WO2023135950A1 - プロテオグリカンを含む免疫応答調節剤 - Google Patents

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WO2023135950A1
WO2023135950A1 PCT/JP2022/043585 JP2022043585W WO2023135950A1 WO 2023135950 A1 WO2023135950 A1 WO 2023135950A1 JP 2022043585 W JP2022043585 W JP 2022043585W WO 2023135950 A1 WO2023135950 A1 WO 2023135950A1
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extract
immune response
proteoglycan
cells
composition
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PCT/JP2022/043585
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English (en)
French (fr)
Inventor
達治 高橋
賢一 伊藤
知也 岡本
明夫 中根
クリスナ 浅野
Original Assignee
一丸ファルコス株式会社
国立大学法人弘前大学
コンビ株式会社
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Filing date
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Application filed by 一丸ファルコス株式会社, 国立大学法人弘前大学, コンビ株式会社 filed Critical 一丸ファルコス株式会社
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    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the present invention relates to immune response modifiers containing proteoglycans (including compositions for administration to humans, etc.).
  • a proteoglycan (hereinafter sometimes referred to as "PG") is one of the glycoconjugates, consisting of a core protein and a glycosaminoglycan (acidic mucopolysaccharide) bound to it.
  • PGs are present in skin, cartilage, bones, blood vessel walls, etc. as main constituents of extracellular matrices, and are involved in cell proliferation and adhesion together with collagen, laminin, fibronectin, and the like. Together with chondroitin sulfate, which constitutes PG, PG is a major component of articular cartilage and is considered important for preventing joint disorders in the elderly.
  • Non-Patent Document 1 PG suppresses the inflammatory response of macrophages stimulated by heat-treated bacteria
  • Non-Patent Document 2 administration of PG suppresses the progression of colitis
  • Patent Document 1 discloses the pharmacological action of PG on the immune system, but the full picture of the action of PG is still unclear.
  • the problem to be solved by the present invention is to examine the effects of proteoglycans on immune responses induced by various immunogenic factors that act on immune cells such as dendritic cells and macrophages, and to find useful proteoglycans for regulating immune responses. and a composition containing the agent.
  • the present invention has been made in order to solve such problems, and it is found that proteoglycans cooperate with various immunogenic factors to enhance or suppress their activity, thereby having the effect of regulating immune responses. Based on findings. That is, the present invention includes the following embodiments.
  • [1] Proteoglycan and bacterial components of Enterococcus faecalis EC-12 strain (accession number FERM BP-10284) and/or BR-108 strain (accession number: NITE P-1317) Fidobacterium longum strain BR-108) in combination together or separately for activating an immune response.
  • [2] The composition of [1], wherein the immune response is activated via innate immunity and/or acquired immunity.
  • agents useful for regulating immune responses induced by various immunogenic factors acting on immune cells such as macrophages, compositions containing such agents, etc. can be provided.
  • Figure 1 shows the amount of TNF- ⁇ secreted into the medium when various immunogenic factors (Pam, LPS, ODN or Zymosan) were added to the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG.
  • Figure 2 shows the results of measuring the amount of IL-6 secreted into the medium when various immunogenic factors (LPS or Zymosan) were added to the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG.
  • Figure 3 shows the amount of IL-10 secreted into the medium when various immunogenic factors (Pam, LPS, ODN or Zymosan) were added to the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG.
  • FIG. 4 shows the amount of IL-1 ⁇ secreted into the medium when various immunogenic factors (Pam, LPS, Imiquimod or Zymosan) were added to the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG.
  • FIG. 5 shows the amount of TNF- ⁇ secreted into the medium when various immunogenic factors (Birch anatake extract or Versicolor versicolor extract) were added to the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG. is the result of measuring FIG.
  • FIG. 6 shows the amount of IL-6 secreted into the medium when various immunogenic factors (Birch nut extract or Versicolor versicolor extract) were added to the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG.
  • FIG. 7 shows the amount of IL-10 secreted into the medium when various immunogenic factors (Birch nut extract or Coriolus versicolor extract) were added to the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG.
  • FIG. 8 shows the amount of IL-1 ⁇ secreted into the medium when various immunogenic factors (Birch anatake extract or Versicolor versicolor extract) were added to the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG.
  • FIG. 9 shows that various immunogenic factors (Pam, Poly(I:C), LPS, CpGDNA, Loxoribine, Zymosan, birch anatake extract or versicolor versicolor extract in the culture medium of mouse macrophage cells in the presence or absence of PG. This is the result of measuring the amount of IL-1 ⁇ secreted into the medium when the product) was added.
  • FIG. 10 shows the amount of TNF- ⁇ secreted into the medium when lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EC-12 was added to the culture medium of mouse bone marrow-derived dendritic cells in the presence or absence of PG. This is the result.
  • FIG. 10 shows the amount of TNF- ⁇ secreted into the medium when lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EC-12 was added to the culture medium of mouse bone marrow-derived dendritic cells in the presence or absence of PG. This is the result.
  • FIG. 10 shows the amount of TNF
  • FIG. 11 shows the amount of IL-6 secreted into the medium when lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EC-12 was added to the culture medium of mouse bone marrow-derived dendritic cells in the presence or absence of PG. This is the result.
  • FIG. 12 shows the amount of IL-12p70 secreted into the medium when lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EC-12 was added to the culture medium of mouse bone marrow-derived dendritic cells in the presence or absence of PG. This is the result.
  • Figure 13 shows Listeria monocytogenes (HK-LM) and H.
  • FIG 14 shows Listeria monocytogenes (HK-LM) and H. cordata that were heat sterilized as test samples in a culture medium of mouse bone marrow-derived dendritic cells in the presence or absence of PG. It is the result of measuring the amount of IL-12p70 secreted into the medium when the extract or the Betula anatake extract was added.
  • Figure 15 shows Listeria monocytogenes (HK-LM) and H.
  • FIG. 1 shows an experimental protocol for examining the effects (innate immunity) of oral administration of a Betula extract on Listeria infection in mice.
  • FIG. 17 shows the amount of IFN- ⁇ secreted into the medium when the spleens were taken out and cultured on day 4 after infection with Listeria monocytogenes while feeding mice with or without the addition of a birch extract. is the result of measuring FIG.
  • FIG. 18 shows the amount of TNF- ⁇ secreted in the medium when the spleen was removed and cultured on day 4 after infection with Listeria monocytogenes while feeding the mice with or without the addition of the birch extract.
  • FIG. 19 shows the amount of IL-12p70 secreted into the medium when the spleen was removed and cultured on day 4 after being infected with Listeria monocytogenes while feeding the mice with or without the addition of the Betula extract.
  • FIG. 1 shows an experimental protocol for investigating the effect of oral administration of a Betula extract on Listeria infection in mice (acquired immunity).
  • FIG. 21 shows the amount of IFN- ⁇ secreted into the medium when the spleens were taken out and cultured after 4 weeks of infection with Listeria monocytogenes while mice were being fed diets with or without the addition of Betula nutella extract.
  • FIG. 22 shows the amount of TNF- ⁇ secreted into the medium when the spleen was removed and cultured after 4 weeks of infection with Listeria monocytogenes while feeding mice with or without the addition of a birch extract.
  • FIG. 23 shows the amount of IL-12p70 secreted into the medium when the spleen was removed and cultured after 4 weeks of infection with Listeria monocytogenes while feeding mice with or without the addition of a birch extract. is the result of measuring
  • an "agent for immune response modulation” is one of restoring a weakened immune response, suppressing an aberrant immune response, and enhancing a normal immune response. or any drug that has multiple actions.
  • An immune response includes, for example, one or more of humoral (antibody-mediated) immunity, cellular immunity, adaptive immunity, and innate immunity.
  • combining such agents with an immunogenic agent provides a composition for activating an immune response.
  • Immunogenic factor means any factor capable of stimulating the immune system of a human or animal.
  • Such immunogenic factors include, for example, ligands of pathogen-associated pattern recognition receptors (PRRs).
  • PRRs include Toll-like receptors (TLR), Nod-like receptors (NLR), RIG-I-like receptors, C-type lectin receptors, scavenger receptors, and complement receptors. Not limited.
  • TLRs are a class of single transmembrane domain non-catalytic receptors that recognize structurally conserved molecules called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). PAMPs are present on microorganisms and are distinguished from host molecules. TLRs are present in all vertebrates and include TLRs 1-10 in humans. TLR ligands are compounds that bind to these TLRs and include virulence molecules associated with pathogens or threats to host survival such as cellular stress. Exemplary pathogenic molecules include, but are not limited to, lipopolysaccharide (LPS), lipoproteins, lipoarabinomannans, flagellin, double-stranded RNA, and unmethylated CpG islands of DNA. .
  • LPS lipopolysaccharide
  • lipoproteins lipoproteins
  • lipoarabinomannans flagellin
  • double-stranded RNA unmethylated CpG islands of DNA.
  • C-type lectin receptors include Dectin 1, Dectin 2, DEC205, Mincle, DC-SIGN, and the like.
  • dectin 1 is a membrane protein expressed in dendritic cells and macrophages, and is an extremely important receptor for recognition of (1 ⁇ 3)- ⁇ -D-glucan, activation of innate immunity, and a protective factor against fungi. It is known that By containing proteoglycan as an active ingredient, the agent or composition of the present embodiment, for example, regulates various immune responses mediated by the above-described receptors, or cooperates with these receptor ligands to suppress immune responses. It has a stimulating effect.
  • Proteoglycan is a glycoprotein in which sugar chains called glycosaminoglycans (hereinafter referred to as GAG) such as chondroitin sulfate and dermatan sulfate are covalently bound to core proteins.
  • GAG glycosaminoglycans
  • PG is widely distributed in the body such as skin and cartilage as one of the main constituents of the extracellular matrix.
  • GAG chains have a long linear structure with no branches. Since it has many sulfate groups and carboxyl groups, it is negatively charged, and the GAG chain assumes an elongated shape due to its electrical repulsion.
  • PG can retain a large amount of water due to the water affinity of sugar.
  • a large number of GAG chain groups contained in PG are responsible for functions unique to cartilage, such as elasticity and resistance to impact, while retaining water flexibly like a sponge.
  • the PG core protein has the property of binding to various molecules in the matrix.
  • cartilage PG it has a binding region with hyaluronic acid or link protein on the N-terminal side, and may bind to these substances or associate between the same molecules.
  • It has a lectin-like domain, an EGF-like domain, etc. at its C-terminus and binds to various other molecules. Due to this property, PG builds a structure that suits each organization.
  • PG derived from salmon nasal cartilage is PG extracted from salmon nasal cartilage.
  • salmon is, for example, a fish belonging to the genus Oncorhynchus, and salmon with the scientific name "Oncorhynchus keta" is preferably selected from the viewpoint of efficiently regulating immune response.
  • the proteoglycan contained in the agent or composition of this embodiment is produced, for example, by the method described in the publication (Japanese Patent No. 6317053).
  • the lower limit of the content of proteoglycan in the composition (1 g) containing the agent of the present embodiment is preferably 0.1 ⁇ g/g or more, more preferably 100 ⁇ g, from the viewpoint of, for example, effective regulation of immune response.
  • the amount of proteoglycan effective for modulating an immune response means that when a single dose or multiple doses are administered to a subject, the effect of modulating the immune response is refers to the amount of proteoglycan that is effective beyond what would otherwise be expected in the absence of such treatment.
  • composition for activating immune response comprises an immunogenic agent and a proteoglycan in combination, either together or separately.
  • Immunogenic factors include, for example, TLR ligands, dectin 1 ligands, birch anatake extracts, versicolor versicolor extracts, bacterial components of lactic acid bacteria, plant extracts (eg, Houttuynia cordata extract), and the like.
  • TLR ligands include TLR2 or TLR4 ligands such as lipoproteins and lipopolysaccharides, TLR3 ligands such as double-stranded DNA, TLR5 ligands such as the proteinaceous ligand flagellin, the imidazoquinoline compound imiquimod, These include resiquimod (R848), TLR7 or TLR8 ligands such as single-stranded RNA, and TLR9 ligands such as CpG sequences that are nucleic acid ligands.
  • TLR2 ligands include synthetic triacylated and diacylated lipopeptides.
  • TLR2 ligands are FSL-1 (synthetic lipoprotein derived from Mycoplasma salivarium 1), Pam3Cys (tripalmitoyl-S-glycerylcysteine), or S-[2,3-bis (Palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-N-palmitoyl-(R)-cysteine, where "Pam3" is "tripalmitoyl-S-glyceryl".
  • Derivatives of Pam3Cys are also suitable TLR2 agonists, where derivatives include, but are not limited to: S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2-R,S) -propyl]-N-palmitoyl-(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys) 4-hydroxy trihydrochloride; Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala; PaM3Cys-Ser-(Lys)4; Pam3Cys Pam3Cys-Ser; PaM3Cys-OMe; Pam3Cys-OH; PamCAG, palmitoyl-Cys ((RS)-2,3-di(palmitoyloxy)-propyl)-Ala-Gly- such as OH.
  • TLR2 agonist is Pam2CSK4; PaM2CSK4 (dipalmitoyl-S-glycerylcysteine-serine-(lysine)4; is a lipopeptide.
  • peptidoglycan and teichoic acid which constitute the cell walls of lactic acid bacteria, are also thought to induce various immune responses via TLR2.
  • TLR3 ligands include natural double-stranded RNA (dsRNA), synthetic dsRNA, synthetic dsRNA analogs, and the like.
  • dsRNA natural double-stranded RNA
  • synthetic dsRNA analogs are polyriboinosine and polyribocytidic acid (Poly(I:C)), polyadenosine-polyuridylic acid (PolyAU), poly-L-lysine and stabilized with carboxymethylcellulose.
  • Polyinosine-polycytidic acid Hiltonol (registered trademark)).
  • TLR4 ligands include naturally occurring lipopolysaccharides (LPS), such as LPS from a wide variety of Gram-negative bacteria; derivatives of natural LPS; synthetic LPS; bacterial heat shock protein-60 (Hsp60); tychronic acid; Streptococcus pneumoniae pneumolysin; bacterial pili; RS (respiratory syncytial) virus coat protein, and the like.
  • LPS lipopolysaccharides
  • Hsp60 bacterial heat shock protein-60
  • tychronic acid Streptococcus pneumoniae pneumolysin
  • bacterial pili RS (respiratory syncytial) virus coat protein, and the like.
  • TLR4 ligands also include monophosphoryl lipid A synthetic (MPLA, Invivogen) and phosphorylated hexaacyl disaccharides (PHAD, Avanti Polar Lipids), as well as other synthetic TLR4 agonists.
  • MPLA monophosphoryl lipid
  • TLR-7/8 ligand TLR-7/8 ligand
  • TLR-7 ligands are known, for example the adenine analogue CL264, the guanosine analogue loxoribine, or, preferably, the imidazoquinoline compounds (resiquimod, GardiquimodTM or imiquimod (4-amino-1 -isobutyl-1H-imidazole[4,5-c]quinoline (4-amino-1-isobutyl-1H-imidazol[4,5-c]chinolin)).
  • TLR-8 agonists are known to have similar biological effects to TLR-7 agonists and can therefore also or alternatively be used. Examples of TLR-8 agonists are single-stranded RNA or E. coli RNA.
  • Exemplary TLR-7/8 ligands are thiazoloquinoline compound CL075, imidazoquinoline compound R848, or water-soluble R848 imidazoquinoline compound CL097, thymidine homopolymer phosphorothioate ODN (poly(dT)).
  • TLR-9 ligand examples include CpG oligodeoxynucleotides and the like.
  • TLR-3 ligand TLR-4 ligand, TLR-7/8 ligand and TLR-9 ligand are preferred.
  • the TLR ligand may be naturally derived or synthetically obtained.
  • Fuscoporia obliqua is a cold-resistant mushroom that is widely distributed in cold regions such as central Europe, Siberia, China, and northern Japan. It parasitizes birch trees such as white birch and birch, and grows on the sap of those trees. Kabanoanatake is known to have physiological activities such as antitumor and hypoglycemic effects, and chaga is a sclerotium of a fungus called Kabanoanatake in Japan, which is parasitic on white birch trees and has excellent cold resistance.
  • chaga contains more ⁇ -glucan, which has an immunostimulating effect
  • SOD superoxide dismutase
  • SOD is said to be about 30 times that of Agaricus and Yamabushi mushroom. It has also been found to contain a wide variety of other physiologically active substances, and has been found to have an antitumor effect, an effect on chronic gastritis and gastric ulcer, and a pedigree effect.
  • Coriolus versicolor belongs to the Basidiomycota family and the Agaricaceae family. It is widely distributed worldwide, with over 120 strains identified in the forest temperature zones of Asia, Europe and North America. Versicolor versicolor has been reported to have immunomodulatory, anticancer, antibacterial, and antiviral effects.
  • Extraction methods and extraction conditions for the extracts of Betula anatake and Versicolor versicolor are not particularly limited. A known extraction method can be used. If the raw material is a liquid culture of mycelium, the material may be dried, cut, and pulverized for extraction. If the raw material is a fruiting body or mycelium, it may be used as it is for extraction, or a processed product after cutting and pulverization may be used for extraction.
  • the solvent used for solvent extraction is not particularly limited, and examples include water, lower alcohols such as methanol and ethanol, alcohols such as polyhydric alcohols such as propylene glycol and 1,3-butylene glycol, and acetone. Examples include ketones, diethyl ether, dioxane, acetonitrile, esters such as ethyl acetate, xylene, hexane, etc.
  • the organic solvent may be an aqueous solution. Among them, water, or acetone, ethanol, methanol, or an aqueous solution thereof is preferable, and when used in the food field, water is more preferable because a step of removing solvents harmful to food is unnecessary.
  • the concentration of the organic solvent in the aqueous solution is preferably 10% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 30% or more, preferably 90% or less, preferably 70% or less, preferably 50% or less. Any one of these solvents may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • the temperature during extraction is not particularly limited as long as it is a temperature at which an extract can be obtained with each solvent.
  • the obtained extract (or its purified product or concentrate) can be used as it is, or it may be dried and used as a powder, or a method of powdering by subjecting it to a freeze-drying treatment.
  • it may be pulverized according to a known method such as a method of adding an excipient such as dextrin, corn starch, gum arabic and pulverizing by spray drying. Further, after that, if necessary, it may be dissolved in pure water, ethanol, or the like and used.
  • a known method such as a method of adding an excipient such as dextrin, corn starch, gum arabic and pulverizing by spray drying. Further, after that, if necessary, it may be dissolved in pure water, ethanol, or the like and used.
  • lactic acid bacteria are used as immunogenic agents.
  • Lactic acid bacteria is a general term for bacteria that produce lactic acid by decomposing sugars such as glucose and lactose in order to obtain the energy necessary for growth. Based on the difference in cell shape, they are classified into rod-shaped or cylindrical lactobacilli and spherical lactic acid cocci. Bifidobacterium also produces lactic acid and contributes to human health, so it is considered to be included in the broad definition of lactic acid bacteria.
  • Lactic acid bacteria include, for example, bacteria belonging to the genus Enterococcus, bifidobacteria (for example, Bifidobacterium longum BR-108: Accession number: Bifidobacterium longum BR-108 strain deposited under NITE P-1317), etc. is.
  • a fungus belonging to the genus Enterococcus is, for example, Enterococcus faecalis.
  • Enterococcus faecalis examples include strains such as Enterococcus faecalis EC-12 strain, ATCC19433, ATCC14508, ATCC23655, IFO16803, and IFO16804, and mutants thereof.
  • mutant strain refers to a specific strain that has been mutated by a method well known to those skilled in the art to the extent that it does not change its properties, or confirmed by a person skilled in the art to be equivalent to it. It means to include what is possible.
  • Enterococcus faecalis EC-12 strain (Enterococcus faecalis EC-12) was deposited on February 25, 2005 (original deposit date) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary ( It has been deposited at Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8566).
  • the accession number is FERM BP-10284.
  • Lactic acid bacteria used as an immunogenic factor can be viable and/or dead cells, but dead cells are preferably used from the viewpoint of storage stability of the composition.
  • Heat-sterilized cells obtained by sterilization by the heat treatment means of are used.
  • the heat-sterilized cells are collected from the culture obtained by culturing the above-mentioned lactic acid bacteria according to a conventional method by a method such as filtration or centrifugation, washed with water, suspended in water etc. and heat-treated. If necessary, it can be prepared by concentration and drying. Alternatively, it may be prepared by baking or steaming the cells.
  • the heat-treated sterilized bacterial powder of the EC-12 strain is commercially available under the trade name "EC-12” (manufactured by Combi Co., Ltd.) or "La Flora EC-12” (manufactured by Ichimaru Farcos Co., Ltd.). there is therefore, in the present invention, such commercially available products may be used as lactic acid bacteria used as immunogenic factors.
  • Houttuynia cordata extract used in the present invention is obtained by, for example, using the flowering aerial part (crude drug name: Juyaku) of Houttuynia cordata Thunb. It was obtained by extracting As the Houttuynia cordata extract used in the following examples, Houttuynia cordata DXP100 (Ichimaru Farcos, an extract obtained by adding the aerial part of Houttuynia cordata to water and extracting it, the quercitrin content was 0.15% or more) was used.
  • dosage form dosage form, dosage form, etc. of composition for activating immune response
  • its dosage form is not particularly limited, and can be liquid, solid, semi-solid, or semi-liquid, preferably in liquid form.
  • These dosage forms can be easily manufactured based on methods known to those skilled in the art, employing appropriate pharmaceutical carriers as necessary.
  • Solid dosage forms include, for example, powders, granules, tablets and capsules containing at least an immunogenic factor and proteoglycan.
  • semi-solid or semi-liquid dosage forms include ointments, lotions, creams and gels.
  • solvents used include water, phosphate-buffered saline, Ringer's solution, dextrose solution, serum-containing solutions, Hank's solution, other aqueous physiologically balanced solutions, oils, esters and Glycols may be mentioned.
  • Solvents can contain suitable auxiliary substances required to approximate the physiological conditions of the recipient, for example, by enhancing chemical stability and isotonicity. Suitable auxiliary substances include, for example, sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, potassium chloride, calcium chloride and other substances used to produce phosphate, Tris and bicarbonate buffers. included.
  • Compositions of the invention may be sterilized by conventional methods and/or may be lyophilized.
  • administration routes of the composition of the present embodiment include, but are not limited to, oral, topical, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, intraperitoneal, transmucosal, transdermal, and the like.
  • Methods of administration of the composition include, for example, subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular or intraperitoneal direct injection; and oral administration, etc., based on known methods.
  • Subjects for administration of the composition include all animals, preferably vertebrates such as mammals and birds, and more preferably mammals. Further, said mammalian subjects are, for example, humans, but also livestock (for example, chickens, pigs, horses, goats, sheep and cattle), pet animals (for example, cats, dogs, hamsters, rabbits and guinea pigs). pet animals) may also be subjects.
  • livestock for example, chickens, pigs, horses, goats, sheep and cattle
  • pet animals for example, cats, dogs, hamsters, rabbits and guinea pigs. pet animals
  • a composition for activating an immune response according to this embodiment is generally administered to a subject, such as an animal, including humans, in an amount and frequency sufficient to bring about strengthening of the immune system.
  • the concentration of the immunogenic factor contained in the composition of this embodiment may be appropriately set according to the type of administration subject.
  • the concentration of the immunogenic agent in the composition (1 g) is preferably in the range of, for example, 3 ⁇ g/g or more and 50 mg/g or less.
  • the upper limit of the concentration of the immunogenic agent is e.g. or less, or 10 mg/g or less.
  • the lower limit of the concentration of the immunogenic factor can be, for example, 3 ⁇ g/g or more, 10 ⁇ g/g or more, 25 ⁇ g/g or more, 50 ⁇ g/g or more, 75 ⁇ g/g or more, or 100 ⁇ g/g or more.
  • Administration at such a dose is effective because sufficient immune response activity can be obtained while maintaining safety to the living body without adversely affecting the subject due to excessive immune response. be.
  • the concentration of proteoglycan in the composition (1 g) is, for example, within the range of 0.1 ⁇ g/g or more. Moreover, from the viewpoint of reducing the volume (liquid volume) of the composition, it is preferable that the concentration of proteoglycan contained in the composition is as high as possible.
  • the composition may contain the immunogenic factor and proteoglycan together in the composition, or may contain each active ingredient separately in combination.
  • an immunogenic agent and (b) a proteoglycan for activation of an immune response can be administered simultaneously or separately in sequence.
  • the method of administration of (a) and (b) may be simultaneous or sequential, preferably (a) and (b) are administered sequentially (or separately). This is provided by providing (a) and (b) in a single unit dosage form to be taken together or as separate entities (e.g., in separate containers) administered at the same time or at staggered intervals. means to get This time difference may be between 1 hour and 1 week, preferably between 12 hours and 3 days.
  • the proteoglycan can be administered by a different administration method than the immunogenic agent.
  • Sequential administration means that the active ingredients of this embodiment are in different dosage forms (one drug is a tablet or capsule, another is a sterile liquid) and/or different dosing schedules, e.g. It is particularly useful when the ingredients are administered with the active ingredient administered less frequently, such as once a week, once every two weeks, or once every three weeks.
  • the agent or composition of this embodiment Since the agent or composition of this embodiment has a remarkable effect of regulating or promoting immune response, for example, the agent or composition of this embodiment is used to reduce or suppress a normal metabolic immune response in a living body. , useful in treating patients with diseases or disorders.
  • the agent or composition of the present embodiment can be used therapeutically or prophylactically for subjects such as animals or humans who are at increased risk of suffering from diseases, disorders, or disorders caused by conditions that adversely affect the immune system. can be used to treat
  • composition of the present embodiment has the effect of synergistically activating humoral immunity and cell-mediated immunity.
  • immunogenic factors and proteoglycans can be used as vaccines because they exhibit distinct adjuvant effects.
  • a vaccine refers to a pharmaceutical composition intended to prevent or treat a specific disease, disorder or disorder by containing the pathogen itself or a specific antigen derived from the pathogen.
  • a pharmaceutical composition is a concept that includes not only pharmaceutical compositions for humans but also pharmaceutical compositions for animals. The type of antigen contained in the vaccine is selected according to the specific disease to be prevented or treated.
  • the vaccine according to the present embodiment can obtain a very high immunostimulatory activity and a high neutralizing antibody titer even with a small amount of immunostimulator and antigen. Since the amount of adjuvant and the amount of antigen can be reduced, the vaccine does not cause excessive stimulation to the living body, is highly safe, and is inexpensive in terms of cost.
  • composition of the present embodiment can also be used, for example, as an additive for food and drink.
  • a food and drink composition with enhanced immune response activity can be provided.
  • Food and drink compositions with enhanced immune response activity include food and drink for specified health use, food and drink with functional claims, and food and drink with nutrient function labeled as immunostimulating, activating, or boosting immunity. is mentioned.
  • Example 1 Effects of various immunogenic factors and proteoglycans on cytokine production in mouse macrophages (experimental materials)
  • ⁇ Proteoglycan proteoglycan, derived from salmon nasal cartilage (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product code: 162-22131)
  • TLR2 ligand Pam3-Cys-Ser-(Lys)4/3HCL
  • ALX-165-066-M002 (Enzo Life Science)
  • TLR3 ligand Poly (I:C)
  • ALX-746-021-M005 Enzo Life Science
  • TLR4/NLR ligand LPS
  • the mouse macrophage cell line RAW264.7 was cultured at a final concentration of 100 U/mL penicillin G, 100 ⁇ g/mL streptomycin sulfate, 100 ⁇ g/mL amphotericin B and 10% fetal bovine serum in DMEM. Culture was performed at ⁇ 10 6 /well. After culturing for one day in a CO 2 incubator at 37 ° C., the culture medium was removed from each well, and the immunogenic factors described above (each TLR ligand, dectin 1 ligand, birch anatake extract or versicolor extract) were added as test samples to new culture medium.
  • the immunogenic factors described above each TLR ligand, dectin 1 ligand, birch anatake extract or versicolor extract
  • PG proteoglycan
  • a culture medium alone and a culture medium to which only PG was added were used. After culturing for 24 hours in a CO 2 incubator at 37° C., after confirming that the cells were not dead with a microscope, the culture solution was recovered from each well. The amounts of TNF- ⁇ , IL-6, IL-10, IL-1 ⁇ and IFN- ⁇ contained in the collected culture supernatant after centrifugation at 4° C. at 3000 rpm for 20 minutes were measured by ELISA.
  • the ELISA used in the measurement is as follows.
  • ThermoFisher ⁇ IL-6 BMS603-2
  • ThermoFisher ⁇ IL-10 BMS614INST
  • ThermoFisher - IL-1 ⁇ BMS6002
  • ThermoFisher - IFN- ⁇ A47435, ThermoFisher
  • the vertical axis of the graph indicates the concentration (pg/mL) of various cytokines measured by the ELISA method.
  • mice Mouse bone marrow-derived dendritic cells (myeloid dendritic cells (mDC)) were prepared by the following procedure. Bone marrow cells were harvested by removing bone marrow from femurs of C57BL/6 mice and destroying red blood cells with hemolysis buffer. Bone marrow cells were plated 2 ⁇ 10 in RPMI1640 medium containing 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 ⁇ g/mL streptomycin, 0.1% 2-mercaptoethanol, and recombinant mouse GM-CSF (2-20 ng/mL). The cells were cultured at a cell density of 5 cells/mL for 7 days to differentiate into myeloid dendritic cells (mDC).
  • mDC myeloid dendritic cells
  • the myeloid dendritic cells (mDC) prepared above were added to a final concentration of 100 U/mL penicillin G, 100 ⁇ g/mL streptomycin sulfate, 100 ⁇ g/mL amphotericin B, and 10% fetal bovine serum. Culture was performed at 2 ⁇ 10 6 /well in DMEM. After one day of culture in a CO 2 incubator at 37° C., the culture medium was removed from each well, and lactic acid bacterium Enterococcus faecalis EC-12 (10 ⁇ g/mL) alone or proteoglycan (250 ⁇ g/mL) was added to the new culture medium as a test sample. mL).
  • a culture medium alone and a culture medium to which only PG was added were used as a control. After culturing for 48 hours in a CO 2 incubator at 37° C., after confirming that the cells were not dead under a microscope, the culture solution was collected from each well. The amounts of TNF- ⁇ , IL-6 and IL-12p70 contained in the collected culture supernatant after centrifugation at 4° C. at 3000 rpm for 20 minutes were measured by ELISA.
  • the ELISA used in the measurement is as follows. ⁇ TNF- ⁇ : A43658, ThermoFisher ⁇ IL-6: BMS603-2, ThermoFisher - IL-12p70: BMS6004, ThermoFisher
  • IL-12 is a heterodimeric protein composed of IL-12p35 and IL-12p40, and is known as an inflammatory cytokine like TNF- ⁇ and IL-6. IL-12 heterodimers are specifically referred to as IL-12p70.
  • IL-12 is produced primarily by phagocytes and dendritic cells that have phagocytosed bacteria. IL-12 is thought to stimulate NK cells, induce differentiation of naive T cells into Th1 cells, and confer resistance to bacteria and viruses. As shown in Table 4 and Figures 10-12, EC-12 was able to promote the production of these cytokines and activate dendritic cells, and this effect was enhanced by PG.
  • Example 3 Influence of birch anatake extract and proteoglycan on cytokine production of dendritic cells Using a 24-well culture plate, the mouse bone marrow-derived myeloid dendritic cells (mDC) prepared in Example 2 were added to the final concentration. Culture was performed at 2 ⁇ 10 6 /well in DMEM containing 100 U/mL penicillin G, 100 ⁇ g/mL streptomycin sulfate, 100 ⁇ g/mL amphotericin B and 10% fetal bovine serum.
  • DMEM mouse bone marrow-derived myeloid dendritic cells
  • PG proteoglycan
  • Sterilized Listeria monocytogenes HK-LM was added together with either H. cordata extract or birch extract (500 ⁇ g/mL each). As a control, only HK-LM was added. After culturing for 48 hours in a CO 2 incubator at 37° C., after confirming that the cells were not dead under a microscope, the culture solution was recovered from each well. The amounts of TNF- ⁇ , IL-6 and IL-12p70 contained in the collected culture supernatant after centrifugation at 4° C. at 3000 rpm for 20 minutes were measured by ELISA.
  • the birch extract enhanced the production of TNF- ⁇ and IL-6 by HK-LM, a ligand that activates immune responses primarily through TLR-2. , the effect of which was further enhanced by PG.
  • IL-12p70 was hardly secreted by HK-LM alone, but IL-12p70 production in dendritic cells was promoted by co-adding a Betula anatake extract, especially a Betula anatake extract and proteoglycan. Do you get it.
  • Example 4 Influence of oral administration of Betula annuus extract on Listeria infection in mice (natural immunity)
  • Six-week-old female C57BL/6 mice were infected by intraperitoneal injection (ip) with 1 ⁇ 10 6 Listeria monocytogenes per mouse according to the experimental method shown in FIG. let me Mice were fed test samples with or without 3 mg of Betula nut extract per day from 9 days before infection to 3 or 4 days after infection.
  • spleens and livers were removed from the mice 3 days after infection.
  • the excised organs were homogenized with a homogenizer in the presence of PBS (phosphate buffered saline).
  • PBS phosphate buffered saline
  • 0.1 mL of the homogenized product (liquid) was applied to a tryptic soy agar plate medium. After the application, the cells were cultured at 37°C for 24 hours. After the culture, the number of bacteria present in the medium was counted. The measured number was defined as the viable cell count. From another group of mice, spleens were removed 4 days after infection, cultured in the same manner as in Example 3, and heat-sterilized Listeria monocytogenes (HK-LM) was added to the culture medium for immunization. stimulated. After culturing for 48 hours in a CO 2 incubator at 37° C., after confirming that the cells were not dead under a microscope, the culture solution was collected from each well. The amounts of TNF- ⁇ , IL-6 and IL-12p70 contained in the collected culture supernatant after centrifugation at 4° C. at 3000 rpm for 20 minutes were measured by ELISA.
  • Table 6 shows the results of measuring the number of bacteria present in the spleen and liver. There was a tendency for the number of infected bacteria to decrease in the organs of mice fed with the test material containing the birch anatake extract.
  • Control means a sample taken from a mouse fed with a sample not containing the Betula extract
  • Extract means a sample taken from a mouse fed with a sample containing the Betula extract.
  • TNF- ⁇ , IL-6 and IL-12p70 were produced by HK-LM, a ligand that activates the immune response mainly through TLR-2, was enhanced by oral administration of Betula oleracea extract. .
  • Example 5 Effect of oral administration of Betula anatake extract on Listeria infection in mice (acquired immunity)
  • Six-week-old female C57BL/6 mice were infected intraperitoneally (ip) with 1 ⁇ 10 5 Listeria monocytogenes (LM) per mouse according to the experimental protocol shown in FIG. After 4 weeks, the cells were infected again with 1 ⁇ 10 6 LM. Beginning 7 days before the first infection and for the duration of the experiment, mice were fed with test samples containing or without control samples containing 3 mg of birch extract per day. For one group of mice, spleens and livers were removed 2 days after infection. The excised organs were homogenized with a homogenizer in the presence of PBS (phosphate buffered saline).
  • PBS phosphate buffered saline
  • 0.1 mL of the homogenized product (liquid) was applied to a tryptic soy agar plate medium. After the application, the cells were cultured at 37°C for 24 hours. After the culture, the number of bacteria present in the medium was counted. The measured number was defined as the viable cell count. From another group of mice, spleens were taken out immediately before the second infection, cultured in the same manner as in Example 3, and heat-sterilized Listeria monocytogenes (HK-LM) was added to the culture medium. to stimulate the immune system. As a control, a similar experiment was performed using mice that were not first infected with LM.
  • HK-LM heat-sterilized Listeria monocytogenes
  • the culture solution was collected from each well.
  • the amounts of TNF- ⁇ , IL-6 and IL-12p70 contained in the collected culture supernatant after centrifugation at 4° C. at 3000 rpm for 20 minutes were measured by ELISA.
  • Formulation Example 1 Tablet A 200 mg tablet having the following component composition containing 5 mg of proteoglycan per tablet was produced by thoroughly mixing each component and then tableting. Proteoglycan 5mg 10 mg of birch extract Lactose 127mg Starch 45mg Carboxymethylcellulose 10mg Talc 2mg Magnesium stearate 1 mg Total 200mg/tablet
  • Formulation Example 2 Capsules 100 mg capsules having the following component composition containing 20 mg of proteoglycan per capsule were produced by filling the capsules after each component was well mixed. Proteoglycan 20mg Versicolor versicolor extract 10 mg Lactose 43mg 25 mg of starch Magnesium stearate 2mg Total 100mg/capsule
  • the present invention has industrial applicability in that it can provide novel uses of proteoglycans as immunomodulators.

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Abstract

【課題】樹状細胞やマクロファージなどの免疫細胞に作用する種々の免疫原性因子によって誘導される免疫応答に与えるプロテオグリカンの影響を検討し、免疫応答調節に有用な剤又は組成物を提供する。 【解決手段】プロテオグリカンを有効成分として含む免疫応答調節のための剤。

Description

プロテオグリカンを含む免疫応答調節剤 クロスリファレンス
　本出願は、日本国において、２０２２年１月１１日に出願された特願２０２２－００２１７１号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容はすべて、参照によりそのまま本明細書に援用される。
　本発明は、プロテオグリカンを含む免疫応答調節剤など（ヒト等に投与するための組成物も含む）、に関する。
　プロテオグリカン（以下、「ＰＧ」と称する場合がある。）は複合糖質の一つで、コアタンパク質とそれに結合するグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）からなる。ＰＧは、細胞外マトリクスの主な構成要素として、皮膚、軟骨、骨、血管壁などに存在し、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどと共に細胞増殖や接着に関わっている。ＰＧを構成するコンドロイチン硫酸と共に、ＰＧは関節軟骨の主成分であり、高齢者の関節障害の予防に重要であると考えられている。さらに、ＰＧが、熱処理した細菌で刺激したマクロファージの炎症反応を抑制すること（非特許文献１参照）、ＰＧの投与が大腸炎の進行を抑制することも報告されている（非特許文献２参照）。
　特許文献１には、免疫系に対するＰＧの薬理作用が開示されているが、ＰＧが有する作用の全容はいまだ明らかでない。
Ｈｉｒｏｓｈｉ　Ｓａｓｈｉｎａｍｉ，Ｋｅｉｉｃｈｉ　Ｔａｋａｇａｋｉ，Ａｋｉｏ　Ｎａｋａｎｅ，Ｓａｌｍｏｎ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２００６；３５１（４）：１００５－１０ Ｔｏｓｈｉｈｉｔｏ　Ｍｉｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓａｌｍｏｎ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｍｏｕｓｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｏｌｉｔｉｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｏｘｐ３＋　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０；４０２（２）：２０９－１５
特開２００７－１３１５４８
　そこで、本発明が解決しようとする課題は、樹状細胞やマクロファージなどの免疫細胞に作用する種々の免疫原性因子によって誘導される免疫応答に与えるプロテオグリカンの影響を検討し、免疫応答調節に有用な剤、当該剤を含有する組成物など、を提供することである。
　本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであって、プロテオグリカンが種々の免疫原性因子と協調してその活性を増強又は抑制することにより、免疫応答を調節する作用を有することの発見に基づく。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
[１]プロテオグリカンと、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）ＥＣ－１２株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０２８４）の菌体成分及び／又はBR-108株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ－１３１７で寄託されているビフィドバクテリウム・ロンガムＢＲ－１０８株 ）とを、一緒に又は別々に組み合わせて含む、免疫応答を活性化するための組成物。
[２]免疫応答が、自然免疫及び／又は獲得免疫を介して活性化される[１]に記載の組成物。
　本発明によれば、マクロファージなどの免疫細胞に作用する種々の免疫原性因子によって誘導される免疫応答を調節するために有用な剤、当該剤を含む組成物など、を提供することができる。
図１は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（Ｐａｍ、ＬＰＳ、ＯＤＮ又はＺｙｍｏｓａｎ）を添加したとき、培地中に分泌されたＴＮＦ－α量を測定した結果である。 図２は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（ＬＰＳ又はＺｙｍｏｓａｎ）を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－６量を測定した結果である。 図３は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（Ｐａｍ、ＬＰＳ、ＯＤＮ又はＺｙｍｏｓａｎ）を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１０量を測定した結果である。 図４は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（Ｐａｍ、ＬＰＳ、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ又はＺｙｍｏｓａｎ）を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１β量を測定した結果である。 図５は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（カバノアナタケ抽出物又はカワラタケ抽出物）を添加したとき、培地中に分泌されたＴＮＦ－α量を測定した結果である。 図６は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（カバノアナタケ抽出物又はカワラタケ抽出物）を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－６量を測定した結果である。 図７は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（カバノアナタケ抽出物又はカワラタケ抽出物）を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１０量を測定した結果である。 図８は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（カバノアナタケ抽出物又はカワラタケ抽出物）を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１β量を測定した結果である。 図９は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウスマクロファージ細胞の培養液中に各種免疫原性因子（Ｐａｍ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、ＣｐＧＤＮＡ、Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ、Ｚｙｍｏｓａｎ、カバノアナタケ抽出物又はカワラタケ抽出物）を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１β量を測定した結果である。 図１０は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウス骨髄由来の樹状細胞の培養液中に乳酸菌エンテロコッカス・フェカリスＥＣ－１２を添加したとき、培地中に分泌されたＴＮＦ－α量を測定した結果である。 図１１は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウス骨髄由来の樹状細胞の培養液中に乳酸菌エンテロコッカス・フェカリスＥＣ－１２を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－６量を測定した結果である。 図１２は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウス骨髄由来の樹状細胞の培養液中に乳酸菌エンテロコッカス・フェカリスＥＣ－１２を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１２ｐ７０量を測定した結果である。 図１３は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウス骨髄由来の樹状細胞の培養液中に被験試料として加熱殺菌処理したリステリア・モノサイトゲネス（ＨＫ－ＬＭ）と、ドクダミ（Ｈ．ｃｏｒｄａｔａ）抽出物又はカバノアナタケ抽出物と、を添加したとき、培地中に分泌されたＴＮＦ－α量を測定した結果である。 図１４は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウス骨髄由来の樹状細胞の培養液中に被験試料として加熱殺菌処理したリステリア・モノサイトゲネス（ＨＫ－ＬＭ）と、ドクダミ（Ｈ．ｃｏｒｄａｔａ）抽出物又はカバノアナタケ抽出物と、を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１２ｐ７０量を測定した結果である。 図１５は、ＰＧの存在又は非存在下において、マウス骨髄由来の樹状細胞の培養液中に被験試料として加熱殺菌処理したリステリア・モノサイトゲネス（ＨＫ－ＬＭ）と、ドクダミ（Ｈ．ｃｏｒｄａｔａ）抽出物又はカバノアナタケ抽出物と、を添加したとき、培地中に分泌されたＩＬ－６量を測定した結果である。 マウスのリステリア菌感染に対するカバノアナタケ抽出物の経口投与の影響（自然免疫）を調べた実験プロトコルを示す。 図１７は、カバノアナタケ抽出物を添加又は非添加の飼料をマウスに給餌しながらリステリア菌を感染させた後、４日目の脾臓を取り出して培養したとき、培地中に分泌されたＩＦＮ－γ量を測定した結果である。 図１８は、カバノアナタケ抽出物を添加又は非添加の飼料をマウスに給餌しながらリステリア菌を感染させた後、４日目の脾臓を取り出して培養したとき、培地中に分泌されたＴＮＦ－α量を測定した結果である。 図１９は、カバノアナタケ抽出物を添加又は非添加の飼料をマウスに給餌しながらリステリア菌を感染させた後、４日目の脾臓を取り出して培養したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１２ｐ７０量を測定した結果である。 マウスのリステリア菌感染に対するカバノアナタケ抽出物の経口投与の影響（獲得免疫）を調べた実験プロトコルを示す。 図２１は、カバノアナタケ抽出物を添加又は非添加の飼料をマウスに給餌しながらリステリア菌を感染させた後、４週間後の脾臓を取り出して培養したとき、培地中に分泌されたＩＦＮ－γ量を測定した結果である。 図２２は、カバノアナタケ抽出物を添加又は非添加の飼料をマウスに給餌しながらリステリア菌を感染させた後、４週間後の脾臓を取り出して培養したとき、培地中に分泌されたＴＮＦ－α量を測定した結果である。 図２３は、カバノアナタケ抽出物を添加又は非添加の飼料をマウスに給餌しながらリステリア菌を感染させた後、４週間後の脾臓を取り出して培養したとき、培地中に分泌されたＩＬ－１２ｐ７０量を測定した結果である。
　次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。
（免疫応答調節のための剤）
　本明細書において、「免疫応答調節のための剤」とは、低下した免疫応答を修復すること、異常な免疫応答を抑制すること、及び正常な免疫応答を増進すること、のうちの１つ又は複数の作用を有する任意の薬剤である。免疫応答は、例えば、液性（抗体介在性）免疫、細胞性免疫、獲得免疫、自然免疫のうちの１つ又は複数を包含する。１つの実施形態において、このような剤を免疫原性因子と組み合わせることで、免疫応答を活性化するための組成物が提供される。「免疫原性因子」は、ヒトや動物の免疫系を刺激することのできるあらゆる因子を意味する。このような免疫原性因子には、例えば、病原体関連パターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンドが含まれる。ＰＲＲとしては、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、Ｎｏｄ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体、Ｃ型レクチン受容体、スカベンジャー受容体、及び補体受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる構造的に保存された分子を認識する１回膜貫通ドメインの非触媒性受容体のクラスである。ＰＡＭＰは、微生物上に存在して、宿主分子とは識別される。ＴＬＲは全ての脊椎動物に存在し、ヒトではＴＬＲ１～１０を含む。ＴＬＲリガンドは、これらのＴＬＲに結合する化合物であって、病原体又は細胞ストレスなどの宿主生存に対する脅威に関連する病原性分子を含む。例示的な病原性分子には、リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタンパク質、リポアラビノマンナン、フラゲリン、二本鎖ＲＮＡ、及びＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ島が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
　Ｃ型レクチン受容体としては、デクチン１、デクチン２、ＤＥＣ２０５、Ｍｉｎｃｌｅ、ＤＣ－ＳＩＧＮ等が挙げられる。これらの中でもデクチン１は、樹状細胞やマクロファージに発現する膜タンパク質であり、（１→３）－β－Ｄ－グルカンの認識と自然免疫活性化及び真菌に対する防御因子として極めて重要な受容体であることが知られている。本実施形態の剤又は組成物は、プロテオグリカンを有効成分として含むことにより、例えば、上述したような受容体を介する様々な免疫応答を調節し、又はこれらの受容体リガンドと協調して免疫応答を促進する作用を有する。
（プロテオグリカン）
　プロテオグリカン（ＰＧ）は、コアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下ＧＡＧと表す。）と呼ばれる糖鎖が共有結合した糖タンパク質である。ＰＧは、細胞外マトリックスの主要構成成分の一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。ＧＡＧ鎖は分岐を持たない長い直鎖構造を持つ。多数の硫酸基とカルボキシル基を持つため負に荷電しており、ＧＡＧ鎖はその電気的反発力のために延びた形状をとる。また、ＰＧは、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持することができる。ＰＧに含まれる多数のＧＡＧ鎖群はスポンジのように水を柔軟に保持しながら、弾性や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。
　ＰＧのコアタンパク質はマトリックス中の様々な分子と結合する性質をもつ。軟骨ＰＧの場合、Ｎ末端側にヒアルロン酸やリンクタンパク質との結合領域を持ち、これらの物質と結合すること、同一分子間で会合することもある。Ｃ末端にはレクチン様領域、ＥＧＦ様領域などを持ち様々な他の分子と結合する。この性質により、ＰＧはそれぞれの組織にあった構造を築く。
　サケ鼻軟骨由来のＰＧは、サケの鼻軟骨から抽出して得られたＰＧである。ここで、サケは、例えばサケ属（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）に属する魚であるが、好ましくは免疫応答を効率的に調節する観点で学名が「Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｋｅｔａ」のサケが選択される。本実施形態の剤又は組成物に含まれるプロテオグリカンは、例えば、公報（日本特許第６３１７０５３号公報）に記載の方法で作製される。また、本実施形態の剤を含有する組成物（１ｇ）中のプロテオグリカンの含有量は、例えば免疫応答を有効に調節しうる観点から、下限は好ましくは０．１μｇ／ｇ以上、より好ましくは１００μｇ／ｇ以上、更に好ましくは１ｍｇ／ｇ以上、である。本明細書において、免疫応答を調節するために有効なプロテオグリカンの量、又は「有効量」とは、単回用量または複数回用量を被験体へ投与した際に、免疫応答の調節作用において、そのような処置を行わない場合に見込まれる状態を超えて有効であるプロテオグリカンの量のことをいう。
（免疫応答を活性化するための組成物）
　１つの実施形態における免疫応答を活性化するための組成物は、免疫原性因子とプロテオグリカンとを、一緒に又は別々に組み合わせて含む。免疫原性因子としては、例えば、ＴＬＲリガンド、デクチン１リガンド、カバノアナタケ抽出物、カワラタケ抽出物、乳酸菌の菌体成分、植物抽出物（例えばドクダミ抽出物）、などが挙げられる。具体的には、ＴＬＲリガンドには、リポタンパク質及びリポ多糖などのＴＬＲ２リガンド又はＴＬＲ４リガンド、二本鎖ＤＮＡなどのＴＬＲ３リガンド、タンパク質性リガンドであるフラジェリンなどのＴＬＲ５リガンド、イミダゾキノリン化合物であるイミキモド、レシキモド（Ｒ８４８）、一本鎖ＲＮＡなどのＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ８リガンド及び、核酸性リガンドであるＣｐＧ配列などのＴＬＲ９リガンド等が含まれる。
　さらに具体的には、以下が挙げられる：
（ＴＬＲ２リガンド）
　ＴＬＲ２リガンドは、合成のトリアシル化およびジアシル化リポペプチドを含む。ＴＬＲ２リガンドの非限定的な例は、ＦＳＬ－１（マイコプラズマ・サリバリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）１に由来する合成リポタンパク質）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ（トリパルミトイル－Ｓ－グリセリルシステイン）、又はＳ－［２，３－ビス（パルミトイルオキシ）－（２ＲＳ）－プロピル］－Ｎ－パルミトイル－（Ｒ）－システインであり、ここで「Ｐａｍ３」は「トリパルミトイル－Ｓ－グリセリル」である。Ｐａｍ３Ｃｙｓの誘導体もまた適切なＴＬＲ２アゴニストであり、ここで誘導体には、限定するものではないが、以下が含まれる：Ｓ－［２，３－ビス（パルミトイルオキシ）－（２－Ｒ，Ｓ）－プロピル］－Ｎ－パルミトイル－（Ｒ）－Ｃｙｓ－（Ｓ）－Ｓｅｒ－（Ｌｙｓ）４－ヒドロキシ三塩酸塩；Ｐａｍ３Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ａｌａ；ＰａＭ３Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－（Ｌｙｓ）４；Ｐａｍ３Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｇｌｙ；Ｐａｍ３Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ；Ｐａｍ３Ｃｙｓ－Ｓｅｒ；ＰａＭ３Ｃｙｓ－ＯＭｅ；Ｐａｍ３Ｃｙｓ－ＯＨ；ＰａｍＣＡＧ、パルミトイル－Ｃｙｓ（（ＲＳ）－２，３－ジ（パルミトイルオキシ）－プロピル）－Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＯＨなど。適切なＴＬＲ２アゴニストの別の非限定的な例は、Ｐａｍ２ＣＳＫ４；ＰａＭ２ＣＳＫ４（ジパルミトイル－Ｓ－グリセリルシステイン－セリン－（リシン）４；またはＰａｍ２Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－（Ｌｙｓ）４）であり、合成のジアシル化リポペプチドである。例えば、乳酸菌の細胞壁を構成するペプチドグリカンやテイコ酸などもＴＬＲ２を介して様々な免疫応答を引き起こすとも考えられている。
（ＴＬＲ３リガンド）
　ＴＬＲ３リガンドは、天然の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、合成ｄｓＲＮＡ、合成ｄｓＲＮＡアナログなどを含む。合成ｄｓＲＮＡアナログの例示的で非限定的な例は、ポリリボイノシン及びポリリボシチジン酸（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、ポリアデノシン－ポリウリジル酸（ＰｏｌｙＡＵ）、ポリＬ－リシンおよびカルボキシメチルセルロースで安定化したポリイノシン－ポリシチジン酸（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））等である。
（ＴＬＲ４リガンド）
　ＴＬＲ４リガンドには、天然に存在するリポ多糖（ＬＰＳ）、例えば、多種多様なグラム陰性菌由来のＬＰＳ；天然ＬＰＳの誘導体；合成ＬＰＳ；細菌熱ショックタンパク質－６０（Ｈｓｐ６０）；マンヌロン酸ポリマー；フラボリピン；タイクロン酸；肺炎レンサ球菌ニューモリシン；細菌性線毛；ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルスコートタンパク質などが含まれる。ＴＬＲ４リガンドには、モノホスホリルリピドＡ合成（ＭＰＬＡ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）及びリン酸化ヘキサアシル二糖（ＰＨＡＤ、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ社）、ならびに他の合成ＴＬＲ４アゴニストも含まれる。
（ＴＬＲ－７／８リガンド）
　いくつかのＴＬＲ－７リガンドが公知であり、例えば、アデニンアナログＣＬ２６４、グアノシンアナログであるロキソリビン、又は、好ましくは、イミダゾキノリン化合物（レシキモド、ガーディキモド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）（商標）またはイミキモド（４－アミノ－１－イソブチル－１Ｈ－イミダゾール［４，５－ｃ］キノリン（４－ａｍｉｎｏ－１－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ［４，５－ｃ］ｃｈｉｎｏｌｉｎ））など）である。ＴＬＲ－８アゴニストは、ＴＬＲ－７アゴニストと同様の生物学的効果を有することが公知であり、したがって、これもまた、または代替的に使用することができる。ＴＬＲ－８アゴニストの例は、一本鎖ＲＮＡまたは大腸菌ＲＮＡである。例示的なＴＬＲ－７／８リガンドは、チアゾロキノリン化合物ＣＬ０７５、イミダゾキノリン化合物Ｒ８４８、または水溶性Ｒ８４８イミダゾキノリン化合物ＣＬ０９７、チミジンホモポリマーホスホロチオアートＯＤＮ（ポリ（ｄＴ））である。
（ＴＬＲ－９リガンド）
　ＴＬＲ－９リガンドとしては、例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド等が挙げられる。
　中でも、ＴＬＲ－３リガンド、ＴＬＲ－４リガンド、ＴＬＲ－７／８リガンド及びＴＬＲ－９リガンドが好ましい。なお、ＴＬＲリガンドは、天然由来でも合成によって得られるものでもよい。
（カバノアナタケ抽出物及びカワラタケ抽出物）
　カバノアナタケ（Ｆｕｓｃｏｐｏｒｉａ　ｏｂｌｉｑｕａ）は、耐寒性のきのこで、中部ヨーロッパ、シベリア、中国、日本の北部地方等の寒冷地に広く分布している。シラカバやダケカンバ等のカバノキ類に多く寄生し、それらの樹木の樹液を養分にして生育し、その黒く硬い菌核はチャーガと呼ばれ、ロシアでは古くからお茶代わりに飲用されている。カバノアナタケは、抗腫瘍作用や血糖降下作用等の生理活性を有することが知られており、チャーガは白樺の木に寄生する、日本名カバノアナタケという耐寒性に優れたキノコの菌核である。また、近年の研究によりチャーガ（カバノアナタケ）は、これまでのキノコ類と比較して、免疫賦活作用を有するβ－グルカンや活性酸素除去能をもつＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）が豊富に含まれていることが確認されている。特にＳＯＤに関しては、アガリクスや山伏茸の約３０倍といわれている。またその他多種多様な生理活性物質が含まれていることが分かり、抗腫瘍作用、慢性胃炎や胃潰瘍に対する効果、血統効果作用があることが分かっている。
　カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）は、担子菌類及びサルノコシカケ科に属する。これは世界中に広く分布しており、アジア、欧州および北アメリカの森林温度帯において１２０以上の株が同定されている。カワラタケは、免疫調節、抗癌、抗菌、及び抗ウイルス効果を有することが報告されている。
　カバノアナタケ及びカワラタケから抽出物を抽出する際には、原料として、子実体、菌糸体、及び菌糸体の液体培養物からなる群から選択される１以上を用いるが、多量の抽出物を抽出でき、同一量の抽出溶媒等を用いた場合でも菌糸体を用いるより抽出物の濃度を大きくできることから、子実体を用いることが好ましい。カバノアナタケ及びカワラタケの抽出物の抽出方法及び抽出条件は、特段限定されないが、例えば、水抽出、熱水抽出、温水抽出、アルコール抽出、含水アルコール抽出、アセトン抽出、含水アセトン抽出、超臨界抽出等の公知の抽出方法を用いることができる。原料が菌糸体の液体培養物であれば、乾燥して、裁断、粉砕後の処理物を用いて抽出してもよい。原料が子実体や菌糸体であれば、それをそのまま用いて抽出してもよく、裁断、粉砕後の処理物を用いて抽出してもよい。
　溶媒抽出を行う際に用いる溶媒としては、特段限定されず、例えば、水、メタノールやエタノール等の低級アルコール、プロピレングリコールや１，３‐ブチレングリコール等の多価アルコール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類、キシレン、ヘキサン等が挙げられ、有機溶媒については水溶液であってもよい。中でも、好ましくは水、又はアセトン、エタノール、メタノール若しくはそれらの水溶液であり、さらに、食品分野に利用する場合には、食品として有害な溶媒を除去する工程が不要であることから、より好ましくは水、又はエタノール若しくはその水溶液である。水溶液の場合の該水溶液中の有機溶媒の濃度は、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上であり、好ましくは９０％以下、好ましくは７０％以下、好ましくは５０％以下である。これらの溶媒は、いずれか１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。抽出時の温度は、それぞれの溶媒で抽出物が得られる温度であれば特段限定されない。得られた抽出物（又はその精製物若しくは濃縮物）は、そのままの状態で使用することもできるが、乾燥させて粉末状のものを用いてもよく、凍結乾燥処理に供して粉末化する方法や、デキストリン、コーンスターチ、アラビアゴム等の賦形剤を添加してスプレードライ処理により粉末化する方法等、公知の方法に従って粉末化してもよい。さらにその後に、必要に応じて純水、エタノール等に溶解して用いてもよい。
（乳酸菌の菌体成分）
　本発明の１つの実施形態によれば、免疫原性因子として乳酸菌が用いられる。乳酸菌は、生育に必要なエネルギーを得るためにブドウ糖や乳糖などの糖を分解して乳酸をつくりだす細菌の総称である。細胞の形状の違いから、棒状あるいは円筒状の形をした乳酸桿菌と球形の乳酸球菌に分類される。ビフィズス菌も乳酸をつくり、 ヒトの健康に寄与することから、 広義の乳酸菌に含めて考えられる。乳酸菌は、例えば、エンテロコッカス属に属する菌、ビフィズス菌（例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＲ－１０８：受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ－１３１７で寄託されているビフィドバクテリウム・ロンガムＢＲ－１０８株）などである。エンテロコッカス属に属する菌は、例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）である。
　エンテロコッカス・フェカリスは、例えば、エンテロコッカス・フェカリス・ＥＣ－１２株、ＡＴＣＣ１９４３３、ＡＴＣＣ１４５０８、ＡＴＣＣ２３６５５、ＩＦＯ１６８０３、ＩＦＯ１６８０４等の菌株またはその変異株が例示できる。なおここで「変異株」は、特定の菌株に対し、当業者に周知の方法により当業者がその性質に変化を及ぼさない範囲で変異させたもの、あるいは、それと同等であると当業者が確認できるものを包含する意味である。
　なお、エンテロコッカス・フェカリス・ＥＣ－１２株（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＥＣ－１２）は、平成１７年（２００５年）２月２５日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。受託番号は、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０２８４である。
　免疫原性因子として用いられる乳酸菌は、生菌及び／又は死菌体を用いることができるが、組成物の保存性などから、好ましくは死菌体が用いられ、より好ましくは、上記乳酸菌を公知の加熱処理手段で殺菌して得られる加熱殺菌菌体が用いられる。加熱殺菌菌体は、上記乳酸菌を常法に従って培養して得られた培養物から、濾過、遠心分離等の方法により菌体を回収し、水洗後、水等に懸濁して加熱処理した後、必要に応じて、濃縮、乾燥することにより調製できる。また、菌体を焼成、蒸煮に付すことによって調製してもよい。なお、上記ＥＣ－１２株の加熱処理による殺菌菌体粉末は、商品名「ＥＣ－１２」（コンビ株式会社製）または「ラ・フローラＥＣ－１２」（一丸ファルコス株式会社製）として市販されている。このため、本発明においては、免疫原性因子として用いられる乳酸菌として、このような市販品を用いてもよい。
（ドクダミ（Ｈ．ｃｏｒｄａｔａ）抽出物）
　本発明で用いられるドクダミ抽出物は、例えば、ドクダミ科ドクダミ属ドクダミ（Houttuynia cordata Thunb.、以下Ｈ．ｃｏｒｄａｔａと記載）の開花期地上部(生薬名：ジュウヤク)を、溶媒（水など）を用いて抽出して得られたものである。以下実施例で用いたドクダミ抽出物は、ドクダミＤＸＰ１００（一丸ファルコス、ドクダミの地上部を水に加えて抽出した抽出物、クエルシトリン含量0.15%以上）を用いた。
（免疫応答を活性化するための組成物の剤型及び投与形態等）
　本実施形態の組成物を使用する場合、その剤型は特に限定されず、液体、固体または半固体もしくは半液体とすることができ、好ましくは液体の形態である。これらの剤型は、当業者に公知の方法に基づき、必要に応じて適切な薬学的担体を採用して容易に製造することができる。剤型が固体の場合は、例えば、少なくとも免疫原性因子とプロテオグリカンとを含む、粉末、顆粒、錠剤、及びカプセル剤等が挙げられる。また、剤型が半固体または半液体の場合は、軟膏、ローション、クリームおよびゲル等が挙げられる。剤型が液体の形態の場合、用いる溶媒の例としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンク溶液、その他の水性の生理的平衡液、油、エステルおよびグリコールが挙げられる。溶媒は、例えば化学的安定性および等張性の増強により被投与者の生理学的条件に接近するのに必要な、適切な補助物質を含むことができる。適切な補助物質には例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ならびに、リン酸緩衝液、トリス緩衝液および重炭酸緩衝液を生産するために使用されるその他の物質が含まれる。本発明の組成物は従来の方法によって滅菌されてもよいし、及び／又は凍結乾燥されてもよい。
　また、本実施形態の組成物の投与経路としては、経口、局所、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、経粘膜および経皮等が挙げられるが、これらに限定されない。組成物の投与の方法は、例えば、皮下、皮内、静脈内、筋肉内又は腹腔内等への直接注射、鼻腔内、口腔内、肺内、膣内又は直腸内等の粘膜への噴霧、並びに経口投与等の、公知の方法に基づいて行われる。
（組成物の投与対象）
　組成物の投与対象としては、あらゆる動物が挙げられ、哺乳類および鳥類等の脊椎動物が好ましく、哺乳類であることがより好ましい。さらに、哺乳類の前記被験体は例えばヒトであるが、家畜（例えばニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびウシ等の家畜類）、ペット動物（例えば、ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギおよびモルモット等のペット動物）などが被験体となる場合もあり得る。
　本実施形態に係る免疫応答を活性化するための組成物は、一般に免疫系強化をもたらすのに十分な量および回数で、ヒトを含む動物等の被験体に投与される。本実施形態の組成物に含まれる免疫原性因子の濃度は、投与対象の種類等に応じて適宜設定すればよい。例えば、組成物（１ｇ）中の、免疫原性因子の濃度は、例えば、３μｇ／ｇ以上で５０ｍｇ／ｇ以下の範囲内であることが好ましい。また、組成物のボリュームを小さくできる観点では、組成物に含まれる免疫原性因子の濃度は高いほど好ましい。免疫原性因子の濃度の上限は、例えば、５０ｍｇ／ｇ以下、４５ｍｇ／ｇ以下、４０ｍｇ／ｇ以下、３５ｍｇ／ｇ以下、３０ｍｇ／ｇ以下、２５ｍｇ／ｇ以下、２０ｍｇ／ｇ以下、１５ｍｇ／ｇ以下、または１０ｍｇ／ｇ以下とすることもできる。免疫原性因子の濃度の下限は、例えば、３μｇ／ｇ以上とすることができ、１０μｇ／ｇ以上、２５μｇ／ｇ以上、５０μｇ／ｇ以上、７５μｇ／ｇ以上、１００μｇ／ｇ以上とすることもできる。このような投与量で投与することによれば、対象ヘの過剰な免疫応答による悪影響を及ぼすことなく、生体への安全性を保ちつつ十分な免疫応答活性を得ることができるため、効果的である。
　組成物（１ｇ）中の、プロテオグリカンの濃度は、例えば、０．１μｇ／ｇ以上の範囲内である。また、組成物のボリューム（液量）を小さくできる観点では、組成物に含まれるプロテオグリカンの濃度が高いほど好ましい。
　組成物は、上記免疫原性因子とプロテオグリカンとを当該組成物中に一緒に含んでもよいし、又は各有効成分を別々に組合せて含んでもよい。例えば、免疫応答の活性化のための（ａ）免疫原性因子及び（ｂ）プロテオグリカンは、同時に、又は順序に従って個別に投与することができる。（ａ）及び（ｂ）の投与方法は、同時または逐次的であってもよく、好ましくは、（ａ）及び（ｂ）は逐次的に（または別々に）投与される。これは、（ａ）及び（ｂ）が、一緒に服用されるための単一の単位剤形で、または同時にもしくは一定の時間差で投与される別々の実体として（例えば別々の容器で）提供され得ることを意味する。この時間差は、１時間から１週間の間、好ましくは１２時間から３日の間であってもよい。さらに、免疫原性因子とは別の投与方法によりプロテオグリカンを投与することができる。これに関して、（ａ）又は（ｂ）のどちらかを静脈内に投与し、他方を全身または経口投与することが有利となり得る。逐次投与は、本実施形態の有効成分が異なる剤形であり（１つの薬剤が錠剤またはカプセル、別の薬剤が滅菌液である）、及び／又は異なる投与スケジュール、例えば、少なくとも毎日投与される有効成分と、１週間に１回、２週間ごとに１回、若しくは３週間ごとに１回などのより少ない頻度で投与される有効成分で投与される場合に、特に有用である。
（医薬品又は食品等への用途）
　本実施形態の剤又は組成物は、顕著な免疫応答調節又は促進作用を有するので、例えば、本実施形態の剤又は組成物を用いて、生体において正常な代謝免疫応答が低下または抑制される疾病、疾患又は障害を有する患者の治療に有用である。また、本実施形態の剤又は組成物は、免疫系に悪影響を及ぼす状態に起因する疾病、疾患又は障害に罹患する危険性が高くなっている動物又はヒト等の被験体を治療的または予防的に処置するために用いることができる。
　また、本実施形態の組成物は、液性免疫と細胞性免疫とを相乗的に活性化する効果を有する。加えて、免疫原性因子とプロテオグリカンとは互いに別異のアジュバント効果を示すことからワクチンとして利用することもできる。ワクチンとは、病原体そのものあるいは病原体に由来する特定の抗原を含むことによって、特定の疾病、疾患または障害の予防または治療を目的とする、医薬組成物をさす。医薬組成物とは、ヒト用の医薬組成物のみならず動物用の医薬組成物も含む概念である。ワクチンに含まれる抗原の種類は、予防又は治療の対象となる特定の疾患等に応じて選択される。本実施形態に係るワクチンでは、従来のアジュバントと比較して、少ない量の免疫賦活剤および抗原を用いても非常に高い免疫賦活活性および高い中和抗体価を得ることができる。アジュバント量と抗原量とを減らすことができるので、生体への過剰な刺激が生じず、安全性が高く、コストの面でも安価なワクチンとすることができる。
　本実施形態の組成物は、例えば、飲食品用の添加物として利用することもできる。本実施形態の組成物を、飲食品用の添加物として利用することによって、免疫応答活性が増強された飲食品組成物を提供することが出来る。免疫応答活性が増強された飲食品組成物としては、例えば、免疫賦活、免疫活性化、又は免疫力アップ等の表示がなされた特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、又は栄養機能飲食品が挙げられる。
　次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
［実施例１］マウスマクロファージのサイトカイン産生に与える各種免疫原性因子及びプロテオグリカンの影響
（実験材料）
・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬株式会社、製品コード：１６２－２２１３１）
・ＴＬＲ２リガンド：Ｐａｍ３－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－（Ｌｙｓ）４／３ＨＣＬ、ＡＬＸ－１６５－０６６－Ｍ００２（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）
・ＴＬＲ３リガンド：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＡＬＸ－７４６－０２１－Ｍ００５（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）
・ＴＬＲ４／ＮＬＲリガンド：ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｏ１１１：Ｂ４）、ＡＬＸ－５８１－０１２－Ｌ００１　（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）
・ＴＬＲ７／８リガンド：Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（Ｒ－８３７）、ＡＬＸ－４２０－０３９－Ｍ１００　（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）
・ＴＬＲ９リガンド：ＯＤＮ１８２６、ＡＬＸ－７４６－０５２－Ｍ００１（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）
・Ｄｅｃｔｉｎ－１リガンド：Ｚｙｍｏｓａｎ（酵母のβ－グルカン）、ＳＣ－２５８３６（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
・カバノアナタケ抽出物：カバノアナタケエキス粉末
・カワラタケ抽出物：カワラタケ粉末
（実験方法）
　２４穴培養プレートを用い、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７を、夫々終濃度で１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ及び１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で２×１０６／ｗｅｌｌにて培養を行った。３７℃、ＣＯ２インキュベータにて１日培養後、各ｗｅｌｌから培養液を抜き、新しい培養液に、被験試料として上述した免疫原性因子（各ＴＬＲリガンド、デクチン１リガンド、カバノアナタケ抽出物又はカワラタケ抽出物）と、プロテオグリカン（以下ＰＧと略す）とを所定の濃度で同時に添加した。コントロールとして培養液のみ及び培養液にＰＧのみを添加したものを用いた。３７℃、ＣＯ２インキュベータにて２４時間培養を行った後、顕微鏡で細胞が死んでいないことを確認後、各ｗｅｌｌから培養液を回収した。４℃にて３０００ｒｐｍ、２０分遠心分離を行い回収した培養上清に含まれるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β及びＩＦＮ－βの量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。当該測定で用いたＥＬＩＳＡは以下である。
・ＴＮＦ－α：Ａ４３６５８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
・ＩＬ－６：ＢＭＳ６０３－２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
・ＩＬ－１０：ＢＭＳ６１４ＩＮＳＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
・ＩＬ－１β：ＢＭＳ６００２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
・ＩＦＮ－β：Ａ４７４３５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
（実験結果）
　その結果を以下の表１～表３及び図１～図９に示す。図１～図９において、グラフの横軸は各種添加物を示し、具体的には以下のとおりである（カッコ内に添加濃度を示す。）：
・Ｍｅｄｉｕｍ：培地
・ＰＧ：プロテオグリカン（２５０μｇ／ｍＬ）
・Ｐａｍ：Ｐａｍ３－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－（Ｌｙｓ）４／３ＨＣｌ（２５０ｎｇ／ｍＬ）
・ＯＤＮ：ＯＤＮ１８２６（１０μｇ／ｍＬ）
・Ｚｙｍｏｓａｎ：サッカロミセス・セレビシエ由来のβ―グルカン（２５μｇ／ｍＬ）
・ＬＰＳ：ＬＰＳ（大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４）（１０μｇ／ｍＬ）
・Ｋａｂａｎｏ：カバノアナタケ抽出物（５００μｇ／ｍＬ）
・Ｋａｗａｒａ：カワラタケ抽出物（５００μｇ／ｍＬ）
・Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ：７－Ａｌｌｙｌ－８－ｏｘｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ（２５０μＭ）
　グラフの縦軸はＥＬＩＳＡ法にて測定した各種サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。これらの結果より、ＰＧそのものは、マウスマクロファージ細胞株におけるＩＬ－１０、ＩＬ－１β及びＩＦＮ－βの発現を誘導した。種々の免疫原性因子と共にＰＧを添加したところ、ＰＧは、ＴＬＲ４を介する種々のサイトカインの産生を抑制した。一方、ＰＧは、ＴＬＲ２，ＴＬＲ７／８，ＴＬＲ９及びデクチン１を介する種々のサイトカインの産生を増強した。カバノアキタケ抽出物及びカワラタケ抽出物は、ＴＮＦ－αの産生を促進し、この作用はＰＧの添加によって促進された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（考察）
　以上の結果より、マウスマクロファージ細胞株を用いた実験において、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の誘導は、ＰＧの有する抗炎症作用に関連すると考えられる。ＰＧは、自然免疫受容体に依存して自然免疫応答を調節することができる。また、カバノアキタケ抽出物及びカワラタケ抽出物は自然免疫応答を促進することができ、この作用はＰＧにより増強されることが分かった。
［実施例２］樹状細胞のサイトカイン産生に対する乳酸菌及びプロテオグリカンの影響
（実験方法）
　マウス骨髄由来の樹状細胞（骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ））を以下の手順で調製した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨から骨髄を取り出し、溶血バッファーにより赤血球を破壊することにより、骨髄細胞を回収した。１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．１％２－メルカプトエタノール、及び組換えマウスＧＭ－ＣＳＦ（２～２０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中、骨髄細胞を２×１０５個／ｍＬの細胞密度で７日間培養し、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）に分化させた。
　２４穴培養プレートを用い、上記で調製した骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）を、終濃度で１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ及び１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で２×１０６／ｗｅｌｌにて培養を行った。３７℃、ＣＯ２インキュベータにて１日培養後、各ｗｅｌｌから培養液を抜き、新しい培養液に、被験試料として乳酸菌エンテロコッカス・フェカリスＥＣ－１２（１０μｇ／ｍＬ）を単独で、又はプロテオグリカン（２５０μｇ／ｍＬ）と一緒に添加した。コントロールとして培養液のみ及び培養液にＰＧのみを添加したものを用いた。３７℃、ＣＯ２インキュベータにて４８時間培養を行った後、顕微鏡で細胞が死んでいないことを確認後、各ｗｅｌｌから培養液を回収した。４℃にて３０００ｒｐｍ、２０分遠心分離を行い回収した培養上清に含まれるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０の量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。当該測定で用いたＥＬＩＳＡは以下である。
・ＴＮＦ－α：Ａ４３６５８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
・ＩＬ－６：ＢＭＳ６０３－２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
・ＩＬ－１２ｐ７０：ＢＭＳ６００４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
（実験結果）
　その結果を以下の表４及び図１０～１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ｐ３５とＩＬ－１２ｐ４０から構成されるヘテロ二量体のタンパク質であり、ＴＮＦ－αやＩＬ－６と同様に炎症性のサイトカインとして知られている。ＩＬ－１２ヘテロ二量体のことを、特にＩＬ－１２ｐ７０と呼ぶ。ＩＬ－１２は、細菌を貪食した食細胞及び樹状細胞によって主に産生される。ＩＬ－１２は、ＮＫ細胞の刺激の他、ナイーブＴ細胞をＴｈ１細胞への分化を誘導し、細菌やウイルスに対する抵抗性を付与すると考えられる。表４及び図１０～１２に示すように、ＥＣ－１２は、これらのサイトカイン産生を促進して樹状細胞を活性化することができ、この作用はＰＧにより増強されることが分かった。
［実施例３］樹状細胞のサイトカイン産生に対するカバノアナタケ抽出物及びプロテオグリカンの影響
　２４穴培養プレートを用い、実施例２で調製したマウス骨髄由来の骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）を、夫々終濃度で１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ及び１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で２×１０６／ｗｅｌｌにて培養を行った。３７℃、ＣＯ２インキュベータにて１日培養後、各ｗｅｌｌから培養液を抜き、新しい培養液に、プロテオグリカン（２５０μｇ／ｍＬ、以下ＰＧと略す。）の存在又は非存在下において、被験試料として加熱殺菌処理したリステリア・モノサイトゲネス（ＨＫ－ＬＭ）と、ドクダミ（Ｈ．ｃｏｒｄａｔａ）抽出物又はカバノアナタケ抽出物（それぞれ５００μｇ／ｍＬ）とを一緒に添加した。コントロールとしてＨＫ－ＬＭのみを添加したものを用いた。３７℃、ＣＯ２インキュベータにて４８時間培養を行った後、顕微鏡で細胞が死んでいないことを確認後、各ｗｅｌｌから培養液を回収した。４℃にて３０００ｒｐｍ、２０分遠心分離を行い回収した培養上清に含まれるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０の量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（実験結果）
　その結果を以下の表５及び図１３～１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５及び図１３～１５に示すように、カバノアナタケ抽出物は、主としてＴＬＲ－２を介して免疫応答を活性化するリガンドであるＨＫ－ＬＭによるＴＮＦ－α及びＩＬ－６の産生量を増強し、その作用はＰＧによりさらに増強された。また、ＨＫ－ＬＭ単独ではＩＬ－１２ｐ７０はほとんど分泌されなかったが、カバノアナタケ抽出物、特にカバノアナタケ抽出物とプロテオグリカンとを共添加することで、樹状細胞におけるＩＬ－１２ｐ７０産生が促進されることが分かった。
［実施例４］マウスのリステリア菌感染に対するカバノアナタケ抽出物の経口投与の影響（自然免疫）
　図１６に示す実験方法に従い、６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、一匹当たり１×１０６個のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を腹腔内投与（ｉ．ｐ．）により感染させた。感染９日前から感染３日後又は４日後まで、１日当たり３ｍｇのカバノアナタケ抽出物を含む被験試料又は含まないコントロール試料でマウスを給餌した。一群のマウス（各群Ｎ＝５）について、感染３日後にマウスから脾臓及び肝臓を摘出した。当該摘出した臓器をＰＢＳ（生理的食塩加リン酸緩衝液）存在下でホモジナイザー(homogenizer)でホモジナイズ(homogenize)した。当該ホモジナイズしたもの（液）０．１ｍＬをトリプトソイ寒天平板培地に塗布した。当該塗布後、３７℃、２４時間培養した。当該培養後、培地に存在する細菌数を計測した。当該計測した数を生菌数とした。他の一群のマウスからは、感染４日後に脾臓を取り出して、実施例３と同様の方法で培養し、培養液に加熱殺菌処理したリステリア・モノサイトゲネス（ＨＫ－ＬＭ）を添加して免疫刺激した。３７℃、ＣＯ２インキュベータにて４８時間培養を行った後、顕微鏡で細胞が死んでいないことを確認後、各ｗｅｌｌから培養液を回収した。４℃にて３０００ｒｐｍ、２０分遠心分離を行い回収した培養上清に含まれるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０の量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（実験結果）
　脾臓及び肝臓に存在する細菌数を計測した結果を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　カバノアナタケ抽出物を含む被験試料で飼育したマウスの臓器では感染した細菌数が減少する傾向がみられた。
　一方、サイトカイン産生量については以下の表７及び図１７～１９に示す。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌとは、カバノアナタケ抽出物を含まない試料を給餌したマウスから採取したサンプルであり、Ｅｘｒａｃｔとは、カバノアナタケ抽出物を含む試料を給餌したマウスから採取したサンプルを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　主としてＴＬＲ－２を介して免疫応答を活性化するリガンドであるＨＫ－ＬＭによるＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１２ｐ７０の産生量は、カバノアナタケ抽出物の経口投与によって増強されることが分かった。
［実施例５］マウスのリステリア菌感染に対するカバノアナタケ抽出物の経口投与の影響（獲得免疫）
　図２０に示す実験プロトコルに従い、６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、一匹当たり１×１０５個のリステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）を腹腔内投与（ｉ．ｐ．）により感染させた後、４週間経過後に再度、１×１０６個のＬＭを感染させた。最初の感染７日前から実験期間中、１日当たり３ｍｇのカバノアナタケ抽出物を含む被験試料又は含まないコントロール試料でマウスを給餌した。一群のマウスについて、感染２日後に脾臓及び肝臓を摘出した。当該摘出した臓器をＰＢＳ（生理的食塩加リン酸緩衝液）存在下でホモジナイザー(homogenizer)でホモジナイズ(homogenize)した。当該ホモジナイズしたもの（液）０．１ｍＬをトリプトソイ寒天平板培地に塗布した。当該塗布後、３７℃、２４時間培養した。当該培養後、培地に存在する細菌数を計測した。当該計測した数を生菌数とした。他の一群のマウスからは、２度目の感染直前に脾臓を取り出して、実施例３と同様の方法で培養し、培養液に加熱殺菌処理したリステリア・モノサイトゲネス（ＨＫ－ＬＭ）を添加して免疫刺激した。コントロールとして、ＬＭによる初回感染を行わなかったマウスを用いて同様の実験を行った。３７℃、ＣＯ２インキュベータにて４８時間培養を行った後、顕微鏡で細胞が死んでいないことを確認後、各ｗｅｌｌから培養液を回収した。４℃にて３０００ｒｐｍ、２０分遠心分離を行い回収した培養上清に含まれるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０の量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（実験結果）
　脾臓及び肝臓に存在する細菌数を計測した結果を以下の表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　カバノアナタケ抽出物を含む被験試料で飼育したマウスの臓器では感染した細菌が検出できないレベルまで細菌数が劇的に減少した。
　一方、サイトカイン産生量については以下の表９及び図２１～２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　ＨＫ－ＬＭによる免疫を行わないと、カバノアナタケ抽出物の給餌の有無に関わらずサイトカイン産生は認められなかったが、ＨＫ－ＬＭ刺激から４週間後の脾臓細胞では、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１２ｐ７０の産生が認められ、この作用は、カバノアナタケ抽出物の給餌により増強された。
製剤例１：錠剤
　１錠当たり５ｍｇのプロテオグリカンを含む以下の成分組成からなる２００ｍｇ錠剤を、各成分をよく混合してから打錠することで製造した。
プロテオグリカン　　　　　　　　　　　　５ｍｇ
カバノアナタケ抽出物　　　　　　　　　１０ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　１２７ｍｇ
でんぷん　　　　　　　　　　　　　　　４５ｍｇ
カルボキシメチルセルロース　　　　　　１０ｍｇ
タルク　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　１ｍｇ
　　　　　　　　　　　　　　　　合計２００ｍｇ／錠
製剤例２：カプセル剤
　１カプセル当たり２０ｍｇのプロテオグリカンを含む以下の成分組成からなる１００ｍｇカプセル剤を、各成分をよく混合してからカプセルに充填することで製造した。
プロテオグリカン　　　　　　　　　　　２０ｍｇ
カワラタケ抽出物　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　４３ｍｇ
でんぷん　　　　　　　　　　　　　　　２５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　２ｍｇ
　　　　　　　　　　　　　　　　合計１００ｍｇ／カプセル
　本発明は、プロテオグリカンの免疫調節剤としての新規用途を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。

 
[規則26に基づく補充 16.01.2023]　
Figure WO-DOC-RO134

Claims (2)

  1. 　プロテオグリカンと、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）ＥＣ－１２株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０２８４）の菌体成分及び／又はBR-108株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ－１３１７で寄託されているビフィドバクテリウム・ロンガムＢＲ－１０８株 ）とを、一緒に又は別々に組み合わせて含む、免疫応答を活性化するための組成物。
  2. 　前記免疫応答が、自然免疫及び／又は獲得免疫を介して活性化される請求項1に記載の組成物。
     

     
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