CN102727508A

CN102727508A - 人参二醇皂苷组分制备及在防治帕金森氏病中的药物用途

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Publication number: CN102727508A
Application number: CN2012102429281A
Authority: CN
Inventors: 连晓媛; 张治针; 陈金龙
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-07-15
Filing date: 2012-07-15
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-07-15
Also published as: CN102727508B

Abstract

本发明提供一种人参二醇皂苷组分在制备治疗帕金森病药物中的应用，主要成分为人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd。所述药物为人参二醇皂苷组分为活性成分单独或与其它药物一起，与药学上可接受的载体组成的药物。利用人参根茎药材、西洋参根茎药材、人参茎叶药材、西洋参茎叶药材以及它们的总提取物或总皂苷等原材料，通过大孔吸附树脂和十八烷基硅烷键合硅胶柱层析相结合的色谱分离纯化等方法制备。本发明可改善PD患者的运动功能，补充对脑内多种神经功能之间的平衡作用，对抗PD患者的黑质－纹状体多巴胺能神经元退化和左旋多巴类药物的神经毒性，可治疗PD患者的神经精神障碍并使左旋多巴类药物长期有效。人参二醇皂苷结构式为：

Description

人参二醇皂苷组分制备及在防治帕金森氏病中的药物用途

技术领域

本发明属医药领域，涉及人参二醇皂苷活性组分(后面简称人参二醇皂苷组分，Panaxadiol Saponins Fraction, PDSF)的制备和一种人参二醇皂苷组分(PDSF)在制备防治帕金森氏综合症药物中的应用。更具体地说，综合利用人参、西洋参药材及其茎叶和它们的提取物或总皂苷制备人参二醇皂苷组分的方法；和人参二醇皂苷组分单独或与其它物质包括已知治疗帕金森氏综合症药物特别是左旋多巴类药物一起制成的药物制剂在治疗和预防帕金森病以及对左旋多巴类药物的增效和减毒作用的应用。

背景技术

帕金森病是一种以运动功能障碍为特征的复杂疾病，需要综合系统治疗和科学防治。

帕金森病(Parkinson disease, PD，也可称为帕金森氏综合症)是一种黑质－纹状体多巴胺能神经元病变所致的慢性进行性中老年神经系统变性疾病。目前在神经系统疾病中，帕金森病为仅次于脑卒中、老年性痴呆，严重威胁老年人健康的第三大杀手。其临床症状突出表现为震颤、肌强直、运动迟缓和姿势障碍。此外，卫生部北京医院进行的一项调查显示，几乎所有患者均有非运动症状，平均每位患者有12项非运动症状。比如嗅觉减退、便秘、情绪低落、焦虑和烦躁不安、幻觉、睡眠障碍、认知损害、排尿困难、疼痛等，对生活质量的影响非常大，常使患者感到不快乐或痛苦。鉴于PD主要是黑质－纹状体多巴胺能神经元变性脱失、导致纹状体的运动抑制性神经递质多巴胺的显著减少，而运动兴奋性神经递质乙酰胆碱的功能相对亢进所致，所以治疗的思路主要是提高中枢神经系统中多巴胺的含量；纠正多巴胺能神经与胆碱能神经两大系统功能的不平衡；保护和恢复变性的多巴胺能及其它相关神经元。

然而，迄今为止尚无根治PD的方法，一旦患病则需终身治疗；各种治疗仍停留在对症阶段（未见对多巴胺神经的保护作用），而且主要是针对运动功能障碍，而非运动症状很少得到治疗。所以，PD的治疗目的主要是延缓疾病的进展，控制疾病的症状，提高病人的生存质量。目前治疗帕金森病的方法包括药物和外科手术2种方法，而基因治疗和干细胞治疗尚处于研究阶段。手术治疗有严格的指征而且价格昂贵，药物治疗仍然是目前最为成熟、使用最多的治疗手段。

多巴类药物是目前最常用、最有效的药物，但存在自身不可克服的缺陷。目前治疗PD的药物包括抗胆碱能药物、多巴类药物、多巴胺受体激动药、多巴增强药、多巴胺降解酶抑制剂等，其中多巴类药物如美多巴（左旋多巴和其降解抑制剂苄丝肼复方制剂）是目前最常用的药物。然而，多巴类药物具有两大自身无法克服的缺陷：一是在治疗过程中出现症状波动（motorfluctuation）和不正常、不自主的运动（abnormal involuntary movements）定义为左旋多巴引起的运动困难（dyskinesia）或称异动症；随着治疗时间的延长，发生率不断升高，5年治疗后有约50%的发生率，10 年治疗后可高达90%。此外，应用3 个月后还可出现不安、失眠、幻觉与精神症状、直立性低血压、心律失常等。其病理机制复杂，目前研究显示多种神经递质之间的生理平衡被打破，如兴奋性神经递质谷氨酸水平升高和抑制性神经递质γ-氨基丁酸水平降低。二是经过5年的治疗后，疗效逐渐降低，最后可完全无效，其原因是左旋多巴的神经毒性所致。其他药物也存在毒副作用。所以，目前临床应用抗PD药物提倡从小剂量起始，缓慢加量，以尽量避免药物的毒副反应和延长有效治疗期。1998 年中华医学会神经病学学会建议药物治疗的原则为：长期服药、控制症状；对症下药、辨证加减；最小剂量、最佳效果，也就是说细水长流，不求全效；权衡利弊、联合用药。

综上所述，PD是一种以黑质－纹状体多巴胺能神经元退化和丢失为本质、运动功能障碍为特征、伴有神经精神行为障碍的系统性、复杂疾病，需要科学防治和综合系统治疗。中药以多靶点、系统治疗、高度安全等为特色，特别是在维持内环境稳定包括脑内各种神经递质之间的平衡方面具有优势，而且作用角度和靶点不同于治疗PD的西药，显然在防治PD方面尤其是配合西药以提高或改良其疗效和降低其毒性方面具有独到之处。但中药在此方面的潜力尚远未得到挖掘。具体地说，到目前为止，在世界范围内尚未见有一种中药，本身具有一定的抗PD和神经保护作用，当与多巴胺类药物联合应用时可产生极大的治疗效果同时可降低多巴胺类药物的毒副作用。本发明涉及的人参二醇皂苷组分在制备治疗PD药物中的应用，正是要提供一种与其它治疗药物特别是多巴胺类药物联合应用，既可极大地增强现有治疗PD药物的疗效又可降低它们的毒副作用的药物，从而克服目前治疗PD药物疗效不足和安全性低的缺陷，特别是左旋多巴的多巴胺类药物的严重缺陷——克服症状波动和异动症和神经精神障碍等毒副作用、使多巴胺类药物长期甚至终生有效疗效。

人参二醇型皂苷和三醇型皂苷混合使用会相互干扰人参或西洋参的临床治疗效果。

人参和西洋参均为名贵中药，而二者的药性、功效和临床用途则显然不同，这种不同是由它们的主要有效成分不同而决定的。人参药性温热，为温补药，具有大补元气，固脱，回阳等功效；而西洋参药性属凉性，具有滋补肺阴、养阴生律、清虚热之功效，被认为补而不燥，所以更适用于失眠、烦躁、记忆力衰退及老年痴呆等症状。人参皂苷包括人参三醇和人参二醇型皂苷被认为是人参和西洋参对中枢神经系统作用的主要药理活性成分。人参较西洋参含有更多的人参三醇型皂苷，而西洋参则含有更多二醇型皂苷。有研究证明，人参可促进中枢兴奋性活活动而西洋参具有中枢镇静作用，这种药效差别主要是由它们所含人参皂苷的差异所决定。

可见，人参二醇皂苷和三醇皂苷与药性和药效密切相关，应该分别加以利用；否则二者混合在一起应用，当需要三醇类皂苷的中枢兴奋性药效时，二醇类皂苷的中枢镇静作用就会减弱或抵消三醇类皂苷的中枢兴奋性药效，反之也然。但是，长期以来人参和西洋参主要以根茎直接入药；而人参和西洋参的提取物的保健药物或产品主要是人参总皂苷包括二醇和三醇皂苷。这就很难实现人参或西洋参或它们的总皂苷产品有效治疗中枢兴奋性或抑制性疾病和症状的药用价值。

就帕金森氏病来说，谷氨酸兴奋性神经毒性和γ-氨基丁酸神经抑制性功能不足均参与了黑质－纹状体多巴胺能神经元病变和PD疾病本身或治疗药物引起的神经精神行为障碍。可见，充分发挥人参二醇皂苷的中枢抑制性药性和神经保护作用同时避免三醇皂苷对中枢的刺激性对防治PD具有重要意义。特别是，人参二醇皂苷对年轻、早期患者的可保持或恢复工作能力，对所有患者可长期保持或恢复生活自理能力，减轻晚期PD患者的痛苦和延长寿命。

发明内容

本发明的目的是提供一种人参二醇皂苷组分在制备防治帕金森病(Parkinson disease, PD)药物中的应用，所述PD包括各种运动症状和神经精神性为障碍；所述药物为人参二醇皂苷组分为活性成分单独或与其它药物如美多巴一起，与药学上可接受的载体组成的药物。

所述人参二醇皂苷组分的主要成分为人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd，这五种人参二醇皂苷的总含量占人参二醇皂苷组分的50～98%之间，优先≥90%，而Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc 和Rd 这五种单体化合物各自的含量分别占人参二醇皂苷组分的3～50%之间，优先在≥10～30%之间，但不包括这五种单体化合物的含量同时大于20%的情况。人参二醇皂苷结构式为：

人参皂苷Rb₁(ginsenoside Rb₁): R =

– D – glucopyranosyl

人参皂苷Rb₂(ginsenoside Rb₂): R =

– L – arabinopyranosyl

人参皂苷Rb₃(ginsenoside Rb₃): R =

– D – xylopyranosyl

人参皂苷Rc(ginsenoside Rc): R =

– L – arabinofuranosyl

人参皂苷Rd(ginsenoside Rd): R = H。

本发明提供的人参二醇皂苷组分与现有治疗PD药物合用，可增强现有药物改善PD患者的运动功能的效果，补充现有药物缺乏的对脑内多种神经功能之间的平衡作用，对抗PD患者的黑质－纹状体多巴胺能神经元退化和左旋多巴类药物的神经毒性，所以人参二醇皂苷组分还可治疗PD患者的神经精神障碍并使左旋多巴类药物长期有效。总之，人参二醇皂苷对年轻、早期患者可保持或恢复工作能力，对所有患者可长期保持或恢复生活自理能力和生活质量，减轻晚期PD患者的痛苦和延长寿命。

用人参二醇皂苷组分或联合其他药物或有效物质制成的药物制剂包括:口服制剂、针剂、缓释剂、控释剂、靶向制剂或泡腾剂，口服制剂包括口服片、含片、咀嚼片、丸剂、滴丸、胶囊、软胶囊、颗粒、口服液、糖浆、乳剂、合剂；针剂包括小针剂、大针剂、粉针剂、乳剂、混悬液。

本发明的另一个目的是提供所述人参二醇皂苷组分的制备方法，其特征是，根据人参根茎药材、西洋参根茎药材、人参茎叶药材、西洋参茎叶药材以及它们的总提取物或总皂苷等原材料中五种人参二醇皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd各自的含量情况，利用上述一种原材料单独为起此原料，或综合利用上述两种或两种以上不同原材料组成的混合物为起此原料，建立了包括大孔吸附树脂和十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析相结合的色谱分离纯化等技术方法来大量制备本发明所述的人参二醇皂苷活性组分，具体通过以下步骤实现：

（1）用于制备人参二醇皂苷组分的原材料中五种人参二醇皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd各自的含量分析：

以纯度大于99.0%的人参二醇皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd为标准品，用高效液相色谱(HPLC)分析方法测定用于制备人参二醇皂苷组分的原材料中人参二醇皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd的含量。所用的HPLC分析方法的条件如下: 色谱柱，Hypersil ODS柱 (250 ´ 4.6 mm, 5mm)，流速，1.5 ml/min；波长，检测波长 203 nm，参比波长313 nm；柱温：25°C；流动相，以乙腈和水分别作为流动相A和B，0-36分钟流动相为69-63% B，36-37分钟流动相为63% B，37-38分钟流动相为63-10% B，38-42分钟流动相为10% B，42-43分钟流动相为10-69% B，43-50分钟流动相为69% B。本发明对所建立的HPLC分析方法进行了线性关系、精密度和标准品稳定性等方法学考察，其结果表明：该方法方法灵敏度高，重复性好，检测化合物稳定。

用于制备人参二醇皂苷组分的原材料包括：人参根茎药材、西洋参根茎药材、人参茎叶药材、西洋参茎叶药材以及它们的总提取物或总皂苷。

（2）制备人参二醇皂苷组分的起此原料的确定：

根据HPLC分析方法所得到的原材料中五种人参二醇皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd的含量情况来选定用于制备人参二醇皂苷组分的起此原料。具体来说，就是根据上述步骤1的HPLC分析方法所获得的各原材料中五种人参二醇皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd的含量，选用上述单一原材料(药材或总提取物或总皂苷)为起此原料，来制备获得本发明所述的人参二醇皂苷活性组分。

或选用上述两种或两种以上原材料(药材或总提取物或总皂苷)以不同比例的混合物为起此原料，优选两种原材料的混合物为起此原料，来制备获得本发明所述的人参二醇皂苷活性组分。不同人参药材混合物的重量比为1 (克)：1～10 (克)，不同人参提取物或总皂苷混合物的重量比为1 (克)：1～5 (克)，不同人参药材和人参提取物或总皂苷混合物的重量比为10～20 (克)：1～5 (克)。

（3）人参总提取物的制备方法：

乙醇回流提取：取上述步骤(1)和(2)所确定的含人参药材的起此原料，用体积比10%～95%乙醇水溶液10～15倍量作溶剂，浸渍1小时后，加热回流提取2～3次，每次1～2小时，合并回流液，浓缩得到人参总提取物流浸膏(每ml不少于4.0克生药)，再经冷冻干燥后得人参总提取物；

或：

乙醇或水渗漉提取：取上述步骤1和2所确定的含人参药材的起此原料，用体积比10～95%乙醇水溶液或水10～15倍量作溶剂，浸渍1小时后进行渗漉直到渗漉液无色，合并渗漉液，浓缩得到人参总提取物流浸膏(每ml不少于4.0克生药)，再经冷冻干燥后得人参总提取物；

或：

乙醇或水浸渍提取：取上述步骤1和2所确定的含人参药材的起此原料，用体积比10～95%乙醇水溶液或水10～15倍量作溶剂，浸渍提取2～3次，每次10～12小时，合并浸渍液，浓缩得到人参总提取物流浸膏(每ml不少于4.0克生药)，再经冷冻干燥后得人参总提取物；

或：

水煎煮提取：取上述步骤1和2所确定的含人参药材的起此原料，用水10～15倍量作溶剂，加热煎煮提取2～3次，每次1～2小时，合并煎煮液，浓缩得到人参总提取物流浸膏(每ml不少于4.0克生药)，再经冷冻干燥后得人参总提取物；

浓缩和干燥：

人参总提取物的浓缩用实验室常规用的旋转蒸发仪器减压浓缩，干燥用实验室常规用的冷冻干燥仪进行冷冻干燥。

（4）人参总皂苷的制备：将上述步骤3所制备得到的人参总体提取物溶解于少量45%乙醇水溶液中，样品液经大孔吸附树脂柱层析分离，先后用45%和70%乙醇水溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压回收乙醇后经冷冻干燥得人参总皂苷，人参总提取物与大孔吸附树脂填料重量比为1(克)：8～15(克)。

（5）人参二醇皂苷组分的制备：将上述步骤4所制备的人参总皂苷或购买的商品人参总皂苷溶解于少量50%乙醇水溶液中，样品液经十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离，先用体积比50%乙醇水溶液洗脱，后用体积比75%乙醇水溶液洗脱；分组分收集75%乙醇洗脱液，每500～ 1000 ml洗脱液为一组分，用上述步骤1所述的HPLC方法定性检测各组分中人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的存在，将含有人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的各组份合并，合并液减压回收乙醇后经冷冻干燥得人参二醇皂苷组分，人参总皂苷与ODS填料重量比为1 (克)：25～30(克)。

（6）人参二醇皂苷组分的成分和质量分析:

本发明建立了高效液相色谱(HPLC)方法来定性和定量分析人参二醇皂苷组分中的各单一成分和他们的总含量。详细的HPLC方法及条件参见上述步骤1所述的HPLC方法和后述实施例一的HPLC方法。该方法灵敏度高，重复性好，可用于人参二醇皂苷组分、含人参二醇皂苷组分的药物制剂、人参和西洋参根茎药材、人参和西洋参茎叶药材和各种商品人参总皂苷中的五种人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的含量分析和他们的总皂苷含量测定。

（7）配制人参二醇皂苷组分：

本发明所述的人参二醇皂苷组分还可通过下述方法配置而成：具体来说，利用上述步骤（2）所述的不同起此原料分别制备得到人参二醇皂苷组分，根据它们的HPLC分析测定所获得的五种人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的各自含量比例和它们的总皂苷含量，选用两种或两种以上的人参二醇皂苷组分以不同比例(1克：1～5 克)混合配制得到本发明所述的人参二醇皂苷组分，特别是得到五种人参二醇皂苷的总含量≥90%，且这五种单体化合物各自的含量比例较接近的优化人参二醇皂苷活性组分。

本发明公开的分离纯化制备人参二醇皂苷组分的技术方法以及人参二醇皂苷组分在制备防治防治帕金森氏综合症药物中的应用，不仅克服了过去人参或西洋参直接入药以及它们的总提取物或总人参皂苷产品使用时，存在二醇类皂苷和三醇类皂苷的相反作用性质的药效相互干扰的缺陷，而且使人参和西洋参可发挥过去从未有过的临床用途—用于防治帕金森氏病。特别是，人参二醇皂苷组分与现有治疗帕金森氏病药物特别是左旋多巴类药物联合应用，可增强现有药物改善PD患者的运动功能的效果，补充现有药物缺乏的对脑内多种神经功能之间的平衡作用，对抗PD患者的黑质－纹状体多巴胺能神经元退化和左旋多巴类药物的神经毒性，所以人参二醇皂苷组分还可治疗PD患者的神经精神障碍并使左旋多巴类药物长期有效。

本发明根据来源不同的人参原药材(包括根茎和茎叶)和它们的总提取物或总皂苷等原材料中所含的人参二醇皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd的含量和比例有其不同的特点，综合而巧妙地选用一种原材料单独和两种或两种以上原材料的混合物为起此原料，建立了提取分离制备高纯度、具有稳定药效的人参二醇皂苷组分的方法。所述方法简单，提取和分离所用的溶媒为无毒无污染的乙醇，柱层析所用的两种色谱填料均可反复使用以节省成本，该方法可大量制备高纯度的人参二醇皂苷组分用于药物制剂的生产。而且，本发明还充分发挥和提高了人参和西洋参茎叶的药用和经济价值。

附图说明

图1-1是人参二醇皂苷对照品的HPLC图谱(1～5:人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd; Hypersil ODS柱, 250 ´ 4.6 mm, 5 mm)。

图1-2是人参二醇皂苷组分-A (PDSF-A) 的HPLC图谱(1～5:人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd; Hypersil ODS柱, 250 ´ 4.6 mm, 5 mm)。

图1-3是西洋参药材的HPLC图谱(1～5:人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd; Hypersil ODS柱, 250 ´ 4.6 mm, 5 mm)。

图2-1是商品人参根茎总皂苷(样品-C₁，A) )的HPLC图谱(1～5: 人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd; ODS-2 Hypersil柱, 250 ´ 4.6 mm, 5 mm)。

图2-2是商品西洋参茎叶总皂苷(样品-C₂，B) )的HPLC图谱(1～5: 人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd; ODS-2 Hypersil柱, 250 ´ 4.6 mm, 5 mm)。

图2-3是人参二醇皂苷组分-C(C)的HPLC图谱(1～5: 人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd; ODS-2 Hypersil柱, 250 ´ 4.6 mm, 5 mm)。

附图3是人参二醇皂苷组分及其联合美多巴对鱼藤酮诱导的帕金森氏病形成发展过程中体重丢失的对抗作用。Control：正常对照；Rotenone：鱼藤酮；L-DOPA+ R：美多巴（66 mg/kg, ig）+鱼藤酮；Rb + R：人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+ 鱼藤酮；L-DOPA + Rb + R：左旋多巴（66 mg/kg, ig）+ 人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+ 鱼藤酮。

附图4是人参二醇皂苷组分及其联合美多巴对鱼藤酮诱导的帕金森氏病形成发展过程中运动行为退化的对抗作用。Control：正常对照；Rotenone：鱼藤酮；L-DOPA+ R：美多巴（66 mg/kg, ig）+鱼藤酮；Rb + R：人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+ 鱼藤酮；L-DOPA + Rb + R：左旋多巴（66 mg/kg, ig）+人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+鱼藤酮。

附图5是人参二醇皂苷组分及其联合美多巴对鱼藤酮诱导的帕金森氏病形成发展过程中运动平衡能力退化的对抗作用。Control：正常对照；Rotenone：鱼藤酮；L-DOPA+ R：美多巴（66 mg/kg, ig）+鱼藤酮；Rb + R：人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+ 鱼藤酮；L-DOPA + Rb + R：左旋多巴（66 mg/kg, ig）+人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+鱼藤酮。

附图6是人参二醇皂苷组分及其联合美多巴对鱼藤酮诱导的帕金森氏病形成发展过程中抓力退化的对抗作用。Control：正常对照；Rotenone：鱼藤酮；L-DOPA+ R：美多巴（66 mg/kg, ig）+鱼藤酮；Rb + R：人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+ 鱼藤酮；L-DOPA + Rb + R：左旋多巴（66 mg/kg, ig）+ 人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+ 鱼藤酮。

附图7是人参二醇皂苷组分联合美多巴对鱼藤酮诱导的帕金森氏病动物黑质-纹状体神经退化的对抗作用。PD 模型：鱼藤酮诱导帕金森氏病模型；Rb：人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+ 鱼藤酮；L-DOPA：美多巴（66 mg/kg, ig）+鱼藤酮；Rb + L-DOPA：人参二醇皂苷组分（40mg/kg，ig）+美多巴（66 mg/kg, ig）+ 鱼藤酮。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。但是，本发明不限于这些实施例。

实施例一从人参根茎药材制备人参二醇皂苷组分 -A ( PDSF-A)

1 ．人参二醇皂苷组分 -A ( PDSF-A) 的分离与纯化：

将人参根茎药材(8000克，样品-A, 其中所含的五种人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的含量和它们的总含量见表5)粉碎成粗粉后用50%乙醇水溶液渗漉提取至提取液无色，合并渗漉液减压回收乙醇后并经冷冻干燥得浸膏(678.6克)。将浸膏溶解在3000毫升45%乙醇水溶液中，样品液用大孔吸附树脂(Diaion HP-20, 6000克)柱层析分离，先用45%乙醇水溶液洗脱至洗脱液无明显的皂苷反应，再用70%乙醇水溶液洗脱至洗脱液无明显的皂苷反应。将70%乙醇洗脱液减压回收乙醇后并经冷冻干燥得人参总皂苷(236.8克)。将人参总皂苷溶解在1000毫升50%乙醇水溶液中，样品液用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS，6000克)柱层析分离，先用50%乙醇水溶液洗脱至洗脱液无明显的皂苷反应，后用75%乙醇水溶液洗脱。分组分收集75%乙醇洗脱液，每组分500ml，用本发明建立的HPLC方法检测各组分中人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的存在，将含有人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的各组分合并，合并液减压回收乙醇后并经冷冻干燥得人参二醇皂苷组分-A (PDSF-A, 103.9克)。

．人参二醇皂苷组分的化学成分研究：

仪器：制备型液相色谱仪(SCL-10A，Shimadzu)，分析型液相色谱仪(HP 1100)。

色谱柱：Econosil ODS柱(250 ´ 22 mm,10 mm), ODS Hypersil柱(250 ´ 4.6 mm, 5 mm)，ODS-2 Hypersil柱(250 ´ 4.6 mm, 5 mm)。

试剂：乙腈和水，均为HPLC级。

方法：将人参二醇皂苷组分-A(1.0g)配成200mg/ml的甲醇溶液，经制备型高效液相色谱分离(色谱柱： Econosil ODS柱, 流动相：乙腈/水(40:60)，流速：5.0ml/min，检测波长：203nm)，分别收集保留时间为35、46、55和76分钟的色谱峰得收集液A-D。将收集液A、B和D分别减压回收溶剂并经冷冻干燥得单体化合物1 (248 mg)、2 (33 mg)和5 (146 mg)。收集液C经减压浓缩得含化合物3和4的混合物，该混合物再经分析型高效液相色谱仪分离(色谱柱：Hypersil ODS柱，流动相:乙腈/水(32:68)，流速:1.5 ml/min；检测波长:203nm)，得到化合物3 (98 mg,保留时间16.1分钟)和4 (346 mg,保留时间18.1分钟)。根据NMR光谱包括二维的COSY、HMQC和HMBC光谱以及高分辨的质谱分析，化合物1～5的结构分别鉴定为人参皂苷Rb₁(Rb₁)、人参皂苷Rc (Rc)、人参皂苷Rb₂ (Rb₂)、人参皂苷Rb₃(Rb₃)和人参皂苷Rd (Rd)，其NMR数据见表1～3。

为检查这五种化合物的纯度是否符合含量测定的要求, 参照中国药典的要求，采用高效液相色谱法对这五种化合物进行杂质检查和含量测定，其分析结果表明这五种人参二醇皂苷的含量均在99.0%以上，符合作为含量测定对照品的纯度要求。

．高效液相色谱 (HPLC) 分析方法的建立：

建立了用HPLC分析人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的方法，并对该方法进行了方法学考查，主要包括以下内容：

1）高效液相色谱条件。色谱柱: Hypersil柱 (ODS, 250 ´ 4.6 mm, 5mm)，流速:

1.5 ml/min；波长: 检测波长 203 nm，参比波长313 nm，柱温：25°C；流动相见表4。

2）线性关系考察。对人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd五种对照品的线性关系进行了考察, 其结果表明这五种化合物进样量在0.5～5.0mg范围内峰面积积分值(Y)与样品进样量(X，mg)呈良好的线性关系，其回归直线方程分别为：Y=179.20544X-0.532483 (R² = 1.00000，人参皂苷Rb₁), Y=181.88325X-1.27940 (R² = 0.99999，人参皂苷Rb₂)，Y= 181.73104X-0.401313 (R² =0.99999, 人参皂苷Rb₃)，Y=178.94861X-1.487782 (R² = 1.00000，人参皂苷Rc)，Y = 220.61248X-7.21899 (R² = 0.99990，人参皂苷Rd)。

3）精密度试验。将五种人参皂苷对照品混合液的三种不同浓度(50 mg/ml, 200mg/

ml, 400 mg/ml)分别重复进样6次(每次10 mg/ml)，在上述色谱条件下测得各化合物的峰面积，并计算其相对标准差(RSD%)。这五种化合物精密度试验的RSD%分别小于或等于0.80 (人参皂苷Rb₁), 0.66 (人参皂苷Rb₂), 0.55(人参皂苷Rb₃), 1.09 (人参皂苷Rc)和0.66 (人参皂苷Rd)。

4）稳定性试验。在五种人参皂苷对照品混合液的三种不同浓度(50 mg/ml, 200 mg/

ml, 400 mg/ml)配制后的连续三天内每天测定对照品混合液中各化合物的含量，分别重复进样5次(每次10mg/ml)，在上述色谱条件下测得各化合物的峰面积，并计算各化合物的含量。所测各化合物含量相对标准差(RSD%)和系统误差(SE%)分别小于或等于1.25和0.50 (人参皂苷Rb₁)，1.15和0.85 (人参皂苷Rb₂), 1.30和0.70 (人参皂苷Rb₃), 1.09和1.30 (人参皂苷Rc)，1.41和1.05(人参皂苷Rd)。

以上结果表明该方法灵敏度高，重复性好, 检测化合物稳定。

．人参二醇皂苷组分的成分分析 :

用上述建立的HPLC方法对从人参根茎药材(样品-A)中制备的人参二醇皂苷组分-A (PDSF-A)的成分进行分析，其结果(见图1-2和表5，人参二醇皂苷对照品见图1-1)表明：人参二醇皂苷组分-A含有五个人参二醇皂苷，即人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd，这五种皂苷的总含量为92.54%, 其中人参皂苷Rb₃含量最高，其次为Rb₁、Rd、Rb₂和Rc，而且人参二醇皂苷组分-A中的Rb₁/Rc/Rb₂/Rb₃/Rd的含量比率与人参根茎药材(样品-A)中的Rb₁/Rc/Rb₂/Rb₃/Rd的含量比率基本相同(表5)。

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实施例二从西洋参根茎药材中制备人参二醇皂苷组分 -B (PDSF-B)

用西洋参根茎药材(7000克，样品-B，其中所含的五种人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的含量和它们的总含量见表5，其HPLC图谱见图1-3)，采用实施例一相同的方法制备得到人参二醇皂苷组分-B (PDSF-B，101.3克)。HPLC分析表明：PDSF-B同样含有人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd五种人参二醇皂苷，这五种皂苷的总含量为91.60%, 其中人参皂苷Rb₁含量最高，其次是Rb₃、Rd、Rb₂和Rc；而且人参二醇皂苷组分-B中的Rb₁/Rc/Rb₂/Rb₃/Rd的含量比率与西洋参根茎药材(样品-B)中的Rb₁/Rc/Rb₂/Rb₃/Rd的含量比率基本相同(表5)。

实施例三 从购买的商品人参总皂苷中制备人参二醇皂苷组分 -C (PDSF-C)

购买的商品人参根茎总皂苷(样品-C₁，其总皂苷含量≥80%)和西洋参茎叶总皂苷(样品-C₂，其总皂苷含量≥80%)经HPLC分析表明，这两种人参总皂苷产品中所含的五种人参二醇皂苷各有其特点，即：样品-C₁均含人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd，但是 Rb₃的含量非常低(见附图2-1和表5)；样品-C₂主要含Rb₃和Rd，而Rb₁、Rc和Rb₂的含量非常低(见附图2-2和表5)。本实施综合利用这两种样品(样品-C₁和样品-C₂)的混合物作为起此原材料来制备获得本发明所述的人参二醇皂苷活性组分，特别是获得了五种人参二醇皂苷的总含量≥90%，且这五种单体化合物的含量较接近的优化人参二醇皂苷活性组分-C (PDSF-C)。其具体的方法如下：

将样品-C₁和样品-C₂各100克的混合物(1:1比例混合，共200克)溶解在1000毫升50%乙醇水溶液中，样品液用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS，6000克)柱层析分离，先用50%乙醇水溶液洗脱至洗脱液无明显的皂苷反应，后用75%乙醇水溶液洗脱。分组分收集75%乙醇洗脱液，每组分收集500ml, 用实施例一的HPLC方法定性检测各组分中人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的存在，将含有人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的各组分合并，合并液减压回收乙醇后经冷冻干燥得人参二醇皂苷组分-C (PDSF-C，71.9克)。HPLC分析表明：PDSF-C含有人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd五种人参二醇皂苷，这五种皂苷的总含量为93.56%, 其中人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的含量非常接近，而且人参二醇皂苷组分-C中的Rb₁/Rc/Rb₂/Rb₃/Rd的含量比率与样品-C₁加样品-C₂中的Rb₁/Rc/Rb₂/Rb₃/Rd的含量比率基本相同(附图2-3，表5)。

实施例四人参二醇皂苷组分及其联合美多巴对鱼藤酮诱导的大鼠帕金森氏病的对抗作用

用鱼藤酮诱导的大鼠帕金森氏病（PD）模型观测了人参二醇皂苷组分防治PD的作用以及对美多巴的增效减毒作用。

鱼藤酮溶液配制：称取Rotenone 300 mg，于2ml的DMSO溶解充分，用100ml葵花油(DMSO：葵花油，1:50)研磨充分，于4°C冰箱中密封保存备用，使用时按以下设定剂量和给药体积稀释。

鱼藤酮诱导PD模型：为了减少鱼藤酮对外周的影响采用低剂量；为了克服动物对低剂量鱼藤酮的适应性，循序增加鱼藤酮剂量。第1-5天，1mg/kg/d；第6-10天，1.25mg/kg/d；第11天至实验结束，1.5 mg/kg/d。以上一天剂量，平均分为早晚各一次，注射于动物颈背部皮下，每次注射体积为0.05 ml/100 g体重。在实验全过程监测动物体重、自主运动行为变化并对运动行为损伤进行分级评分。此外，用转棒测定运动协调能力，用抓力仪测定前双肢的抓力。以上指标均每2-3天测定一次。于最后一次测定后，深麻醉动物，心脏灌流多聚甲醛并取脑用于测定黑质－纹状体的多巴胺神经病变。大部分动物在15天后出现显著的PD运动功能的损伤症状包括自主运动行为退化、在转棒上的运动平衡能力和四肢的抓力降低（附图3-6），同时黑质－纹状体多巴胺能神经元明显病变和丢失（附图7）。

实验组别及给药：将在实验室适应环境5-6天、体重280-310g的雄性成年SD大鼠，随机均匀分为以下4组：鱼藤酮组即PD模型组、人参二醇皂苷组分组(后简称Rb，40 mg/kg，ig)、美多巴组(66 mg/kg，相当于人每公斤用量10倍，ig)组、Rb (40 mg/kg，ig)+美多巴 (66 mg/kg，ig)组，每组动物数为7。人参二醇皂苷组分和美多巴均在每次给鱼藤酮前一小时灌胃给药。设定各种指标的测定均在给药前进行。无论何组动物出现4级运动行为障碍，均终止其实验即心脏灌流多聚甲醛并取脑用于测定黑质－纹状体的多巴胺神经病变。为了平行对照，其它各组也灌流1只运动行为障碍级别最高的动物。待模型组的90%动物出现4级运动行为障碍时，终止各组所有动物的实验。分析比较各组动物的体重变化、运动功能障碍和黑质－纹状体的多巴胺神经病变。

结果发现，人参二醇皂苷可显著对抗鱼藤酮诱导的PD病变，也可显著增强美多巴作用并降低起毒副作用（附图3-7）。

在体重变化方面（附图3），鱼藤酮组与正常组比较，随着时间延长体重不断降低；人参二醇皂苷组分和人参二醇皂苷组分联合美多巴均能显著对抗鱼藤酮诱导的PD发展过程中动物体重降低，特别是联合组的体重始终保持在相对其他各处理组的最高和最稳定的水平；与鱼藤酮模型组一样，美多巴组动物的体重随着时间延长体重不断降低，而且在第10天开始其体重低于鱼藤酮模型组，第13天后与模型组保持并行。

在运动行为损伤级别方面（附图4），鱼藤酮组动物在给鱼藤酮的第9天开始出现自主运动行为退化，表现为运动行为损伤级别升高，随着造模时间延长特别是第15-18天，自主运动行为退化不断加重（*P‹0.05，**P‹0.01，**P‹0.001 与人参二醇皂苷组分组和人参二醇皂苷组分联合美多巴组比较）；有趣的是，美多巴组动物出现运动行退化的时间及进程与鱼藤酮模型组基本一致（#P‹0.05 与人参二醇皂苷组分联合美多巴组比较），只是在早期美多巴组有严重于模型组的趋势，而在后期有优于模型组的趋势；人参二醇皂苷组分和人参二醇皂苷组分联合美多巴均能显著对抗鱼藤酮诱导的PD发展过程中动物自主运动行为损伤，特别是联合组始终保持在相对其他各处理组的最低和最稳定的水平。

在运动平衡能力方面（附图5），鱼藤酮组动物在给鱼藤酮的第5天后开始出现运动平衡能力的减低，表现为在转棒上的停留时间缩短，随着造模时间延长运动平衡能力的降低不断加重（**P‹0.01与人参二醇皂苷组分组和人参二醇皂苷组分联合美多巴组比较）；有趣的是，美多巴组动物出现运动平衡能力降低的时间及进程与鱼藤酮模型组基本一致（#P‹0.05 与人参二醇皂苷组分联合美多巴组比较），只是在早期美多巴组有严重于模型组的趋势，而在后期有优于模型组的趋势；人参二醇皂苷组分和人参二醇皂苷组分联合美多巴均能显著对抗鱼藤酮诱导的PD发展过程中动物运动平衡能力降低，但此两组动物未见明显不同。

在四肢抓力变化方面（附图6），鱼藤酮组与正常组比较，随着时间延长四肢抓力不断降低，特别是第11-17天，而且在第17天其抓力显著低于个给药组包括美多巴组；人参二醇皂苷组分和人参二醇皂苷组分联合美多巴均能显著对抗鱼藤酮诱导的PD发展过程中四肢抓力的降低，但此两组动物未见明显不同；与前面测定3个指标不同，于第17天（此时模型组动物出现显著的PD症状），美多巴组动物的抓力也显著高于模型组动物，但显著低于人参二醇皂苷组分组和人参二醇皂苷组分联合美多巴组。

以上实验结果证明，人参二醇皂苷组分对鱼藤酮诱导的帕金森氏病具有显著的对抗作用，人参二醇皂苷组分与美多巴联合可获得更好的效果；美多巴的对鱼藤酮诱导的帕金森氏病的对抗作用不明显，并且在某些方面表现出明显的毒性。这就支持人参二醇皂苷组分单独或与其他治疗帕金森氏病药物或活性物质特别是多巴胺类药物联合防治帕金森氏病的医药用途。

在黑质-纹状体多巴胺神经退化方面（附图7），鱼藤酮诱导的PD模型动物在运动功能的损伤症状包括自主运动行为退化、在转棒上的运动平衡能力和四肢的抓力降低的同时，黑质－纹状体多巴胺能神经元明显病变和丢失（附图7）；人参二醇皂苷组分联合美多巴预防治疗动物在运动行为明显改善的同时，黑质－纹状体多巴胺能神经元明显多于PD模型动物。

Claims

1.一种人参二醇皂苷组分在制备防治帕金森氏病药物中的应用，所述的人参二醇皂苷组分主要包括人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd五种人参二醇皂苷，这五种人参二醇皂苷的总含量占人参二醇皂苷组分的50～98%，而Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc 和Rd 这五种单体化合物各自的含量分别占人参二醇皂苷组分的3～50%，但不包括这五种单体化合物的含量同时大于20%，人参二醇皂苷结构式为：

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2.权利要求1所述的人参二醇皂苷组分的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）根据HPLC分析方法测定人参根茎药材、西洋参根茎药材、人参茎叶药材、西洋参茎叶药材以及它们的总提取物或总皂苷等原材料中五种人参二醇皂苷Rb₁、Rb₂、Rb₃、Rc和Rd各自的含量情况，利用上述一种原材料单独为起此原料，或综合利用上述两种或两种以上不同原材料组成的混合物为起此原料，用于人参二醇皂苷活性组分的制备；

（2）起此原料总提取物的制备：起此原料粗粉以水或不同浓度的乙醇水溶液为溶媒，采用加热回流提取法、渗漉法、浸渍法或水煎煮法，并经减压浓缩提取液，最后经冷冻干燥得到人参总提取物；

（3）人参二醇皂苷组分的分离与纯化：用大孔吸附树脂和十八烷基硅烷键合硅胶柱层析相结合的色谱分离纯化技术来大量制备高纯度的人参二醇皂苷活性组分，具体步骤为：

① 将上述步骤（2）制备的人参总提取物或购买的人参总提取物或它们的混合物溶解于体积比45%乙醇水溶液中，样品液经大孔吸附树脂柱层析分离，先后用体积比45%和70%乙醇水溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压回收溶剂并经冷冻干燥得人参总皂苷，人参总提取物与大孔吸附树脂填料重量比为1：8～15；

② 将上述制备的人参总皂苷或购买的人参总皂苷或它们的混合物溶解于体积比50%乙醇水溶液中，样品液经十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离，先用50%乙醇水溶液，后用75%乙醇水溶液洗脱，分段收集75%乙醇洗脱液，用高效液相色谱检测各组分，将含有人参皂甙Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的各组分合并，合并液减压回收溶剂并经冷冻干燥得到人参二醇皂苷组分，人参总皂苷与ODS重量填比为1：25～30；

（4）人参二醇皂苷组分的配制: 利用上述步骤（1）-（3）所述的不同起此原料分别制备得到的人参二醇皂苷组分，根据它们的HPLC分析测定所获得的五种人参二醇皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd的各自含量比例和它们的总皂苷含量，选用两种或两种以上的人参二醇皂苷组分以1：1-5重量比混合配制得到所述的人参二醇皂苷活性组分，其中得到五种人参二醇皂苷的总含量≥90%，且这五种单体化合物各自的含量比例较接近的优化人参二醇皂苷活性组分；

（5）人参二醇皂苷组分的质量分析: 用HPLC方法对所分离得到的人参二醇皂苷组分中的人参皂苷Rb₁、Rc、Rb₂、Rb₃和Rd五种成分进行定性和定量分析。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物由人参二醇皂苷组分单独或与其他治疗帕金森氏病药物或与其它活性化合物，与制剂允许的赋形剂或载体制成，所述其他治疗帕金森氏病药物选用左旋多巴类药物，所述其它活性化合物选用中药活性物质、天然产物、人工合成化合物和体内活性物质。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式有液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为口服给药或注射给药或经口鼻喷雾给药。