WO2001016145A1 - Compositions immunostimulantes - Google Patents

Description

明 細 書

免疫賦活組成物

技 術 分 野

本発明は、 免疫賦活組成物及びイ ン タ ー フ ェ ロ ン — γ の産生能亢進組成物に関する。

背 景 技 術

生体が外界と接する境面である皮膚及び粘膜、 特に、 腸管粘膜な どの消化管粘膜は、 ウ ィ ルス 、 細菌、 寄生虫、 病原性抗原、 食物抗原な どの多く の異物と接触する。 こ のため、 これらの皮膚及び粘膜は、 上記異物の体内への 進入を防止 して、 生体を守るための免疫シス テ ムを有 し ている。 上記異物の進入を防止する作用を有する免疫物 質と しては、 ィ ム ノ グロ ブ リ ン A ( I g A ) が知 られて レヽる。 該 I g Aは、 細菌、 ゥイ ノレス な どの中和、 組織へ の細菌の付着の抑制、 食物抗原によ るア レルギーの抑制 な どに重要な役割を果た している。 該 I g Aの産生には、 腸管に存在する リ ンパ組織であるパイ エル板 リ ンパ球が 関与する。

消化管粘膜における生体防御系の免疫機能が低下する と 、 消化管に微生物が定着 し、 増殖 して消化管感染症、 細菌性下痢症な どを引起こ し、 発熱、 嘔吐、 下痢、 腹痛 などの症状が発症する。 上記免疫機能低下は、 過労、 ス ト レス な どによ る食欲不振症によ って も惹起される。

特に、 幼児、 老人、 体力が低下 した人達は、 免疫力が 弱 く なつてお り 、 病原菌な どの外部からの侵入に対する 抵抗力が低い。 そのため、 これらの人達及び上記消化管 感染症患者な どには、 特に I g A産生を亢進 し、 その量 を高値に保ち得る作用を有する物質の投与、 殊に飲料な どの食品形態での上記物質の投与が望まれている。

しかるに、 上記のよ う な I g A産生亢進作用を有 し、 消化管免疫機能の低下、 細菌性消化管感染な どに対 して 有効な予防薬乃至治療薬は、 現在なお知 られていない。 細菌性下痢症に対 しては、 僅かに脱水症に対する輸液注 入や抗生物質投与が行なわれているのみである。

発 明 の 開 示

従っ て、 本発明の 目 的は、 上記消化管感染症な どの予 防及び Z又は治療に有効な新しい消化管免疫賦活組成物 , 殊に飲料な どの食品形態の該組成物を提供する こ と にあ る。

本発明者は、 上記目 的を達成するために、 鋭意研究を 重ねた結果、 乳果オ リ ゴ糖が、 ヒ 卜 に対 して所望の免疫 賦活効果を発揮する こ と 、 その投与によ り 、 消化管感染 症な どの治療及び予防が可能と なる こ と と い う 新 しい事 実を見出 し、 こ こ に本発明を完成するに至った。 即ち、 本発明は、 乳果オ リ ゴ糖を担体と 共に含有する 免疫賦活組成物を提供する。

また、 本発明者は上記組成物の投与によれば、 イ ンタ 一フ ュ ロ ン一 γ ( I F Ν - γ ) の産生能が亢進される と い う 新しい事実を も発見 した。

従って、 本発明は、 乳果オ リ ゴ糖を担体と 共に含有す る I F N — γ の産生能亢進組成物を提供する。

本発明組成物は、 有効成分と して乳果オ リ ゴ糖 （以下 「 L S 」 と レ、 う ） を含有する こ と を必須とする。 こ こで 乳果オ リ ゴ糖と は、 下記構造式で表わされる公知の物質 であ り 、 ィ匕合物名では O — ]3 — D—ガラ ク ト ピラ ノ シル - ( 1 → 4 ) — O — a — D—グノレコ ピラ ノ シノレ 一 （ 1 — 2 ) — ]3 — D—フ ラ ク ト フ ラ ノ シ ドと表示される。

L S は、 各種の方法によ り 製造する こ と ができ る。 該 方法と しては、 例えば、 特公昭 57 - 58905号公報に記載さ れる よ う に、 ァェ ロ ノくク ター属菌起源の レバンシュ ク ラ ーゼをシュ ク ロース及びラ ク トース を含む溶液に作用 さ せる方法、 特開昭 64-85090号公報に記載のよ う に、 例え ばス ポロ ボマイ セ ス · シングラ リ ス な どのス ポ ロ ボマイ セス属に属する菌体又はその処理物をシュ一ク ロース及 びラ ク トース を含む溶液に作用 させる方法、 特開平 2 - 35 095号公報に記载のよ う に、 例えば口 一ネラ · アク アティ リ スな どのロ ーネラ属に属する菌体又はその処理物をシ ユ ーク ロ ー ス及びラ ク ト 一 スを含む溶液に作用 させる方 法な どを例示する こ と ができ る。

本発明組成物には、 上記各方法によ り 得られる L S を 主とする反応混合物及びこれから精製 した L S精製品が 利用でき る。

L S は、 また ビ フ ィ ズス菌の腸内増殖に と って必須の 重要な栄養素 （糖源） と して も知 られている。

本発明組成物における L S の配合量は、 通常 ◦ . 5 〜 7 0 g Z l 0 0 g 程度であ り 、 好ま し く は 5 〜 3 0 g / 1 0 0 g 程度の範囲から選ばれる。

本発明免疫賦活組成物及び I F N — γ の産生亢進組成 物は、 服用乃至摂取可能である限 り 、 特にその形態には 制限はな く 、 各種の形態、 例えば、 塊状、 液状、 シロ ッ プ状、 粉末状な どの形態を と る こ と ができ る。 よ り 具体 的な形態と しては、 例えば液状又は粉末状の甘味料形態、 清涼飲料、 乳飲料、 炭酸飲料な どの飲料形態 （ ド リ ンク 剤） 、 ノ ン類、 ク ッ キー、 キャ ンディ 一な どの菓子類形 態、 その他の健康食品形態な どの種々 の食品形態、 及び 粉剤、 散剤、 液剤、 懸濁剤、 錠剤、 発泡製剤などの医薬 品形態を例示する こ と ができ る。 之等の う ちでは、 特に 飲料形態、 発泡剤形態な どが好ま しい。

上記各種形態の本発明組成物は、 これ ら の形態に応 じ て、 有効成分とする L S 以外に、 適当な食品担体及び製 剤学的に許容される医薬品担体を添加配合 して調製する こ と ができ る。 食品担体は、 種々 の可食性添加剤、 例え ば増量剤、 甘味剤、 他の糖質、 ビタ ミ ン類、 香料、 着色 剤な どがある。

よ り 詳 しく は、 例えば本発明組成物が食品形態である 場合には、 1 日 当た り の L S の摂取量 （有効量） が、 1 〜 3 0 g 程度である こ と を考慮 して、 該組成物は該有効 量が容易に摂取でき る よ う に、 L S を適当な食品担体と 共に配合 して調製される。 食品形態の代表的例と しての 飲料は、 一般に、 有効成分とする オ リ ゴ糖を 0 . 5 〜 7 0 _{g /}/ l O O m l 、 好ま し く は S S O g Z l O O m 1 含む水溶液形態に調製する こ と ができ る。 該飲料は、 また好ま し く は適当な p H調節剤乃至緩衝剤な どを用い て、 p H 4 . 0 〜 6 . 5 程度、 好ま し く は 4 . 5 〜 6 . 0 程度に調整する こ と ができ る。

こ こで、 p H調整剤乃至緩衝剤 と しては、 代表的には、 ク ェン酸、 酒石酸、 リ ンゴ酸、 乳酸、 炭酸な どの弱酸及 びそれらの塩類、 例えばク ェン酸ナ ト リ ウム、 クェン酸 アンモニ ゥム、 酒石酸ナ ト リ ウム、 リ ンゴ酸ナ ト リ ウム、 乳酸ナ ト リ ウム、 乳酸カルシウム、 炭酸ナ ト リ ウム、 炭 酸水素ナ ト リ ウムな どを例示でき る。 リ ン酸水素ナ ト リ ゥム も上記 p H調整剤乃至緩衝剤と して使用する こ と が でき る。 これらの酸及びその塩類は、 単独で使用 されて も よ く 、 2 種以上併用 されて も よい。 これらの配合割合 は、 得られる飲料が上記適当な p H範囲を保持する範囲 から適宜決定される。 通常組成物重量の約 2 重量％以下、 好ま し く は約 0 . 0 5 〜 0 . 3 重量。 /₀である。

また、 上記飲料な どの食品形態の本発明組成物中には、 一般的な飲料な どと 同様に、 各種の糖質乃至甘味料な ど を添加配合する こ と ができ る。 糖質と しては、 ダルコ一 ス 、 フ ラ ク ト 一 スな どの単糖類 ； マ ル ト 一 ス 、 シユ ーク ロ ース な どの二糖類 ； デキス ト リ ン、 シク ロ デキス ト リ ンな どの多糖類 （但 し L S を除く ） ； キシ リ トール、 ェ リ ス リ トーノレ、 ソノレ ビ ト —ノレな どの糖ァノレコ ーノレ類 ； シ ュガ一エステルな どを例示でき る。 甘味料と しては、 天 然甘味料 （ レバウディ ォサイ ド Aな どのステ ビア抽出物 ソーマチン、 グ リ チル リ チンな ど） 、 合成甘味料 （サッ カ リ ン、 ア スパルテームな ど） な どを例示でき る。 これ ら糖質乃至甘味料の配合割合は、 通常得られる飲料の約 1 5 重量％以下、 好ま し く は約 1 3 重量％以下である。 更に、 食品形態の本発明組成物には、 必要に応 じて、 例えば下記の添加剤の 1 種又は 2 種以上を添加配合する こ と もでき る。 該添加剤には、 例えばグ レープフルーツ . リ ンゴ、 オ レンジ、 レモ ン、 ノ、。ィ ナ ッ プノレ 、 ノくナナ、 ナ シな どの各種果汁 （濃縮果汁、 粉末果汁な どであっても よい） ； ビタ ミ ン類及びプロ ビタ ミ ン類 （パルミ チン酸 レチノ ール、 ビスベンチア ミ ン、 リ ボフ ラ ビン、 塩酸ピ リ ドキシン、 シァ ノ コノくラ ミ ン、 ァス コノレ ビン酸ナ ト リ ゥ ム、 ニ コ チン酸ア ミ ド、 ノ、。ン ト テ ン酸カノレシ ゥム、 葉 酸、 ピオチン、 コ レカルシフ ェ ロ ーノレ 、 重酒石酸コ リ ン、 ト コ フ エ ロ ール、 3 — 力 ロ チンな どの水溶性及び脂溶性 ビタ ミ ン類） ； 香味料 （ レモ ンフ レーノく 一 、 オ レンジフ レ一バー 、 グレープフ ノレー ッ フ レ一 ノく 一 、 ノく ニラエ ッセ ンスな ど） ； ア ミ ノ 酸、 核酸及びそれらの塩類 （グルタ ミ ン酸、 グルタ ミ ン酸ナ ト リ ウ ム、 グ リ シン、 ァ ラ ニン、 ァ スパラ ギン酸、 ァ ス ノ、。ラギン酸ナ ト リ ウム、 イ ノ シン 酸な ど） ； 食物繊維 （ポ リ デキス ト ロー ス 、 ぺク チン、 キサンタ ンガム、 アラ ビアガム、 アルギン酸な ど） ； ミ ネラル乃至微量元素 （塩化ナ ト リ ウム、 酢酸ナ ト リ ウム 硫酸マグネシウ ム、 塩化カ リ ウム、 塩化マグネシウム、 炭酸マグネシウム、 塩化カルシウム、 リ ン酸二カ リ ウム リ ン酸一ナ ト リ ウム、 グ リ セ 口 リ ン酸カルシウム、 クェ ン酸第一鉄ナ ト リ ウム、 クェン酸鉄アンモニ ゥム、 クェ ン酸鉄、 硫酸マ ンガン、 硫酸銅、 沃化ナ ト リ ウム、 ソル ビン酸カ リ ウム、 亜鉛、 マンガン、 銅、 ヨ ウ素、 コバル ト な ど） な どが包含される。

本発明組成物は、 上記各成分を混合 して調製される。 その調製方法は特に制限される も のではな く 、 必要な成 分を全て同時に混合 して も よ く 、 また油性成分 と水性成 分と の両者を用いる場合には、 予め油性成分を適当な油 剤に溶解し、 これと水溶性成分の水溶液と を乳化剤を用 いて乳化する こ と もでき る。 該乳化操作は、 一般的方法 に従って、 通常の乳化分散機、 例えばホモ ミ キサー、 高 圧ホモジナイ ザーな どを用いて、 完全通過方式又は循環 方式に従い実施する こ と ができ る。 尚、 上記各成分の混 合乃至乳化は、 通常常温下に実施されるが、 加温操作を 採用する こ と もでき る。 かく して調製される本発明組成 物は、 これを適当な容器に充填後、 常法に従い、 加熱滅 菌、 無菌濾過などによ り 滅菌 して、 製品 と される。

本発明組成物は、 また、 錠剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセ ル剤な どの使用前に水中に溶解分散させ得る適当な形態 の発泡製剤に調製する こ と も でき る。 該発泡製剤は、 発 泡成分と しての炭酸水素ナ ト リ ウム及び （又は） 炭酸ナ ト リ ウム と 、 中和剤と を用いて調製される。 こ こで中和 剤と しては、 例えばク ェ ン酸、 酒石酸、 フマル酸、 ァス コルビン酸、 乳酸、 リ ンゴ酸な どを例示でき る。 上記発 泡成分及び中和剤の配合割合は、 通常全組成物中に発泡 成分 8 〜 6 0 重量％及び中和剤 1 0 〜 7 0 重量％ と なる 範囲から選択されるのが好ま しい。 かかる発泡製剤は、 必要に応 じて更に炭酸カ リ ウムの所定量を用いて、 一般 的方法、 例えば直接粉末圧縮法又は乾式も し く は湿式顆 粒圧縮法に従って調製する こ と ができ る。

本発明組成物の摂取乃至服用量は、 使用 目 的に応 じて、 また これを適用すべき人の年齢、 性別、 体重、 疾患の程 度な どに応 じて適宜決定され、 特に限定される も のでは ない。 本発明組成物が固剤の場合には、 一般には、 1 回 当た り 約 1 〜 3 0 g の有効成分を含む固剤を服用、 よ り 好ま し く は該固剤を水 3 0 〜 2 0 0 m 1 に溶解 して服用 させるのがよい。 また本発組成物が飲料な どの液剤形態 の場合には、 これを 1 回当た り 約 3 0 〜 2 0 0 m l 服用 させるのが好ま しい。 本発明組成物の 1 日 当た り の摂取 乃至服用量は、 これに含有される有効成分が約 0 . 5 〜 7 0 g 、 好ま し く は約 l 〜 3 0 g 、 よ り 好ま し く は約 3 〜 2 0 g 摂取、 服用 される量とするのが好適である。 こ の摂取、 服用量に応 じて、 上記固剤、 飲料な どは 1 日 に 数回に分けて服用する こ と もでき る。

発 明 の 効 果

本発明組成物は、 その服用乃至摂取によ って、 免疫賦 活及び I F N— γ 産生能亢進作用を発揮 し得、 消化管に おける生体防御機構 （免疫機能） を高めて、 消化管感染 な どに対 して顕著な予防及び治療効果を奏 し得る。

図面の簡単な説明

図 1 は、 試験例 2 において本発明組成物を摂取させた 被験者の顆粒球画分について求め られた貪食率 （％ ) を 示すグラ フである。

図 2 は、 試験例 3 において本発明組成物を給餌させた 供試ラ ッ 卜 のパイ エル板 リ ンパ球の I F N — γ 産生量 ( p g / m 1 ) を求めた結果を示すグラ フである。

発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を更に詳 し く 説明するため、 本発明組成 物の調製例を実施例 と して挙げ、 次いで本発明組成物及 びその有効成分とする L S について行なった試験例を挙 げる。 尚、 各例中、 部及び％はいずれも重量基準である。 実施例 1 〜 6

表 1 に記載の組成と なる よ う に各原料化合物を水に投 入 して混合、 溶解 して本発明組成物を調製 した。 各実施 例の組成物には、 更に適宜、 香料及び 又は ビタ ミ ン類 が配合され得る。 また各実施例の配合は、 水によ り 全量 を 1 0 0 0 m l と した。

実施例 7

下記成分 （全量 5 g ) を混合 して直接打錠に よ り 調製 (錠剤） する力、、 各成分を秤量混合 し分包 （散剤） する か、 又は各成分を秤量混合 し、 造粒乾燥後、 分包 （顆粒 剤） して、 それぞれの製剤形態の本発明組成物を調製 し た。

L S 5 5 P 3 4

( L S と して 8 7 % )

L ー ァ ス コ ル ビ ン酸 2 1

L 一酒石酸 2 0

甘味料

炭酸水素ナ ト リ ウム 2

塩化ナ ト リ ウム

炭酸カ リ ウム 0 5

香料 · 着色料 ― . 微量

合計 1 0 0 %

尚、 上記 「 L S 5 5 P」 は、 L S を 5 5 %含有する粉 末である。

実施例 8 〜 1 0

実施例 7 と 同様に して、 下記各成分を含む錠剤、 散剤 及び顆粒剤形態の本発明組成物を調製 した。

〈実施例 8 処方〉

L S 5 5 P 4 0 %

( L S と して 2 2 % )

L — ァ ス コ ル ビン酸 1 0 % L 一酒石酸 2 3 %

甘味料 適量

炭酸水素ナ ト リ ウム 2 2 %

ク ェ ン酸ナ ト リ ウム 適量

炭酸カ リ ウム 0 . 4 %

香料」 着色料 一 _ 微量

i 1 0 0 % (全量 5 g )

〈実施例 9 処方〉

L S 5 5 P 4 0 %

( L S と して 2 2 % )

L 一ァ ス コ ノレ ビ ン酸

L 一酒石酸 2 3 %

甘味料 適量

炭酸水素ナ ト リ ウム 2 2 %

ク ェ ン酸ア ンモニ ゥ ム 0 . 8 %

シァ ノ コノくラ ミ ン 微量

ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム 微量

炭酸カ リ ウム 0 4 %

香料 ·—着色料 一 微量

口 S十 1 0 0 % (全量 4 . 6 g )

〈実施例 1 0 処方〉

L S 5 5 P 4 0 % ( L S と して 2 2 % ) L 一酒石酸 2 9 %

甘味料

炭酸水素ナ ト リ ウム 2 4 %

ク ェン酸鉄ア ンモニ ゥ ム 3 . 6 %

シァノ コノくラ ミ ン 微量

炭酸カ リ ウム 0 . 5 %

香料 ， 着色料 ― 微量

合計 1 0 0 % (全量 4 g ) 実施例 1 1 〜 ： L 8

実施例 7 〜 1 0 と 同様に して、 下記表 2 に示す組成の 発泡錠剤形態の本発明組成物を調製 した。

表 2

実施例 1 9 〜 2 5

下記表 3 に示す各成分 （ m g ) を混合 し、 直接圧縮法 によ り 、 チユアブル錠 （発泡錠） 形態の本発明組成物を 調製 した。 表 3

尚 、 上記 「 L S 7 5 P 」 は 、 L S を 7 5 %含有す る 粉 末で あ る 。 実施例 2 6 〜 3 4

下記表 4 に示す各成分を混合 し、 水を加えて全量を

1 0 0 m 1 と して、 健康飲料形態の本発明組成物を調製 した。

表 4

尚、 乳化剤 と しては、 プ ロ ピ レ ング リ コ ール脂肪酸ェ ステルを使用 し、 油剤と してはサフ ラ ワー油を使用 した。 実施例 3 5 〜 4 5

下記表 5 に示す各成分を混合 し、 水を加えて全量を 1 0 0 m 1 と して、 飲料形態の本発明組成物を調製した。 尚、 表中のガスボ リ ューム値は、 溶液と 同体積の二酸 化炭素の気体を溶解させた場合を 1 と して算出 された含 有二酸化炭素量を示す指標であ り 数値が大き いほど含有 二酸化炭素量が多いこ と を示す。

表 5

SI成成分 実施例 No.

(IOOBI中） 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 杲ォ 糖 (g) 3 12 9 1 8 2 4 10 15 7 13 異性化 il(g) 8 - - 7 7 8 5 - - 9 - 精賺 ) 一 1 8 3 7 5 3 - - - 一 杲 I (g) 2 6 - 1 - - 3 - 一 - 60 ブドウ糖 (g) 2 2 - - 2 - 3 - - 2 4 クェン酸 («g) 3 2 - - 8 - - 2 5 一 - 酒石酸 (ιύ - 2 - 2 - - - - - 10 - リンゴ酸 (Η) 4 - 8 - 5 - 4. 5 - - ― -

% 酸 in) 8 一 - 2 - 20 - - - 10 - ン酸ナ (mg) 20 30 10 一 80 - - 100 55 70 一 酒石酸ナ (n) 60 一 一 60 25 70 一 - 一 30 20

- 80 150 - - 100 45 - 10 ~ 50 讓シ dg) - - - - 15 10 - - 一 - 5 m ) 4 1 1. 5 2

(«g) 3 2 5 1 1

塩化マ Π ) 2 1 1

杲汁 (°/o) 3 1 0. 5 0. 1 2 0. 3 香料 '甘味料 適量 適量 適量 適量 適量 適量 適量 適量 適量 適量 ガスボリューム 3.0 2. 0 2. 5 2. 3 3. 3 1. 5 H 5. 0 6. 3 5. 8 4.9 5. 8 5. 3 5. 5 5. 6 6. 4 5. 6 5. 9 試験例 1

こ の試験は、 プラセボ飲料を対照と した二重盲検群間 比較法によ り 飲料形態の本発明組成物の摂取が腸内細菌 叢や免疫能に及ぼす影響を検討したものであ り 、 以下の 通 り 行なわれた。

1.被験者 ： 成人男性 2 8 名

2.試験デザィ ン ： プラセボ飲料を対照と した二重盲検群 間比較法

3.群構成 ： 本発明群 ： 本発明飲料摂取群 （n = 14)

対照群 ： プラセボ飲料摂取群 （n = 14)

4.被験物 ：

本発明飲料 ：

乳果オ リ ゴ糖 （ L S ) 5 g を 5 0 m l の水に溶解 して 調製 した溶液 （ 1 本） 。

プラセボ飲料 ：

本発明飲料中の L S に代えて蔗糖を用いて、 同様に し て調製 した も の。

5.用法 ' 用量 ： 1 日 1 本 （全 5 0 m l ) を就寝前に飲用。

飲用期間は 6 週間。

6.測定項 目 ： 腸内細菌叢及び糞便中 I g A濃度

7.糞便採取方法 ：

被験物飲用前と飲用 6 週後に、 新鮮糞便を採取 した。 糞便は採取 日 の起床時以降に排泄された も のを密閉でき るポ リ エチ レン製袋に採取 し、 ポ リ エチ レン製袋内に極 力空気が残らないよ う に注意 して袋を密閉 した後、 ポ リ プロ ピ レ ン製糞便採取容器に入れて水冷保存 した。 採取 した糞便は重量を測定し、 よ く 混和 した後に腸内細菌叢 及び I g A量の測定を行なった。 尚、 I g A量の測定に は糞便の一部を一 8 0 °Cで保存 して用いた。

8.腸内細菌叢測定法 ：

糞便細菌叢の検索は、 光岡 らの方法 （光岡知足、 腸内 常在菌叢、 臨床検査、 23 (4) : 320-334 ( 1979) ) に準拠し、 分離用培地と して 3 種の非選択培地 （BL寒天、 EG寒天、 Tryptycase soy blood寒天） 及び 1 1 種の選択培地 ( BS 寒天、 NBGT寒天、 ES寒天、 変法 VS寒天、 eomycin

Nagler寒天、 変法 LBS寒天、 DHL寒天、 TATAC寒天、 PEES寒 天、 Potato dextrose寒天、 GE寒天） を用レヽて実施 した。 これら各培地組成は、 腸内常在細菌叢、 光岡知足、 臨床 検査、 23 (4) : 320-334 ( 1979 )に記載される通 り である。

約 1 . O g の新鮮糞便を正確に秤量し、 嫌気性希釈液 (上記文献記載の方法によ り 調製） 9 m l に懸濁 した後、 炭酸ガス雰囲気下にて同希釈液にて順次 1 0倍ずつ希釈 して、 1 0 '〜 1 0 ⁸倍希釈液を調製 した。 B L寒天及び E G寒天培地には、 上記で調製された 1 0 ⁶、 1 0 ⁷及び 1 0 ⁸倍希釈液を、 Tryptycase soy b 1 ood寒天培地 {こ fま、 上記で調製された 1 0 ⁵、 1 0 ⁶及び 1 0 ⁷倍希釈液を、 他 の選択培地には、 上記で調製された 1 0 ¹、 1 0 ³、

1 0 ⁵及び 1 0 ⁷倍希釈液を、 それぞれ 0 . 0 5 m l ずつ 塗抹した。

その後、 BL寒天、 EG寒天、 BS寒天、 NBGT寒天、 ES寒天、 変法 VS寒天、 Neomycin Nag 1 er寒天及び変法 LBS寒天は、 嫌気ジャーに入れ、 炭酸ガス置換後、 スチールウール法 にて 3 7 °Cで 4 8 時間嫌気培養を行なった。 Tryptycase soy blood寒天及び DHL寒天は、 3 7 °Cで 2 4 時間培養 し、 TATAC寒天、 PEES寒天、 Potato dextrose寒天及び GE寒天 は、 同様に 4 8 時間培養 した。

培養後、 各培地上のコ ロ ニー数を計測 し、 コ ロ ニー性 状、 グラム染色性、 芽胞の有無、 好気発育性及び顕微鏡 によ る形態学的観察によ る菌群レベルの同定を行なった。 結果は、 糞便 1 g 当た り の菌数の対数値 （ loglOCFU/g wet feces) で表わ し 7こ。

9.糞便中 I g A濃度測定法 ：

(1)糞便中 I g A測定用サ ンプルの調整

— .8 0 °Cで保存 した糞便サンプルを凍結乾燥し、 乾燥 糞便 0 . 2 g に対 して 0 . 1 M炭酸緩衝液（ p H 9 . 6 ) 2 . 0 m l を加えて十分に撹拌後、 1 5 0 0 回転 分で 1 0 分間遠心 し、 上清を p H 7 . 5 に調整 して I g A測 定用サンプルと した。

(2)糞便中 I g A測定用サンプル中の I g A濃度の測定 露木ら （露木重雄、 山崎省二、 上村裕、 木村昌伸、 川 島柘司、 上田雄幹、 マ ウス胆汁および小腸内容物中の

1 g A抗体および総 I g Aの酵素抗体法（ELISA)によ る測 定、 ビフ ィ ズス 、 2 : 9-13 (1988) ) の方法に従って、

E L I S A法によ り I g A濃度を測定した。

I g A抗体の測定は、 次の通 り 実施 した。 即ち、 抗原 と して非標識マ ウス由来抗ヒ ト I g A ( 2 5 μ g / m l ,

2 0 0 μ 1 )を用い、 該抗原を各 ゥ エルに入れ 4 °Cで一夜 静置した。 対照 と して上記抗原の代わ り に緩衝液を同量 入れた対照ゥ エルを用いた。

翌 日 、 溶液を吸引 した各ゥ ヱルにスぺーサ一 と して 1 % B S A溶液 （ 0 . 1 M炭酸緩衝液， 2 0 ◦ μ 1 ) を加 え、 3 7でで 6 0 分間反応させた。 ついで糞便中 I g A 測定用サ ンプル （ 4 0 1 ) を抗原処理及び対照ゥ エル に入れ、 3 7 °Cで 4 5 分間反応させた。 反応後ペルォキ シダーゼ標識マ ウス 由来抗ヒ ト I g A ( l 0 0 0 倍希釈， 4 0 1 ) をカ卩え、 3 7 °C , 4 5 分間反応させた。 っレヽ で SIGMA FAST ODP ( SIGMA社、 2 0 0 μ 1 ) を力 Qえて 1 5 分間発色させた後、 3 M H C 1 ( 5 0 m l )で反応を停止 し、 吸光度 （ 4 9 0 n m ) を測定 した。 サンプルの I g A濃度は、 s I g A標品 （purified human secretory I gA 5mg ； Capp 1 e社)で検量線を作成し その検量線から算出 したサンプル中の I g A濃度を乾燥 糞便 1 g 当た り の濃度に換算 して表わ した。 10.統計解析 ： 被験物飲用前と飲用 6 週後の値について、 各群の平均 値と標準偏差を算出 した。 群間の比較は、 繰返 しを加味 した分散分析を行ない、 危険率 5 %以下を有意と した。 上記試験の結果を下記表 6 に示す。 表 6 糞便中 IgA 腸内細菌数 腸内細菌 瀹度 (mg/g- (loglOCFU/g 占 有 率 dry wt) wet ieces) (%) 本発明飲料摂取群

n 14 13 13

平均土 S D

飲用 m 3. 9 + 3. 2 9.5 + 0.7 19. 6 + 15. 2 飲用 6週後 6. 9 + 5. 4 10. 1+0. 7 32. 1 + 15. 2 プラセボ飲料摂取群

n 14 12 12

平均土 S D

飲用 RIJ 5.6 + 7. 0 9. 8 + 0.6 23. 5 + 12.6 飲用 6週後 4.4 + 3. 1 9. 8 + 0. 6 18. 8+ 9. 2 表 6 に示す結果から、 次の こ と が判る。

1. 本発明飲料摂取群では、 本発明飲料の摂取によ り ビフ ィ ド ノくク テ リ ゥム （Bifidobacterium)の菌数カ 增カロ した

( 9.5± 0.7→ 10. 1 ± 0.7 loglO CFU/g wet feces,

Paired t-test ； P = 0.013) 。 これ ίこ対 して、 プラセボ飲 料摂取群では変化を認めなかった （9.8± 0.6→9.8± 0.6 log 10 CFU/g wet feces) 。 従って、 ビフ ィ ド ノくク テ リ ゥムの菌数の変化に群間で有意差を認めた。

2. 本発明飲料摂取群では、 本発明飲料の摂取によ り ビフ イ ドバク テ リ ゥムの占有率も増カ卩 した （ 19· 6± 15.2—

32. 1 ± 15.2% , Paired t-test ； P = 0.001) 。 これ ίこ対し て、 プラセボ飲料摂取群では低下する傾向 （23.5± 12.6 → 18.8 ± 9.2 %、 Paired t-test ； P = 0. 110) にあ り 、 ビ フ ィ ドバク テ リ ゥムの 占有率の変化に も群間で有意差を 認めた。

3. 本発明飲料摂取群では、 糞便中 I g A濃度が有意に上 昇 した ( 3.9 ± 3.2→ 6.9 ± 5.4 mg/g dry wt、 Paired t - test ； P = 0.014) 。 これに対 して、 プラセボ飲料摂取群で は変ィ匕せず ( 5.6± 7.0→ 4.4± 3. 1 mg/g dry wt) 、 糞便 中 I g A濃度の変化に群間で有意差を認めた。

以上の こ と から、 試験 した本発明飲料は、 その摂取に よ っ て、 糞便中の I g A濃度を有意に上昇させた。 こ の こ と から、 本発明飲料は、 消化管における I g A産生能 を亢進させる こ と が明 らかと なった。

本発明者はまた、 上記と 同様に L S の摂取によ り モル モ ッ 卜 の盲腸内 I g A濃度が有意に上昇する こ と を確認 した。

試験例 2

こ の試験は、 健常者が本発明組成物を摂取した際に、 本発明組成物 （有効成分とする L S ) がその免疫指標に 及ぼす影響を検討した も のであ り 、 以下の通 り 実施され た。

1.被験者 ：

過去 1 か月 以内に抗生物質を服用 していない健常成人 2 0 名 を対象と した。

2.被験物及び摂取条件

被験物は、 本発明飲料 （ L S 5 g を水 5 0 mlに溶解し た溶液） を 1 日 2 回 （午前 1 0 時と午後 3 時） 、 4 週間 摂取させた。

3.試験方法

被験者に被験物を摂取させ、 摂取開始日 （ 0 週） 及び 摂取 4週後 （ 4 週後） に各々採血を行なった。 尚、 採血 及び採便の前 日 は、 午後 9 時よ り 絶食と した。 試験期間 中の食事は、 暴飲暴食及び発酵食品の摂取を避ける こ と と した。 また、 試験期間中は、 薬の服用を控え させた。 4.評価項目及び評価法

(1)血清 ト ラ ンス フ ェ リ ン ： ネ フエ ロ メ ト リ ー法によ る。

(2)顆粒球画分の貪食能 ：

螢光ビーズ 蛍光標識ビーズ、 Polyscience #1 8604, Lot No. 425844) 2 0 μ 1 をグノレ コ ー スメ ディ ゥ ム （下記溶液 A、 溶液 B及び滅菌水を 1 ： 1 ： 8 容量比 で混合 したもの） 1 m l に添カ卩 し、 l l O O O r p mで 3 0 分間、 遠心 して洗浄した。

グルコー ス メ ディ ゥム組成

A溶液 ： 1 . 0 1 M N a C 1

0 3 M C H a C O O N a

0 0 4 M K C 1

0 0 4 Μ C a C 1

0 . 0 2 M M g C 1 a

B溶液 ： 0 . 0 7 M グルコー ス

得られた沈殿を、 同グルコー スメ ディ ゥ ム 1 m 1 に懸 濁 し、 超音波処理をする こ と によ り 均一な ビーズ液を得 た。 被験者からへパ リ ン採血 した末梢血 1 0 0 Z 1 に上 記蛍光 ビーズ 1 0 0 1 を添加 し、 各々 0 ， 5 ， 1 0及 び 3 0 分間、 3 7 °Cで振盪 しなが らイ ンキュベー ト した 反応終了後、 溶血剤を等量の緩衝液 （Facs Lysing buffer, Becton Dickinson社， Cat. No. 349202) に溶解 させた液 2 m 1 を加え、 赤血球を完全に溶血させた後、 氷冷後、 測定 した。 サンプルはフ ローサイ ト メ ータ一

(COULTER EPICS XL-MCL System II) にて測定 した。 そ の際、 顆粒球画分にゲー ト をあて、 蛍光を発 している貪 食細胞を ピーク と して と ら える よ う に設定し、 その貪食 率を解析した。

(3)好酸球数 ： 鏡検法によ った。

5.統計処理

データ は全て、 平均値土 S. D.で示 し、 乱塊法によ る割付 後、 Dunnettの多重比較によ る検定を行ない有意差を判定 した。 有意水準は、 危険率 5 %以下と した。

6.結果

(1)血清 ト ラ ン ス フ ェ リ ン ：

得られた結果を表 7 に示す。

表 7

Mean± S. D. , n = 20 (0週）， 17(4週）

※ ： p く 0 . 0 5 vs 0 週

表 7 に示す結果から、 血清 ト ラ ンス フ ェ リ ン濃度は 摂取 4 週後において、 0週に比べて危険率 5 %以下で有 意に高値を示すこ と が判った。

(2)顆粒球画分の貪食率 ：

結果は図 1 (縦軸 ： 顆粒球画分の貪食率 （％ ) 、 横軸 ： 試験期間 （週） ） に示される通 り であ り 、 顆粒球画分 の貪食率の平均値土 S. D. ( 3 0 分間反応値） は、 摂取 0 週及び摂取 4 週後で、 それぞれ 50.8 ± 10.8%及び 63.6土 14.1%であ り 、 摂取 4 週後において、 0 週に比べて危険 率 1 %以下で有意に高値を示 した。

(3)血中好酸球数

結果を表 8 に示す。

尚、 表 8 には同時に行なった血液一般検查 （白血球細 胞数、 好中球数、 好塩基球数、 リ ンパ球数及び単球数） の結果を併記する。

表 8

謹始日（0週) 摂取 4週後 (4週後）

白血球細抱 (カウント/ μ I) 5443+1604 5536土 2370

好中球 （％) 59. 9± 11. 0 59. 9±6. 7

m (%) 1. 0±0. 7 1. 0土 0. 5

好酸球 （％) 4. 7 + 3. 9 3. 2土 2. 0 ·

リンパ球 (%) 28. 6土 9. 5 29. 2土 5. 8

単球 （％) 5. 9 + 2. 1 6. 7土に 2 Mean土 S. D. , n = 20 (0週）， 17(4週）

* : p < 0 . 0 5 vs O 週

該表に示す結果よ り 、 血中好酸球数は、 摂取 4 週後に おいて、 0 週に比べて危険率 5 。/。以下で有意に低値を示 した。

7.考察

以上の結果から、 本発明組成物の摂取によれば、 感染 防御の要である顆粒球の貪食能及び血清 ト ラ ンス フエ リ ンが増加 し、 こ のこ と よ り 、 本発明組成物が、 宿主の感 染防御能を高める作用を奏する こ と が判った。 また、 本 発明組成物の摂取によれば、 血中の好酸球数が低下 し、 こ の こ と から、 本発明組成物はァ レルギ一反応を抑える 可能性を有する こ と が示唆された。

試験例 3

こ の例は、 遺伝的糖尿病発症モデル動物を用いて本発 明組成物の給餌が腸管免疫に及ぼす影響を検討したもの であ り 、 以下の通 り 実施された。

1.実験動物

4 週令の LET0ラ ッ ト及び 0LETFラ ッ ト （各 10匹） を用レヽ た。 尚、 0LETFラ ッ ト受精卵は、 1 9 9 4 年 8 月 2 4 日 に . アメ リ カ ン タ イ プ カルチ ャ ー コ レク シ ョ ン （American Type Culture Co 11 ec t i on)に、 ATCC No. 7 2 0 1 6 と し て寄託されている。 LET0ラ ッ ト は、 大塚製薬工場 徳島実 験動物管理室にて、 分譲可能な状態で保存されている。 2.飼育条件

動物搬入後、 1 週間の検^を行なった。 検疫期間中は、 M F 固形飼料 （オ リ エ ン タ ル酵母社製） の 自 由摂取条件 下、 飲水は水道水を 自 由摂取と した。 飼育はス テ ン レス 製金網ケージを使用 し、 1ケージ当 り 1 匹の飼育条件で行 なった。 明暗サイ クノレは、 明期を 7 ： 0 0 - 1 9 ： 0 0 と した。

試験期間中は A I N 7 6 組成 ( American Institute of Nutrition (1977) Report of the American

Institute Nutrition ad hoc committee on standards for nutrition studies. , J. Nutr. , 107： 1340-1348) に準拠して、 低繊維（ 3 % )、 高脂肪（ 5 %コー ン油 + 1 0 %牛脂）飼料を調製 して対照飼料と し、 該対照飼料中の し よ糖 Zコ ー ンス ターチ混合物の一部を L S に置き換えて 飼料当た り L S 5 %が含まれる よ う に調製 した ものを本 発明飼料 （ L S含有飼料） と した。 各飼料の組成は、 下 記表 9 に示される通 り である。 表 9

3.試験群

試験群 （供試動物、 飼料、 動物数） は、 以下の通 り と し た。

群 動物 飼料 動物数（匹）

1 群 LETOラ ッ ト 対照飼料 1 〇

2 群 LETOラ ッ ト 本発明飼料 1 0

3 群 OLETFラ ッ ト 対照飼料 1 0

4 群 OLETFラ ッ ト 本発明飼料 1 0

4.試験ス ケ ジュ ール 検疫終了後よ り 対照飼料にて 2 週間飼育 した。 飼育後 に各群の平均体重が同 じになる よ う に LET0ラ ッ ト及び 0LETFラ ッ ト をそれぞれ上記各群に分けた。 群分けの後に 試験飼料に切 り 替え、 飼育を開始 し （ 7 週令） 、 2 2 週間 試験飼料にて飼育 した。

5.解剖

2 2 週間の飼育終了後 （ 2 9 週令時）にラ ッ ト をエーテ ル麻酔下に開腹 し、 腹部下大静脈よ り 採血後、 脱血 し屠 殺 した。 下大静脈血は 3 0 0 0 回転で 1 5 分間遠心分離 後、 血清を分取 し一 8 0 °Cで保存 した。 屠殺後、 小腸（各 群 3 匹づつ）は、 リ ンパ球調製のために使用 した。

6. リ ンパ球の調製

小腸パイ エル板 リ ンパ球の調製は、 バチルス 由来のプ 口 テア一ゼ （ディ ス ノ 一ゼ、 ベー リ ンガーマ ンノヽィ ム社 製 「Dispa_Se II」 使用） を用いた酵素法にて行なった。 パイ エル板細胞の分離は、 フ ラガキ らの方法 （Fragaski, e t a 1. , Journal of Immunological Methods, 48， 《33 - 44 ( 1989) ) に従った。 屠殺後、 無菌的に十二指腸上部か ら回腸末部までを摘出 した。 滅菌生理食塩水でよ く 洗浄 した後、 シ リ ンジにて滅菌生理食塩水を腸管内部に送 り 込み内容物を除いた。 氷上に敷いた滅菌ガーゼ上で、 パ イ エル板を切 り 出 した。 切 り 出 したパイ エル板は不完全 R P M I 1 6 4 0培地 （ l O g / m l ゲンタ マイ シン を含む R P M I 1 6 4 0 ) 中に置いた。 全て取 り 出 し終 わったノ ィ エル板は、 デイ スパーゼ 1 . 5 m g ノ m 1 を 含む培地 （ Joklik- modified MEM) 液 （酵素液） 中でス タ 一ラーにて攪拌 しなが ら 、 3 7 °Cで 4 0 分間酵素処理を 行なった。 分離し始めた細胞は回収 し、 新たに同酵素液 を加えた。 こ の操作を 3〜 4 回繰 り 返 した。 完全に分離 した細胞を 3 5 0 g X 1 0 分間、 4 で下に遠心分離 し、 P B S にて洗浄後、 所定の培地に懸濁 して細胞数を血球 計算板にて測定 した。

各群 3 匹ずつのパイ エル板をプール して リ ンパ球の調 製を行なった。

7. リ ンパ球の培養

リ ンノ 球は R P M I 1 6 4 0 ( 2 m M L — グノレタ ミ ン 、 5 0 x Mメ ノレカ プ ト エタ ノ ール、 l O O U Z m l ぺニ シ リ ン、 l O O g Z m l ス ト レプ ト マイ シン及び 1 0 % F C S を含有する）にて、 細胞数を 1 X 1 0 ⁶細胞 Zm 1 に調整 した。 1 m 1 /ゥエルの リ ンパ球懸濁液は細胞培 養用の 2 4 ゥエルプレー ト （FALCON 3047)中でマイ ト一ゲ ンと して C o n A ( Concanavalin A； Canava 1 i a

ensiformis (タチナタマメ ）由来、 シグマ社製） 5 . 0 μ g / m 1 の刺激下で培養を行なった。 抗体産生能試験は、 3 7で、 5 % C 0₂下で 7 日 間、 サ ィ ト カイ ン産生能試験は同条件下で 3 日 間培養 して実施 した。 脾臓の リ ンパ球培養の場合、 1 サンプルにっき 1 ゥエルを、 パイ エル板 リ ンパ球の培養の場合、 1 サンプ ルにっき 3 ゥエルを、 それぞれ培養 した。

培養終了後プ レー ト を 1 6 0 0 回転 Z分、 1 0分遠心 して上清を回収 した。 回収 した上淸は各項目 の測定まで 一 2 0 °Cで凍結保存 した。

8.サイ ト カイ ンの測定

リ ンパ球培養上清中の I F N - γ は、 市販の測定キ ッ ト を用いた E L I S A法にて測定 した。

9.統計処理

結果は平均値土標準偏差で示 した。 サイ ト カイ ン濃度 は各群間について 1 元配置分散分析を行なった後、

Fisher' s Protected LSDの多重 J;匕較を なった。 ノヽ⁰イエ ル板細胞の場合は各群でプールしたサ ンプルを用いたた め統計処理は行なわなかった。 危険率 5 %未満を有意と した。

10.結果

図 2 にノ ィエル板 リ ンパ球の培養における I F Ν - γ の 産生能を求めた結果を示す。

この結果よ り 、 本発明組成物飼料摂取群 （ 2群及び 4 群） では、 対照飼料摂取群 （ 1 群及び 3 群） に比 して、 L E T O ラ ッ ト及び O L E T F ラ ッ 卜のいずれにおいて も、 I F N — y 濃度が高値を示すこ と が明 らかと なった。

Claims

請 求 の 範 囲

1 乳果オ リ ゴ糖を担体と 共に含有する免疫賦活組成物。

2 乳果オ リ ゴ糖を担体と 共に含有するイ ンタ一フ エ 口 ンー γ の産生能亢進組成物。

3 組成物 1 0 0 g 当た り に、 乳果オ リ ゴ糖を 0 . 5 〜 7 0 g 含有する請求項 1 又は 2 に記載の組成物。 4 食品形態である請求項 1 又は 2 に記載の組成物。

5 乳果オ リ ゴ糖が 1 日 当た り l 〜 3 0 g 摂取される請 求項 1 又は 2 に記載の組成物。 6 乳果オ リ ゴ糖を担体と 共に含有する消化管感染症の 予防及び治療剤。

7 免疫賦活組成物の製造のための乳果オ リ ゴ糖の使用。 8 イ ンターフ ェ ロ ン一 γ 産生能亢進組成物の製造のた めの乳果オ リ ゴ糖の使用。 消化管感染症の予防及び治療剤の製造のための乳果 オリ ゴ糖の使用。 0 患者に乳果オ リ ゴ糖の有効量を服用乃至摂取させ る免疫賦活方法。 1 乳果オ リ ゴ糖の有効量が l 〜 3 0 g Z l 日 である 請求項 1 0 に記載の方法。 2 患者に乳果オ リ ゴ糖の有効量を服用乃至摂取させ る、 イ ンタ一フ ュ ロ ン一 γ 産生能亢進方法。 3 乳果オ リ ゴ糖の有効量が 1 〜 3 0 g / 1 日 である 請求項 1 2 に記載の方法。 4 処置を必要とする患者に乳果オ リ ゴ糖の有効量を 服用乃至摂取させる 、 消化管感染症の予防方法。 5 乳果オ リ ゴ糖の有効量が 1 〜 3 0 g / 1 日 である 請求項 1 4 に記載の方法。 6 処置を必要とする患者に乳果オ リ ゴ糖の有効量を 服用乃至摂取させる、 消化管感染症の治療方法

7 乳果オ リ ゴ糖の有効量が 3 0 g Z l 日 である 請求項 1 6 に記載の方法。