CN102697781B - 胡芦巴碱作为制备防治糖尿病及其并发症药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有氮作为环杂原子的六元环的杂环系统的药物，具体涉及胡芦巴碱在制备防治糖尿病及其并发症药物中的应用。本发明所述的药物由胡芦巴碱和药学上可以接受的辅料组成，其中，胡芦巴碱的含量为1%~99.5%。本发明所述的药物是片剂或胶囊等口服制剂。

Description

胡芦巴碱作为制备防治糖尿病及其并发症药物的应用
技术领域
本发明涉及一种防治糖尿病及其并发症的医药配制品，具体涉及含有氮作为杂环原子的六元环的杂环系统的药物。
背景技术
当前，全球化的糖尿病已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后的严重危害人类健康的第三大疾病。世界卫生组织及国际糖尿病联盟资料表明预计到2025年全世界糖尿病患者总人数将达到3.33亿。根据我国公布的19省市糖尿病普查结果显示随着人群平均寿命延长，经济收入的增加和生活方式的改变(如多食少动、精神紧张、吸烟饮酒等)，糖尿病患者总数将以每年至少100万的数量增加。我国近20年来糖尿病发病率增长了5倍多，是全球增长最快的国家之一，其中2型糖尿病占全部患者的90%以上。糖尿病并发症是糖尿病患者致死的重要原因，目前对糖尿病并发症的发病机制尚未完全阐明，也缺乏有效的防治药物。糖尿病及其并发症的防治消耗了大量的医疗资源，给世界各国带来了巨大的医疗压力和沉重的经济负担，医学界对该病的防治也感到非常棘手。已有研究显示，西医西药尚缺乏安全有效的手段从各方面改善糖尿病并发症，而且药物种类偏少，价格居高不下，长期使用药效下降、依从性降低，产生诸多副作用。
祖国传统医学称糖尿病为消渴病，在防治糖尿病及其并发症方面进行了大量的临床实践。目前，西药治疗糖尿病注重于控制血糖，但仅仅控制血糖不能在根本上阻止糖尿病并发症的发生。中医药从辨病辨证论治的角度出发，根据糖尿病及其并发症的病证特点，从整体水平上加以综合调理，可使糖尿病及其并发症的症状减轻。中药具有祖国传统医药特色和良好的临床疗效，在糖尿病及其并发症的防治上具有广阔的前景。传统中药用于糖尿病的防治，尤其是治疗伴有高脂血症糖尿病方面已经积累了丰富的经验，是进一步研究和开发新药的宝贵资源。由于传统中药的复杂成份经常展现出多种生物活性和不同的作用机制，而中药复方制剂更具复杂成分使其难以阐明机制，中药单体成分防治糖尿病及其并发症的作用机制易于阐明。因此，从天然药物中筛选和研究有效中药单体成分以防治糖尿病及其并发症，这对于延长患者的寿命，提高生活质量具有重大的社会和经济意义，已受到全世界的普遍关注。近年来，从现代药理研究和古代文献记载出发筛选防治糖尿病及其并发症的中药单体成分已成为糖尿病防治药物研究的热点之一。
目前我国批准使用的口服降糖药有促胰岛素分泌剂(磺酰脲类、格列奈类)和非促胰岛素分泌剂(α-糖苷酶抑制剂、双胍类、噻唑烷二酮胰岛素增敏剂)，但都不能从根本上解决在降低高血糖方面维持长期疗效及针对病因有效缓解病情这两大最为显著的问题，因此限制了这些药物在临床上的应用。与化学合成药物相比，资源广泛的天然植物药及有效成分具有低毒高效，使用安全的优点，为寻求新型抗糖尿病及其并发症的药物防治展现了一条极其广阔的途径。但到目前为止，尚无有效的天然药物或中药活性成分用于糖尿病及其并发症的防治。因此寻找新的防治药物一直是该领域中的研究热点。
胡芦巴碱(Trigonelline)，又称胡芦巴灵，化学名为4-羟基异亮氨酸(L-4-Hydroxyisoleucine)，其化学结构如下式所示，分子式为C7H7NO2，分子量是173.6,CAS登录号为535-83-1。
Figure BDA00001751592500021
葫芦巴碱存在于豆科植物葫芦巴的种子、葫芦科植物南瓜的果实及多种植物如咖啡豆，马铃薯中。常用其盐酸盐，溶于水和醇。具有降血糖、降低胆固醇、抗癌、促进神经组织再生、镇静等功效[姜华,尹湉,赵余庆.胡芦巴碱的生物分布与药理作用.中草药,2008,39(4)：2-4.]。研究显示胡芦巴碱能降低大鼠和人的血糖浓度[Moorthy R,Prabhu K,Murthy P.Studieson the isolation and effect of orally active hypoglycemic principle from the seeds of fenugreek(Trigonella foenum graecum).Diabetes Bull,1989,9：69-72;Mishkinsky J,Joseph B,Sulman FG.Hypoglycaemic effect oftrigonelline.Lancet,1967,2(7529)：1311-1312;van Dijk AE,Olth of MR,Meeuse JC,Seebus E,Heine RJ,van Dam RM.Acute effects of decaffeinated coffee and themajor coffee components chlorogenic acid and trigonelline on glucose tolerance.Diabetes Care,2009,32(6)：1023-1025.]。仅有文献报道，胡芦巴碱抑制一种伴有2型糖尿病的肥胖小鼠，KK-Ay糖尿病小鼠的进展机制与其调控葡萄糖激酶/葡萄糖-6-磷酸酶和肿瘤坏死因子α产生密切相关[Yoshinari O,Igarashi K.Anti-diabetic effect of trigonelline and nicotinic acid,onKK-Aymice.Curr Med Chem,2010,17(20)：2196-2202.]。体外细胞实验表明胡芦巴碱具有抗氧化功效[Bakuradze T,Lang R,Hofmann T,Stiebitz H,Bytof G,Lantz I,Baum M,Eisenbrand G,Janzowski C.Antioxidant effectiveness of coffee extracts and selected constituents in cell-freesystems and human colon cell lines.Mol Nutr Food Res,2010,54(12)：1734-1743.]。
胡芦巴系豆科一年生草本植物，是一种集食用、药用、香料、饲料、工业原料于一体的经济作物。胡芦巴味苦、温，无毒，可补肾阳、祛寒湿，是宁夏地道药材。葫芦巴种子含龙胆宁碱、番木瓜碱和葫芦巴碱等生物碱和黄酮、氨基酸、矿物质和维生素等成分。现代研究表明葫芦巴具有抗糖尿病和降胆固醇作用。可见，葫芦巴碱是葫芦巴降血糖和降血脂的主要活性成分。胡芦巴碱也是咖啡、南瓜、紫茉莉根等用于防治糖尿病的传统中药的的主要成份之一。
虽然已有报道胡芦巴碱可降低糖尿病大鼠血糖值，但其安全性和具体作用机制尚未阐明，糖尿病动物模型单一，仅仅观察胡芦巴碱降低KK-Ay糖尿病小鼠血糖及其可能作用机制，且对防治糖尿病并发症的作用及其机制国内外均未见报道。为将胡芦巴碱进一步应用于防治糖尿病及其并发症上，尚存在诸多技术和作用机制问题，包括对2型糖尿病患者常伴有的血脂升高、组织糖脂代谢紊乱等症状和糖尿病并发症的影响，以及对正常人糖脂代谢的影响。这些功能指标和作用机制的完善将为胡芦巴碱应用于防治糖尿病及其并发症和其制备方法提供坚实的理论基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种葫芦巴碱在制药中的新用途。
上述新用途是葫芦巴碱的抗糖尿病用途，具体是葫芦巴碱在制备防治糖尿病及其并发症药物中的应用。
本发明所述的葫芦巴碱(Trigonelline)，又称胡芦巴灵，化学名为4-羟基异亮氨酸(L-4-Hydroxyisoleucine)，分子式为C7H7NO2，分子量是173.6。
本发明所述的葫芦巴碱可以从葫芦巴中提取得到，也可以由合成或其他方法制得。
本发明所述的提取方法是本领域常用的生物碱提取方法。
本发明所述的胡芦巴(Trigonella foenum graecum F.)是豆科蝶形花亚科植物胡芦巴的成熟干燥种子。
本发明所述的葫芦巴可以是葫芦巴种子、南瓜、紫茉莉根等植物，最好是葫芦巴的种子。
本发明所述的药物采用本领域常用的制备方法，具体可参考以下文献：1、肖崇厚主编的《中药化学》(上海科学技术出版社，第1版，上海，1997.)；2、梁生旺主编《生物碱类成份分析》(学苑出版社，北京，1999.)；3、宋小妹，唐志书主编《中药化学成分提取分离与制备》(人民卫生出版社，北京，2004.)。本发明人认为值得推荐的如下方法：
1、取正品中药葫芦巴，粉碎成粗粉(过40目)，100℃水浴加热微沸提取30min。
2、减压回收乙醇后，用3%盐酸溶液溶解过滤。滤液用氨水碱化，用乙醚加热回流提取数次，回收溶剂，得乙醚提取液。参阅网络资料
3、上样于硅胶(200~300目)柱，以石油醚-醋酸乙酷梯度洗脱，所得流份再反复经硅胶柱、SephadexLH-20柱和ODS柱色谱分离，得到葫芦巴碱。
本发明所述的葫芦巴碱具有防治糖尿病及其并发症作用，尤其是2型糖尿病及其并发症的作用。
本发明所述的药物由葫芦巴碱和药学上可以接受的辅料组成，其中，葫芦巴碱的含量1%~99.5%。
本发明所述的药物可以是本领域常用的口服剂型，如胶囊(硬胶囊、软胶囊)、片剂(素片、糖衣片，薄膜衣片)、丸剂(微丸、滴丸)、颗粒剂、片剂等。
为了进一步阐明胡芦巴碱的药理作用，本发明对胡芦巴碱防治糖尿病及其并发症作用进行了研究，发现胡芦巴碱具有以下药理作用及其机制：(1)明显的降血糖、降低血清总胆固醇、血清甘油三酯、降低组织甘油三酯含量和增加糖原含量的作用，预防性和治疗性给药的降糖降脂功效相似，且不影响正常小鼠的糖脂代谢；(2)降低糖尿病大鼠血糖血脂、血清胰岛素，提高胰岛素敏感指数，增加胰腺中胰岛面积和胰岛β细胞胰岛素表达，增加胰腺重和胰腺重体重比值，但不影响糖尿病大鼠体重；(3)增加糖尿病神经病变大鼠的感觉和运动神经传导速度，降低冷热敏感性，改善坐骨神经超微病理结构的改变，增加血清胰高血糖素样肽1水平和坐骨神经中胰高血糖素样肽1受体mRNA和蛋白的表达，降低坐骨神经中磷酸化p38蛋白的表达，但不影响总p38蛋白的表达。
本发明的有益效果：本发明通过多项实验证明中药单体成分胡芦巴碱具有降血糖、降血脂、降低肝脏和骨骼肌中甘油三酯含量和增加肝脏和骨骼肌中糖原含量的功效，预防性和治疗性给药的降糖降脂功效相似，且对正常小鼠的糖脂代谢无影响。本发明为糖尿病及其并发症提供一种非合成降糖药，其功能明确、作用持久、无毒副作用，拓宽了胡芦巴碱防治疾病的范围。
药效实验1葫芦巴碱对2型糖尿病和正常小鼠糖脂代谢的影响：
实验通过对本发明的药物进行药效学研究，观察其对正常和2型糖尿病小鼠血糖、血脂、肝脏和骨骼肌中糖原和甘油三酯含量的影响。
1.1实验材料与方法
(1)动物和试剂
清洁级雄性KM小鼠，体重18-22g，由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。自由饮水摄食，清洁级动物房适应性饲养1周，温度(20±2)℃，湿度(60±5)%，12h光照周期。
格列本脲(No.20100224,纯度99.56%)，购至武汉远城科技发展有限公司；链脲菌素，美国Sigma公司产品；总胆固醇、甘油三酯、肌酐糖原试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；血糖试纸为美国强生公司产品。
(2)葫芦巴碱对正常小鼠糖脂代谢的影响
用于单次给药和多次给药的正常KM小鼠均随机分为5组，每组10只动物，正常给药组分别灌胃给予7、21、63mg/kg葫芦巴碱和0.43mg/kg格列本脲，正常对照组灌胃给予蒸馏水。
单次给药过程如下：0.2ml/10g体重给药，单次给药2h后麻醉小鼠，眼球取血用于血糖、血清总胆固醇、血清甘油三酯检测，取快速肝脏和骨骼肌用液氮冻存，用于糖原和甘油三酯的检测。
连续给药过程如下：每天以0.2ml/10g体重给药，连续28天，每14天测1次体重。在第14天，取禁食16h小鼠尾巴血用于血糖检测；在第28天，麻醉禁食16h小鼠，眼球取血用于血糖、血清总胆固醇、血清甘油三酯检测，快速取肝脏和骨骼肌用液氮冻存，用于糖原和甘油三酯的检测。
(3)葫芦巴碱对已建成2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响
禁食16h小鼠腹腔注射160mg/kg链脲菌素，3天后检测空腹血糖，以空腹血糖大于11.1mmol/L为糖尿病造模成功指标，并随机分为5组，每组10只动物。模型给药组分别灌胃7、21、63mg/kg葫芦巴碱和0.76mg/kg格列本脲，模型对照组灌胃等体积蒸馏水。单次给药和多次给药过程同“葫芦巴碱对正常小鼠糖脂代谢的影响”。
(4)预防性给予葫芦巴碱对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响
小鼠随机分为6组，每组10只动物。其中4组分别灌胃7、21、63mg/kg葫芦巴碱和0.76mg/kg格列本脲，剩余2组给予等体积蒸馏水，连续14天。14天后所有小鼠禁食16h其中给予蒸馏水的1组腹腔注射0.1mol/L柠檬酸缓冲液，其余4组均腹腔注射160mg/kg链脲菌素。所有动物再继续给予蒸馏水或葫芦巴碱28天，每14天称一次体重。在第17天(即注射链脲菌素3天后)和28天剪鼠尾取血用于血糖的检测。第42天麻醉禁食小鼠，眼球取血用于血糖、血清总胆固醇和甘油三酯水平的检测，取肝脏和骨骼肌用于糖原和甘油三酯含量的检测。
(5)血清总胆固醇和甘油三酯水平的检测
用南京建成生物工程研究所的总胆固醇和甘油三酯试剂盒检测小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯水平，严格按照说明书进行。
(6)肝脏和骨骼肌中糖原和甘油三酯含量的检测
用南京建成生物工程研究所的糖原和甘油三酯试剂盒检测小鼠肝脏和骨骼肌中糖原和甘油三酯含量，严格按照说明书进行。
1.2结果
(1)葫芦巴碱对正常和2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响
1)葫芦巴碱对血糖水平的影响
单次给药
链脲菌素诱导的糖尿病模型对照组小鼠的空腹血糖水平明显高于给予葫芦巴碱前后的正常小鼠的血糖水平，但是单次给予7、21、63mg/kg葫芦巴碱均不影响正常及糖尿病小鼠的空腹血糖水平，单次给予阳性对照药格列本脲可显著降低糖尿病小鼠的血糖水平，但不影响正常小鼠的血糖水平(表1)。
多次给药
连续灌胃7、21、63mg/kg葫芦巴碱和阳性对照药格列本脲14天和28天对正常小鼠血糖水平均无影响。与给药前和模型对照组小鼠比较，连续14天给予21、63mg/kg葫芦巴碱和格列本脲可降低糖尿病小鼠血糖水平，葫芦巴碱并能在随后14天里进一步降低血糖水平，低剂量(7mg/kg)葫芦巴碱不影响糖尿病小鼠的血糖水平。相反，实验过程中糖尿病模型对照组小鼠的血糖水平持续升高(表1)。
表1单次和多次给药对正常和糖尿病小鼠血糖水平的影响
Figure BDA00001751592500061
Figure BDA00001751592500071
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500072
表示，n＝10。*P＜0.01，糖尿病模型组与正常对照组比较。
#P＜0.01，药物治疗组与糖尿病模型组比较。
Figure BDA00001751592500073
，与给药前比较。
2)葫芦巴碱对血清总胆固醇和甘油三酯水平的影响
单次给药
与正常对照组小鼠比较，注射链脲菌素导致血清总胆固醇和甘油三酯水平显著升高。但是单次给予7、21、63mg/kg葫芦巴碱和格列本脲未能降低正常及糖尿病小鼠的总胆固醇和甘油三酯水平(表2)。
多次给药
连续28天给予7、21、63mg/kg葫芦巴碱和格列本脲均不影响正常小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平。连续28天给予7mg/kg葫芦巴碱和格列本脲也不影响糖尿病小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平，但21、63mg/kg葫芦巴碱可显著降低糖尿病小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平(表2)。
表2.单次和多次给药对正常和糖尿病小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平的影响
Figure BDA00001751592500074
Figure BDA00001751592500081
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500082
表示，n=10。*P＜0.01,糖尿病模型组与正常对照组比较。
#P＜0.01,药物治疗组与糖尿病模型组比较。
3)葫芦巴碱对肝脏和骨骼肌中糖原和甘油三酯含量的影响
单次给药
单次给予7、21、63mg/kg葫芦巴碱和格列本脲对正常及糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中甘油三酯和糖原含量均不产生影响。与正常对照组小鼠比较，糖尿病模型对照组小鼠肝脏和骨骼肌中甘油三酯含量明显增加，而糖原含量明显降低(表3)。
表3.单次给药对正常和糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中糖原和甘油三酯含量的影响
Figure BDA00001751592500083
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500084
表示，n=10。*P＜0.01,糖尿病模型组与正常对照组比较。
多次给药
连续28天灌胃7、21、63mg/kg葫芦巴碱和格列本脲均不影响正常小鼠肝脏和骨骼肌中甘油三酯和糖原含量。与正常对照组小鼠比较，糖尿病模型对照组小鼠肝脏和骨骼肌中甘油三酯含量明显增加，而糖原含量明显降低。连续28天给予7mg/kg葫芦巴碱也不影响糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中甘油三酯和糖原含量，但21、63mg/kg葫芦巴碱可显著降低糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中甘油三酯含量和增加糖原含量；阳性对照药格列本脲可显著增加糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中糖原含量，但不影响甘油三酯含量(表4)。
表4.多次给药对正常和糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中糖原和甘油三酯含量的影响
Figure BDA00001751592500091
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500092
表示，n=10。*P＜0.01,糖尿病模型组与正常对照组比较。
#P＜0.01,药物治疗组与糖尿病模型组比较。
(2)预防性给予葫芦巴碱对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响
1)预防性给予葫芦巴碱对2型糖尿病小鼠血糖水平的影响
腹腔注射链脲菌素诱导糖尿病之前，预防性连续14天给予7、21、63mg/kg葫芦巴碱和格列本脲不影响正常小鼠血糖水平。腹腔注射链脲菌素3天(即连续17天给予葫芦巴碱)后，糖尿病模型对照组小鼠的血糖水平仍明显高于正常对照组小鼠。与糖尿病模型对照组小鼠比较，连续28天灌胃21、63mg/kg葫芦巴碱和格列本脲可明显降低糖尿病小鼠的血糖水平，且葫芦巴碱在连续42天给药后可进一步降低血糖水平。在第28天和第42天，7mg/kg葫芦巴碱均不影响糖尿病小鼠的血糖水平。相反，在实验过程中，糖尿病模型对照组小鼠的血糖水平持续升高(表5)。
表5.预防性给药对糖尿病小鼠血糖水平的影响
Figure BDA00001751592500101
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500102
表示，n=10。*P＜0.01,糖尿病模型组与正常对照组比较。
#P＜0.01,药物治疗组与糖尿病模型组比较。
2)预防性给予葫芦巴碱对2型糖尿病小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平的影响
与正常对照组小鼠比较，糖尿病模型对照组小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平明显升高。预防性连续42天给予21、63mg/kg葫芦巴碱可明显降低糖尿病小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平，但7mg/kg葫芦巴碱和格列本脲不影响糖尿病小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平(表6)。
表6.预防性给药对糖尿病小鼠血清总胆固醇、甘油三酯水平的影响
Figure BDA00001751592500103
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500104
表示，n=10。*P＜0.01,糖尿病模型组与正常对照组比较。
#P＜0.01,药物治疗组与糖尿病模型组比较。
3)预防性给予葫芦巴碱对2型糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中糖原和甘油三酯含量的影响
与正常对照组小鼠比较，链脲菌素诱导可明显导致小鼠肝脏和骨骼肌中甘油三酯含量升高，糖原含量降低。与糖尿病模型对照组小鼠比较，预防性连续42天给予21、63mg/kg葫芦巴碱可明显降低糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中甘油三酯含量，增加糖原含量，格列本脲可显著增加糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中糖原含量，但不影响甘油三酯含量，7mg/kg葫芦巴碱不影响糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中糖原和甘油三酯含量(表7)。
表7.预防性给药对糖尿病小鼠肝脏和骨骼肌中糖原、甘油三酯含量的影响
Figure BDA00001751592500111
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500112
表示，n=10。*P＜0.01,糖尿病模型组与正常对照组比较。
#P＜0.01,药物治疗组与糖尿病模型组比较。
1.3结论
建立糖尿病模型前预防性连续14天灌胃葫芦巴碱并继续给药28天，对糖尿病小鼠的血糖、血清总胆固醇、甘油三酯水平及肝脏和骨骼肌中糖原、甘油三酯含量的影响与建立糖尿病后连续给药28天相同。葫芦巴碱对糖尿病小鼠具有治疗性和预防性的降糖降脂作用，但对正常小鼠的糖脂代谢无影响，说明该药物可用于2型糖尿病及其并发症的防治，且不影响正常糖脂代谢。
药效实验2葫芦巴碱对2型糖尿病大鼠血糖血脂、胰岛素和胰岛的影响：
实验通过对本发明的药物进行药效学研究，观察其对2型糖尿病大鼠血糖、血脂、血清胰岛素、胰岛中胰岛素含量和胰岛β细胞病理结构的影响。
2.1实验材料与方法
(1)2型糖尿病大鼠模型建立、分组及给药
清洁级雄性Wistar大鼠，体重200-240g，高糖高脂饲料由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。动物自由饮水摄食，温度(20±2)℃，湿度(60±5)%，12h光照周期。高糖高脂饲料喂养2周后，大鼠禁食12h后腹腔注射35mg/kg链尿菌素（美国Sigma公司），链尿菌素溶于0.1mmol/L枸橼酸缓冲液(pH4.5)后快速注射，以免降解失效。正常对照组大鼠只注射枸橼酸缓冲液。72小时后取禁食12h大鼠的尾血用稳步倍加型血糖仪(检测范围为0.5-27.6mmol/L)测定血糖值，以空腹血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠造模成功的指标，挑选合格的糖尿病模型大鼠共30只和正常对照大鼠10只，共分4组，每组10只。正常对照组由年龄匹配的正常大鼠组成，既不注射链尿菌素也不用高糖高脂饲料喂养；糖尿病模型组不给予药物治疗，胡芦巴碱(50mg/kg)治疗组，格列本脲(0.30mg/kg)阳性对照组。连续给药4周，每2周测1次大鼠空腹血糖，每周称1次体重，根据体重调整每只大鼠的每天给药量。
(2)血液和组织的采集及处理
连续给药4周末腹腔注射戊巴比妥钠(120mg/kg)以麻醉已禁食大鼠，取鼠尾血用血糖仪测定血糖值。仰卧式固定大鼠后开胸，用10ml注射器从心尖取血，每只大鼠至少可取到10ml全血，立即分装于2支抗凝管(1ml/支)和2支促凝管(4ml/支)中，2h后各取1支用于测定大鼠血液中血脂指标和糖化血红蛋白(HbA1c)含量，剩余2支于4h后分别离心分离血浆和血清，分装于EP管，标记后置于-20℃保存。
大鼠采血后，快速胰腺并称重，剪取部分组织用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，用于苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化实验。
(3)血脂指标和HbA1c的检测
严格按照测试盒说明书检测血清中甘油三酯、总胆固醇和HbA1c含量。
(4)血清胰岛素检测和胰岛素敏感指数评价
严格按照试剂盒说明书进行血清胰岛素含量的测定。评价胰岛素敏感指数(ISI)采用李光伟[李光伟,潘孝仁,Stephen Lillioja,等.检测人群胰岛素敏感性的一项新指数.中华内科杂志,1993,32(10)：656-660]等引进改良胰岛素敏感性指数型公式计算，因1/(血清胰岛素×空腹血糖)为非正态分布，故分析时取其自然对数，即胰岛素敏感指数=log1/(血清胰岛素×空腹血糖)。
(5)胰岛HE染色和免疫组化
免疫组化实验步骤如下：(a)石蜡切片，常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗3次。(b)热修复抗原：将切片置于切片架上，浸入盛有200ml 0.01mol/L枸橼酸缓冲液修复盒并盖上盖子，微波炉中火加热3min至微沸，5min后再加热30s。自然冷却，0.02mol/LPBS洗3次×1min。(c)3%H2O2去离子水(无色液体)孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗3次×1min。(d)甩片，逐片处理逐片滴加蓝色试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)，盖住组织即可，室温孵育15min。吸去多余液体，不洗。(e)滴加按1∶100稀释的胰岛素一抗(小鼠抗大鼠IgG)，一抗原液在临用前用PBS稀释，注意要盖住所有组织。用PBS替代一抗加至各组大鼠的1张切片用于阴性对照。湿盒内4℃过夜。次日取出恢复至室温，用PBS洗3次×3min。(f)滴加黄色试剂B(生物素山羊抗小鼠IgG二抗工作液)，室温孵育15min。PBS洗3次×3min。(g)滴加橙色试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液)，室温孵育15min。PBS洗4次×3min。(h)DAB显色：取1ml蒸馏水，加显色试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后逐片滴加。室温显色，镜下控制反应时间，显色时间为30s，蒸馏水洗涤以终止显色。(i)苏木素复染1min，蒸馏水洗；1%盐酸乙醇分化5s，自来水洗并浸泡10min。(j)梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜观察。按照常规方法进行HE染色。
2.2结果
(1)胡芦巴碱对2型糖尿病大鼠血糖、甘油三酯和总胆固醇水平的影响
与糖尿病模型组大鼠比较，连续14天灌胃给予50mg/kg葫芦巴碱和格列本脲可降低糖尿病大鼠血糖水平，葫芦巴碱并能在随后14天里进一步降低血糖水平，相反，实验过程中糖尿病模型对照组大鼠的血糖水平持续升高。与糖尿病模型组大鼠比较，连续28天给予葫芦巴碱可显著降低糖尿病大鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平，但格列本脲不影响糖尿病大鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平(表8)。
表8.药物对2型糖尿病大鼠血糖和血脂水平的影响
Figure BDA00001751592500131
Figure BDA00001751592500141
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500142
表示，n=10。*P＜0.01,与正常对照组比较.#P＜0.01,与糖尿病模型组比较。
(2)葫芦巴碱对血清胰岛素水平、胰岛素敏感指数和胰岛胰岛素含量的影响
糖尿病模型组大鼠血清中胰岛素水平与正常对照组大鼠比较明显升高，胰岛素敏感指数和胰岛中胰岛素含量则较正常对照组大鼠降低。胡芦巴碱治疗组大鼠血清中胰岛素水平较糖尿病模型组明显降低，胰岛素敏感指数和胰岛中胰岛素含量均显著升高。格列本脲无法改善糖尿病大鼠血清胰岛素水平、胰岛素敏感指数和胰岛中胰岛素含量(表9)。
表9.葫芦巴碱对血清胰岛素水平、胰岛素敏感指数和胰岛胰岛素含量的影响
Figure BDA00001751592500143
胰岛素敏感指数=log1/(血清胰岛素×空腹血糖)。数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500144
表示，n=10。
*P＜0.01,与正常对照组比较.#P＜0.01,与糖尿病模型组比较。
(3)胡芦巴碱对2型糖尿病大鼠胰岛中胰岛素表达的影响
胰岛中胰岛素免疫组化阳性结果呈棕黄色颗粒，存在于β细胞胞质内，免疫组化阴性对照无棕黄色颗粒着色。正常对照组大鼠胰岛素染色阳性β细胞位于胰岛中央部，染色较深(图1A)；糖尿病模型组胰岛素染色阳性β细胞数量明显减少，染色较浅，呈散在分布(图1B)。胡芦巴碱组胰岛素染色阳性β细胞数量比糖尿病模型组增多，但仍较正常对照组减少(图1C)；格列本脲组阳性β细胞数量与糖尿病模型组比较未见明显增加，与正常对照组比较明显减少(图1D)。糖尿病模型组大鼠胰岛中胰岛素表达(积分光密度值)与正常对照组大鼠比较明显下调，胡芦巴碱组大鼠血清中胰岛素表达较糖尿病模型组明显上调，恢复至接近正常对照组大鼠水平；格列本脲组大鼠胰岛中胰岛素表达与糖尿病模型组比较无显著性差异(表10)。
表10.药物对胰腺中胰岛素表达和胰岛面积的影响
Figure BDA00001751592500151
IOD：积分光密度值。数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500152
表示，n=10。*P＜0.01,与正常对照组比较.
#P＜0.01,与糖尿病模型组比较。
(4)胡芦巴碱对2型糖尿病大鼠胰岛普通病理结构的影响
与正常对照组大鼠比较(图2A)(表10)，糖尿病模型组大鼠胰腺中胰岛面积明显减小和胰岛β细胞数量明显减少(图2B)。胡芦巴碱组大鼠的胰岛面积和胰岛β细胞数量较糖尿病模型组大鼠明显增加和增多，恢复至接近正常对照大鼠水平(图2C)；但格列本脲组大鼠的胰岛面积和胰岛β细胞与糖尿病模型组大鼠比较无显著性差异(图2D)。
组大鼠，(C)胡芦巴碱治疗组，(D)格列本脲治疗组。
(5)胡芦巴碱对2型糖尿病大鼠体重、胰腺重和胰腺重体重比值的影响
与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠体重增加，但胡芦巴碱和格列本脲均未能影响糖尿病大鼠体重。糖尿病模型组大鼠的胰腺重、胰腺重体重比值均明显低于正常对照组。胡芦巴碱组的胰腺重、胰腺重体重比值明显高于糖尿病模型组大鼠，有接近正常对照水平的趋势。但格列本脲组的胰腺重、胰腺重体重比值与糖尿病模型组比较无明显差异(表11)。
表11.药物对体重、胰腺重和胰腺重体重比值的影响
Figure BDA00001751592500153
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500154
表示，n=10。*P＜0.01,与正常对照组比较.#P＜0.01,与糖尿病模型组比较。
2.3结论
采用小剂量注射链尿菌素(35mg/kg)加高糖高脂饲料喂养建立2型糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠具有血糖、血脂升高的特点，且血清胰岛素水平升高、胰岛素敏感指数下降，胰岛中胰岛素含量、β细胞胰岛素表达、胰腺重和胰岛面积均明显下降，表明建模成功。经28天50mg/kg葫芦巴碱治疗，糖尿病大鼠血糖、血脂、血清胰岛素、胰岛中胰岛素含量、表达、胰岛面积、胰腺重均得到明显改善，但格列本脲只降低糖尿病大鼠血糖值，未能改善其它指标。
药效实验3葫芦巴碱抗糖尿病神经病变作用及其机制：
该部分实验通过对本发明的药物进行深入的药效学及作用机制研究，观察葫芦巴碱对糖尿病神经病变大鼠的神经传导速度、冷热敏感性、坐骨神经超微病理结构、血清胰高血糖素样肽1浓度、坐骨神经中胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)mRNA和蛋白表达、磷酸化和总p38蛋白的影响，探讨葫芦巴碱抗糖尿病神经病作用及其机制。
3.1实验材料与方法
(1)糖尿病神经病变大鼠模型建立、分组及给药
清洁级雄性SD大鼠，高糖高脂饲料由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。动物自由饮水摄食，温度(20±2)℃，湿度(60±5)%，12h光照周期。高糖高脂饲料喂养2周后，大鼠禁食12h后腹腔注射35mg/kg链尿菌素（美国Sigma公司），链尿菌素溶于0.1mmol/L枸橼酸缓冲液(pH4.5)后快速注射，以免降解失效。正常对照组大鼠只注射枸橼酸缓冲液。72h后取禁食12h大鼠的尾血用稳步倍加型血糖仪(检测范围为0.5-27.6mmol/L)测定血糖值，以空腹血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠造模成功的指标，挑选合格的糖尿病模型大鼠共30只和正常对照大鼠10只，共分4组，每组10只。正常对照组由年龄匹配的正常大鼠组成，既不注射链尿菌素也不用高糖高脂饲料喂养；糖尿病模型组不给予药物治疗，胡芦巴碱(40mg/kg)治疗组，西他列汀(4mg/kg)阳性对照组。连续给药48周，每4周称所有大鼠体重一次，每8周测一次血糖。
(2)冷水和热水甩尾实验
将大鼠尾巴垂直放入45℃热水中，记录从大鼠尾巴入水到甩出水面的时间，以此评价大鼠对热敏感的潜伏期。将大鼠尾巴垂直放入10℃冷水中，记录从大鼠尾巴入水到甩出水面的时间，以此评价大鼠对冷敏感的潜伏期。如果大鼠在15秒内未甩尾，从冷水和热水中取出，此时潜伏期记录为15秒。
(3)神经传导速度
对于坐骨神经，记录电极置于足背，刺激电极置于膝和坐骨切迹。对于腓肠神经，正极置于第三脚趾，负极置于足后跟，正极与负极电极相距5mm。肌电位记录(顺向传导，运动神经传导速度)的频带用2和10赫兹，诱发记录(逆向传导，感觉神经传导速度)的频带用10和2赫兹。
(4)血液和组织的采集及处理
实验结束后，用3％戊巴比妥钠0.2ml/100g麻醉已禁食大鼠（ip，60mg/kg），剪鼠尾尖用血糖试纸测定血糖。仰卧式固定大鼠后打开腹腔，肝门静脉插管，通过门静脉收集肝门静脉血于含二肽基肽酶IV抑制剂的EDTA管。50μl血液用于检测糖化血红蛋白(HbA1c)。离心收集血浆，-80°C储存用于GLP-1(7-36)和其他生化指标的检测。迅速杀死大鼠，分离左右侧坐骨神经，液氮保存用于mRNA、蛋白表达和生化指标的检测。按上述过程逐只处理大鼠。快速去每组一只大鼠的右侧侧坐骨神经用透射电镜专用固定液固定，置于在冰块上的石蜡板上的电镜专用固定液中进行修块，之后快速投入4℃电镜专用固定液，严格按照透射电镜操作方法进行检测。
(5)血清胰高血糖素样肽1浓度的检测
严格按照测试盒说明书检测血清中胰高血糖素样肽1和HbA1c浓度。(6)按照常规方法用real time PCR检测坐骨神经中相关mRNA表达和用western blotting检测坐骨神经中相关蛋白表达。
用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行处理，以积分光密度(Integrated optical density，IOD)表达阳性结果，其值等于阳性物面积×平均光密度(OD)，可反映OD与面积的综合变化，目的条带与相应加样孔内参β-actin IOD的比值表示目的蛋白的表达强度。
3.2结果
(1)胡芦巴碱对2型糖尿病大鼠血糖、糖化血红蛋白和体重差值的影响
实验过程中糖尿病模型组大鼠的血糖水平持续升高。与糖尿病模型组大鼠比较，连续48周给予40mg/kg葫芦巴碱和4mg/kg西他列汀可降低糖尿病大鼠血糖水平，葫芦巴碱治疗能逐步降低血糖值，并降低糖化血红蛋白值。正常对照组大鼠第48周体重与起始体重的差值明显大于其他各组，葫芦巴碱可明显降低糖尿病大鼠体重(表12)。
表12.药物对糖尿病神经病变大鼠血糖、糖化血红蛋白和体重差值的影响
Figure BDA00001751592500171
Figure BDA00001751592500181
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500182
表示，n=10。*P＜0.01，与正常对照组比较；#P＜0.01，与糖尿病模型组比较。
(2)葫芦巴碱对糖尿病神经病变大鼠冷水和热水甩尾潜伏时间的影响
与正常对照组比较，第48周糖尿病大鼠的冷水和热水甩尾潜伏时间均明显下降。经葫芦巴碱治疗能明显改善糖尿病神经病变大鼠受损的冷水和热水甩尾潜伏期时间(表13)。
表13.药物对糖尿病神经病变大鼠冷水和热水甩尾潜伏时间的影响
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500184
表示，n=10。*P＜0.01，与正常对照组比较；#P＜0.01，与糖尿病模型组比较。
(3)葫芦巴碱对糖尿病神经病变大鼠觉神经传导速度的影响
得糖尿病48周之后，大鼠的感觉和运动神经传导速度与正常对照组比较，明显下降。连续48周葫芦巴碱的治疗能明显改善糖尿病神经病变大鼠受损的感觉和运动神经传导速度(表14)。
表14.药物对糖尿病神经病变大鼠运动和感觉神经传导速度的影响
Figure BDA00001751592500185
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500186
表示，n=10。*P＜0.01，与正常对照组比较；#P＜0.01，与糖尿病模型组比较。
(4)胡芦巴碱对糖尿病神经病变大鼠坐骨神经超微病理结构的影响
采用透射电镜观察坐骨神经超微结构发现，正常对照组大鼠坐骨神经的神经纤维形态规整，神经髓鞘结构完整，髓鞘板层呈同心圆状排列；神经轴突内电子密度均匀，雪旺细胞线粒体及无髓纤维均正常(图3C)。糖尿病神经病变模型大鼠的坐骨神经可见有髓神经纤维髓鞘板层分离现象显著，分离处失去层状结构，排列紊乱，电子密度变淡，有的呈突出的葱管样改变；轴突变细，神经微丝排列紊乱，雪旺细胞线粒体肿胀(图3D)。连续48周葫芦巴碱和西他列汀治疗能部分地改善糖尿病神经病变大鼠坐骨神经的超微病理结构改变(图3T，4S)。
(5)胡芦巴碱对糖尿病神经病变坐骨神经中GLP-1R、total-p38和phosphated p38蛋白表达的影响
与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠坐骨神经中GLP-1R mRNA和蛋白表达明显下调，磷酸化p38蛋白则上调，但总p38蛋白表达不变。连续48周葫芦巴碱治疗能增加糖尿病大鼠坐骨神经中GLP-1RmRNA和蛋白表达，并降低磷酸化p38蛋白的表达，但也不影响总p38蛋白的表达(图4，表15)。
表15.药物对糖尿病神经病变大鼠血清胰高血糖素样肽1受体水平、坐骨神经GLP-1RmRNA和蛋白表达的影响
Figure BDA00001751592500191
数据以均数±标准差
Figure BDA00001751592500192
表示，n=10。*P＜0.01，与正常对照组比较；#P＜0.01，与糖尿病模型组比较。
3.3结论
采用小剂量注射链尿菌素(35mg/kg)加高糖高脂饲料长期(48周)喂养建立糖尿病神经病变大鼠模型，糖尿病神经病变大鼠具有感觉、运动神经传导速降低，触觉敏感性增加，坐骨神经超微病理结构改变的特点，表明建模成功。经连续48周40mg/kg葫芦巴碱治疗，糖尿病神经病变大鼠血糖、糖化血红蛋白、感觉神经传导速度、运动神经传导速度、冷水热水甩尾潜伏期、坐骨神经超微病理结构、血清胰高血糖素样肽1浓度，葫芦巴碱改善糖尿病神经病变的部分作用机制与其增加糖尿病大鼠坐骨神经中下调了的胰高血糖素样肽1受体mRNA、蛋白表达和降低上调了的磷酸化p38蛋白表达有关。
本发明可根据实际情况制备成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂或丸剂提供临床应用，在制备上述制剂时可加入适量淀粉或其它辅料作为添加剂。
附图说明
图1.药物对胰岛β细胞分布和胰岛素表达的影响(×400)；其中
(A)正常对照组大鼠，(B)糖尿病模型组大鼠，(C)胡芦巴碱治疗组，(D)格列本脲治疗组。
图2.药物对胰岛β细胞HE染色的影响(×400)；其中
(A)正常对照组大鼠，(B)糖尿病模型，(C)胡芦巴碱治疗组，(D)格列本脲治疗组。
图3.药物对坐骨神经超微病理结构的影响；其中
(C)正常对照组大鼠，(D)糖尿病神经病变模型组大鼠，(T)胡芦巴碱治疗组，(S)西他列汀治疗组。
图4.糖尿病神经病变大鼠坐骨神经中GLP-1R、total-p38和phosphatedp38蛋白表达的变化；其中
(C)正常对照组大鼠，(D)糖尿病神经病变模型组大鼠，(T)胡芦巴碱治疗组，(S)西他列汀治疗组。
具体实施方式
[实施例一]
葫芦巴碱的获得
葫芦巴粉碎成粗粉后，用5倍量50%乙醇室温浸提3次，每次24h，合并滤液，过滤；利用旋转蒸发仪减压浓缩；真空干燥，获得葫芦巴碱，提取率为2.5%。
[实施例二]
葫芦巴碱的获得
葫芦巴粉碎成粗粉后，用10倍量用95%乙醇室温浸提3次，每次48h，合并滤液，过滤；利用旋转蒸发仪减压浓缩；真空干燥，获得葫芦巴碱，提取率为3%。
[实施例三]
葫芦巴碱的获得
葫芦巴粉碎成粗粉后，用12倍量用70%乙醇回流提取3次，每次2h，合并滤液，过滤；利用旋转蒸发仪减压浓缩；真空干燥，获得葫芦巴碱，提取率为4.1%。
[实施例四]
葫芦巴碱的获得
葫芦巴粉碎成粗粉后，用8倍量用80%乙醇回流提取3次，每次2h，合并滤液，过滤；利用旋转蒸发仪减压浓缩；真空干燥，获得葫芦巴碱，提取率为3.7%。
[实施例五]
葫芦巴碱的获得
葫芦巴粉碎成粗粉后，用5倍量用95%乙醇回流提取3次，每次1h，合并滤液，过滤；利用旋转蒸发仪减压浓缩；真空干燥，获得葫芦巴碱，提取率为2.4%。
[实施例六]
葫芦巴碱胶囊的制备
一种中草药药物，它是以中药有效单体成分葫芦巴碱为原料所制成的药剂，用于防治糖尿病及其并发症。
配方：葫芦巴碱(活性成分)200g，乳糖(赋形剂)80g，淀粉(赋形剂)70g，硬脂酸镁(抗粘剂)2.5g，共制成1000粒胶囊。
制备方法：将有效成分和药用辅料均过100目筛，按处方分别准确称量，在混合机中混合10-15min，加入硬脂酸镁2.5g，混合2min后，装入1000粒胶囊即得。
[实施例七]
葫芦巴碱软胶囊的制备
一种中草药药物，它是以中药有效单体成分葫芦巴碱为原料所制成的药剂，用于防治糖尿病及其并发症。
配方：葫芦巴碱(活性成分)200g，植物油(赋形剂)70g，蜂蜡(赋形剂)30g，对羟基苯甲酸甲酯(防腐剂)1g，共制成1000粒软胶囊。
制备方法：将有效成分过100目筛，按照制剂处方准确称取主药和辅料，置于胶体磨研成油膏状混悬物，制成1000粒软胶囊，即得。
[实施例八]
葫芦巴碱颗粒剂的制备
一种中草药药物，它是以中药有效单体成分葫芦巴碱为原料所制成的药剂，用于防治糖尿病及其并发症。
配方：葫芦巴碱(活性成分)250g，糊精(赋形剂)100g，甜菊素(矫味剂)适量。
制备方法：将有效成分和药用辅料均过100目筛，按处方分别准确称量，在混合机中混合均匀，通过干法制粒，包装即得。
[实施例九]
葫芦巴碱薄膜衣片的制备
一种中草药药物，它是以中药有效单体成分葫芦巴碱为原料所制成的药剂，用于防治糖尿病及其并发症。
片芯配方：葫芦巴碱(活性成分)20g，糊精(赋形剂)20g，淀粉(赋形剂)57g，微粉硅胶(抗粘剂)3g。
制备方法：将有效成分和其他药用辅料均过100目筛，称取处方量的葫芦巴碱、淀粉、糊精和微粉硅胶，主辅药充分混匀，过100目筛，制粒，干燥，整粒，压片，包薄膜衣，制成薄膜衣片。每片含葫芦巴碱10mg。
服用方法：口服，一次3片，一日3-4次。
[实施例十]
葫芦巴碱糖衣片的制备
一种中草药药物，它是以中药有效单体成分葫芦巴碱为原料所制成的药剂，用于防治糖尿病及其并发症。
片芯配方：葫芦巴碱(活性成分)200g，糊精(赋形剂)112.5g，乳糖(赋形剂)87.5g，低取代羟丙基纤维素(粘合剂)18.75g，4%羟丙基纤维素的50%乙醇(粘合剂)112.5ml，滑石粉(抗粘剂)3.75g，硬脂酸镁(抗粘剂)3.75g，共制成1250片。
包衣液配方：包衣预混剂(欧巴代OY-C-7000A)4.37g，蒸馏水30g，用于制备1250片。
制备方法：将有效成分和其他药用辅料均过100目筛，称取处方量的葫芦巴碱、乳糖、糊精和占处方量一半的低取代羟丙基纤维素，按等量递加法混合均匀，以4%羟丙基纤维素的50%乙醇为润湿剂制软材，18目筛制粒，湿颗粒于45-50℃干燥，20目筛整粒，加入剩余量的低取代羟丙基纤维素和处方量的滑石粉、硬脂酸镁混匀，测定有效成分含量后，确定片重，于10.0mm浅凹冲模压片。按常规方法包以白色薄膜衣，包衣增重1-2%。
包衣液的配制：在搅拌下把包衣预混剂(欧巴代OY-C-7000A)加入蒸馏水中，5min内加完，继续搅拌45min即得。
[实施例十一]
葫芦巴碱滴丸的制备
一种中草药药物，它是以中药有效单体成分葫芦巴碱为原料所制成的药剂，用于防治糖尿病及其并发症。
配方：葫芦巴碱(活性成分)15g，聚乙二醇4000(粘合剂)50g，聚乙二醇6000(粘合剂)45g。
制备方法：将聚乙二醇4000和聚乙二醇6000置容器内，在85-900℃的油浴上加热溶融，随即加入处方量葫芦巴碱，搅拌均匀，等药物完全分散在液态的载体中后，置滴丸设备中，滴入液体石蜡，滴制成小丸。每丸含葫芦巴碱15mg。
服用方法：口服，一次3粒，一日2-3次。
[实施例十二]
葫芦巴碱胶丸的制备
一种中草药药物，它是以中药有效单体成分葫芦巴碱为原料所制成的药剂，用于防治糖尿病及其并发症。
配方：葫芦巴碱(活性成分)10g，食用植物油100g，明胶40g，甘油20g，水30g。
制备方法：葫芦巴碱与经加热灭菌、澄清的食用植物混合，搅拌均匀，放入药液贮槽内。将明胶、甘油和水混合的明胶液置于明胶液贮槽中，滴制成胶丸。每丸含毛钩藤碱5mg。
服用方法：口服，一次3-4粒，一日3-4次。
由此已详细地描述了本发明，对本领域技术人员而言，在本发明的范围内显然还可有各种改变，本发明并不受说明书所述的限制。

Claims (3)

1. 葫芦巴碱作为唯一活性成分在制备防治糖尿病神经病变药物中的应用。
2. 根据权利要求1的应用，其特征在于，所述葫芦巴碱是从葫芦巴种子、南瓜或紫茉莉根中提取得到的。
3. 根据权利要求2的应用，其特征在于，所述葫芦巴碱的提取方法是本领域常用的生物碱提取方法。
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