CN103860649B - 一种提取亚麻木酚素的方法、所得提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素的方法、所得提取物及其用途。取亚麻籽油渣，用70%乙醇提取，浓缩，滤过，离心；超滤；取超滤液加于大孔树脂上水洗，再依次用20%和30%的乙醇洗脱至无色；收集合并洗脱液，减压浓缩、干燥，即得。本发明的优点：1）工艺简单；2）提取溶媒价廉易获取；3）不采用有机溶媒萃取，解决了萃取效果不理想的问题，且不会对环境造成污染；4）不采用酸碱处理除杂，且精制方法更简单合理，生产成本低；5）所得中间体的亚麻木酚素含量高；6）所制得的提取物具有治疗妇女更年期综合症的效果，可应用于临床，而且经过提取后的亚麻油渣仍可作家畜的饲料使用，大大地提高了油渣的综合利用价值。

Description

一种提取亚麻木酚素的方法、所得提取物及其用途

技术领域

本发明涉及一种从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素的方法、所得提取物及其用途。

背景技术

亚麻籽油渣为胡麻油籽经过压榨或提取其所含植物油后所得的油渣，目前在产地作为家畜饲料使用。经实验发现，亚麻油渣中含有以亚麻木酚素为代表的具有生理活性的物质，具有治疗妇女更年期综合症的效果。目前报道亚麻木酚素的提取方法和溶剂有采用三氯甲烷脱脂后用乙醇和二恶烷作为混合溶剂冷浸提取，或将原料粉碎后加入乙醇冷浸提取及加有机溶剂萃取除杂等方法。但均存在提取时间长，提取效率不高，采用有机溶剂容易污染环境且提取后的油渣不再适合作为家畜饲料使用，生产过程采用酸碱调节药液pH值以及采用乙酸乙酯萃取等方法除杂，存在生产成本高等缺点。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供一种从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素类物质的方法、所得提取物及其用途。

其具体技术方案如下：

一种从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素的方法，其特征在于，步骤如下：

1)取亚麻籽油渣，加入10-20倍量的40-80％乙醇提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液，浓缩至1-2g生药材/ml，冷藏12-48小时，滤过，取滤液，以5000转/分的转速进行离心；

2)取离心液，超滤；

3)取超滤液，以0.5-3BV/h速度加于已处理好的大孔树脂上，水洗至流出液无色，再依次用20％和30％的乙醇以0.5-3BV/h的速度进行洗脱至洗脱液无色；

4)收集合并20％、30％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥、即得。

优选地，所述的从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素类物质的方法，其特征在于，步骤如下：

1)取亚麻籽油渣，加入16倍量的70％乙醇提取3次，每次1小时，合并提取液，浓缩至2g生药材/ml，冷藏24小时，滤过，取滤液，以5000转/分的转速进行离心；

2)取离心液，超滤；

3)取超滤液，以1BV/h速度加于已处理好的大孔树脂上，水洗至流出液无色，再依次用20％和30％的乙醇以2BV/h的速度进行洗脱至洗脱液无色；

4)收集合并20％、30％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥、即得。

进一步地，所述亚麻籽油渣是亚麻籽经压榨或提取其所含植物油后，过滤所得。

优选地，所述步骤2)中，用截留分子量为5-10万的膜超滤。

优选地，所述步骤3)中，采用D101大孔树脂。

进一步地，由上述方法制得的提取物。

进一步地，由上述方法制得的提取物在制备抗更年期综合症药物中的用途。

本发明对原料处理方式，提取方法、提取溶媒及其精制方法进行了大量实验研究和验证，结果表明，本发明和现有技术相比，其综合有益效果如下：

1)本法工艺简单，原材料不用粉碎，直接提取；

2)提取溶媒价廉易获取(仅采用70％乙醇)；

3)不采用有机溶媒萃取，解决了萃取效果不理想的问题，且不会对环境造成污染；

4)不采用酸碱处理除杂，且精制方法更简单合理，生产成本低；

5)本发明所得中间体的亚麻木酚素含量高，达91％以上；

6)本发明所制得的提取物具有治疗妇女更年期综合症的效果，可应用于临床，而且经过提取后的亚麻油渣仍可作家畜的饲料使用，大大地提高了油渣的综合利用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地说明。

实施例

取亚麻籽,经压榨或提取后，滤取油渣，得干燥油渣，取1000g，加入16倍量的70％乙醇提取3次，每次1小时，合并提取液，浓缩至2g生药材/ml，冷藏24小时，滤过，取滤液，离心(5000转/分)，取离心液，用截留分子量为10万的膜超滤，取超滤液，以1BV/h速度加于已处理好的D101大孔树脂上，水洗至流出液无色，依次用20％和30％的乙醇以2BV/h的速度进行洗脱至洗脱液无色，收集合并20％、30％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥、即得。本法所得三批中间体含亚麻木酚素分别为为91.3％、91.8％、91.2％。

为获得较为理想的制备工艺，本发明对从亚麻油渣中提取亚麻木酚素类物质的提取、精制工艺，以及对所得提取物制备抗更年期综合症药物中的用途进行了深入的研究。

(一)从亚麻油渣中提取亚麻木酚素的提取、精制工艺研究

1、仪器与试剂

亚麻油渣：来自山西神池县福渊土特产品开发有限公司，批号：20130617，乙醇(95％)、氢氧化钠、盐酸，乙腈、甲醇均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；酒精计：河北省武强县同辉仪表厂生产；超声波清洗器：KQ-100型，昆山市超声仪器有限公司生产；电子天平：BS-6KH型，上海友声衡器有限公司生产；分析电子天平：FA2004型，上海良平仪器仪表有限公司生产；HPLC：P2302II型,大连依利特分析仪器有限公司生产；旋转蒸发仪：RE-5205B型，上海荣生化设备仪器有限公司生产。

2、提取方法研究

亚麻木酚素的常用提取方法有溶剂浸提法、回流提取法、微生物发酵法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等，本实验对溶剂浸提法、回流提取法进行了研究。

2.1 溶剂浸提法

取药材106.4g，粉碎成粗粉，放于1000ml蒸馏烧瓶中，加600ml浓度为70％的乙醇溶液，在50℃浸提取6h。

2.2 回流提取法

取药材106.4g，粉碎成粗粉，放于1000ml蒸馏烧瓶中，加600ml浓度为70％的乙醇溶液，加热回流提取2h。

2.3 供试品的制备

将2.1和2.2项下的提取液离心除去沉淀，取上清液各50ml备用。

2.4 对照品的制备

取亚麻木酚素标准品0.01070g，用甲醇溶解，定容至10ml，得到1.07g/L的对照品溶液。

2.5 测定法

取2.3项下的供试品，用HPLC法测定，条件：流动相：70％乙腈溶液，流速：1.0x10³，波长：280nm，进样量10ml。计算，实验结果表明溶剂浸提法中药液的木酚素含量低于回流法中药液木酚素含量。

2.6 固含物的测定

量取2.3项下两种提取液相同体积于已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3h，置中冷却30min，迅速称量重量。实验结果表明溶剂浸提法中药液的固含物含量低于回流法中药液固含物含量，故因此本研究选择回流法作为从亚麻油渣里提取木酚素的工艺研究的提取方法。

3、颗粒和碎粉的考察

称取亚麻油渣颗粒，亚麻油渣碎粉100.0g各一份。分别放于两只1000蒸馏烧瓶中，各加500ml浓度为70％的乙醇溶液提取2h。收集提取液，离心除去沉淀，分别取上清液各50ml，按照2.5和2.6的测定方法测定。计算，实验结果表明颗粒亚麻油渣提取药液中木酚素含量高于碎粉亚麻油渣，同时固含物的含量也高于碎粉，故本研究选择形状为颗粒物的原药材为提取药材。

4、提取工艺研究

根据文献报道亚麻油渣提取过程中的影响因素主要为乙醇浓度、加醇量、提取时间及提取次数4个因素，本实验对此进行研究

4.1 单因素实验的考察

参考相关文献，很多专家和学者选择的是70％的乙醇溶液，所以本实验选择乙醇体积分数是60％，70％，80％在这3个水平进行考察。单因素考察已确定乙醇体积分数为70％。

4.2 正交实验因素水平确定

以乙醇为提取溶媒，选取提取时间(A)、提取次数(B)、加醇倍数(C)，乙醇浓度(D)为考察因素，以亚麻油渣中木酚素含量为考察指标采用L₉(3⁴)正交表安排试验，因素水平表见表1。

表1 提取工艺因素水平表

4.3 实验方法与结果

分别取9组亚麻油渣药材(每组100g)，按照正交实验安排表(表3)进行回流提取正交实验，提取液含量测定方法同2.5项下，结果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 正交实验安排及结果

表3 正交试验方差分析表

变异来源	SS	f	S	F	P
						A	57.942	2.000	28.971	7.452	＞0.05
B	1175.473	2.000	587.736	151.179	＜0.01
						C	1563.462	2.000	781.731	201.079	＜0.01
D	7.775	2.000	3.887	1.000	＞0.05

由正交实验结果表明3个因素对从亚麻油渣中木酚素提取效果影响顺序从大到小分别为：加醇倍数>提取次数>提取时间，方差分析表显示提取次数和加醇倍数对提取效果影响均显著。综合试验结果，选取A₁B₃C₃D₁作为本提取工艺的最佳参数，即：药材中加入16倍量70％乙醇，提取3次，每次1h。

4.4 提取工艺验证试验

取3组亚麻油渣颗粒物，1、2组100g，3组200g，1、2组加入1600ml 70％的乙醇，3组入3200ml 70％的乙醇分别提取3次，每次1h，合并提取液，测定提取液中木酚素的含量，结果如表4所示。

表4 提取工艺验证结果表

编号	药材用量/g	木酚素总量/mg
			1	100	12.3942
2	100	12.3669
			3	200	25.0312

验证实验结果表明，本提取工艺稳定、可行。

5、PH值对实验的影响

取验证实验留样浓缩液，分为3份(依次标号为20131026A，20131026B，20131026C)于烧杯中，然后分别加入浓度为1mol/L的NaOH溶液调至PH值分别为7、8、9。药液的颜色发生变化(颜色由浑浊逐渐变得澄清)静置一段时间无沉淀产生。

按2.5和2.6的方法测定

表5 PH值对实验的影响

实验结果表明PH值为8时，测得木酚素的含量有明显提高，但无显著性差异。

6、超滤除杂试验

取超滤前药液，离心，备用，采用截留分子量10kDa、50kDa、100kDa的超滤膜超滤，超滤过程中均控制进料口压力为0.15MPa，出料口压力控制在0.05MPa，使进料口和超滤口压力差稳定在0.1MPa，待超滤液为原体积的2/3时，向浓缩液中加入1/3原体积的纯化水，继续超滤，收集原液体积量的超滤液。分别取超滤液测定亚麻木酚素的含量，结果表明50kDa含量最高，达到25％，但转移率为49％、100kDa的超滤液含量为20％最高，转移率达85.7％，因此选择100kDa的超滤膜作为最佳孔径。

7、大孔树脂的优选

7.1 大孔树脂预处理

将D101、AB-8、HPD100、HPD300、HPD600五种树脂分别用95％的乙醇溶液浸泡。

7.2 大孔树脂的水洗

取7.1中预处理的各大孔树脂一定量，分别进行湿法装柱用纯净水洗至无醇味(或含乙醇低于1％)，然后分别滤干备用。

7.3 大孔树脂的静态吸附

称取7.2中各型号的树脂各7g于烧杯中，用移液管移取0.5g/ml药液(批号20131113冷藏药液)各50ml于各型号大孔树脂中进行吸附。隔10min，30min，1h，2h各震荡一次(保持树脂和药液的充分接触)，静置24h。再分别取一定量的上清液，按照2.5和2.6测定方法测定。计算，实验结果表明AB-8树脂大孔树脂对亚麻木酚素的吸附能力最强。

7.4 D101型大孔吸附树脂吸附洗脱工艺考察：

7.4.1 D101树脂柱对亚麻木酚素的动态吸附曲线：按照预实验的最佳吸附条件(上样浓度为2:1)，树脂柱径高比为1:9.4(1.7cm：16cm)，柱体积为36ml，进行装柱，上样速度为4BV/h，并按5ml/份进行接样，共15份。采用高效液相色谱仪(HPLC)测定流出液中亚麻木酚素的含量，以流出液中亚麻木酚素的浓度(mg/ml)为纵坐标，以上柱液的体积(ml)为横坐标，绘制树脂动态吸附曲线，结果表明提取液的上样体积加至45ml时，D101树脂柱开始出现泄漏。故初步确定树脂的上样量为45ml。

7.4.2 洗脱溶剂的选择：按照优选的吸附条件进行样品吸附后，再用水洗脱至流出液为无色后，分别用10％、20％、30％的乙醇以2BV/h流速洗脱上述树脂柱，按每100ml单位收集流出液，测定各流出液中亚麻木酚素的量，并计算其洗脱率。其结果见表6。

表6 洗脱溶剂的选择研究

由表可知，20、30％的乙醇洗脱下来的亚麻木酚素的量最高，故选择20、30％的乙醇作为洗脱溶剂。

7.4.3 洗脱溶剂用量的考察：采用30％的乙醇溶液洗脱已上样的树脂柱，按照没50ml为单位收集洗脱液，分别测定洗脱液中亚麻木酚素的量，计算洗脱下来的亚麻木酚素的分布情况，结果：前10BV洗脱溶剂对亚麻木酚素洗脱量占总洗脱量的90.36％。含量达92.9％。

8、本法与其他文献方法含量对比研究

按照本法制备三批样品，按照文献方法制备样品，进行纯度对比研究，结果如表7所示

表7 含量对比研究

样品号	亚麻木酚素含量(％)
		1	91.3％
2	91.8％
		3	91.2％
4	67.8％
		5	82.8％

注：样品1、2、3均为本法制备所得的样品，样品4为油渣经过50％乙醇提取、离心、碱化及滤过后采用大AB-8大孔对脂吸附，收集20％乙醇洗脱液，浓缩、干燥后所得的样品，样品5为油渣经过70％乙醇的45℃下提取2次(8倍量，4小时；6倍量，4小时)，浓缩、采用分子量为10000、5000超滤后，收集超滤液，浓缩干燥后所得的样品

(二)亚麻籽提取物在制备抗更年期综合症药物中用途的研究

1、试剂和药品

促黄体生成激素放免试剂盒，天津德普生物技术和医学产品有限公司。CPIDLH-A；白细胞介素-2放免药盒，解放军总医院科技开发中心放免所，批号：130318；雌二醇放免试剂盒，天津德普生物技术和医学产品有限公司，CPIDE2-A；促卵泡生成激素放免试剂盒，天津德普生物技术和医学产品有限公司。尼尔雌醇片(2mg/片)，上海华联制药有限公司，批号：121201。亚麻籽提取物I为本发明方法制备的样品，批号：121179，提取物II为表14中4号样品，提取物III为表14中提取物5的样品。

2、仪器

1470型Wizard全自动伽玛计数器，芬兰，Pharmacia公司；DK-型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；LDZ5-2型低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂；LeicaTP1020自动脱水机。

3、动物

SD大白鼠雌性200只，体重250～80g，雌雄各半，山西医科大学生提供。

4、实验方法

4.1.去卵巢大鼠更年期综合征模型复制

选用雌性SD大鼠200只，体重250～280g。将实验鼠以乙醚麻醉，腹位固定于大鼠固定板上，并以浸透乙醚的棉球放置动物口鼻部位维持麻醉。然后在最末肋骨下、腋中线和距脊柱外侧约2cm交叉处，剪除长毛，切开皮肤和背肌约1.5～2cm，切口视野中可见一乳白色脂肪团，卵巢即包埋其中，结扎卵巢下输卵管，摘除双侧卵巢，术后将子宫角送回腹腔，缝针。手术后5d作阴道涂片，观察造模后动物动情周期，每天1次，连续5d，挑选不显周期性改变(即卵巢切除干净)的大鼠为造模成功的大鼠。

4.2.评价指标

4.2.1.动情周期的阴道涂片细胞学变化

(1)动情间期：主要是大量多核的白细胞，也有少量的上皮细胞。

(2)动情前期：有大量上皮细胞，呈粒状胞浆，尚有少量角化(无核)的上皮细胞，但无白细胞。

(3)动情期：主要是大量角化上皮细胞，形状大而不规则，间有少量上皮细胞。

(4)动情后期：有大量白细胞，亦有融合的角化上皮细胞。

4.2.2.造模成功参考结果：

实验动物从手术后第5天起，全部进入了动情间期，以后脱落细胞逐日减少，至第9日，仅见到少量的白细胞，偶见有核上皮细胞，但动物仍活泼喜动，毛色光滑，肌肉紧张度正常。

本法从雌激素分泌降低这一角度来考虑制备的更年期动物模型，结果表明实验动物持续处于动情间情，而不再出现动情前期、动情期等雌激素的作用变化，基本上符合“更年期”表现。

4.3.分组给药

将造模成功的大鼠随机分为6组：(1)假手术组：蒸馏水10ml/kg；(2)模型组：蒸馏水10ml/kg；(3)尼尔雌醇组：0.42mg/kg；(4)亚麻籽提取物I组：12.0g(生药)/kg；(5)亚麻籽提取物组Ⅱ组：12.0g(生药)/kg；亚麻籽提取物III组：12.0g(生药)/kg。

4.4.检测指标

(1)阴道涂片细胞学观察：于灌胃给药后第10日作阴道涂片观察大鼠的动情周期，用消毒棉签插入大鼠阴道约1～2cm，沿阴道壁旋转一圈取出，均匀涂于载波片上，稍风干后用10％甲醛溶液固定，经常规取材，脱水，石蜡包埋，制片，HE染色后进行光镜检查，每日1次，连续4日。

(2)性激素水平测定：末次给药后24h大鼠眼眶取血，检测血清促性腺激素、性激素水平：放免法测定雌二醇(E₂)、促黄体生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、白细胞介素-2(IL-2)等指标。

4.5.统计方法

量反应用Excel软件作student-t检验。质反应用SPSS软件作χ²(卡方)检验。

5、实验结果

5.1.对大鼠阴道涂片及动情周期结果的影响

结果显示，模型组大鼠出现大量角化上皮细胞的动物数明显低于假手术组，与假手术组比较差异显著(p<0.01)；各给药组出现大量角化上皮细胞的动物数目均比模型组有所增加，其中亚麻籽提取物Ⅰ、Ⅱ、III组与模型组比较有显著性差异(p<0.05)，但提取物I组与模型组比较有极显著性差异(p<0.01)。提示药物可改善更年期大鼠模型的动情周期的变化。

表8亚麻籽提取物及其各部分提取物对更年期大鼠阴道涂片的影响(X²)

注：与假手术组比较，^△△p<0.01；与模型组比较，**p<0.01，*p<0.05。

5.2.对大鼠血清IL-2及LH、E₂、FSH激素水平的影响

结果提示，造模后大鼠白细胞介素-2(IL-2)、雌二醇(E₂)低于假手术组，促黄体生成素(LH)、促卵泡素(FSH)高于假手术组。结果见表9。

表9亚麻籽提取物及其各部分提取物对更年期大鼠血清激素水平的影响

注：与假手术组比较，^△△p<0.01；与模型组比较，**p<0.01，*p<0.05。

6、实验结论

从上述研究结果表明，本发明所得的提取物对妇女更年期综合症有一定的治疗作用，且较之其他方法效果更佳。

综上所述，以上仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。

Claims (7)

1.一种从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素的方法，其特征在于，步骤如下：

1)取亚麻籽油渣，加入10-20倍量的40-80％乙醇采用回流提取方法提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液，浓缩至1-2g生药材/ml，冷藏12-48小时，滤过，取滤液，以5000转/分的转速进行离心；

2)取离心液，超滤；

3)取超滤液，以0.5-3BV/h速度加于已处理好的大孔树脂上，水洗至流出液无色，再依次用20％和30％的乙醇以0.5-3BV/h的速度进行洗脱至洗脱液无色；

4)收集合并20％、30％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，即得。

2.如权利要求1所述的从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素的方法，其特征在于，步骤如下：

1)取亚麻籽油渣，加入16倍量的70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，浓缩至2g生药材/ml，冷藏24小时，滤过，取滤液，以5000转/分的转速进行离心；

2)取离心液，超滤；

3)取超滤液，以1BV/h速度加于已处理好的大孔树脂上，水洗至流出液无色，再依次用20％和30％的乙醇以2BV/h的速度进行洗脱至洗脱液无色；

4)收集合并20％、30％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，即得。

3.如权利要求1或2中任一所述的从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素的方法，其特征在于，所述亚麻籽油渣是亚麻籽经压榨或提取其所含植物油后，所得的干燥油渣。

4.如权利要求1或2中任一所述的从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素的方法，其特征在于，所述步骤2)中，用截留分子量为5-10万的膜超滤。

5.如权利要求1或2中任一所述的从亚麻籽油渣中提取亚麻木酚素的方法，其特征在于，所述步骤3)中，采用D101大孔树脂。

6.由权利要求1或2中任一所述方法制得的提取物。

7.由权利要求1或2中任一所述方法制得的提取物在制备抗更年期综合症药物中的用途。