JP2001064181A

JP2001064181A - 免疫賦活組成物

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Publication number: JP2001064181A
Application number: JP24158499A
Authority: JP
Inventors: Megumi Kumemura; 恵久米村; Tatsuya Doi; 達也土居; Takao Saito; 高雄斎藤; Tsuneyuki Noda; 恒行野田; Hiroshi Okamatsu; 洋岡松
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2001-03-13
Also published as: DE60035355D1; ATE365743T1; AU6726800A; WO2001016145A1; CA2382887C; US6656924B1; DE60035355T2; CN1371385A; ES2287025T3; KR20020068499A; EP1219630A4; AU773079B2; TW574035B; KR100751865B1; AU773079C; EP1219630A1; EP1219630B1; CA2382887A1

Abstract

(57)【要約】【課題】免疫賦活に有効な新しい組成物、殊に食品形態
の該組成物を提供。【解決手段】乳果オリゴ糖を有効成分とする免疫賦活組
成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫賦活組成物及
びインターフェロン−γの産生能亢進組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体が外界と接する境面である皮膚及び
粘膜、特に、腸管粘膜等の消化管粘膜は、ウイルス、細
菌、寄生虫、病原性抗原、食物抗原等の多くの物質と接
触しており、之等異物の体内への進入を防止して、生体
を守るための消化管免疫システムを有している。上記異
物の進入を防止する作用を有するものとしては、イムノ
グロブリンＡ（ＩｇＡ）が知られている。該ＩｇＡは、
細菌やウイルスの中和、組織への細菌の付着の抑制、食
物抗原によるアレルギーの抑制等に重要な役割を果たし
ている。該ＩｇＡの産生には腸管にあるリンパ組織であ
るパイエル板リンパ球の関与することも知られている。

【０００３】上記消化管粘膜における生体防御系の免疫
機能が低下すると、消化管への微生物の定着、増殖によ
る消化管感染等によって発熱、嘔吐、下痢、腹痛等の症
状が発症する。また、過労、ストレス等による食欲不振
症によっても、消化管免疫機能が低下し、細菌性の下痢
症等を惹起する傾向があることも知られている。

【０００４】特に、幼児、老人、体力が低下した人等
は、免疫力が弱くなっており、病原菌等の外部からの侵
入に対する抵抗力が低く、そのため、細菌やウイルスの
中和、組織への細菌の付着の抑制、食物抗原によるアレ
ルギーの抑制に重要な役割を果たしているＩｇＡ産生を
亢進し、その量を高値に保ち得る作用を有する物質の摂
取が望まれている。

【０００５】しかるに、上記のようなＩｇＡ産生亢進作
用を有し、消化管免疫機能の低下、細菌性消化管感染等
に対して有効な予防薬乃至治療薬は、現在なお知られて
おらず、実際の細菌性下痢症等に対しては、僅かに脱水
症に対する輸液注入や抗生物質投与が行なわれているの
みである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、上記消化管感染症等の予防及び治療に有効な新しい
消化管免疫賦活組成物、殊に飲料等の食品形態の該組成
物を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的よ
り、鋭意研究を重ねた結果、乳果オリゴ糖の摂取が、所
望の免疫賦活効果を奏し得るという新しい事実を見出
し、ここに本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明は、乳果オリゴ糖を有効成分
として含有することを特徴とする免疫賦活組成物、及び
乳果オリゴ糖を有効成分として含有することを特徴とす
るインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生能亢進組
成物に係わる。

【０００９】特に、本発明は、組成物１００ｇ中に、乳
果オリゴ糖を０．５〜７０ｇ含有する上記組成物；食品
形態である上記組成物；及び乳果オリゴ糖有効量が１〜
３０ｇ／日である上記組成物に係る。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明組成物においては、有効成
分として、乳果オリゴ糖（以下「ＬＳ」という）を用い
ることを必須とする。ここで、乳果オリゴ糖とは、下記
構造式で表わされる公知の物質であり、Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１←２）−β−Ｄ−フラクトフラノシドと
表示される。

【００１１】

【化１】

【００１２】かかるＬＳは、各種の方法により製造する
ことができ、本発明有効成分としての該ＬＳは、上記い
ずれの方法で得られるもの（反応混合物及びその精製
品）であってもよい。該方法としては、例えば、特公昭
５７−５８９０５号公報に記載されるようにアエロバク
ター属菌起源のレバンシュクラーゼをシュクロースとラ
クトースとの溶液に作用させる方法、特開昭６４−８５
０９０号公報に記載のように特定のスポロボロマイセス
属菌の菌体抽出物を用いる方法、特開平２−３５０９５
号公報に記載のようにローネラ属菌を用いる方法等を例
示することができる。上記ＬＳは、またビフィズス菌の
腸内増殖にとって必須の重要な栄養素（糖源）としても
知られている。

【００１３】本発明組成物における上記ＬＳの有効量
は、０．５〜７０ｇ／１００ｇ程度、好ましくは５〜３
０ｇ／１００ｇ程度の範囲から選ばれるのが好ましい。

【００１４】本発明免疫賦活組成物及びＩＦＮ−γの産
生亢進組成物は、これが服用乃至摂取され得る限り、特
にその形態には制限はなく、例えば、塊状、液状、シロ
ップ状、粉末状等とすることができ、之等の形態に応じ
て、種々の添加剤、例えば増量剤、甘味剤、他の糖質、
ビタミン類、香料、着色剤等を含有させることができ
る。具体的な組成物形態としては、例えば、液状又は粉
末の甘味料、清涼飲料や乳飲料等の飲料（ドリンク
剤）、パン類、クッキー、キャンディー等の菓子類、健
康食品等の種々の食品形態や、粉剤、散剤、液剤、懸濁
剤、錠剤、発泡剤等の医薬品形態等を例示することがで
きる。

【００１５】上記各種形態の本発明組成物は、之等形態
に応じて、有効成分とするＬＳ以外に、公知の各種の添
加剤を添加配合して調製される。

【００１６】例えば、本発明組成物が食品形態に調製さ
れる場合、該組成物は１日当たりの有効成分ＬＳの摂取
量（有効量）が、１〜３０ｇ程度であることを考慮し
て、該有効量が容易に摂取できるように、該有効成分を
適当な担体（賦形剤及び希釈剤）と共に配合して調製す
ることができる。その代表的例としての飲料は、一般
に、有効成分とするオリゴ糖を０．５〜７０ｇ／１００
ｍｌ、好ましくは５〜３０ｇ／１００ｍｌ含む水溶液形
態に調製することができる。該飲料は、また好ましくは
適当なｐＨ調節剤乃至緩衝剤等を用いて、ｐＨ４．０〜
６．５程度、好ましくは４．５〜６．０程度に調製する
ことができる。ここで、ｐＨ調整剤乃至緩衝剤として
は、代表的には、クエン酸、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、
炭酸等の弱酸及びそれらの塩類、例えばクエン酸ナトリ
ウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、乳酸ナ
トリウム、乳酸カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭
酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等を例示できる。之
等の配合割合は、得られる飲料が上記適当なｐＨ範囲を
保持する範囲から適宜決定され、通常２重量％まで、好
ましくは約０．０５〜０．３重量％程度とされ得る。

【００１７】また、上記飲料等の食品組成物中には、一
般的な飲料等と同様に、各種の糖質乃至甘味料等を添加
配合することができる。該糖質としては、グルコース、
フラクトース等の単糖類の他、本発明のオリゴ糖以外
の、例えばマルトース、シュークロース等の二糖類、デ
キストリン、シクロデキストリン等の多糖類、キシリト
ール、エリスリトール、ソルビトール等の糖アルコール
等を例示できる。甘味料としては、天然甘味料（ソーマ
チン、ステビア抽出物、グリチルリチン等）、合成甘味
料（サッカリン、アスパルテーム等）等を利用できる。
之等糖質等の配合割合は、通常得られる飲料の１５重量
％まで、好ましくは約１３重量％までとされるのが普通
である。

【００１８】更に、本発明組成物には、上記の他に、例
えばグレープフルーツ、リンゴ、オレンジ、レモン、パ
イナップル、バナナ、ナシ等の各種果汁（濃縮果汁）；
ビタミン類（パルミチン酸レチノール、ビスベンチアミ
ン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、シアノコバラミ
ン、アスコルビン酸ナトリウム、ニコチン酸アミド、パ
ントテン酸カルシウム、葉酸、ビオチン、コレカルシフ
ェロール、重酒石酸コリン、トコフェロール等の水溶性
及び脂溶性ビタミン類）；香味料；アミノ酸（グルタミ
ン酸ナトリウム、グリシン、アラニン、アスパラギン酸
ナトリウム等）；食物繊維（ポリデキストロース、ペク
チン、キサンタンガム、アラビアガム、アルギン酸
等）；呈味成分（グルタミン酸、イノシン酸等）；ミネ
ラル乃至微量元素（塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、
硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、
炭酸マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二カリウ
ム、リン酸一ナトリウム、グリセロリン酸カルシウム、
クエン酸第一鉄ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、沃
化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、亜鉛、マンガン、
銅、ヨウ素、コバルト等）等の各種添加剤の１種又は２
種以上を必要に応じて添加配合することができる。

【００１９】本発明組成物は、上記各成分を混合して調
製され、その調整方法は特に制限されるものではなく、
必要な成分を全て同時に混合してもよく、また油性成分
と水性成分との両者を用いる場合には、予め油性成分を
適当な油剤に溶解し、これと水溶性成分の水溶液とを乳
化剤を用いて乳化することもできる。該乳化操作は、一
般的方法に従って、例えばホモミキサー、高圧ホモジナ
イザー等を用いて、完全通過方式又は循環方式に従い実
施することができる。尚、上記各成分の混合乃至乳化
は、通常常温下に実施されるが、若干の加温操作を採用
することもできる。かくして調製される本発明組成物
は、これを適当な容器に充填後、常法に従い、加熱滅
菌、無菌濾過等により滅菌して、製品とされる。

【００２０】本発明組成物は、また、錠剤、顆粒剤、散
剤、カプセル剤等の水中に溶解分散させ得る適当な形態
の発泡製剤に調製することもできる。該発泡製剤は、発
泡成分としての炭酸水素ナトリウム及び（又は）炭酸ナ
トリウムと中和剤とを用いて調製される。ここで中和剤
としては、例えばクエン酸、酒石酸、フマル酸、アスコ
ルビン酸、乳酸、リンゴ酸等を例示できる。上記発泡成
分及び中和剤の配合割合は、通常発泡成分８〜６０重量
％、中和剤１０〜７０重量％の範囲から選択されるのが
好ましい。かかる発泡製剤は、必要に応じて更に炭酸カ
リウムの所定量を用いて、一般的方法、例えば直接粉末
圧縮法又は乾式もしくは湿式顆粒圧縮法に従って調製す
ることができる。

【００２１】本発明組成物の摂取乃至服用量は、使用目
的により又はこれを適用すべき人の年齢、性別、体重、
疾患の程度等に応じて適宜決定され、特に限定されるも
のではない。本発明組成物が固剤の場合には、一般に
は、１回当たり約１〜３０ｇの本発明製剤を服用、より
好ましくは該固剤を水３０〜２００ｍｌに溶解して服用
させるのがよく、また本発組成物が飲料等の液剤形態の
場合には、これを１回当たり約３０〜２００ｍｌ服用さ
せるのが好ましい。本発明組成物の１日当たりの摂取乃
至服用量は、これに含有される有効成分量換算で、約１
〜５０ｇ、好ましくは約３〜２０ｇの有効成分が摂取、
服用される量とするのが好適である。

【００２２】かくして、本発明組成物は、その服用乃至
摂取によって、免疫賦活及びＩＦＮ−γ産生能亢進作用
を発揮し得、消化管における生体防御機構（免疫機能）
を高めて、消化管感染等に対して顕著な予防及び治療効
果を奏し得る。

【００２３】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、本
発明組成物の調製例を実施例として挙げ、次いで本発明
有効成分につき行なった試験例を挙げる。尚、各例中、
部及び％はいずれも重量基準である。

【００２４】

【実施例１〜６】下記表１に記載の組成となるように各
原料化合物を水中に混合、溶解させて本発明組成物を調
製した。各実施例の組成物には、更に適宜、香料及び／
又はビタミン類が配合される。各配合は、水により全量
を１０００ｍｌとした。

【００２５】

【表１】

【００２６】

【実施例７】下記成分（全量５ｇ）を混合して直接打錠
により調製（錠剤）するか、各成分を秤量混合し分包
（散剤）するか、又は各成分を秤量混合し、造粒乾燥
後、分包（顆粒剤）して、それぞれ製剤形態の本発明組
成物を調製した。

【００２７】ＬＳ５５Ｐ３４％Ｌ−アスコルビン酸２１％Ｌ−酒石酸２０％甘味料適量炭酸水素ナトリウム２１％塩化ナトリウム適量炭酸カリウム０．５％香料・着色料微量合計１００％尚、上記「ＬＳ５５Ｐ」は、ＬＳを５５％含有する粉末
である。

【００２８】

【実施例８〜１０】実施例７と同様にして、下記各成分
を含む錠剤、散剤及び顆粒剤形態の本発明組成物を調製
した。〈実施例８処方〉ＬＳ５５Ｐ４０％Ｌ−アスコルビン酸１０％Ｌ−酒石酸２３％甘味料適量炭酸水素ナトリウム２２％クエン酸ナトリウム適量炭酸カリウム０．４％香料・着色料微量合計１００％（全量５ｇ）〈実施例９処方〉ＬＳ５５Ｐ４０％Ｌ−アスコルビン酸１１％Ｌ−酒石酸２３％甘味料適量炭酸水素ナトリウム２２％クエン酸アンモニウム０．８％シアノコバラミン微量クエン酸ナトリウム微量炭酸カリウム０．４％香料・着色料微量合計１００％（全量４．６
ｇ）〈実施例１０処方〉ＬＳ５５Ｐ４０％Ｌ−酒石酸２９％甘味料適量炭酸水素ナトリウム２４％クエン酸鉄アンモニウム３．６％シアノコバラミン微量炭酸カリウム０．５％香料・着色料微量合計１００％（全量４ｇ）

【００２９】

【実施例１１〜１８】実施例７〜１０と同様にして、下
記表２に示す組成の発泡製剤形態の本発明組成物を調製
した。

【００３０】

【表２】

【００３１】

【実施例１９〜２５】下記表３に示す各成分（ｍｇ）を
混合し、直接圧縮法により、チュアブル錠形態の本発明
組成物を調製した。

【００３２】

【表３】

【００３３】

【実施例２６〜３４】下記表４に示す各成分を混合し、
水を加えて全量を１００ｍｌとして、健康飲料形態の本
発明組成物を調製した。

【００３４】

【表４】

【００３５】

【実施例３５〜４５】下記表５に示す各成分を混合し、
水を加えて全量を１００ｍｌとして、飲料形態の本発明
組成物を調製した。

【００３６】尚、表中のガスボリューム値は、溶液と同
体積の二酸化炭素の気体を溶解させた場合を１として算
出された含有二酸化炭素量を示す指標であり数値が大き
いほど含有二酸化炭素量が多いことを示す。

【００３７】

【表５】

【００３８】

【試験例１】この試験は、プラセボ飲料を対照とした二
重盲検群間比較法により飲料形態の本発明組成物の摂取
が腸内細菌叢や免疫能に及ぼす影響を検討したものであ
り、以下の通り行なわれた。 1.被験者：成人男性２８名 2.試験デザイン：プラセボ飲料を対照とした二重盲検群
間比較法 4.被験物：本発明飲料：乳果オリゴ糖（ＬＳ）５ｇを５０ｍｌの水
に溶解して調製した溶液（１本）。プラセボ飲料：本発明飲料においてＬＳに代えて蔗糖を
用いて同様にして調製したもの。 5.用法・用量：１日１本（全５０ｍｌ）を就寝前に飲
用。飲用期間は６週間。 6.測定項目：腸内細菌叢及び糞便中ＩｇＡ濃度 7.糞便採取方法：被験物飲用前と飲用６週目に、新鮮糞
便を採取した。糞便は採取日の起床時以降に排泄された
ものを密閉できるビニ−ル袋に採取し、ビニ−ル袋内に
極力空気が残らないように注意して袋を密閉した後、プ
ラスチック製糞便採取容器に入れて氷冷保存した。採取
した糞便は重量を測定し、よく混和した後に腸内細菌叢
及びＩｇＡ量の測定を行なった。尚、ＩｇＡ量の測定に
は糞便の一部を−８０℃で保存して用いた。 8.腸内細菌叢測定法：糞便細菌叢の検索は、光岡らの方
法（光岡知足、腸内常在菌叢、臨床検査、23(4): 320-3
34 (1979)）に準拠し、分離用培地として３種の非選択
培地（BL寒天、EG寒天、Tryptycase soy blood寒天）及
び１１種の選択培地（BS寒天、NBGT寒天、ES寒天、変法
VS寒天、Neomycin Nagler寒天、変法LBS寒天、DHL寒
天、TATAC寒天、PEES寒天、Potato dextrose寒天、GE寒
天）を用いた。之等各培地組成については腸内常在細菌
叢、光岡知足、臨床検査、２３（４）：３２０−３３４
（１９７９）が参照される。

【００３９】約１．０ｇの新鮮糞便を正確に秤量し、嫌
気性希釈液（上記文献記載の方法により調製）９ｍｌに
懸濁した後、炭酸ガス雰囲気下にて同希釈液にて順次１
０倍ずつ希釈して、１０¹〜１０⁸倍希釈液を調製した。
ＢＬ寒天及びＥＧ寒天培地には、１０⁶、１０⁷及び１０
⁸倍希釈液を、Tryptycase soy blood寒天培地には１
０⁵、１０⁶及び１０⁷倍希釈液を、他の選択培地には１
０¹、１０³、１０⁵及び１０⁷倍希釈液をそれぞれ０．０
５ｍｌずつ塗抹した。

【００４０】接種後、BL寒天、EG寒天、BS寒天、NBGT寒
天、ES寒天、変法VS寒天、NeomycinNagler寒天及び変法
LBS寒天は、嫌気ジャーに入れ、炭酸ガス置換後、スチ
ールウール法にて３７℃で４８時間嫌気培養を行なっ
た。Tryptycase soy blood寒天及びDHL寒天は、３７℃
で２４時間培養し、TATAC寒天、PEES寒天、Potato dext
rose寒天及びGE寒天は、同様に４８時間培養した。

【００４１】培養後、各培地上のコロニ−数を計測し、
コロニ−性状、グラム染色性、芽胞の有無、好気発育性
及び顕微鏡による形態学的観察による菌群レベルの同定
を行なった。結果は、糞便１ｇ当たりの菌数の対数値
（log10CFU/g wet feces）で表わした。 9.糞便中ＩｇＡ濃度測定法： (1)糞便中ＩｇＡ測定用サンプルの調整 −８０℃で保存した糞便サンプルを凍結乾燥し、乾燥糞
便０．２ｇに対して０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
２．０ｍｌを加えて十分に撹拌後、１５００ｒｐｍで１
０分間遠心し、上清をｐＨ７．５に調整してＩｇＡ測定
用サンプルとした。 (2)糞便中ＩｇＡ測定用サンプル中のＩｇＡ濃度の測定露木ら（露木重雄、山崎省二、上村裕、木村昌伸、川島
拓司、上田雄幹、マウス胆汁および小腸内容物中のＩｇ
Ａ抗体および総ＩｇＡの酵素抗体法(ELISA)による測
定、ビフィズス、2: 9-13 (1988)）の方法に従って、Ｅ
ＬＩＳＡ法によりＩｇＡ濃度を測定した。ＩｇＡ抗体測
定には抗原として非標識マウス由来抗ヒトＩｇＡ(２５
μｇ／ｍｌ,２００μｌ)を各ウェルに入れ４℃で一夜静
置した。対照ウェルには緩衝液を同量入れた。

【００４２】翌日、溶液を吸引した各ウェルにスペーサ
ーとして１％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍ炭酸緩衝液，２００
μｌ）を加え、３７℃で６０分間反応させた。ついで糞
便中ＩｇＡ測定用サンプル（４０μｌ）を抗原処理及び
対照ウェルに入れ、３７℃で４５分間反応させた。反応
後ペルオキシダーゼ標識マウス由来抗ヒトＩｇＡ(１０
００倍希釈，４０μｌ）を加え、３７℃，４５分間反応
させた。ついでSIGMAFAST ODP（SIGMA社、２００μｌ）
を加えて１５分間発色させた後、３ＭＨＣｌ(５０ｍ
ｌ)で反応を停止し、吸光度（４９０ｎｍ）を測定し
た。

【００４３】サンプルのＩｇＡ濃度は、ｓｌｇＡ標品(p
urified human secretory IgA 5mg; Capple社)で検量線
を作成し、その検量線から算出したサンプル中のＩｇＡ
濃度を乾燥糞便１ｇ当たりの濃度に換算して表わした。 10.統計解析：被験物飲用前と飲用６週目の値につい
て、各群の平均値と標準偏差を算出した。群間の比較
は、繰返しを加味した分散分析を行ない、危険率５％以
下を有意とした。

【００４４】上記試験の結果を下記表６に示す。

【００４５】

【表６】

【００４６】表６より、次のことが判る。 1. 本発明飲料摂取群では、本発明飲料摂取によりビフ
ィドバクテリウム(Bifidobacterium)の菌数が増加した
（9.5±0.7→10.1±0.7 log10 CFU/g wet feces、Paire
d t-test；P=0.013）が、プラセボ飲料摂取群では変化
を認めず（9.8±0.6→9.8±0.6 log10 CFU/g wet fece
s）、ビフィドバクテリウムの菌数の変化に群間で有意
差を認めた。 2. 本発明飲料摂取群では、その摂取によりビフィドバ
クテリウムの占有率も増加した（19.6±15.2→32.1±1
5.2％、Paired t-test；P=0.001）が、プラセボ飲料摂
取群では低下する傾向（23.5±12.6→18.8±9.2 ％、Pa
ired t-test；P=0.110）であり、ビフィドバクテリウム
の占有率の変化にも群間で有意差を認めた。 3. 本発明飲料摂取群では、糞便中ＩｇＡ濃度が有意に
上昇した（3.9±3.2→6.9±5.4 mg/g dry wt、Paired t
-test；P=0.014）が、プラセボ飲料摂取群では変化せず
（5.6±7.0→4.4±3.1 mg/g dry wt）、糞便中ＩｇＡ濃
度の変化に群間で有意差を認めた。

【００４７】以上のことから、試験した本発明飲料は、
その摂取によって、糞便中のＩｇＡ濃度を有意に上昇さ
せ、このことから、消化管におけるＩｇＡ産生能を亢進
することが明らかとなった。

【００４８】本発明者らはまた、上記と同様にＬＳの摂
取がモルモットの盲腸内ＩｇＡ濃度を有意に上昇させる
ことを確認している。

【００４９】

【試験例２】この試験は、健常者が本発明組成物を摂取
した際に、本発明組成物（有効成分とするＬＳ）がその
免疫指標に及ぼす影響を検討したものであり、以下の通
り実施された。 1.被験者：過去１か月以内に抗生物質を服用していない
健常成人20名を対象とした。 2.被験物及び摂取条件被験物は、本発明飲料（ＬＳ５ｇを水５０mlに溶解した
溶液）を１日２回（午前１０時と午後３時）、４週間摂
取させた。 3.試験方法被験者に被験物を摂取させ、摂取開始日（０週）及び摂
取４週後（４週後）に各々採血を行なった。尚、採血及
び採便の前日は、午後９時より絶食とした。試験期間中
の食事は、暴飲暴食及び発酵食品の摂取を避けることと
した。また、試験期間中は、薬の服用を控えさせた。 4.評価項目及び評価法 (1)血清トランスフェリン：ネフェロメトリー法によ
る。 (2)顆粒球画分の貪食能：螢光ビーズ（２μｍ蛍光標識
ビーズ、Polyscience #18604, Lot No. 425844）２０μ
ｌをグルコースメディウム（下記溶液Ａ、溶液Ｂ及び滅
菌水を１：１：８容量比で混合したもの）１ｍｌに添加
し、１１０００ｒｐｍで３０分間、遠心して洗浄した。Ｂ溶液：０．０７Ｍグルコース得られた沈殿を、同グルコースメディウム１ｍｌに懸濁
し、超音波処理をすることにより均一なビーズ液を得
た。被験者からヘパリン採血した末梢血１００μｌに上
記蛍光ビーズ１００μｌを添加し、各々０，５，１０及
び３０分間、３７℃で振盪しながらインキュベートし
た。反応終了後、溶血剤×1 Facs Lysing buffer（Bect
on Dickinson社, Cat. No. 349202）を２ｍｌ加え、赤
血球を完全に溶血させた後、測定まで氷冷した。サンプ
ルはフローサイトメーター（COULTEREPICS XL-MCL Syst
em II）にて測定した。その際、顆粒球画分にゲートを
あて、蛍光を発している貪食細胞をピークとしてとらえ
るように設定し、その貪食率を解析した。 (3)好酸球数：鏡検法によった。 5.統計処理データは全て、平均値±S.D.で示し、乱塊法による割付
後、Dunnettの多重比較による検定を行ない有意差を判
定した。有意水準は、危険率５％以下とした。 6.結果 (1)血清トランスフェリン：得られた結果を表７に示
す。

【００５０】

【表７】

【００５１】表７より、血清トランスフェリン濃度は、
摂取４週後において、０週に比べて危険率５％以下で有
意に高値を示した。 (2)顆粒球画分の貪食率：結果は図１（縦軸：顆粒球画
分の貪食率（％）、横軸：試験期間（週））に示される
通りであり、顆粒球画分の貪食率の平均値±S.D.（３０
分間反応値）は、摂取０週及び摂取４週後で、それぞれ
50.8±10.8％及び63.6±14.1％であり、摂取４週後にお
いて、０週に比べて危険率１％以下で有意に高値を示し
た。 (3)血中好酸球数結果を表８に示す。尚、表８には同時に行なった血液一
般検査（白血球数、好中球数、好塩基球数、リンパ球数
及び単球数）の結果を併記する。

【００５２】

【表８】

【００５３】該表より、血中好酸球数は、摂取４週後に
おいて、０週に比べて危険率５％以下で有意に低値を示
した。 7.考察以上のことから、本発明組成物の摂取によれば、感染防
御の要である顆粒球の貪食能及び血清トランスフェリン
が増加し、このことより、本発明組成物が、宿主の感染
防御能を高める作用を奏することが判った。また、本発
明組成物の摂取によれば、血中の好酸球数が低下し、こ
のことから、本発明組成物はアレルギー反応を抑える可
能性を有することが示唆された。

【００５４】

【試験例３】この例は、遺伝的糖尿病発症モデル動物を
用いて本発明組成物の給餌が腸管免疫に及ぼす影響を検
討したものであり、以下の通り実施された。 1.実験動物４週令のLETOラット及びOLETFラット（各10匹）をもち
いた。尚、OLETFラット受精卵は、１９９４年８月２４
日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（A
merican Type Culture Collection）に、ＡＴＣＣＮ
ｏ．７２０１６として寄託されている。LETOラットは、
大塚製薬工場徳島実験動物管理室にて、分譲可能な状
態で保存されている。 2.飼育条件動物搬入後、１週間の検疫を行なった。検疫期間中は、
ＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母社製）の自由摂取条件
下、飲水は水道水を自由摂取とした。飼育はステンレス
製金網ケージを使用し、1ケージ当り１匹の飼育条件で
行なった。明暗サイクルは、明期を７：００−１９：０
０とした。

【００５５】試験期間中はＡＩＮ７６組成（American I
nstitute of Nutrition (1977) Report of the America
n Institute Nutrition ad hoc committee on standard
s for nutrition studies., J. Nutr., 107: 1340-134
8）に準拠して、低繊維(３％)、高脂肪(５％コーン油＋
１０％牛脂)飼料を調製して対照飼料とし、該対照飼料
中のしょ糖／コーンスターチ混合物の一部をＬＳに置き
換えて飼料当たりＬＳ５％が含まれるように調製したも
のを本発明飼料（ＬＳ含有飼料）とした。各飼料の組成
は、下記表９に示される通りである。

【００５６】

【表９】

【００５７】3.試験群試験群（供試動物、飼料、動物数）は、以下の通りとし
た。

【００５８】群動物飼料動物数(匹) １群 LETOラット対照飼料１０２群 LETOラット本発明飼料１０３群 OLETFラット対照飼料１０４群 OLETFラット本発明飼料１０ 4.試験スケジュール検疫終了後より対照飼料にて２週間飼育した。飼育後に
各群の平均体重が同じになるようにLETOラット及びOLET
Fラットをそれぞれ上記各群に分けた。群分けの後に試
験飼料に切り替え、飼育を開始し(７週令）、２２週間
試験飼料にて飼育した。 5.解剖２２週間の飼育終了後(２９週令時)にラットをエーテル
麻酔下に開腹し、腹部下大静脈より採血後、脱血し屠殺
した。下大静脈血は３０００回転で１５分間遠心分離
後、血清を分取し−８０℃で保存した。屠殺後、小腸
(各群３匹づつ)は、リンパ球調製のために使用した。 6.リンパ球の調製小腸パイエル板リンパ球の調製は、ディスパーゼ（バチ
ルス由来のプロテアーゼ、ベーリンガーマンハイム社製
「Dispase II」使用）を用いた酵素法にて行なった。パ
イエル板細胞の分離は、フラガキらの方法（Fragaski,
et al., Journal of Immunological Methods, 48, 33-4
4 (1989)）に従った。屠殺後、無菌的に十二指腸上部か
ら回腸末部までを摘出した。滅菌生理食塩水でよく洗浄
した後、シリンジにて滅菌生理食塩水を腸管内部に送り
込み内容物を除いた。氷上に敷いた滅菌ガーゼ上で、パ
イエル板を切り出した。切り出したパイエル板は不完全
ＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０を含む１０μ
ｇ／ｍｌゲンタマイシン）中に置いた。全て取り出し終
わったパイエル板は、ディスパーゼ１．５ｍｇ／ｍｌを
含む培地（Joklik-modified MEM）液（酵素液）中でス
ターラーにて攪拌しながら、３７℃で４０分間酵素処理
を行なった。分離し始めた細胞は回収し、新たに同酵素
液を加えた。この操作を３〜４回繰り返した。完全に分
離した細胞を３５０ｇ×１０分間、４℃下に遠心分離
し、ＰＢＳにて洗浄後、所定の培地に懸濁して細胞数を
血球計算板にて測定した。

【００５９】各群３匹ずつのパイエル板をプールしてリ
ンパ球の調製を行なった。 7.リンパ球の培養リンパ球はＲＰＭＩ１６４０(２ｍＭＬ−グルタミン、
５０μＭメルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシ
リン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％
ＦＣＳを含有する)にて、細胞数を１×１０⁶細胞／ｍｌ
に調整した。１ｍｌ／ウエルのリンパ球懸濁液は細胞培
養用の２４ウエルプレート(FALCON 3047)中でマイトー
ゲンとしてＣｏｎＡ（Concanavalin A; Canavalia ensi
formis(タチナタマメ)由来、シグマ社製）５．０μｇ／
ｍｌの刺激下で培養を行なった。

【００６０】抗体産生能試験は、３７℃、５％ＣＯ₂下
で７日間、サイトカイン産生能試験は同条件下で３日間
培養した。脾臓のリンパ球培養の場合、１サンプルにつ
き１ウエルで、パイエル板リンパ球の培養の場合、１サ
ンプルにつき３ウエルで、それぞれ培養を行なった。

【００６１】培養終了後プレートを１６００ｒｐｍ、１
０分遠心して上清を回収した。回収した上清は各項目の
測定まで−２０℃で凍結保存した。 8.サイトカインの測定リンパ球培養上清中のＩＦＮ-γは、市販の測定キット
を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定した。 9.統計処理結果は平均値±標準偏差で示した。サイトカイン濃度は
各群間について１元配置分散分析を行なった後、Fishe
r's Protected LSDの多重比較を行なった。パイエル板
細胞の場合は各群でプールしたサンプルを用いたため統
計処理は行なわなかった。危険率５％未満を有意とし
た。 10.結果図２にパイエル板リンパ球の培養におけるＩＦＮ-γの
産生能を求めた結果を示す。

【００６２】この結果より、本発明組成物飼料摂取群
（２群及び４群）では、対照飼料摂取群（１群及び３
群）に比して、ＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラットの
いずれにおいても、ＩＦＮ−γ濃度が高値を示すことが
明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例２に従い求められた顆粒球画分の貪食率
（％）を示すグラフである。

【図２】試験例３に従い求められた供試ラットのパイエ
ル板リンパ球のＩＦＮ−γ産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示す
グラフである。

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】乳果オリゴ糖を有効成分として含有するこ
とを特徴とする免疫賦活組成物。
【請求項２】乳果オリゴ糖を有効成分として含有するこ
とを特徴とするインターフェロン−γの産生能亢進組成
物。
【請求項３】組成物１００ｇ中に、乳果オリゴ糖を０．
５〜７０ｇ含有する請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】食品形態である請求項１又は２に記載の組
成物。
【請求項５】乳果オリゴ糖有効量が１〜３０ｇ／日であ
る請求項１又は２に記載の組成物。