CN114891131A - 一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺 - Google Patents

一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN114891131A
CN114891131A CN202210731461.0A CN202210731461A CN114891131A CN 114891131 A CN114891131 A CN 114891131A CN 202210731461 A CN202210731461 A CN 202210731461A CN 114891131 A CN114891131 A CN 114891131A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
extraction
water
nostoc commune
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210731461.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114891131B (zh
Inventor
杨菁
吕享
刘顶鼎
陈亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Guizhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Guizhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN202210731461.0A priority Critical patent/CN114891131B/zh
Publication of CN114891131A publication Critical patent/CN114891131A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114891131B publication Critical patent/CN114891131B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/44—Sample treatment involving radiation, e.g. heat
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺。该工艺是采用苯酚‑硫酸法测定多糖含量，在单因素考察的基础上，以料液比、提取时间、提取次数为考察因素，采用Box‑Behnken结合响应面分析法对提取工艺进行研究，得出最佳提取工艺，料液比为1：60(g/ml)，提取时间1h/次，提取次数2次，再用大孔吸附树脂进行纯化制得粉条儿菜多糖。该提取纯化工艺简单、快速、可行，可为粉条儿菜多糖的进一步开发研究奠定基础，并为药材质量标准的完善提供参考。

Description

一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺
技术领域
本发明属于天然多糖提取纯化技术领域，涉及一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺。
背景技术
粉条儿菜，别名肺筋草、肺心草。来源于百合科(Liliaceae)粉条儿菜属AletrisL.植物粉条儿菜Aletris spicata(Thunb.)Franch.的全草，其原植物广泛分布于江苏、浙江、安徽、江西、福建、台湾、广东、广西、湖南、湖北、河南、河北、山西、陕西(秦岭以南)和甘肃(南部) 等地，生山坡上、路边、灌丛边或草地上，海拔350～2500米。粉条儿菜首次记载于《图考》，其性甘味平，有利尿渗湿、止咳化痰、润肺平喘、驱蛔和止血的功效[1]。
目前国内外对粉条儿菜的化学成分和药理作用研究较少，多集中在生药学鉴定及考释方面 [2-4]。此外，有文献报道，粉条儿菜可用于治疗癌症、肺炎和咳嗽等方面[5]，具有较好的药用价值。现代研究表明部分中药多糖具有多种药理活性，如研究较多的抗炎、抗癌等作用[6]，为部分中药的药效成分之一，有较好的开发应用价值。且目前未见对粉条儿菜多糖进行提取纯化工艺的研究，因此本发明团队旨在对粉条儿菜多糖进行提取纯化工艺研究，为粉条儿菜的充分开发和利用提供参考。该植物作为民间药物，其化学成分的研究报道较少。
多糖有着多样的生物功能活性，这一特点使其在功能食品和临床上被广泛应用，多糖资源的开发利用和研究也越来越受到大众的关注，并在近年来快速成为新的研究热点之一。迄今为止，从各种来源中提取出的多糖化合物已经超过了300余种，目前已上市的保健食品超过86 种，化妆品超过210种[20]，应用于临床的药物超过38种。目前多糖的开发方向大致分为两类，一是无明显生物活性多糖，如淀粉、粘液质等，常常作为食品和化妆品的添加剂；二是活性多糖，如香菇多糖[21]，黄芪多糖，银耳多糖，肿节风多糖[22]等因具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等生物学功能，常常被开发成药品和疫苗等。
粉条儿菜多糖是一种极具有开发潜力的药效成分，以葡萄糖为对照，其浓度在2.240μg/ml～15.68μg/ml(r＝0.9998)范围内呈良好线性关系，得出最佳提取工艺，提取得到粉条儿菜多糖的平均含量为4.95％。该提取纯化方法简单、快速、可行，可为粉条儿菜多糖的进一步开发研究奠定基础，并为药材质量测定方法的完善提供参考。
发明内容
本发明目的旨在提供一种合理、稳定的粉条儿菜中多糖的提取纯化方法，并建立相应的测定方法以保障工艺和产品的稳定。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺，包括如下步骤：
S1，将粉条儿菜干燥并粉碎，过4号筛，得粉条儿菜粉末，备用；
S2，将步骤S1得到的粉条儿菜干燥粉末以料液比1：50～70的石油醚在50～60℃水浴中回流提取0.5～1.0h，过滤，挥干溶剂，得残渣，备用；
S3，将步骤S2得到的残渣以料液比1：50～70的纯化水加热回流提取1～3次，每次0.5～1.5h，过滤后，合并滤液，得粉条儿菜水提取液，备用；
S4，将步骤S3得到的粉条儿菜水提取液，浓缩至料液比为1：35～70，得到粗多糖溶液，备用；
S5，将AB-8大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24h后，进行装柱，95％乙醇冲洗浸泡好的大孔吸附树脂至与水混合后不再出现白色乳浊状为止，再以水为洗脱剂冲洗树脂柱至洗脱液无乙醇味，置于烧杯中用水浸泡，得处理好的大孔吸附树脂，保存备用；
S6，将步骤S5处理好的大孔吸附树脂，按1：6～8的径高比装柱，加入步骤S4得到的粗多糖溶液上样，静置吸附4～8h，用粗多糖溶液5～7倍量的纯净水洗脱，流速0.5～1.5ml/min，收集洗脱液，采用Molish反应进行洗脱终点的判断，至Molish反应呈阴性作为洗脱终点，将洗脱液浓缩，得到粉条儿菜多糖。
优选的，步骤S2中所述粉条儿菜干燥粉末以料液比1：60的石油醚在55℃水浴中回流提取0.5h。
优选的，步骤S3中所述残渣以1：60的料液比用纯化水加热回流提取2次，每次1h。
优选的，步骤S4中所述浓缩至料液比为1：50～70。
优选的，步骤S4中所述浓缩至料液比为1：70。
优选的，步骤S6中所述处理好的大孔吸附树脂，按1∶8的径高比装柱。
优选的，步骤S6中所述静置吸附4h，用粗多糖溶液6倍量的纯净水洗脱，流速1.0ml/min。
本发明进一步提出了粉条儿菜多糖的检测方法，包含如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称定10.08mg无水葡萄糖对照品于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，再精密移取5ml至50ml容量瓶中，用水定容至刻度，制成0.1008mg/ml的葡萄糖对照品，即得；
(2)供试品溶液的制备：精密称取粉条儿菜干燥粉末(4号筛)0.2g，于100ml圆底烧瓶中，加入12ml石油醚，在55℃水浴中回流提取0.5h，过滤，挥干溶剂，残渣加入12ml 水在沸水浴中回流提取1h，回流提取两次，合并滤液，加水定容至25ml，即得；
(3)测定方法：精密移取对照品溶液、供试品溶液0.2ml，于25ml量瓶中，用水补足至 2.0ml，依次精密加入的苯酚溶液和浓硫酸，混匀，在水浴中显色，取出，放置冷水中冷却至室温，以相应试剂为空白对照，在波长490nm处进行光谱扫描。
优选的，步骤(3)中所述依次精密加入2％、3％、4％的苯酚溶液1.0ml和浓硫酸6.0ml、7.0ml、 8.0ml，混匀，在60℃、70℃、80℃、90℃水浴中显色15min。
优选的，步骤(3)中所述依次精密加入3％的苯酚溶液1.0ml和浓硫酸6.0ml，混匀，在80℃水浴中显色15min。
有益效果：
一、本发明提供的粉条儿菜多糖的提取纯化方法，在提取时先使用了石油醚对粉条儿菜先进行提取，在本发明过程中，石油醚的主要作用是排除粉条儿菜中色素对紫外分光光度计的影响，从而排除对实验的相关干扰。同时，采用氢氧化铜试剂对粉条儿菜总糖中是否存在单糖进行了验证，在粉条儿菜总糖溶液中加入新制氢氧化铜悬浊液并加热，未产生砖红色沉淀，说明溶液中无单糖物质。
二、本发明提供的粉条儿菜多糖的提取纯化方法，采用超苯酚-硫酸法测定多糖含量，在单因素考察的基础上，以料液比、提取时间、提取次数为考察因素，采用Box-Behnken结合响应面分析法对提取工艺进行研究，得出最佳提取工艺：料液比为1：60(g/ml)，提取时间1h/ 次，提取次数2次。在此条件下，测得粉条儿菜多糖平均含量为4.95％，实测值与模型预测值无显著性差异，说明该方法可用于粉条儿菜多糖提取工艺的优化，也为优质粉条儿菜资源的筛选和健康产业的稳定发展提供科学依据。
三、本发明提供的粉条儿菜多糖的提取纯化方法，采用超苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖为对照，考察了标准曲线，其浓度在2.240μg/ml～15.68μg/ml(r＝0.9998)范围内呈良好线性关系，提取得到粉条儿菜多糖的平均含量为4.95％；考察了精密度试验，结果，RSD＝0.21％，表明该仪器精密度良好；考察了稳定性试验，结果，RSD＝1.1％，表明供试品溶液在24h内基本稳定；考察了重复性试验，结果，RSD＝1.5％，表明该方法重复性良好；考察了加样回收试验，计算得多糖平均加样回收率为101.9％，RSD＝2.2％，表明该方法准确度良好。
四、本发明提供的粉条儿菜多糖的提取方法为水提法，操作容易、价格低廉、同时也适用于大规模的工业化生产；其纯化方法，采用大孔吸附树脂和水提醇沉法，并通过比较，大孔吸附树脂对粉条儿菜多糖的含有量由2.46％提升至5.02％；水提醇沉法对粉条儿菜多糖的含有率由2.23％提升至3.27％，因此优选大孔吸附树脂法对粉条儿菜多糖进行纯化。
五、本发明提供的粉条儿菜多糖的提取纯化方法，简单、快速、可行，可为粉条儿菜多糖的进一步开发研究奠定基础，并为药材质量标准的完善提供参考。
附图说明
图1对照品溶液与供试品溶液吸收曲线图(红色曲线：对照品溶液蓝色曲线：供试品溶液)。
图2苯酚浓度对吸光度的影响图。
图3浓硫酸用量对吸光度的影响图。
图4显色温度对吸光度的影响图。
图5显色时间对吸光度的影响图。
图6料液比对吸光度的影响考察图。
图7提取时间对吸光度的影响考察图。
图8提取次数对吸光度的影响考察图。
图9提取次数与液料比交互作用图(左为等高线图；右为响应面图)。
图10提取时间与液料比交互作用图(左为等高线图；右为响应面图)。
图11提取时间与提取次数交互作用图(左为等高线图；右为响应面图)。
图12标准曲线的绘制图。
图13上样浓度对多糖保留率的影响图。
图14径高比对多糖保留率的影响图。
图15泄露曲线图。
图16上样量对多糖保留率的影响图。
图17提取液浓度对多糖得率的影响图。
图18醇沉浓度对多糖得率的影响图。
图19醇沉时间对多糖得率的影响图。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
粉条儿菜多糖的提取纯化工艺，其具体工艺步骤如下：
S1，将粉条儿菜干燥并粉碎，过4号筛，得粉条儿菜粉末，备用；
S2，将步骤S1得到的粉条儿菜干燥粉末以料液比1：60的石油醚在55℃水浴中回流提取 0.5h，过滤，挥干溶剂，得残渣，备用；
S3，将步骤S2得到的残渣以料液比1：60的纯化水加热回流提取2次，每次1h，过滤后，合并滤液，得粉条儿菜水提取液，备用；
S4，将步骤S3得到的粉条儿菜水提取液，浓缩至料液比为1：70，得到粗多糖溶液，备用；
S5，将AB-8大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24h后，进行装柱，95％乙醇冲洗浸泡好的大孔吸附树脂至与水混合后不再出现白色乳浊状为止，再以水为洗脱剂冲洗树脂柱至洗脱液无乙醇味，置于烧杯中用水浸泡，得处理好的大孔吸附树脂，保存备用；
S6，将步骤S5处理好的大孔吸附树脂，按1：8的径高比装柱，加入步骤S4得到的粗多糖溶液上样，静置吸附4h，用粗多糖溶液6倍量的纯净水洗脱，流速1.0ml/min，收集洗脱液，采用Molish反应进行洗脱终点的判断，至Molish反应呈阴性作为洗脱终点，将洗脱液浓缩，得到粉条儿菜多糖。
实施例2
粉条儿菜多糖的检测方法，其具体方法如下：
(1)对照品溶液的制备：精密称定10.08mg无水葡萄糖对照品于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，再精密移取5ml至50ml容量瓶中，用水定容至刻度，制成0.1008mg/ml的葡萄糖对照品，即得；
(2)供试品溶液的制备：精密称取粉条儿菜干燥粉末(4号筛)0.2g，于100ml圆底烧瓶中，加入12ml石油醚，在55℃水浴中回流提取0.5h，过滤，挥干溶剂，残渣加入12ml 水在沸水浴中回流提取1h，回流提取两次，合并滤液，加水定容至25ml，即得；
(3)测定方法：精密移取对照品溶液、供试品溶液0.2ml，于25ml量瓶中，用水补足至 2.0ml，依次精密加入3％的苯酚溶液1.0ml和浓硫酸6.0ml，混匀，在80℃水浴中显色15min，取出，放置冷水中冷却至室温，以相应试剂为空白对照，在波长490nm处进行光谱扫描。
实施例3
一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺，其具体工艺步骤如下：
S1，将粉条儿菜干燥并粉碎，过4号筛，得粉条儿菜粉末，备用；
S2，将步骤S1得到的粉条儿菜干燥粉末以料液比1：70的石油醚在60℃水浴中回流提取 1.0h，过滤，挥干溶剂，得残渣，备用；
S3，将步骤S2得到的残渣以料液比1：70的纯化水加热回流提取3次，每次1.5h，过滤后，合并滤液，得粉条儿菜水提取液，备用；
S4，将步骤S3得到的粉条儿菜水提取液，浓缩至料液比为1：60，得到粗多糖溶液，备用；
S5，将AB-8大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24h后，进行装柱，95％乙醇冲洗浸泡好的大孔吸附树脂至与水混合后不再出现白色乳浊状为止，再以水为洗脱剂冲洗树脂柱至洗脱液无乙醇味，置于烧杯中用水浸泡，得处理好的大孔吸附树脂，保存备用；
S6，将步骤S5处理好的大孔吸附树脂，按1：7的径高比装柱，加入步骤S4得到的粗多糖溶液上样，静置吸附8h，用粗多糖溶液7倍量的纯净水洗脱，流速1.5ml/min，收集洗脱液，采用Molish反应进行洗脱终点的判断，至Molish反应呈阴性作为洗脱终点，将洗脱液浓缩，得到粉条儿菜多糖。
实施例4
一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺，其具体工艺步骤如下：
S1，将粉条儿菜干燥并粉碎，过4号筛，得粉条儿菜粉末，备用；
S2，将步骤S1得到的粉条儿菜干燥粉末以料液比1：50的石油醚在50℃水浴中回流提取 0.5h，过滤，挥干溶剂，得残渣，备用；
S3，将步骤S2得到的残渣以料液比1：50的纯化水加热回流提取1次，每次0.5h，过滤后，合并滤液，得粉条儿菜水提取液，备用；
S4，将步骤S3得到的粉条儿菜水提取液，浓缩至料液比为1：35，得到粗多糖溶液，备用；
S5，将AB-8大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24h后，进行装柱，95％乙醇冲洗浸泡好的大孔吸附树脂至与水混合后不再出现白色乳浊状为止，再以水为洗脱剂冲洗树脂柱至洗脱液无乙醇味，置于烧杯中用水浸泡，得处理好的大孔吸附树脂，保存备用；
S6，将步骤S5处理好的大孔吸附树脂，按1：6的径高比装柱，加入步骤S4得到的粗多糖溶液上样，静置吸附4h，用粗多糖溶液5倍量的纯净水洗脱，流速0.5ml/min，收集洗脱液，采用Molish反应进行洗脱终点的判断，至Molish反应呈阴性作为洗脱终点，将洗脱液浓缩，得到粉条儿菜多糖。
实施例5
一种粉条儿菜多糖的检测方法，其具体方法如下：
(1)对照品溶液的制备：同实施例2
(2)供试品溶液的制备：同实施例2
(3)测定方法：精密移取对照品溶液、供试品溶液0.2ml，于25ml量瓶中，用水补足至 2.0ml，依次精密加入4％的苯酚溶液1.0ml和浓硫酸8.0ml，混匀，在90℃水浴中显色15min，取出，放置冷水中冷却至室温，以相应试剂为空白对照，在波长490nm处进行光谱扫描。
实施例6
一种粉条儿菜多糖的检测方法，其具体方法如下：
(1)对照品溶液的制备：同实施例2
(2)供试品溶液的制备：同实施例2
(3)测定方法：精密移取对照品溶液、供试品溶液0.2ml，于25ml量瓶中，用水补足至 2.0ml，依次精密加入2％的苯酚溶液1.0ml和浓硫酸7.0ml，混匀，在60℃水浴中显色15min，取出，放置冷水中冷却至室温，以相应试剂为空白对照，在波长490nm处进行光谱扫描。
为了进一步验证本发明的可行性及有效性，筛选出最佳方案，发明人进行了一系列的试验，具体如下：
一、综述部分
粉条儿菜，是百合科(Liliaceae)粉条儿菜属Aletris L植物粉条儿菜Aletrisspicata(Thunb.)Franch.的全草，为多年生草本植物。该植物作为特色的民间药物，其化学成分的研究报道较少，现对其化学成分及药理作用进行综述。
1粉条儿菜的化学成分研究现状
潘杰等[7]从粉条儿菜脂溶性的部分中分离鉴定出5个化合物，分别为β-谷甾醇(1)、阿魏酸甲酯(2)、4－羟基苯甲酸(3)、香豆酸(4)、二十六碳烷酸甲酯(5)。
黄兰等[8]利用正、反相硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱等方法进行分离纯化，从粉条儿菜的干燥全草中分离得到了9个化合物。分别为24-甲基-9，19-环羊毛甾-24-烯-3-醇(1)、 24-甲基-9，19-环羊毛甾-25-烯-3-醇(2)、24，24-二甲基-环木菠萝烷-3-醇(3)、美商陆酚A (4)、异美商陆酚A(5)、9′-methylamericanolA(6)、1-(4′-羟基苯基)-7-(3″-甲氧基-4″-羟基苯基)-4-烯-3-庚酮(7)、methyl-9，12，13-trihydroxyoctadeca-10E，15Z-dienoate(8)、5- 羟甲基-2-呋喃甲醛(9)，且化合物1～3无抗肿瘤和抗菌活性。
李林珍等[9]采用多种柱色谱方法，对粉条儿菜进行分离纯化，得到了10个化合物。分别为环石仙桃萜醇(cyclopholidonol，1)、白桦脂酸(betulinicacid，2)、熊果酸(ursolicacid，3)、13- 表柏油酸(13-epicupressicacid，4)、5-羟基-3，7，4'-三甲氧基黄酮(5-hydroxy-3，7， 4'-trimethoxyflavone，5)、二十二烷酸-1-甘油酯(2，3-dihydroxypropyldocosoate，6)、正十七烷醇(1-heptadecanol，7)、正二十四烷酸(lignocericacid，8)、24，24-二甲基-环木菠萝烷-3-醇 (cycloneolitsoln，9)和β-谷甾醇(β-sitosterol，10)。且化合物1～8均为首次从该属植物中分离得到。
李焱等[10]采用试管法，对粉条儿菜的石油醚提取液、水提液、醇提液、酸水提取液进行研究，初步推断出粉条儿菜中可能含有黄酮及其苷类、还原糖、三萜皂苷、氨基酸、有机酸、油脂、鞣质、香豆素及内脂等化学成分，还可能含有生物碱和挥发油。此研究为进一步对粉条儿菜进行生物活性成分的研究确定以及提取、分离和纯化提供了研究基础。这些研究对于进一步研究其化学成分，以及其近缘植物的化学成分的研究具有一定的研究意义。
2中药多糖类化合物的药理研究进展
多糖类化合物广泛存在于高等植物、动物、微生物、地衣和海藻中，具有一定的抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫促进等多种生物活性作用[6，11]。如灵芝多糖等植物多糖具有抗氧化和抗衰老等作用，夏枯草多糖、香菇多糖具有较强的抗病毒作用，枸杞多糖及云芝多糖具有明显的增强机体免疫作用。
2.1抗炎作用
身体炎症是伴随许多疾病的发生与发展，是一些疾病的病理变化的基本过程，在很多疾病的处理与治疗过程当中，我们都需要使用抗炎药物来阻止或者减少炎症所带来的对人体的损伤和伤害。近些年来，天然药物的抗炎作用也越来越被人们所认识。王如锋等[12]研究发现竹节参多糖中含有α-吡喃糖环的结构，通过二甲苯导致小鼠耳肿胀模型的试验，实验结果表明竹节参多糖对消除小鼠耳肿胀具有一定的作用。武剑等[13]也研究发现了柴胡多糖对诱导的信号通路有调节和抑制的相关作用，主要是体现在可以显著降低诱导的、表达以及磷酸化水平的增高，实验发现了柴胡多糖很可能会通过影响并抑制信号通路来发挥其抗炎免疫作用。
2.2抗肿瘤作用
目前，恶性肿瘤类疾病已成为我的国居民死亡的主要因素之一[14]，并且放疗和化疗产生的副作用和治疗费用都给患者带来了巨大的身心痛苦和经济负担.近些年来，经过研究发现许多植物多糖具有显著的抗肿瘤活性，且因其来源广泛、价格低廉、不良反应小等优点，使植物多糖作为抗肿瘤药物的研究得到了广泛的关注。邵祥龙等[15]经研究发现，经化学修饰改变茯苓多糖的空间结构、分子量、水溶性、分支度等可以明显提高其抗肿瘤活性。
2.3抗衰老作用
人体衰老是伴随着生命发生与发展过程中的一系列活动，是机体从构成物质、组织结构到生理功能的衰老、丧失、退化的一系列过程[16]。随着生活条件日益提高，人们对生命的认识，也不仅仅局限于吃饱穿暖了，而是开始寻求与生命的质量，可随着年龄的增长，身体机能逐渐下降，人们对衰老问题就越来越重视。许爱霞等[17]利用衰老模型小鼠每天每公斤体重灌服50mg 或150mg的党参多糖，能使胸腺指数和脾脏指数不同程度回升，提示党参多糖能够不同程度地对抗衰老机体免疫器官退化及提高免疫功能，提高机体生理机能。可见党参多糖有显著的抗衰老作用，其机制可能与提高免疫功能，清除自由基及抗脂质过氧化有关。
2.4应用前景
多糖作为一种聚合物，它的来源非常广泛、毒性也低，同时也有着良好的保湿性、美白、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多种多样的生物活性[18]，目前在多个行业中都得到了广泛的应用，是一种较为理想的自然资源。近年来，越来越多的研究都表明多糖及其多糖复合物存在于一切细胞膜结构中，也不仅仅是只作为生命体的能量来源，而是在各个领域都有多种应用。多糖及其复合物在医疗、食品、石油和发酵工业等多个领域有着相当广泛的应用和开发潜力[19]。
多糖有着多样的生物功能活性，这一特点使其在功能食品和临床上被广泛应用，多糖资源的开发利用和研究也越来越受到大众的关注，并在近年来快速成为新的研究热点之一。迄今为止，从各种来源中提取出的多糖化合物已经超过了300余种，目前已上市的保健食品超过86 种，化妆品超过210种[20]，应用于临床的药物超过38种。目前多糖的开发方向大致分为两类，一是无明显生物活性多糖，如淀粉、粘液质等，常常作为食品和化妆品的添加剂；二是活性多糖，如香菇多糖[21]，黄芪多糖，银耳多糖，肿节风多糖[22]等因具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等生物学功能，常常被开发成药品和疫苗等。
二、粉条儿菜多糖的提取工艺研究
1仪器与试药
1.1、仪器
UV-5900紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；SB-5200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；JJ223BC型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；EX225DZH 型电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；101-1BS型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；SHZ-DⅢ型循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；DRHH-2型数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)。
1.2、试剂与试药
葡萄糖对照品(批号：GEDD0114，供含量测定用，贵州迪大生物科技有限责任公司)；乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)；苯酚(天津市科密欧化学试剂有限公司)；浓硫酸(重庆川东化工(集团)有限公司)；石油醚(天津市富宇精细化工有限公司)；正丁醇(上海申博化工有限公司)；三氯甲烷(四川西陇科学有限公司)。
1.3、药材来源
实验药材采于贵州省安顺市关岭县，经贵州中医药大学谢军丽老师鉴定为百合科(Liliaceae)粉条儿菜属Aletris L.植物粉条儿菜Aletris spicata(Thunb.)Franch.的干燥全草。
2粉条儿菜多糖含量测定
2.1、对照品溶液的制备
精密称定10.08mg无水葡萄糖对照品于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，再精密移取5 ml至50ml容量瓶中，用水定容至刻度，制成0.1008mg/ml的葡萄糖对照品，备用。
2.2、供试品溶液的制备
精密称取粉条儿菜干燥粉末(4号筛)0.2g，于100ml圆底烧瓶中，加入12ml石油醚，在55℃水浴中回流提取0.5h，过滤，挥干溶剂，残渣加入12ml水在沸水浴中回流提取1h，回流提取两次，合并滤液，加水定容至25ml，备用。
2.3、测定波长的选择
分别精密移取对照品溶液、供试品溶液0.2ml，于25ml量瓶中，用水补足至2.0ml，依次精密加入3％的苯酚溶液1.0ml和浓硫酸6.0ml，混匀，在80℃水浴中显色15min。以相应试剂为空白对照，在350～800nm范围内进行光谱扫描。
结果如图1所示，对照品及供试品溶液在490nm处均有较大吸收。且空白对照在相应位置无干扰，故选择测定波长为490nm。
2.4、显色条件考察
2.4.1苯酚浓度的考察
分别精密移取供试品溶液0.2ml，共5份(每份3组)，于25ml容量瓶中，加水补足至2.0ml，分别依次加入1％、2％、3％、4％、5％的苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5ml，混匀后在80℃水浴中加热15min，取出，放置冷水中冷却至室温，在490nm处测吸光度。以样品空白作为空白对照。
结果如图2所示，3％的苯酚对粉条儿菜多糖在490nm处有最大吸收，故选用3％的苯酚作为本实验的显色剂浓度。
2.4.2浓硫酸用量的考察
分别精密移取供试品溶液0.2ml，共6份(每份3组)，置25ml容量瓶中，加水补至2.0ml，加入3％的苯酚溶液1ml，分别加入3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml浓硫酸，混匀后，置80℃水浴中加热15min，取出，放置冷水中冷却至室温，在490nm处测吸光度。
结果如图3所示，6.0ml的浓硫酸对粉条儿菜多糖在490nm处有最大吸收，故浓硫酸用量选择6.0ml。
2.4.3显色温度的考察
分别精密移取供试品溶液0.2ml，共5份(每份3组)，置25ml容量瓶中，加水补至2.0ml，精密加入3％的苯酚溶液1.0ml，迅速加入浓硫酸6.0ml，混匀后，分别于60℃、70℃、 80℃、90℃、100℃水浴中加热15min，取出，放置冷水中冷却至室温，在490nm处测吸光度。
结果如图4所示，当显色温度在80℃时，对粉条儿菜多糖在490nm处有最大吸收，故选用80℃为粉条儿菜多糖的显色温度。
2.4.4显色时间的考察
分别精密移取供试品溶液0.2ml，共5份(每份3组)，置25ml容量瓶中，加水补足至2.0ml，精密加入1.0ml 3％的苯酚溶液1.0ml，迅速加入浓硫酸6.0ml，混匀后分别在80℃水浴中加热5min、10min、15min、20min、25min，取出，放置冷水中冷却至室温，在490nm 处测吸光度。
结果如图5所示，当显色时间为15min时，粉条儿菜多糖在490nm处有最大吸收，故选择显色时间为15min最佳。
2.5提取工艺考察
2.5.1提取工艺的单因素考察
2.5.1.1料液比的考察
精密称定粉条儿菜粉末0.2g，共5份(每份3组)，于100ml圆底烧瓶中，加入12ml 石油醚，于55℃下回流30min，过滤，挥干溶剂，残渣按料液比1:30、1:40、1:50、1:60、1:70，分别加入6ml、8ml、10ml、12ml、14ml水，于沸水浴中加热回流提取1h，过滤，提取2 次，合并两次滤液，定容至25ml，备用。
照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果如图6所示，当料液比为1:60时粉条儿菜多糖在波长490nm处有最大吸收。
2.5.1.2提取时间的考察
精密称定粉条儿菜粉末0.2g，共4份(每份3组)，于100ml圆底烧瓶中，加入12ml 石油醚，于55℃下回流30min，趁热过滤，挥干溶剂，残渣加入12ml水回流提取0.5h、1.0 h、1.5h。回流两次，合并滤液，定容至25ml，备用。
照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果如图7所示：当提取时间为1h时粉条儿菜多糖在波长490nm处有最大吸收，故选择最佳提取时间为1h。
2.5.1.3提取次数的考察
精密称定粉条儿菜粉末0.2g，共4份(每份3组)，于100ml圆底烧瓶中，加入12ml 石油醚，于55℃下回流30min，趁热过滤，挥干溶剂，残渣加入12ml水回流提取1h，过滤，分别回流1、2、3、4次，合并滤液，定容至50ml备用。
照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果如图8所示：当提取次数为2次时粉条儿菜多糖在波长490nm处有最大吸收。
2.5.2Box-Behnken结合响应面分析法
选取Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken中心组合原理对3因素3水平进行试验设计进而优化粉条儿菜多糖的提取条件。
通过单因素试验，初步确定从粉条儿菜中提取多糖的最佳液料比(A)、提取次数(B)、提取时间(C)，并用所获得的数据在响应面分析软件中设定响应面分析试验的因素与水平，见表1。
表1响应面分析因素与水平
Figure BDA0003713677640000111
2.5.2.1建立回归模型
表2响应面分析法的试验设计组合与结果
实验号 料液比/ml/g 提取次数/次 提取时间/h 多糖含量/％
1 70 1 1 3.43
2 60 2 1 4.92
3 50 3 1 4.75
4 70 3 1 4.68
5 70 2 0.5 4.34
6 60 3 1.5 4.66
7 50 2 0.5 3.59
8 60 1 0.5 3.79
9 60 3 0.5 4.75
10 50 1 1 3.88
11 60 2 1 4.91
12 60 2 1 5.00
13 70 2 1.5 4.67
14 60 2 1 4.88
15 50 2 1.5 4.47
16 60 2 1 4.89
17 60 1 1.5 4.33
2.5.2.2响应面分析法回归模型的方差分析
通过Design-expert软件对其数据进行二次回归拟合，拟合得到提取次数、提取时间、液料比3个影响因素与多糖含量(Y)的二次多项式回归方程为：Y＝4.92-0.071A+0.43B+0.33C+0.095AB+0.11AC-0.16BC-0.55A2-0.19B2-0.35C2。该回归多项式方程的总决定系数r＝0.9497，表明此二次多项式回归方程的可信度较高，此方程能够较好地预测和分析粉条儿菜多糖的提取率。
用响应面分析软件，根据单因素试验结果设计试验组合，通过试验得到不同组合下粉条儿菜中多糖的提取率(见上表2)，并对其进行方差分析(见表3)。
由F检验可知：当P＜0.05时，表示模型项显著；P＞0.05时，表示模型项不显著。从回归模型方差分析的结果可知，模板的F值是6.34，P值为0.0118，小于0.05表明模板具有显著性，可以得出由于料液比的影响，只有1.18％的几率出现较大的F值。在这个模型中交互项 AB、AC、BC，二次项A2、B2、C2都是重要的模型项，其中AC、BC、AB、C2模型项的P 值大于0.05，表明模型项不显著；而A2、B2模型项的P值小于0.05，表明模型项显著。失拟项的F值为63.47，P值为0.0008，小于0.05表明失拟项相对于绝对误差显著，可以得出由于提取时间和提取次数的影响，只有0.008％的几率出现较大的F值。在本试验中，通过方差分析可以得出影响粉条儿菜中多糖提取率3种因素的作用程度排序为：料液比＞提取时间＞提取次数。
表3回归模型方差分析
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 3.56 9 0.40 6.34 0.0118 显著
A料液比 0.023 1 0.023 0.73 0.5623
B提取次数 1.45 1 1.45 23.26 0.0019 显著
C提取时间 0.34 1 0.34 5.51 0.0513
AB 0.036 1 0.036 0.58 0.4720
AC 0.076 1 0.0076 1.21 0.3077
BC 0.099 1 0.099 1.59 0.2480
A<sup>2</sup> 0.76 1 0.76 12.17 0.0101 显著
B<sup>2</sup> 0.40 1 0.40 6.48 0.0384 显著
C<sup>2</sup> 0.22 1 0.22 3.49 0.1041
残差 0.44 7 0.062
失拟项 0.43 3 0.14 63.47 0.0008 显著
绝对误差 9.000E-003 4 2.250E-003
总和 4.00 16
2.5.2.3提取次数与液料比交互作用
由图9可知：等高线图呈椭圆形，响应面图坡度较陡，说明液料比和提取次数的互作用对粉条儿菜多糖的提取率影响比较显著；当液料比一定时，随着提取次数的增加，粉条儿菜多糖的提取率也随之增加；而当提取次数一定时，随着液料比的增加，粉条儿菜多糖得出提取率先增加后减少。
2.5.2.4提取时间与液料比交互作用
由图10可知：在提取时间一定的条件下，液料比对粉条儿菜多糖提取率的影响比较显著。当液料比大于1∶60，多糖的提取率显著降低；而且当液料比一定时，提取时间对粉条儿菜多糖提取率的影响较大。因此，可以得出粉条儿菜提取率受提取时间和液料比交互作用的影响较大。
2.5.2.5提取时间与提取次数交互作用
由图11可知：以粉条儿菜多糖提取率的响应面抛物曲线来看，不同水平的提取时间对提取次数的影响较大，在提取时间为1h时曲线的最高点稍高，而不同水平的提取次数对提取时间的影响也较大，提取次数为2次时提取率最高。
2.5.2.6验证实验
本试验通过建立回归模型及对其进行分析的基础上，最终将粉条儿菜中多糖提取的最佳提取条件调整为：液料比为1∶60，提取时间为1 h，提取次数为2次，并且预测其多糖的提取率可达4.92％。根据试验的结果，以最佳提取条件对粉条儿菜多糖进行提取，并进行3次重复试验取其平均值，可得粉条儿菜中多糖的实际提取率为4.95％。见表4。
表4验证实验
试验号 多糖含量/％ 平均值/％ RSD/％
1 4.95
2 4.91 4.95 0.62
3 4.97
2.6方法学考察
2.6.1标准曲线的绘制
分别精密移取“2.1项”下制备的葡萄糖对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml，于25ml容量瓶中。照“2.3测定波长的选择”项进行测定，以葡萄糖浓度(C) 为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，见图12，其线性回归方程为，A＝0.0505C+0.016， r＝0.9998。由r可知：当葡萄糖浓度在2.240μg/ml～15.68μg/ml范围内，吸光度与葡萄糖呈良好的线性关系。
2.6.2精密度试验
取葡萄糖对照品1.0ml，照“2.3测定波长的选择”项，自“于25ml容量瓶中”进行显色并测定，平行测6次。结果见表5，RSD＝0.21％，表明该仪器精密度良好。
表5精密度试验结果(n＝6)
序号 喂光度 平均吸光度 RSD/％
1 0.531
2 0.532
3 0.534
4 0.531 0.532 0.21
5 0.532
6 0.532
2.6.3稳定性试验
精密移取按“2.2”项下方法制备的供试品溶液，照“2.3测定波长的选择”项进行显色并测定，分别放置0h、2h、4h、6h、8h、24h，并测定其吸光度，结果见表6，RSD＝1.1％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
表6稳定性试验结果(n＝6)
时间h 吸光度 平均吸光度 RSD/％
0 0.469
2 0.467
4 0.464 0.462 1.1
6 0.460
8 0.460
12 0.454
2.6.4重复性试验
精密称定同一批粉条儿菜粉末6份，每份0.2g，照“2.2”项下方法制备样品供试液，照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果见表7，RSD＝1.5％，表明该方法重复性良好。
表7重复性试验结果(n＝6)
序号 吸光度 多糖含量/％ 平均含量/％ RDS/％
1 0.454 4.88
2 0.455 4.89
3 0.457 4.91
4 0.469 5.05 4.96 1.5
5 0.468 5.04
6 0.465 5.00
2.6.5加样回收试验
精密称定已知含量的同一批粉条儿菜粉末9份(每份3组)，每份0.1g，分别按照质量分数的50％、100％、150％3个水平加入葡萄糖对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3测定波长的选择”项进行测定，见表8，计算得多糖平均加样回收率为101.9％，RSD＝2.2％，表明该方法准确度良好。
表8加样回收试验结果(n＝9)
Figure BDA0003713677640000151
三、粉条儿菜多糖的纯化工艺研究
1大孔吸附树脂纯化工艺考察
大孔吸附树脂是近年快速发展起来的有机高聚物吸附剂，可用于大部分化合物的分离与纯化，因其具有比表面积大、选择性较好、吸附量也大、稳定性高、吸附速度快、易于解吸附、容易再生处理、易于构成闭路循环、费用低廉等诸多优点[23-24]，在中草药分离、富集等方面的应用日趋广泛[25]。
1.1粗多糖的制备
照“2.2”项下方法制备样品供试液，浓缩至料液比1∶70，得到1mg/ml的粗多糖溶液。
1.2大孔吸附树脂预处理
用95％乙醇浸泡24h后进行装柱，95％乙醇冲洗浸泡好的大孔吸附树脂至与水混合后不再出现白色乳浊状为止，再以水为洗脱剂冲洗树脂柱至洗脱液无乙醇味，置于烧杯中用水浸泡，保存备用。
1.3静态实验
分别称取经预处理好的不同型号的大孔吸附树脂2.0g，于25ml具塞锥形瓶中，加入1.0 mg/ml粗多糖溶液15ml，吸附12h后，过滤，测定滤液中多糖含有量。将过滤后的大孔吸附树脂于100ml具塞锥形瓶中，加50ml水，静置1 2h解吸，过滤，测定滤液中多糖含有量，计算综合评分。
结果如表9所示，选择综合评分最高的三种树脂继续进行筛选，分别是NKA-9、AB-8、 D101。
表9静态实验考察结果
Figure BDA0003713677640000161
1.4动态实验
将处理好的NKA-9、AB-8、D101三种大孔吸附树脂按1∶8的径高比装柱，加入1.0mg/ml 粗多糖溶液15ml，静置吸附4h，使各树脂吸附皆达到饱和，用水洗脱，收集洗脱液至Molish 反应呈阴性，将洗脱液浓缩，定容至15ml，计算多糖保留率和动态解吸率，用综合评分表示。
结果如表10所示，AB-8较NKA-9、D101的综合评分高，所以选择AB-8作为本实验的大孔吸附树脂。
表10动态实验考察结果
Figure BDA0003713677640000162
1.5上样液浓度考察
将提取液浓缩至1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的粗多糖溶液，用AB-8大孔吸附树脂按1∶8的径高比装柱，分别加入各浓度的粗多糖溶液15ml，用水进行洗脱，流速1.0 ml/min，收集洗脱液，浓缩定容至15ml，照“2.3测定波长的选择”项进行测定，计算多糖保留率。
结果如图13所示，随着上样浓度的增加，多糖保留率在逐渐降低，特别是多糖浓度大于 3mg/ml时，这可能是由于上样浓度大，引起了固定相超载的原因，因此选择上样浓度为1mg/ml。
1.6径高比的考察
取1mg/mL粗多糖溶液共3份，每份15ml，将AB-8树脂分别按1∶6、1∶7、1∶8径高比装柱，用水洗脱，收集洗脱液，浓缩定容至15ml，照“2.3测定波长的选择”项进行测定，计算保留率。
结果如图14所示，故选择1∶8作为最佳径高比。
1.7上样量的考察
取处理好的AB-8大孔吸附树脂，按1∶8的径高比装柱，取1mg/ml得粗多糖溶液3份，每份25ml，每5ml洗脱液进行收集，并编号为1，共收集20份。以水为空白对照，在490nm 处测定吸光度，绘制泄露曲线。
结果见图15，由泄露曲线图可知，从第5管(25ml)开始泄漏，故最大上样量选择25ml、 37.5ml、50ml。同法装柱洗脱，浓缩定容至25ml，照“2.3测定波长的选择”项进行测定，计算多糖保留率。
结果见图16，可知上样量为25ml时纯化效果最佳。
1.8洗脱剂用量
AB-8大孔吸附树脂按1∶8的径高比装柱，1.0mg/mL粗多糖溶液上样25ml，静置吸附4 h，用水洗脱，收集洗脱液，每25ml收集1份，取少量洗脱液直至洗脱液用Molish反应检测呈阴性，此时表明大孔吸附树脂上的粉条儿菜多糖已经基本洗脱，此时停止收集洗脱液，此时洗脱剂的用量为150ml。因此，本实验的洗脱剂用量为150ml。
1.9验证试验
大孔吸附树脂的最佳纯化工艺为：上样浓度为1mg/ml，即料液比为1：70，径高比为1： 8，上样量为25ml，洗脱剂用量为150ml，即上样量与洗脱剂用量的比为1：6，按照最佳纯化工艺进行3份样品的纯化，结果见表11，结果显示用上述最佳的纯化工艺有较好的对比性。
表11验证实验
Figure BDA0003713677640000171
取3份1mg/ml粗多糖液25ml在最佳纯化工艺条件下，搜集150ml洗脱液，进行水浴蒸发，得到浸膏，同时取3份未纯化的粗多糖液进行挥发，得到未纯化的浸膏。计算含有率率。结果如表12所示，大孔吸附树脂对粉条儿菜多糖的含有量由2.46％提升至5.02％。
表12大孔树脂吸附法多糖纯化前后比较
Figure BDA0003713677640000172
2醇沉纯化工艺考察
水提醇沉法是中药多糖常用的纯化方法之一，影响醇沉的因素主要有提取液浓度、醇沉浓度、醇沉时间等，此三个因素采用单因素试验进行筛选。
2.1提取液浓度的考察
将照“2.2”下最优工艺制得的粉条儿菜水提液，均分为4份，分别浓缩至原体积的20％、 30％、40％、50％后，均加乙醇醇沉至含醇量80％，静置4h，以4000r/min离心10min，取沉淀，干燥，按照“2.2项”制备供试品溶液并测定吸光度，计算多糖含有率。
照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果如图17所示，当药液浓缩浓度在原体积的 40％时，其多糖在490nm处有最大的吸收峰，故选择浓缩到原体积的40％最佳。
2.2醇沉浓度的考察
将粉条儿菜水提液浓缩至原体积的40％后，依次加乙醇至含醇量60％、70％、80％、90％，分别为192ml、224ml、256ml、288ml乙醇，静置4h，以4000r/min离心10min，取沉淀，干燥，按照“2.2项”制备供试品溶液并测定吸光度，计算多糖含量。
照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果如图18所示，当醇沉浓度为80％时，其多糖在490nm处有最大的吸收峰，故选择醇沉浓度为80％最佳。
2.3醇沉时间的考察
将粉条儿菜多糖水提液浓缩至40％后，加入乙醇达到乙醇浓度到80％，静置2h、4h、6h、 8h、12h、24h后，以4000r/min离心10min，取沉淀，干燥，按照“2.2项”制备供试品溶液并测定吸光度，计算多糖含量。
照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果如图19所示，当醇沉时间为4h时，其多糖在490nm处有最大的吸收峰，故选择醇沉时间为4h最佳。
2.4Sevage法除蛋白
参照刘子健等[26]报道的除蛋白方法，取粉条儿菜粉末1g，按最优条件进行提取并醇沉后，与Sevage试剂(氯仿-正丁醇＝4∶1，V/V)混合，(粉条儿菜水溶液-Sevage试剂＝5∶1， V/V)，振荡，静置，回收下层Sevage试剂，将剩余的药液和析出物以4000r/min离心10min，再加入上清液体积1/5的Sevage试剂，重复上述操作3次，收集上清液，干燥，按照“2.2项”制备供试品溶液并测定吸光度，计算多糖含量。
照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果如表13所示：平均的吸光度为0.408，对比图18的0.454，说明粉条儿菜中存在一定量的蛋白质，会对实验产生误差，故而除蛋白是很有必要的一项工作。
表13 Sevage法除蛋白结果
Figure BDA0003713677640000181
2.5工艺验证
取粉条儿菜药材1g，共3份，按最优工艺用水提取，将水提液浓缩至原体积的40％后，用乙醇进行80％醇沉4小时，再除蛋白后，按照“2.2项”制备供试品溶液并测定吸光度，计算多糖含有率。
照“2.3测定波长的选择”项进行测定，结果如表14所示：水提醇沉法对粉条儿菜多糖的含有率由2.23％提升至3.27％。
表14醇沉法多糖纯化前后比较
Figure BDA0003713677640000191
3讨论与结论
在本实验过程中每一次的提取都先使用了石油醚对粉条儿菜先进行提取，在本实验过程中，石油醚的主要作用是排除粉条儿菜中色素对紫外分光光度计的影响，从而排除对实验的相关干扰。同时，采用氢氧化铜试剂对粉条儿菜总糖中是否存在单糖进行了验证，在粉条儿菜总糖溶液中加入新制氢氧化铜悬浊液并加热，未产生砖红色沉淀，说明溶液中无单糖物质。
在水提醇沉法中，有除蛋白项，此步骤中没有除蛋白质的吸光度是0.454，经过除蛋白后吸光度是0.408，说明粉条儿菜中蛋白质对吸光度的干扰较大，在做类似实验时应当去除蛋白质对吸光度的影响，实验数据才能更可靠。
粉条儿菜多糖是一种极具有开发潜力的药效成分，由于水提法的操作比较容易、价格低廉、同时也适用于大规模的工业化生产，成为粉条儿菜多糖的主要提取方法之一。本试验在单因素考察的基础上，采用Box－Behnken响应面法优化并分析粉条儿菜多糖的提取工艺并建立其含量测定的方法，得到的最佳提取条件为:料液比为1：60(g/ml)，提取时间1h/次，提取次数2 次。在此条件下，测得粉条儿菜多糖平均含量为4.95％，实测值与模型预测值无显著性差异，说明该方法可用于粉条儿菜多糖提取工艺的优化，以为优质粉条儿菜资源的筛选和健康产业的稳定发展提供科学依据。
经过大孔吸附树脂纯化和用水提醇沉法纯化后，大孔吸附树脂对粉条儿菜多糖的含有量由 2.46％提升至5.02％；水提醇沉法对粉条儿菜多糖的含有量由2.23％提升至3.27％。我们可以很明显的比较两种纯化方法对粉条儿菜多糖的纯化效果：大孔树脂较水提醇沉来说，大孔树脂的操作程度要复杂些，但多糖的含有量要比醇沉法纯，在更精细的化学分析中，使用大孔树脂来纯化效果更好，并且从含有率来说大孔吸附树脂的含有率也较醇沉法高，可操作性强。
参考文献：
[1]何顺志,徐文芬,黄敏,等.贵州中药资源种类、地理分布及开发利用现状[J].贵州科学,2004,(4):45-52.
[2]李光华.粉条儿菜不应作瞿麦用[J].贵州医药,1987,(3):48.
[3]王锦秀.粉条儿菜和粉条儿菜的考释[J].植物分类学报,2005,44(1):100-107.
[4]赵以民,张树仁,毕海燕.粉条儿菜属_粉条儿菜科_的地理分布及其物种多样性和分化中心_赵以民[J].西北植物学报,2006,(10):2131-2141.
[5]吴宇飞.九阜山自然保护区野生百合科药用植物资源多样性调查[J].中国林副特产,2017,150(5):72-78.
[6]郑敏.中药多糖抗肿瘤的药理学研究进展[J].国外医学(中医中药分册),2000,(5):259-263.
[7]潘杰,潘卫东.粉条儿菜脂溶性化学成分研究[J].山地农业生物学报,2011,30(5):458-460.
[8]黄兰,潘杰,曹佩雪,等.粉条儿菜化学成分研究[J].中草药,2013,44(7):812-815.
[9]李林珍,王孟华,孙建博,等.粉条儿菜化学成分的研究[J].中国药科大学学报,2014,45(2):175-177.
[10]李焱,王婷,丁义.粉条儿菜化学成分的初步研究[J].时珍国医国药,2010,21(3):644-645.
[11]冯国宣.抗癌植物资源与天然产物研究[J].湖北民族学院学报(自然科学版),2001,(3):26-32.
[12]王如锋,陈平,贾放,等.鄂产竹节参多糖的抗炎、镇痛活性[J].中国医院药学杂志,2012,32(7):491-494.
[13]武剑.柴胡多糖对巨噬细胞免疫功能的调节及对TLR4信号通路的影响[D].复旦大学,2012.
[14]刘隽怡,潘清波.浅析癌症现状以及抗癌药物的发展与前景[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(26): 103,105.
[15]邵祥龙,苏日娜,李伟立,等.茯苓多糖抗肿瘤作用研究进展[J].北京中医药,2009,28(4):315-317.
[16]黎敏,刘莉,刘周江,等.中药多糖抗衰老作用机制研究进展_黎敏[J].重庆中草药研究,2018,73(1):44-46.
[17]许爱霞,张振明,葛斌,等.党参多糖抗衰老作用机制的实验研究[J].中国现代应用药学,2006(S2): 729-731.
[18]刘高强,王晓玲.灵芝多糖的抗癌构效关系及其抗癌作用机制(英文)[J].菌物学报,2006(3):430-438.
[19]解梦汐,姜波,宋莉,等.菊苣多糖的保健功能及产品开发研究进展[J].辽宁农业科学,2020,315(5):59-61.
[20]陈斌.植物多糖在化妆品中的应用研究进展[J].中国野生植物资源,2020,39(4):44-47.
[21]贾妙婷,李成义,孙天雄,等.红芪多糖药理作用研究新进展[J].中药药理与临床,2020,36(6):235-239.
[22]冷永涛,吕圭源,陈素红.肿节风抗肿瘤相关作用及机制研究[J].中国现代药物应用,2010,4(6):232-234.
[23]莫天录,薛林贵,高慧,等.大孔吸附树脂纯化绿茄叶黄酮的工艺研究[J].天然产物研究与开发,2015, 27(3):534-539.
[24]刘丹,吴叶红,李玮桓,等.大孔吸附树脂在天然产物分离纯化中的应用[J].中草药,2016,47(15): 2764-2770.
[25]董漪,吴虹.大孔吸附树脂提取及纯化中药研究进展[J].安徽中医学院学报,2012,31(3):76-78.
[26]刘子健,岳玲.Sevage法纯化紫菜粗多糖的工艺研究[J].吉林农业,2018,428(11):54-55。

Claims (10)

1.一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺，其特征在于：所述的提取纯化工艺步骤如下：
S1，将粉条儿菜干燥并粉碎，过4号筛，得粉条儿菜粉末，备用；
S2，将步骤S1得到的粉条儿菜干燥粉末以料液比1：50～70的石油醚在50～60℃水浴中回流提取0.5～1.0h，过滤，挥干溶剂，得残渣，备用；
S3，将步骤S2得到的残渣以料液比1：50～70的纯化水加热回流提取1～3次，每次0.5～1.5h，过滤后，合并滤液，得粉条儿菜水提取液，备用；
S4，将步骤S3得到的粉条儿菜水提取液，浓缩至料液比为1：35～70，得到粗多糖溶液，备用；
S5，将AB-8大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24h后，进行装柱，95％乙醇冲洗浸泡好的大孔吸附树脂至与水混合后不再出现白色乳浊状为止，再以水为洗脱剂冲洗树脂柱至洗脱液无乙醇味，置于烧杯中用水浸泡，得处理好的大孔吸附树脂，保存备用；
S6，将步骤S5处理好的大孔吸附树脂，按1∶6～8的径高比装柱，加入步骤S4得到的粗多糖溶液上样，静置吸附4～8h，用粗多糖溶液5～7倍量的纯净水洗脱，流速0.5～1.5ml/min，收集洗脱液，采用Molish反应进行洗脱终点的判断，至Molish反应呈阴性作为洗脱终点，将洗脱液浓缩，得到粉条儿菜多糖。
2.根据权利要求1所述的提取纯化工艺，其特征在于：步骤S2中所述粉条儿菜干燥粉末以料液比1：60的石油醚在55℃水浴中回流提取0.5h。
3.根据权利要求1所述的提取纯化工艺，其特征在于：步骤S3中所述残渣以料液比1：60的纯化水加热回流提取2次，每次1h。
4.根据权利要求1所述的提取纯化工艺，其特征在于：步骤S4中所述浓缩至料液比为1:50～70。
5.根据权利要求4所述的提取纯化工艺，其特征在于：步骤S4中所述浓缩至料液比为1:70。
6.根据权利要求1所述的提取纯化工艺，其特征在于：步骤S6中所述处理好的大孔吸附树脂，按1∶8的径高比装柱。
7.根据权利要求1所述的提取纯化工艺，其特征在于：步骤S6中所述静置吸附4h，用粗多糖溶液6倍量的纯净水洗脱，流速1.0ml/min。
8.一种粉条儿菜多糖的检测方法，其特征在于：所述检测方法用于检测权利要求1～7任一项所述的提取纯化工艺提取的粉条儿菜多糖，具体方法如下：
(1)对照品溶液的制备：精密称定10.08mg无水葡萄糖对照品于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，再精密移取5ml至50ml容量瓶中，用水定容至刻度，制成0.1008mg/ml的葡萄糖对照品，即得；
(2)供试品溶液的制备：精密称取粉条儿菜干燥粉末(4号筛)0.2g，于100ml圆底烧瓶中，加入12ml石油醚，在55℃水浴中回流提取0.5h，过滤，挥干溶剂，残渣加入12ml水在沸水浴中回流提取1h，回流提取两次，合并滤液，加水定容至25ml，即得；
(3)测定方法：精密移取对照品溶液、供试品溶液0.2ml，于25ml量瓶中，用水补足至2.0ml，依次精密加入的苯酚溶液和浓硫酸，混匀，在水浴中显色，取出，放置冷水中冷却至室温，以相应试剂为空白对照，在波长490nm处进行光谱扫描。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述依次精密加入2％、3％、4％的苯酚溶液1.0ml和浓硫酸6.0ml、7.0ml、8.0ml，混匀，在60℃、70℃、80℃、90℃水浴中显色15min。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述依次精密加入3％的苯酚溶液1.0ml和浓硫酸6.0ml，混匀，在80℃水浴中显色15min。
CN202210731461.0A 2022-06-24 2022-06-24 一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺 Active CN114891131B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210731461.0A CN114891131B (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210731461.0A CN114891131B (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114891131A true CN114891131A (zh) 2022-08-12
CN114891131B CN114891131B (zh) 2023-04-21

Family

ID=82730152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210731461.0A Active CN114891131B (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114891131B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116003649A (zh) * 2023-02-03 2023-04-25 西南民族大学 一种偏翅唐松草多糖提取方法及其抗氧化活性分析方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944465A (zh) * 2006-10-25 2007-04-11 南京中科集团股份有限公司 一种灵芝孢子多糖的精制工艺
CN105767633A (zh) * 2014-12-22 2016-07-20 哈尔滨天生态农副产品有限公司 一种百药煎润肺化痰黑年糕及其生产方法
CN110818809A (zh) * 2018-08-09 2020-02-21 江苏紫山生物股份有限公司 一种食用菌复合多糖的制备工艺

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1944465A (zh) * 2006-10-25 2007-04-11 南京中科集团股份有限公司 一种灵芝孢子多糖的精制工艺
CN105767633A (zh) * 2014-12-22 2016-07-20 哈尔滨天生态农副产品有限公司 一种百药煎润肺化痰黑年糕及其生产方法
CN110818809A (zh) * 2018-08-09 2020-02-21 江苏紫山生物股份有限公司 一种食用菌复合多糖的制备工艺

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何维维 等: "黔产民族药肺筋草的化学成分预试验研究", 《广东化工》 *
张丽: "《中药分析学》", 30 August 2018, 中国医药科技出版社 *
张志锋: "《彝药化学》", 30 August 2017, 民族出版社 *
李永吉 等: "《高等学校中药学类专业实验操作指南》", 30 May 2017, 中国中医药出版社 *
李焱等: "肺筋草化学成分的初步研究", 《时珍国医国药》 *
蔡凌云等: "川黔民间常用药肺经草（肺筋草）考证", 《中国医药导报》 *
郝鹏飞 等: "《天然药物化学》", 31 July 2014, 吉林大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116003649A (zh) * 2023-02-03 2023-04-25 西南民族大学 一种偏翅唐松草多糖提取方法及其抗氧化活性分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114891131B (zh) 2023-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101244129B (zh) 拉萨大黄提取物、其制备方法及其在制备治疗心脑血管疾病制剂中的应用
CN101974045B (zh) 一种制备红景天苷的方法
CN1865273A (zh) 一种从甘草中提取纯化多种甘草黄酮成分的新方法
CN114891131A (zh) 一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺
CN108042590B (zh) 一种低农残人参茎叶提取物及其制备方法
CN101703669B (zh) 菝葜有效部位群及其提取纯化工艺
CN101078713A (zh) 一种加入内标物的绞股蓝药材指纹图谱质量控制方法
CN101531721B (zh) 一种三萜皂苷单体的工业化制备方法
CN1977885A (zh) 一种抗肝炎药物组合物
CN103083388B (zh) 猪牙皂总皂苷的制备方法
CN107033156B (zh) 阿朴啡生物碱Laurodionine B及其制备方法和应用
CN113429442B (zh) 川射干水提药渣中射干苷和鸢尾黄素的分离方法
CN110776541B (zh) 一种槲皮素-3-龙胆二糖苷的制备方法及用途
CN1977886B (zh) 一种由苦参素、灵芝和黄芪制成的药物组合物
Yan et al. A study on the effect of ethanol extract of Radix rhapontici on erythrocyte immune function in rats
CN108003002B (zh) 大黄素型蒽醌Hedyanthraquinone A及其制备方法和应用
CN107043383B (zh) 阿朴啡生物碱Illigerine A及其制备方法和应用
CN113185618A (zh) 一种抗酒精性肝损伤的白术多糖及其制备方法与应用
CN107879916B (zh) 大黄素型蒽醌Hedyanthraquinone B及其制备方法和应用
CN112076151A (zh) 一种用于治疗气阴两虚证糖尿病的中药口服液体制剂的制备方法及其质量控制方法
CN107892705B (zh) Hedycaffeoylglucoside A及其制备方法和应用
CN110927281B (zh) 一种治疗乳腺增生、乳腺炎的药物组合物乳癖舒胶囊的检测方法
CN113813305B (zh) 一种北五味子果实中活性成分集成提取的方法
CN110215494B (zh) 一种调节睡眠的中药颗粒及其制备方法
CN103860649B (zh) 一种提取亚麻木酚素的方法、所得提取物及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant