得产品批次间质量均一稳定：
本发明产业化大生产采用自动层析柱后，由于在上样吸附时实现了自动上样和自动混匀，树脂装填均匀，因此克服了手工装填大柱的不均匀性、气泡、壁效应或沟流的种种问题。针对生产设备的变化，对本发明的生产工艺参数进行了深入研究和优化，包括不同上柱药液密度范围及加入量范围、乙醇梯度洗脱的不同醇浓度及用量等工艺参数，通过数十次的筛选研究对比试验，最终选择确定了浓缩去油、水沉去杂的提取浓缩工艺参数，以及适宜的上柱药液密度范围及加入量范围(上柱药液与树脂重量比)和乙醇洗脱梯度浓度和用量等分离纯化工艺参数。与原发明专利制备工艺相比，本发明产业化放大生产取得了出乎意料的效果，总黄酮的泄漏率降低了约40％，总黄酮的柱转移率提高了10％左右，所得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的总黄酮含量提高了10％左右，并且同批药材所得提取物批次间质量更加均一稳定。
③节能降耗，降低成本首先本发明通过考察筛选确定了水沉上柱药液的适宜密度，从而去除了原发明专利中水沉后再一步的浓缩工序，减少了工时(约4～5个工时)，降低人工成本(每批次减少1个工人岗位)，节能降耗(节约蒸汽真空能源成本约10％)；其次，由于分离纯化过程采用了自动层析柱，有效缩减了每批的生产周期(程序设定流速、流量，每批自上样至洗脱结束的周期仅需10余小时，较手动上样洗脱减少了约4个小时)，节约了人工成本(每批次减少2个工人岗位)，节能降耗。
(2)本发明取得的有益效果如下：
①本发明在工艺研究过程中，采用总黄酮及金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、棉皮苷、槲皮素3′-葡萄糖苷5种黄酮成分的含量作为提取分离纯化工艺的检测指标，用来筛选产业化大生产的工艺参数，在中药制备工艺研究领域中尚属首次；本发明建立黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的产业化大生产工艺并将其应用于黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的大生产中，在国内尚属首次。经数十批产业化大生产，结果表明本发明制备工艺操作简便，工艺稳定，所得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的总黄酮含量均在50wt％～80wt％范围内，含量均达到60wt％以上，金丝桃苷含量为6.4wt％～19.0wt％，异槲皮苷含量为4.4wt％～14.0wt％，均符合质量标准要求，且同批药材所得不同批次黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的批次间质量均一稳定；结果见表1。
表1：数批产业化大生产黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的数据
②采用本发明产业化大生产制备工艺得到的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物，具有杂质少、有效成分及有效部位含量高的特点，克服了传统中药制剂“黑、粗、大”(粗提物颜色深、杂质成分多、服用量大)的瓶颈，因此在相等的日服生药量下，本发明提取物的日服用量较常规中药粗提物明显降低。毒理试验结果显示，本发明提取物125mg/kg～500mg/kg(小鼠)和20.0mg/kg～80.0mg/kg(犬)为安全剂量范围。本发明提取物制成的口腔贴片(每片含20mg提取物)I期临床试验结果均表明，本发明提取物的临床安全剂量范围是每日20～240mg，无明显不良反应和毒副作用，安全可靠。
③发明人将采用本项工艺生产得到的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物制成了治疗口腔溃疡的制剂—黄蜀葵花总黄酮口腔贴片(已申请发明专利202011237110.1：一种治疗口腔溃疡的中药双层贴片及其制备方法，2022年8月16日获得授权)，完成了800余例的I、II、III期临床试验，其中480例的Ⅲ期临床试验结果显示，本品贴片对口腔溃疡(心脾积热证)临床疗效的总有效率为61.28％，显著优于空白对照组的总有效率36.67％(P＜0.01)，患者使用依从性好，具有临床价值。
④全面实现了中药现代化GMP生产管理：本发明产业化大生产工艺的应用，实现了黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物生产过程的管道化、连续化、自动化，实现了对产品质量的精确控制和质量全程追溯，杜绝了人工操作产生的生产偏差，可全面追溯生产质量数据，确保了相同批次药材生产的每一批产品质量都是稳定均一的，极大提高了中药质量批次稳定性，确保了药品生产的规范性、合规性，全面实现了中药现代化GMP生产管理。
迄今为止，尚未见有将产业化大生产工艺应用在黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的制备中的文献报道及专利公开。
附图说明
图1为本发明大生产批次黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物(批号T220202)的高效液相色谱图，液相条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，体积分数为0.2％～0.8％的磷酸溶液为流动相B，进行线性梯度洗脱；流速为每分钟0.8mL～1.2mL，柱温为30℃～45℃，检测波长为325nm～365nm，进样体积5～10μL。
峰定位如下：1.杨梅素-3-O-β-D-木糖(1-2)-β-D-葡萄糖苷；2.杨梅素-3-O-半·乳糖苷；3.槲皮素-3-O-洋槐糖苷；4.芦丁；5.金丝桃苷；6.异槲皮苷；7.杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷；8.棉皮素-3′-O-β-葡萄糖苷；9.棉皮苷；10.杨梅素；11.槲皮素3′-葡萄糖苷；12.槲皮素。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例中所用黄蜀葵药材产地均为江苏，且符合中华人民共和国药典2020年版一部“黄蜀葵花”项下的标准。
实施例1醇提液浓缩密度的筛选
取黄蜀葵花药材，加体积分数为85％的乙醇提取2次，每次1h，提取液滤过，回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.10(60℃)的浓缩液，平均分成4份，分别减压浓缩至相对密度为1.13～1.16(60℃)，1.16～1.18(60℃)，1.18～1.20(60℃)，1.20～1.22(60℃)的清膏，静置，去油。测定不同密度清膏中总黄酮含量及不同黄酮成分含量，测定结果见表2、表3。
表2：不同浓缩密度醇提清膏中总黄酮总重量及去油率测定结果
| 不同相对密度(60℃) | 清膏中总黄酮总重量(g) | 清膏总黄酮转移率(％) | 去油率(％) |
| 1.13～1.16 | 215.04 | 91.90 | 1.61 |
| 1.16～1.18 | 206.19 | 88.12 | 4.82 |
| 1.18～1.20 | 204.70 | 87.48 | 6.68 |
| 1.20～1.22 | 199.36 | 85.20 | 8.44 |
备注：上表中，清膏总黄酮转移率是清膏总黄酮总重量与药材总黄酮总重量的比值；去油率是油层重量与去油前清膏总重量的比值。
表3：不同浓缩密度醇提清膏样品中五成分含量
从表2和表3中的试验结果可以看出，不同浓缩密度醇提清膏总黄酮总重量及金丝桃苷等五成分的含量无明显变化；相对密度1.13～1.16，总黄酮转移率最高，但去油率最低，并且该密度清膏加水水沉后，需要再增加一步浓缩工序，才能上柱；相对密度为1.16～1.18、1.18～1.20去除叶绿素及油脂较多，表明提高醇浓缩液相对密度后，去油率增加，去杂效果明显，与相对密度1.13～1.16比较，总黄酮转移率稍低但无明显影响；相对密度为1.20～1.22去油率最高，但清膏中总黄酮转移率降低，考虑醇提清膏相对密度过高，叶绿素及其他油脂类成分易与清膏混悬，反而不易分离。因此确定在大生产中，将黄蜀葵花醇提后，将提取液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.18～1.20(60℃)的清膏。
实施例2上柱药液密度的筛选
合并实施例1项下不同密度的清膏，浓缩至相对密度为1.20(60℃)，静置后撇去上层油；取三份分别加水至相对密度为1.08～1.10、1.10～1.12、1.12～1.14(20～25℃)，分别冷藏(-2～2℃)24小时，滤过，滤液分别作为上柱药液1、2、3。分别取上柱药液上层及容器壁上的油状物，离心称重。测定不同密度上柱药液及油中总黄酮含量；上述三种不同密度的上柱药液，分别通过树脂柱上样吸附洗脱，收集醇洗脱液，浓缩、干燥、粉碎。
不同密度上柱药液总黄酮含量及去杂效果、柱分离纯化后的提取物含量情况见表4、表5。
表4：不同密度上柱药液总黄酮含量及去杂效果一览表
表5：不同密度上柱药液树脂柱分离纯化后所得提取物含量一览表
表4可见，随上柱药液相对密度升高去油率逐渐增加，上柱药液折合为每g药材中总黄酮含量无明显差异，表明提高相对密度后，对上柱药液中总黄酮含量无明显影响。柱分离纯化结果表明，泄漏率随上柱药液密度增加而逐渐增加，提取物总黄酮柱转移率逐渐降低，密度1.14的上柱药液上柱后的柱转移率仅为43.15％。综合分析，上柱药液相对密度为1.10～1.12(20～25℃)时，去杂效果最好，提取物中总黄酮及金丝桃苷等5成分含量、泄漏率及柱转移率与密度1.08～1.10无明显差异，因此确定将醇提清膏适量水配制上柱药液的相对密度为1.10～1.12(20～25℃)。
实施例3大孔树脂不同型号的选择
分别取预处理完毕的XAD-4、AB-8、HPD-100、LSA-10、LSA-40、LSA-21、D101型大孔树脂各25g，另取黄蜀葵花上柱药液，通过树脂层，收集流出液，当流出液中总黄酮浓度达到上柱药液的10％时，停止上样，记录通过树脂的上柱药液体积数，折算每g树脂载样量(以原药材计)。不同树脂型号载样量比较见表6。
表6：各种型号树脂载样量比较
| 树脂型号 | 树脂用量(g) | 载样量(g药材/g树脂) |
| XAD-4 | 25 | 1.15 |
| AB-8 | 25 | 1.83 |
| HPD-100 | 25 | 1.77 |
| LSA-10 | 25 | 1.51 |
| LSA-40 | 25 | 1.73 |
| LSA-21 | 25 | 1.79 |
| D-101 | 25 | 1.69 |
结果表明AB-8、HPD-100、LSA-10、LSA-40、LSA-21、D101树脂载样量无明显差异，AB-8型大孔树脂载样量最大，XAD-4树脂载样量最小。
实施例4上柱药液加入量(上柱药液与树脂量比)的筛选
取不同量的黄蜀葵花上柱药液共7份，分别通过7个LSA-21型大孔树脂自动层析柱，使上柱药液与树脂量比(W/W)分别为1.5:1，1.8:1，2.1:1，2.2:1，2.3:1，2.4:1及2.5:1，作为柱-1、柱-2、柱-3、柱-4、柱-5、柱-6及柱-7，进行上样吸附洗脱，得到不同提取物，并测定总黄酮含量。不同上柱药液量的泄漏率、提取物中总黄酮含量及柱转移率见表7。
表7：不同上柱药液量树脂柱分离纯化一览表
| 树脂柱 | 上柱药液:树脂(W/W) | 泄漏率(％) | 总黄酮含量(wt％) | 柱转移率(％) |
| 柱-1 | 1.5:1 | 10.7 | 62.8 | 60.5 |
| 柱-2 | 1.8:1 | 11.7 | 65.3 | 62.7 |
| 柱-3 | 2.1:1 | 13.0 | 66.7 | 61.0 |
| 柱-4 | 2.2:1 | 12.1 | 67.9 | 62.8 |
| 柱-5 | 2.3:1 | 14.4 | 68.1 | 59.3 |
| 柱-6 | 2.4:1 | 17.1 | 67.3 | 56.1 |
| 柱-7 | 2.5:1 | 19.2 | 66.2 | 53.7 |
结果表明，上柱药液加入量较低的时候，由于树脂吸附未达到饱和，因此提取物总黄酮含量较低；随上柱药液量增加，泄漏率升高，当上柱药液与树脂量比达到2.5:1(W/W)时，泄漏率高达近20％，柱转移率随之降低，提取物总黄酮含量无明显变化。因此综合考虑泄漏率、总黄酮含量及柱转移率等因素，确定上柱药液与树脂量比为1.8～2.3:1(W/W)。
实施例5本发明产业化大生产工艺与原专利制备工艺——总黄酮泄漏率及柱转移率的比较试验
对原专利条件下与本发明产业化大生产条件下制备的黄蜀葵花总黄酮提取物进行泄漏率、柱转移率的比较，结果见表8。
表8：不同分离纯化技术的总黄酮泄漏率、柱转移率的比较
对比实验结果表明，在基本相同的工艺条件下，采用原专利分离纯化方法，总黄酮泄漏率高达14％～20％，采用本发明大生产工艺，总黄酮泄漏率降低至9％～15％之间，较原发明工艺平均降低了约40％，相应的总黄酮柱转移率平均提高了约10％。
实施例6本发明产业化大生产工艺乙醇洗脱液浓度及用量的优选本发明采用大生产提取分离纯化工艺后，由于加入的上柱药液量增加，以及树脂泄漏率明显降低，因此本发明人通过大量的实验，在不改变洗脱流程的前提下，选择不同浓度乙醇的梯度洗脱，进一步筛选了每一个梯度适宜的加入量，筛选试验如下：
取黄蜀葵花药材，加体积分数为80％的乙醇提取2次，每次1.5h，提取液滤过，滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.20(60℃)的清膏，静置，去油，加水适量至相对密度为1.10～1.12(20～25℃)，冷藏(-2～4℃)20～30小时，滤过，滤液作为上柱药液。取上柱药液，分别用LSA-21大孔树脂自动层析柱进行自动上样、自动混匀，上样结束后，先用纯化水(3个柱体积)冲洗树脂后，再分别按照不同的乙醇洗脱梯度工艺洗脱，分别将醇洗脱液浓缩、干燥、粉碎，得不同工艺的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物：
柱1按照原专利的洗脱条件进行洗脱，即体积分数为10％及30％的乙醇各洗脱3个柱体积，70％乙醇洗脱1个柱体积；
柱2采用体积分数为15％、35％、65％的乙醇各洗脱5个柱体积；
柱3采用体积分数为15％、40％、65％的乙醇各洗脱3个柱体积；
柱4采用体积分数为20％、35％、70％的乙醇各洗脱4个柱体积；
柱5采用体积分数为20％、30％、70％的乙醇各洗脱5个柱体积；
柱6采用体积分数为25％、35％、70％的乙醇各洗脱4个柱体积；
柱7采用体积分数为25％、30％、65％的乙醇各洗脱5个柱体积；
柱8采用体积分数为20％、35％、65％的乙醇各洗脱4个柱体积；
柱9采用体积分数为20％、40％、70％的乙醇各洗脱3个柱体积；
柱10采用体积分数为15％、30％、60％的乙醇各洗脱5个柱体积；
柱11采用体积分数为15％、35％、60％的乙醇各洗脱4个柱体积；
不同洗脱条件下的提取物总黄酮含量及柱转移率结果详见表9。
表9：不同洗脱梯度提取物的总黄酮含量及柱转移率比较
结果表明，本发明采用产业化大生产工艺后，由于加入上柱药液量的增加，树脂泄漏率的明显降低，因此采用原洗脱梯度，提取物总黄酮含量为59.4wt％，柱转移率仅为51.6％，表明在该乙醇梯度浓度条件下，总黄酮成分洗脱不完全；而经过进一步的醇洗脱浓度和用量的筛选实验，发现采用体积分数为15％～25％、30％～40％、60％～70％的乙醇各洗脱3～5个柱体积，可以保证黄酮成分洗脱完全，提取物总黄酮含量均在65wt％以上，柱转移率亦明显提高。
实施例7本发明产业化大生产工艺与原专利制备工艺——黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的总黄酮含量对比对按照原专利制备工艺与本发明产业化大生产所得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物进行总黄酮含量的对比，结果详见表10。
表10：不同分离纯化工艺所得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物总黄酮含量结果
对比结果表明，采用本发明产业化分离纯化工艺大生产所得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的总黄酮含量，明显高于原专利制备工艺所得提取物的总黄酮含量，平均提高了约10％，并且相同批次药材所得不同提取物的总黄酮含量相对于原专利制备工艺均较为均一稳定，确保了相同批次药材生产的每一批黄蜀葵花总黄酮有效部位质量都是稳定均一的。
实施例8黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的制备
取黄蜀葵花药材42kg，加体积分数为70％的乙醇提取二次，每次提取2小时，第一次加10倍量，第二次加8倍量，提取液滤过，滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.20(60℃)的清膏，静置，去油，加水适量至相对密度为1.12(25℃)，冷藏(-2～2℃)24小时，滤过；滤液自动上样至AB-8大孔树脂自动层析柱(上柱药液与树脂量比为1.8:1，W/W)中，自动混匀，水洗脱3个柱体积，再用体积分数为15％、30％、60％的乙醇各洗脱3个柱体积，收集醇洗脱液，回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.25(60℃)的稠膏，真空干燥(60～70℃)，粉碎，过80目筛，混匀，得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物1.3kg。经测定，醇提清膏总黄酮转移率为84％，提取物中总黄酮含量为78wt％，金丝桃苷含量为18.8wt％，异槲皮苷含量为11.7wt％。
实施例9黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的制备
取黄蜀葵花药材38kg，加体积分数为85％的乙醇提取二次，每次提取1小时，第一次加12倍量，第二次加10倍量，提取液滤过，滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.20(60℃)的清膏，静置，去油，加水适量至相对密度为1.12(25℃)，冷藏(-2～2℃)24小时，滤过；滤液自动上样至LSA-21大孔树脂自动层析柱(上柱药液与树脂量比为2.2:1，W/W)中，自动混匀，水洗脱3个柱体积，再用体积分数为25％、30％、70％的乙醇各洗脱3个柱体积，收集醇洗脱液，回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.25(60℃)的稠膏，真空干燥(60～70℃)，粉碎，过80目筛，混匀，得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物1.1kg。经测定，醇提清膏总黄酮转移率为73％，提取物中总黄酮含量为72wt％，金丝桃苷含量为17.6wt％，异槲皮苷含量为10.1wt％。
实施例10黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的制备
取黄蜀葵花药材38kg，加体积分数为80％的乙醇提取二次，每次提取1.5小时，第一次加14倍量，第二次加12倍量，提取液滤过，滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.18(60℃)的清膏，静置，去油，加水适量至相对密度为1.10(25℃)，冷藏(0～4℃)20小时，滤过；滤液自动上样至AB-8大孔树脂自动层析柱(上柱药液与树脂量比为2.1:1，W/W)中，自动混匀，水洗脱3个柱体积，再用体积分数为15％、40％、70％的乙醇各洗脱4个柱体积，收集醇洗脱液，回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.30(60℃)的稠膏，真空干燥(60～70℃)，粉碎，过80目筛，混匀，得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物1.2kg。经测定，醇提清膏总黄酮转移率为90％，提取物中总黄酮含量为68wt％，金丝桃苷含量为9.3wt％，异槲皮苷含量为6.0wt％。
实施例11黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的制备
取黄蜀葵花药材40kg，加体积分数为90％的乙醇提取二次，每次提取1.5小时，第一次加12倍量，第二次加10倍量，提取液滤过，滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.19(60℃)的清膏，静置，去油，加水适量至相对密度为1.11(25℃)，冷藏(-2～2℃)30小时，滤过；滤液自动上样至LSA-40大孔树脂自动层析柱(上柱药液与树脂量比为2.3:1，W/W)中，自动混匀，水洗脱3个柱体积，再用体积分数为20％、40％、65％的乙醇各洗脱5个柱体积，收集醇洗脱液，回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.28(60℃)的稠膏，真空干燥(60～70℃)，粉碎，过80目筛，混匀，得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物1.2kg。经测定，醇提清膏总黄酮转移率为70％，提取物中总黄酮含量为64wt％，金丝桃苷含量为7.7wt％，异槲皮苷含量为5.4wt％。
实施例12黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的制备
取黄蜀葵花药材76kg，加体积分数为85％的乙醇提取二次，每次提取1小时，第一次加12倍量，第二次加10倍量，提取液滤过，滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.20(60℃)的清膏，静置，去油，加水适量至相对密度为1.12(25℃)，冷藏(-2～2℃)24小时，滤过；滤液自动上样至LSA-21大孔树脂自动层析柱1-2(上柱药液与树脂量比为2.2:1，W/W)中，自动混匀，水洗脱3个柱体积，再用体积分数为25％、30％、70％的乙醇各洗脱3个柱体积，收集醇洗脱液，回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.25(60℃)的稠膏，真空干燥(60～70℃)，粉碎，过80目筛，混匀，得黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物2.6kg。经测定，醇提清膏总黄酮转移率为88％，提取物中总黄酮含量为65wt％，金丝桃苷含量为9.3wt％，异槲皮苷含量为7.2wt％。
实施例13黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物中黄酮成分的检测采用高效液相色谱法，检测了采用本发明工艺生产的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物中的主要黄酮化合物成分，结果如图1所示。在本发明所得提取物中，检测到了金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮苷、槲皮素3′-葡萄糖苷、槲皮素、芦丁、杨梅素、棉皮素-3′-O-β-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素-3-O-β-D-木糖(1-2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷共12个黄酮成分及其他黄酮成分。
实施例14数批黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物12个黄酮成分的含量测定按照实施例13的液相色谱条件，对采用本发明工艺产业化大生产的数批黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物中所含的金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮苷、槲皮素3′-葡萄糖苷、槲皮素、芦丁、杨梅素、棉皮素-3′-O-β-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素-3-O-β-D-木糖(1-2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷12个黄酮成分进行了含量测定，结果见表11。
表11：数批黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物中12个黄酮成分含量结果
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
Claims (12)
1.一种黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物的产业化大生产制备工艺，其特征是，包括如下步骤：
（1）将黄蜀葵花用体积分数为70%～90%的乙醇提取1～2次，每次1～4小时，滤过，得到醇提液；
（2）醇提液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.18～1.20的清膏，静置，去油，加水至相对密度为1.10～1.12，-2～4℃下冷藏20～30小时，滤过；
（3）步骤（2）所得滤液通过大孔吸附树脂自动层析柱，上柱药液与树脂的重量比为1.8～2.3:1，进行自动上样，自动混匀；
（4）水洗脱3个柱体积，体积分数为15%～25%、30%～40%、60%～70%的乙醇各洗脱3～5个柱体积；
（5）步骤（4）所得醇洗脱液回收乙醇并减压浓缩至相对密度为1.25～1.30的稠膏，真空干燥、粉碎、过筛、混匀后即得。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是，步骤（1）中的乙醇体积分数为80%～90%，提取次数为2次，每次加醇重量分别为12～14倍、8～12倍。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是，步骤（2）中采用清膏中总黄酮转移率及金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、棉皮苷、槲皮素3′-葡萄糖苷5种黄酮成分的含量作为提取分离纯化工艺的检测指标；清膏中总黄酮转移率≥70%，金丝桃苷含量≥1.19wt%，异槲皮苷含量≥0.87wt%，槲皮素含量≥0.05wt%，棉皮苷含量≥2.04wt%，槲皮素3′-葡萄糖苷含量≥0.97wt%；清膏中总黄酮转移率是清膏总黄酮总重量与药材总黄酮总重量的比值。
4.根据权利要求1或3所述的制备工艺，其特征是，步骤（2）中醇提液回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度为1.18～1.20的清膏，静置，去油，加水至20~25℃下相对密度为1.10～1.12，-2～2℃下冷藏24小时，滤过。
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是，步骤（3）中大孔吸附树脂的型号为AB-8、HPD-100、LSA-10、LSA-40、LSA-21、D101中的一种。
6.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是，步骤（3）中大孔吸附树脂的型号为AB-8或LSA-21。
7.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是，步骤（3）中上柱药液与树脂的重量比为2.1～2.3:1。
8.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是，步骤（4）中的洗脱方式为水洗脱3个柱体积，体积分数为25%、30%、70%的乙醇各洗脱3～5个柱体积。
9.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是，步骤（5）中醇洗脱液回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度为1.25～1.30的稠膏；真空干燥温度为60～70℃；过80目筛。
10.一种黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物，其特征是，采用如权利要求1~9任一所述的产业化大生产制备工艺制备得到。
11.根据权利要求10所述的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物，其特征是，以质量百分数计，提取物中总黄酮含量为50wt%～80 wt %，金丝桃苷含量为6.4 wt %～19.0 wt %，异槲皮苷含量为4.4 wt %～14.0 wt %；提取物中还含有棉皮苷、槲皮素3′-葡萄糖苷、槲皮素、芦丁、杨梅素、棉皮素-3′-O-β-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素-3-O-β-D-木糖（1-2）-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷。
12.根据权利要求11所述的黄蜀葵花总黄酮有效部位提取物，其特征是，总黄酮含量为50 wt %～78 wt %，金丝桃苷含量为7.0 wt %～17.0 wt %，异槲皮苷含量为6.0 wt %～12.0 wt %。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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