JP5468183B2 - IgA産生促進作用を有する新規乳酸菌及びその用途 - Google Patents
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Description
(I-1) ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低い、ラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌。
(I-2) グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示すことを特徴とする、(I-1)に記載の乳酸菌。
(I-3) 分離源がミツバチ又は養蜂産品である、(I-1)又は(I-2)に記載の乳酸菌。
(I-4) ラクトバチルス・クンキーBPS402(FERM BP-11439)又はラクトバチルス・クンキーBPS104(FERM BP-11438)である、(I-1)〜(I-3)のいずれか一項に記載の乳酸菌。
(II-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物。
(II-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する医薬組成物。
(II-3) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する化粧品組成物。
(III-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、気道又は食道の粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤。
(III-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、食中毒の予防又は緩和用の腸管免疫賦活剤。
(IV-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、整腸、美容、又はアンチエイジング用の組成物。
(IV-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、炎症性腸疾患の予防及び/又は治療用組成物。
(IV-3) 前記炎症性腸疾患がクローン病又は潰瘍性大腸炎である、(IV-2)に記載の組成物。
(IV-4) 食品又は医薬品である、(IV-1)〜(IV-3)のいずれか一項に記載の組成物。
本発明のラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌は、ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低いことを特徴とする。
<菌学的性質>
A.形態的性状
細胞形態:桿菌(0.7-0.8×1.5-2.0μm)
グラム染色:陽性
コロニー色調:クリーム色
MRS寒天平板培地による48時間培養(30℃)
B.糖類発酵性(api 50CHを使用) 48時間培養後に判定(陽性:+、陰性:−)
0 コントロール −
1 グリセロール −
2 エリスリトール −
3 D-アラビノース −
4 L-アラビノース −
5 D-リボース −
6 D-キシロース −
7 L-キシロース −
8 D-アドニトール −
9 メチル-β-D-キシロピラノシド −
10 D-ガラクトース −
11 D-グルコース +
12 D-フルクトース +
13 D-マンノース −
14 L-ソルボース −
15 L-ラムノース −
16 ズルシトール −
17 イノシトール −
18 D-マンニトール ?
19 D-ソルビトール −
20 メチル-α-D-マンノピラノシド −
21 メチル-α-D-グルコピラノシド −
22 N-アセチルグルコサミン −
23 アミグダリン −
24 アルブチン −
25 エスクリン クエン酸第二鉄 −
26 サリシン −
27 D-セロビオース −
28 D-マルトース −
29 D-ラクトース −
30 D-メリビオース −
31 D-スクロース +
32 D-トレハロース +
33 イヌリン −
34 D-メレジトース −
35 D-ラフィノース −
36 スターチ −
37 グリコーゲン −
38 キシリトール −
39 ゲンチオビオース −
40 D-ツラノース −
41 D-リキソース −
42 D-タガトース −
43 D-フコース −
44 L-フコース −
45 D-アラビトール −
46 L-アラビトール −
47 グルコネート +
48 2-ケト-グルコネート −
49 5-ケト-グルコネート −
BPS402株の16S rDNAの塩基配列を配列表の配列番号1に示す。BPS402株の16S rDNAの配列は、既知種の基準株であるラクトバチルス・クンキーYH-15(JCM16173)株と100%の同一性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ラクトバチルス・クンキーとクラスターを形成し、両者は同一の分子系統学的位置を示した。これらの結果から、BPS402株はラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌であると判断された。
<菌学的性質>
A.形態的性状
細胞形態:桿菌(0.6-0.7×1.2-1.5μm)
グラム染色:陽性
コロニー色調:乳白色
MRS寒天平板培地による72時間培養(30℃)
B.糖類発酵性(api 50CHを使用) 48時間培養後に判定(陽性:+、陰性:−)
0 コントロール −
1 グリセロール −
2 エリスリトール −
3 D-アラビノース −
4 L-アラビノース −
5 D-リボース −
6 D-キシロース −
7 L-キシロース −
8 D-アドニトール −
9 メチル-β-D-キシロピラノシド −
10 D-ガラクトース −
11 D-グルコース +
12 D-フルクトース +
13 D-マンノース −
14 L-ソルボース −
15 L-ラムノース −
16 ズルシトール −
17 イノシトール −
18 D-マンニトール ?
19 D-ソルビトール −
20 メチル-α-D-マンノピラノシド −
21 メチル-α-D-グルコピラノシド −
22 N-アセチルグルコサミン −
23 アミグダリン −
24 アルブチン −
25 エスクリン クエン酸第二鉄 −
26 サリシン −
27 D-セロビオース −
28 D-マルトース −
29 D-ラクトース −
30 D-メリビオース −
31 D-スクロース +
32 D-トレハロース +
33 イヌリン −
34 D-メレジトース −
35 D-ラフィノース −
36 スターチ −
37 グリコーゲン −
38 キシリトール −
39 ゲンチオビオース −
40 D-ツラノース −
41 D-リキソース −
42 D-タガトース −
43 D-フコース −
44 L-フコース −
45 D-アラビトール −
46 L-アラビトール −
47 グルコネート +
48 2-ケト-グルコネート −
49 5-ケト-グルコネート −
BPS104株の16S rDNAの塩基配列を配列表の配列番号2に示す。BPS104株の16S rDNAの配列は、既知種の基準株であるラクトバチルス・クンキーYH-15(JCM16173)株と99.9%の同一性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ラクトバチルス・クンキーとクラスターを形成し、両者は同一の分子系統学的位置を示した。これらの結果から、BPS104株はラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌であると判断された。
本発明の食品組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。当該食品組成物には、動物(ヒトを含む)が摂取できるあらゆる食品組成物が含まれる。
本発明の医薬組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。本発明の医薬組成物は、乳酸菌製剤と称することができる。
本発明の化粧品組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。
菌の分離に用いた培地は、MRS培地(又はROGOSA培地)であり、必要に応じてリンゴジュース、オレンジジュース、トマトジュース又はグレープジュースのいずれかを最終濃度25%となるように混ぜ、酢酸と水酸化ナトリウムを用いてpH4.5に調整した。調製した培地に、花粉荷を適宜希釈し、インキュベータ内にて、25〜37℃で培養を開始した。2〜3日間培養後、炭酸カルシウム入りのMRS寒天培地に画線法にて広げ、更に、同様の温度にて2〜3日間培養し、乳酸産生によりクリアゾーンを有するシングルコロニーを複数株得た。得られたコロニーを、MRSにて培養後、10%グリセロールストックとして、-80℃にて凍結保存した。
試験例1
<実験方法>
・動物の飼育・飼養
検疫・検収の終了後、1週間予備飼育を行った6週齢のBALB/c雌マウスを使用した。試験に用いる動物は、ほぼ同体重又は予備飼育期間中の体重変動がほぼ同様の動きを示した個体を選択した。
実験動物の飼育と飼養に関する法律に則り、麻酔処理した動物より採血を行い、放血させた。放血後、脾臓及び小腸(盲腸回盲部を含む)を摘出し、1%BSA含有Hank's液の入ったシャーレに移し、氷冷保存した。脾臓より脾臓由来リンパ球(SPL)、小腸よりパイエル氏板由来リンパ球(PPL)を回収し、各細胞を1×106/mL となるように10%RPMI-1640培地に再懸濁した。
細菌株をミューラーヒントン寒天培地に画線し、37℃孵卵器で16時間培養した。寒天培地上に発育した単一の細菌集落より白金線にて釣菌し、新たなミューラーヒントン寒天培地に画線し、37℃孵卵器で16時間培養した。マクファーランド濁度(McFarland;MCF) 3.0を目安にTS液体培地中に細菌集落を溶解し、細菌懸濁液を調製した。菌液の一部は、10倍階段希釈法にて菌数を測定した。調製した細菌懸濁液を100℃、30分間加熱処理を行い、次項に示す被験物質とした。対照細菌株にはListeria monocyotogenes (EGD株)を使用し、上述した画線培養と同様の操作を行い、MCF3.0を目安に細菌懸濁液を調製した。さらに、調製した細菌懸濁液を100℃、30分間加熱処理を行い、次項に示す対照株とした。
回収したPPLに対して被験物質による抗原刺激を行い、刺激後48時間後に培養上清の回収を行った。回収した培養上清中のIgAをELISA法にて測定した。
回収したSPLをBrdU-Thymidine存在下でマイトゲン刺激(PWM終濃度5μg/mL)又は被験物質による抗原刺激を行い、BrdU-Thymidineの取込量を測定した。また、同様の系にて培養上清を回収し、CTLL-2細胞による細胞増殖能試験を行った。
(IgA抗体産生能)
被験物質を用いてパイエル氏板細胞への刺激を行った。48時間刺激後の培養上清をIgA抗体測定用ELISAプレートに添加し、IgA抗体産生能を評価した。なお、パイエル氏板細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照のO.D.値を基準に被験物質毎のO.D.値を評価した。結果を図2に示す。
・BrdU取込を指標とした脾臓細胞増殖反応
被験物質を用いて脾臓細胞への刺激を行った。蛍光標識したBrdU-Thymidineの取込量をフローサイトメータによる蛍光強度により評価した。なお、脾臓細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照の蛍光強度を基準に被験物質毎の蛍光強度を評価した。結果を図3に示す。
上記の試験で得られた培養上清中のIL-2測定をCTLL-2細胞を指標に行った。測定に関しては、CTLL-2細胞のBrdU-Thymidineの取込量をフローサイトメータによる蛍光強度により評価した。なお、脾臓細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照の蛍光強度を基準に被験物質毎の蛍光強度を評価した。結果を図4に示す。
<試験方法>
1.ウイルスの調製
超低温冷凍庫に凍結保存してあるインフルエンザウイルス(IFVA, PR/8/34(H1N1)株)を細胞増殖培地で培養したMDCK 細胞にM.O.I. (Multiplicity of infection) 0.01で感染させ、37℃, 5% CO2存在下で72時間培養した(1継代)。連続して5 代継代したものを大量培養し、蔗糖密度勾配超高速遠心法によりウイルス液を分離精製した後、使用時まで超低温冷凍庫にて保存した。ウイルス液の一部は10倍階段希釈法にて細胞変性効果を確認し、ウイルス感染力価(TCID50)並びにプラーク形成単位(pfu:plaque forming unit)を測定した。
a 被験物質の経口投与
検疫及び検収の終了後、1週間予備飼育を行った6週齢の雌性BALB/cマウスに、被験物質をマウス1匹当たり0.2 mLずつ1回強制経口投与した。被験物質の濃度は1 mg/kgに設定し、被験物質の強制経口投与は試験期間を通じて1日1回行い、これをIFVA感染後の試験期間終了時まで継続した。なお、陰性対照には生理食塩水を用い、被験物質と同様の経口投与を行った。
試験群は、2群にて構成し、詳細は下表の通りとした。2群には調製したIFVAを経鼻接種し、ウイルス接種が確実に行われた動物を各群に20 匹ずつ割り付けた。なお、群分けの指標には動物番号を用い、被験物質投与開始時に層別無作為に割り付けた。
被験物質を3週間連続強制経口投与した9週齢の雌性BALB/cマウスを使用し、動物番号順に生理食塩水にて希釈したペントバルビタールナトリウム(5.0 mg/mL;共立製薬株式会社(商品名;ソムノペンチル麻酔用注射液))を50 mg/kg にて腹腔内に注射し、全身麻酔を施した。麻酔下において、調製したIFVA をマウスの右鼻腔に103 pfu/20μLずつ経鼻的に接種した。
生存率の測定には、IFVA接種後3週間の経過観察を行った。経過観察中生存した個体数を群当たりの総数で除した値に100 を乗じた値を生存率とした。
a 被験物質の経口投与
検疫・検収の終了後、1週間予備飼育を行った6週齢の雌性BALB/c マウスに、被験物質をマウス1匹当たり0.2 mLずつ1回強制経口投与した。被験物質の濃度は100 mg/kg のみとし、被験物質の強制経口投与は試験期間を通じて1日1回行い、これをIFVA感染後の試験期間終了時まで継続した。なお、陰性対照には生理食塩水を用い、被験物質と同様の経口投与を行った。
試験群は、ウイルス接種群2群およびウイルス非接種群2群の計4群にて構成し、詳細は下表の通りとした。ウイルス接種群の2群には調製したIFVAを経鼻接種し、ウイルス接種が確実に行われた動物を各群に50匹ずつ割り付けた。ウイルス非接種群の動物数は各群10匹とした。なお、群分けの指標には動物番号を用い、被験物質投与開始時に層別無作為に割り付けた。
被験物質を3週間連続強制経口投与した9週齢の雌性BALB/cマウスを使用し、動物番号順に生理食塩水にて希釈したペントバルビタールナトリウム(5.0 mg/mL;共立製薬株式会社(商品名;ソムノペンチル麻酔用注射液))を50 mg/kgにて腹腔内に注射し、全身麻酔を施した。麻酔下において、調製したIFVAをマウスの右鼻腔に102 pfu/20μLずつ経鼻的に接種した。なお、ウイルス非接種群には、生理食塩水を同様に20μLずつ経鼻的に注入した。
IFVA 感染0日後(d0)及び14日後(d14)に各群8匹ずつ動物を屠殺した。各群5匹からは、肺胞-気管支洗浄液(BALF)を回収した。各群3匹からは、無処置のまま肺臓を摘出して10%(v/v)ホルマリン液にて保存した。
各群5匹より処置後の肺臓を摘出し、gentleMACS dissociator (Miltenyi Biotec)を用いて細胞懸濁液を作成した。調製した細胞懸濁液からISOGEN IIを用いて、肺臓由来全RNAを抽出した。抽出したRNA についてはUni12 primer (Hoffmann E. et al. Arch Virol. 2001.)を用いた逆転写反応を行い、ウイルスゲノムRNA を選択的に増幅した後、ウイルスNP遺伝子に対する特異的プライマーを用いたリアルタイムPCR法により、肺臓におけるウイルスゲノムRNA量を測定した。
回収したBALFについては遠心操作を実施し、上清と細胞成分に分離した。上清については解析実施時まで超低温冷凍庫にて保存した。BALF上清の抗体について、ELISA法にて測定した。測定項目は、抗インフルエンザウイルス特異的IgAとした。
生存率解析における群間の比較はLogrank検定にて実施し、有意水準は両側5%とした。その他の試験における群間の有意差はStudentのt検定にて行い、有意水準は両側5%とした。
1.生存率解析(図5)
実験対照群である生理食塩水投与群については、試験終了時の生存率は25.0%であった。被験物質(乳酸菌末BPS402;以下BPS402) 1 mg/kg投与群については、試験終了時の生存率は55.0%であった。BPS402 1 mg/kg投与群ではLogrank検定(p=0.0465)にて、実験対照群との比較により有意差が認められた。
a 肺臓ウイルスゲノムRNA量の測定(図6)
BPS402投与群におけるウイルス量の推移は、感染14日後について有意な減少が認められた。
IFVA感染マウスのBALFに関して、感染14日後のインフルエンザウイルス特異的IgAについては、BPS402投与群で有意に増加していた。
本試験ではラクトバチルス・クンキーBPS402のヒトにおける有効性及び安全性の確認を行った。
BPS402摂取前後において唾液中sIgA(μg/min)が有意に上昇していた。sIgAは粘膜系における重要な免疫機能を持つ免疫グロブリンとして広く知られており、上気道感染症においてその感染リスクを低減しうると考えられている。
BPS402の摂取により安全性について特筆すべき問題は生じなかった。
以下、本発明の組成物の製造例を示す。
グルコースを2%、酵母エキスを5%含む1,000Lの培地をpH6.5に調整し、既に前培養しておいたBPS104培養液を1%植菌した。適宜、途中でpHを調整しながら、30〜37℃にて、24〜48時間培養したものを菌体培養液とした。その菌体培養液を遠心分離し、菌体1重量部に対して1重量部の水を加えた後、凍結乾燥し、固形物を粉砕機によって粉砕することで、BPS104菌体末1 kgを得た。
乳酸菌BPS104粉末400 gとショ糖脂肪酸エステル20 gを混合し、充填機にてハードカプセルに充填し、2,000粒の乳酸菌BPS104カプセルを得た。
実施例1
ローヤルゼリーを終濃度5%に希釈した希釈液1,000 mLを、pH6.5に調整した後、既に前培養しておいたBPS402培養液を1%植菌した。30℃にて、48時間培養後、遠心分離によって残渣を除き、ローヤルゼリー発酵エキス800 mLを得た。
実施例1と同様に、酵素処理ローヤルゼリーを終濃度5%に希釈した希釈液1,000 mLから、酵素処理ローヤルゼリー発酵エキス800 mLを得た。
48時間後の発酵エキスを、pHメーターにて評価した。
48時間後の培養液を、発酵前と比較し、評価した。
48時間後の培養液を懸濁後、適宜希釈し、MRS寒天培地に塗り広げ、評価した。
(i) PBS 20 mlとポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(Triton X-100) 0.2 mlを混合し撹拌した。
(ii) PBS 10 mlとL-DOPA 19.7 mlを混合しアルミホイルで巻き攪拌した。
(iii) 発酵エキスと2日間培養したB16メラノーマ細胞(3000 cells/well)に、(i)を90μl, (ii)を10μl添加し、マイクロプレートリーダーで0, 60分の吸光度(490 nm)を測定し、評価した。
メラニン産生抑制試験から5日後の培地の色を目視にて確認し、DOPAの酸化を評価した。
クエン酸ナトリウム0.1%、ピロリドンカルボン酸ナトリウム1.0%、1,3-ブチレングリコール5.0%となるように、精製水にそれぞれを50℃で混合した溶液1000 mLに、POE(30)POP(6)デシルテトラデシルエーテル(NIKKOL PEN-4630)を0.6%配合して100 mLとしたエタノールを、撹拌しながら徐々に加えて可溶化した。撹拌しながら冷却し30℃まで下げ、最後に0.5%となるよう、実施例2の乳酸菌発酵エキスを加え、1000 mLの乳酸菌発酵エキス化粧水を得た。
Claims (7)
- ラクトバチルス・クンキーBPS402(FERM BP-11439)又はラクトバチルス・クンキーBPS104(FERM BP-11438)。
- 請求項1に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物。
- 請求項1に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する医薬組成物。
- 請求項1に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する化粧品組成物。
- 請求項1に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、気道又は食道の粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤。
- 請求項1に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、美容、又はアンチエイジング用の組成物。
- 食品又は医薬品である、請求項6に記載の組成物。
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