PL233794B1 - Szczepy bakterii z rodzajow Lactobacillus i Fructobacillus wyizolowane z przewodu pokarmowego pszczol miodnych do zastosowania w zwalczaniu i zapobieganiu chorob pszczol oraz preparaty probiotyczne na bazie takich szczepow bakterii - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus kunkeei, takie jak: L. kunkeei CH1, L. kunkeei CH2, L. kunkeei CH3, L. kunkeeiZ1, L. kunkeeiZ3, L. kunkeeiZ5, L. kunkeei III1, L. kunkeei VI1, L. kunkeei VI3, L. kunkeei VI4, L. kunkeei VI6, L. kunkeei VII4 oraz z gatunku Fructobacillus fructosus, takie jak: F. fructosus V5 i F. fructosus VIII1, wyizolowane z przewodu pokarmowego pszczół, zidentyfikowane, oznaczone i zdeponowane w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda, Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu, pod numerami: L. kunkeei CH1 - B/00125; L. kunkeei - CH2 B/00126; L. kunkeei CH3 - B/00127; L. kunkeei Z1 - B/00128; L. kunkeei Z3 - B/00129; L. kunkeei Z5 - B/00130; L. kunkeei III1 - B/00131; L. kunkeei VI1 - B/00132; L. kunkeei VI3 - B/00133; L. kunkeei VI4 - B/00134; L. kunkeei VI6 - B/00135; L. kunkeei VII4 - B/00136; F. fructosus VIII1 - B/00137 oraz F. fructosus V5 - B/00138, znajdujące zastosowanie w zwalczaniu i zapobieganiu chorób pszczół miodnych, a także poprawiające odporność pszczół i wydłużające okres ich życia.

Przedmiotem wynalazku są również preparaty probiotyczne na bazie tych wyżej wymienionych, szczepów bakterii, dodawane do pokarmów pszczelich, korzystnie w postaci liofilizatów z dodatkiem substancji utrwalających, i osłaniaczy zwiększających trwałość preparatu.

Dotychczas, w leczeniu zakażeń grzybowych pszczół, takich jak nosemoza, stosuje się leki na bazie fumagiliny, substancji wyizolowanej z grzyba Aspergillus fumigatus, której działanie polega, jak ujawniono w opisie patentowym KR20140017291, jedynie na hamowaniu aktywności enzymu aminopeptydazy metioninowej MetAP-2, bez niszczenia zarodników Nosema spp., co w konsekwencji prowadzi do rozwijania się oporności grzyba na ten antybiotyk. Innym preparatem, stosowanym do leczenia mikrosporydioz, a zwłaszcza nosemozy, znanym ze zgłoszenia patentowego P.408774, jest preparat zawierający jedną z rozprowadzonych homogenicznie, amidowych pochodnych protoporfiryny. Z uwagi na fakt, iż miód i inne produkty pszczele wykorzystywane są przez człowieka jako produkty żywnościowe, lecznicze czy suplementy diety, leczenie pszczół powinno opierać się na dobrze poznanych, bezpiecznych preparatach, łatwo degradowalnych, które nie powodują zmian genetycznych w organizmach pszczół. W zwalczaniu nosemozy i poprawy odporności pszczół stosowane są również mieszanki ziołowe, jak np. wyciąg z kory dębu, czy też preparaty roślinne jak np. preparat opisany w zgłoszeniu patentowym P.415155. Jednakże, jak wykazuje praktyka, nadal odczuwalny jest brak preparatów naturalnych o szerokim spektrum działania, które będą pomocne jedocześnie w zapobieganiu oraz zwalczaniu mikrosporydioz i chorób bakteryjnych u pszczół. Inny sposób zapobiegania i zwalczania nosemozy, znany z opisu patentowego ΜΧ2011011839, polega na wyciszaniu wybranych genów Nosema spp., metodą przebiegającą z zastosowaniem konstruktów genetycznych lub cząsteczek kwasów nukleinowych - dsRNAs, np. siRNAs, miRNAs i shRNAs funkcjonalnie związanych z białkami penetrującymi komórkę. Tego typu kontrowersyjne praktyki są metodami nie zawsze akceptowanymi wśród pszczelarzy.

Prawodawstwo Unii Europejskiej zakazuje stosowania antybiotyków do leczenia chorób pszczół z powodu możliwości rozwinięcia się oporności na używane środki chemioterapeutyczne, nawrotów choroby i szkodliwego działania pozostałości antybiotyków lub ich metabolitów w produktach pszczelich. Czynniki te wpłynęły na konieczność stosowania w profilaktyce i leczeniu chorób pszczelich preparatów probiotycznych zawierających mikroorganizmy, wśród których dominującą rolę spełniają bakterie z rodzaju Lactobacillus, bezpieczne i powszechnie stosowane dla ludzi i zwierząt.

Tego typu preparaty zawierające ogólnodostępne mikroorganizmy znane są z szeregu opisów patentowych, jak np. RU2166322 i RU2008100115, ale nie gwarantują one dostatecznej skuteczności zwalczania nosemozy u pszczół, podobnie jak preparaty ujawnione w opisie patentowym WO2016135655, zawierające bakterie Lactobacillus buchneri oraz inne mikroorganizmy należące do co najmniej jednego gatunku wybranego z grupy Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis czy Lactobacillus plantarum. Z kolei w opisie patentowym EP2914754 ujawniono preparat używany do produkcji pyłku pszczelego zawierający bakterie Lactobacillus delbrueckii izolowane z pyłku. Preparat ten jednak nie wpływa bezpośrednio na zdrowotność rodzin pszczelich. Z opisu patentowego KR20130101370 znany jest preparat zawierający szczepy bakterii Lactobacillus plantarum YML001, Lactobacillus plantarum YML004 i Leuconostoc citreum KM20W oraz pyłki, sacharydy, drożdże, odtłuszczone mleko w proszku i kazeinę jako ciasto pyłkowe, mający na celu dostarczenie składników odżywczych dla pszczół i zwiększenie ich odporności na pasożytnicze owady. Preparat ten nie wpływa na grzyby pasożytnicze porażające pszczoły.

Z kolejnych opisów patentowych takich jak, KR20130005052, KR20100125747, KR830001681 czy KR830001681, znane są preparaty zawierające bakterie Lactobacillus spp., takie jak: L. leuteri,

PL 233 794 B1

L. buchneri, L. bifidobacterium, L. buchneri lub L. plantarum, L. acidophilus, mające na celu zapobieganie i leczenie chorób grzybicy otorbielakowej oraz zgnilca złośliwego i zwiększenie masy pszczoły miodnej. Jednakże, nie udowodniono, aby preparaty te poprawiały kondycję pszczół ani wpływały bójczo na grzyby pasożytnicze z rodzaju Nosema czy też bakterie z rodzaju Paenibacillus porażające pszczoły.

Z opisu patentowego CN102670664 znany jest preparat zawierający tzw. korzystne mikroorganizmy jednego gatunku bakterii lub będące kombinacją następujących gatunków: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bifidobacterium spp., Lactobacillus jensenii, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus plantarum, mający na celu zapobieganie i kontrolę chorób grzybowych pszczół oraz jedwabników.

Z opisu patentowego BG108067, znany jest preparat zawierający różne rodzaje mąki oraz bakterie Lactobacillus bulgaricus thermophilus. Inne opisy jak np., WO2010146405, DE4215534 podają składy preparatów z udziałem bakterii kwasu mlekowego. Wymienione preparaty nie wpływają na grzyby pasożytnicze z rodzaju Nosema porażające pszczoły, zawierają ogólnodostępne mikroorganizmy, jak szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus, które nie są charakterystyczne dla pszczół, ani nie zostały wyizolowane z pszczół. Taki stan rzeczy, może niekiedy zaburzać funkcjonowanie organizmu pszczół, powodować przyspieszenie rozwoju nosemozy i w konsekwencji zwiększać ich śmiertelność, co wykazano w publikacjach Whitten i Coates, Re-evaluation of insect melanogenesis research: Views from the dark side, Pigment Cell Melanoma Res., 2017, (1-16) oraz Ptaszyńska i in., Parasitology Research, 115(1), 2016, (397-406). Znane preparaty rynkowe, stosowane do wzmocnienia systemu immunologicznego pszczół i stosowane dotychczas przez pszczelarzy, sporządzane są na bazie żywych kultur bakterii kwasu mlekowego, drożdży, promieniowców czy wyciągów roślinnych.

Jeden z takich preparatów, zawiera oprócz mikroelementów, wyciągów ziołowych i melasy z trzciny cukrowej, szczepy Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis i Saccharomyces cerevisiae, wytwarzające enzymy wpływające skutecznie na trwałości miodu i pierzgi, a zawarte w nim związki bakteriobójcze służą do bioasekuracji pasiek, poprawiając warunki sanitarne w ulu oraz w całej pasiece.

Inne znane na rynku preparaty probiotyczne, zawierają w swoim składzie Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus casei i Lactobacillus plantarum, czy też preparat odżywczo witaminowy zawierający w składzie Lactobacillus acidophilus i Streptococcus faecium. Są to specyfiki zawierające ogólnodostępne bakterie, które nie zostały wyizolowane z pszczół, toteż w niedostatecznym stopniu ograniczają rozprzestrzenianie się takich groźnych chorób jak nosemoza czy warroza, a jako żywe organizmy, wykazują dużą wrażliwość na wodę chlorowaną, chemiczne środki ochrony roślin, nawozy sztuczne, detergenty, środki dezynfekcyjne czy też silne nasłonecznienie.

Z opisu patentowego z US2016081309 znany jest preparat dla pszczół zawierający bakterie z rodzaju Fructobacillus. Bakterie te to mutanty wyizolowane z kwiatów i owoców, oporne na niektóre antybiotyki np. tetracyklinę, co powinno wykluczać ich wykorzystywanie w leczeniu pszczół.

W znanym stanie techniki nie są znane żadne preparaty otrzymywane z bakterii probiotycznych wyizolowanych z przewodu pokarmowego pszczół miodnych i dedykowane dla pszczół.

Jak dotychczas walka pszczelarzy i naukowców z chorobami pszczół spowodowanymi najczęściej grzybami z rodzaju Nosema oraz bakteriami Paenibacillus larvae wywołującymi zgnilec złośliwy, nie dała spodziewanych rezultatów.

Celem wynalazku było opracowanie preparatu skutecznie zwalczającego najczęściej występujące choroby u pszczół miodnych, spowodowane grzybami pasożytniczymi zwłaszcza z rodzaju Nosema czy bójczymi bakteriami jak np., Paenibacillus larvae wywołującymi zgnilec złośliwy, poprawiającego kondycję pszczół, bezpiecznego i łatwo degradowalnego, nie powodującego skutków ubocznych u pszczół miodnych jak i ich produktów.

Nieoczekiwanie okazało się, że z przewodu pokarmowego pszczół wyizolowano grupę nowych szczepów bakterii z rodzajów Lactobacillus i Fructobacillus, dedykowanych w szczególności pszczołom i znajdujących zastosowanie do skutecznego zapobiegania i zwalczania najczęściej spotykanych chorób pszczół miodnych oraz wzmacniania ich kondycji zdrowotnej, a w konsekwencji zwiększające długość ich życia.

Istotą wynalazku są nowe szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus kunkeei oraz z gatunku Fructobacillus fructosus, wyizolowane z przewodu pokarmowego pszczół miodnych, takie jak: Lactobacillus kunkeei CH1, Lactobacillus kunkeei CH2, Lactobacillus kunkeei CH3, Lactobacillus kunkeei Z1, Lactobacillus kunkeei Z3, Lactobacillus kunkeei Z5, Lactobacillus kunkeei III1, Lactobacillus kunkeei VI1, Lactobacillus kunkeei VI3. Lactobacillus kunkeei VI4, Lactobacillus kunkeei VI6, Lactobacillus kunkeei

PL 233 794 B1

VII4 oraz Fructobacillus fructosus V5 i Fructobacillus fructosus VIII1, zdeponowane w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda, Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu, pod numerami: Lactobacillus kunkeei CH1 - B/00125; Lactobacillus kunkeei - CH2 B/00126; Lactobacillus kunkeei CH3 - B/00127; Lactobacillus kunkeei Z1 - B/00128; Lactobacillus kunkeei Z3 - B/00129; Lactobacillus kunkeei Z5 - B/00130; Lactobacillus kunkeei III1 - B/00131; Lactobacillus kunkeei VI1 - B/00132; Lactobacillus kunkeei VI3 - B/00133; Lactobacillus kunkeei VI4 - B/00134; Lactobacillus kunkeei VI6- B/00135; Lactobacillus kunkeei VII4 - B/00136; Fructobacillus fructosus VIII1 - B/00137 oraz Fructobacillus fructosus V5 - B/00138.

Istotą wynalazku są wymienione wyżej szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus kunkeei oraz z gatunku Fructobacillus fructosus, do zastosowania w zwalczaniu i zapobieganiu chorób pszczół miodnych, spowodowanych grzybami pasożytniczymi i bójczymi bakteriami, a także we wzmocnieniu odporności i kondycji zdrowotnej pszczół miodnych.

Istotą wynalazku są również preparaty na bazie tych nowo wyizolowanych szczepów bakterii probiotycznych, dodawanych pojedynczo lub w dowolnym zestawie, do pokarmów pszczelich, korzystnie w postaci liofilizatów.

Korzystnym jest również, jeśli preparat posiada w swoim składzie znane substancje utrwalające i osłaniacze, zwiększające trwałość preparatu, takie jak: krio-, lipo- lub osmo-protektanty: laktoza, sacharoza, trehaloza; środki zwiększające objętość jak np. laktoalbumina, surowicza albumina wołowa (BSA), odtłuszczone mleko w proszku, glikol polietylenowy (PEG), dekstran lub żelatyna; polisorbaty jako stabilizatory; składniki buforujące: układ buforu PBS, buforu fosforanowego; a w przypadku braku układu buforującego woda; substancje pomocnicze: glicerol, laktuloza czy glutaminian potasu. Korzystnym jest również, jeśli w 1 ml preparatu według wynalazku zawarte jest od 1x10³ do 1x1011 żywych bakterii.

Jak wykazano w przykładach, preparaty probiotyczne według wynalazku wykazują dużą skuteczność w zapobieganiu i zwalczaniu zakażeń grzybami takimi jak, Nosema apis czy Nosema ceranae, a także bakteriami patogenicznymi Paenibacillus larvae, wywołującymi zgnilca złośliwego w rodzinach pszczół miodnych. Wykazano również hamujące działanie nowo wyizolowanych szczepów na rozwój bakterii takich jak, Escherichia coli powodujących zwiększoną śmiertelność larw pszczelich i osobników dorosłych, Raoultella ornithinolytica wywołujących dysfunkcję układu pokarmowego oraz Klebsiella pneumoniae uszkadzające układ oddechowy, przez co następuje wzmocnienie odporności i kondycji zdrowotnej pszczół i wydłużenie okresu ich przeżycia.

Nowo wyizolowane z pszczół bakterie probiotyczne są dedykowane pszczołom, a ich właściwości związane ze źródłem ich pochodzenia, w naturalny sposób zabezpieczają jelito pszczele, a tym samym chronią przed patogenami.

Wynalazek przedstawiono w poniższych przykładach wykonania

P r z y k ł a d 1. Sposoby izolacji i oznaczania nowych szczepów bakterii według wynalazku

Z pszczół miodnych Apis mellifera wypreparowano przewody pokarmowe, a następnie treść jelita wysiewano na podłoża mikrobiologiczne. Bakterie z grupy mlekowych, namnażano na różnych podłożach dedykowanych hodowli bakterii mlekowych, takich jak: podłoże MRS o składzie: glukoza 20 g/l; ekstrakt drożdżowy 4 g/l; ekstrakt mięsny 8 g/l; pepton K 10 g/l; cytrynian triamonu 2 g/l; wodorofosforan (V) dipotasu 2 g/l; octan sodu 5 g/l; siarczan magnezu x7H2O 0,2 g/l, siarczan manganu (II) x4H2O 0,05 g/l oraz Tween 80 l ml/l, podłoże MRS z dodatkiem fruktozy w zakresie 1-300 g/l, a także podłoża FYP o składzie: D - fruktoza 10 g/l; ekstrakt drożdżowy 10 g/l; polypepton 5 g/l; octan sodu 2 g/l; siarczan magnezu x7H2O 0,2 g/l; siarczan manganu (II) x4H2O 0,01 g/l; siarczan żelaza (II) x7H2O 0,01 g/l; chlorek sodu 0,01 g/l oraz Tween 80 0,46 ml/l, wzbogacane dodatkami fruktozy w ilości 1-300 g/l; a drugie - dodatkiem glukozy w ilości 1-200 g/l. Kolejnym podłożem, na którym prowadzono hodowle było podłoże GYP o składzie takim samym jak podłoże FYP, z tym że zamiast fruktozy występuje glukoza w zakresie 1-200 g/l, podłoże GYP z dodatkiem fruktozy w zakresie 1-300 g/l oraz podłoże GYP z dodatkiem fruktozy w zakresie 1-300 g/l i pirogronianem. Hodowle bakteryjne, prowadzone były w warunkach beztlenowych i tlenowych, w temperaturze mieszczącej się w zakresie od 10 do 42°C. Po dokonaniu wstępnej selekcji, wybrano kolonie bakteryjne o najwyższym stopniu wzrostu i ponownie przesiano je na wyżej wymienione stałe podłoża mikrobiologiczne. Tak wyrosłe z jednej komórki bakteryjnej czyste kultury szczepów, ponownie namnożono na wymienionych wyżej podłożach, po czym zagęszczono poprzez odwirowanie, a osad podzielono na dwie części.

Z jednej części osadu, znanymi metodami, wyizolowano DNA, a następnie w reakcji PCR, powielono fragment DNA wybranych szczepów za pomocą znanych starterów 27F i 1507R o sekwencjach

PL 233 794 B1 przedstawionych w wykazie. W ten sposób powielono fragment genu 16S rRNA, który posłużył do klasyfikacji wyizolowanych szczepów do poszczególnych rodzajów i gatunków bakterii. Powielone fragmenty DNA, otrzymane z nowych szczepów bakteryjnych, zsekwencjonowano i porównano ze znanymi sekwencjami umieszczonymi w genetycznej bazie danych NCBI, co pozwoliło na sklasyfikowanie wyizolowanych nowych szczepów bakterii do gatunków Lactobacillus kunkeei i Fructobacillus fructosus.

Z gatunku Lactobacillus kunkeei, wyizolowano 12 szczepów takich jak: L. kunkeei CH1, L. kunkeei CH2, L. kunkeei CH3, L. kunkeei Z1, L. kunkeei Z3, L. kunkeei Z5, L. kunkeei III1, L. kunkeei VI1, L. kunkeei VI3, L. kunkeei VI4, L. kunkeei VI6, L. kunkeei VII4 oraz z gatunku Fructobacillus fructosus, taki e jak: F. fructosus V5 i F. fructosus VIII1.

Sekwencje nowych szczepów zostały umieszczone w genetycznej bazie danych NCBI pod numerami: L. kunkeei VI3 - MF461307; L. kunkeei III1 - MF461308; L. kunkeei VI1 - MF461309; L. kunkeei CH1 - MF461310; L. kunkeei VI4 - MF461311; L. kunkeei CH2 - MF461312; L. kunkeei Z1 - MF461313; L. kunkeei Z5 - MF461314; L. kunkeei Z3 - MF461315; L. kunkeei CH3 - MF461316; L. kunkeei VII4 - MF461317; L. kunkeei VI6 - MF461318; F. fructosus VIII1 - MF461319 oraz F. fructosus V5 - MF461320.

Druga część rozdzielonego osadu, posłużyła do założenia czystych hodowli nowych szczepów bakteryjnych, ich namnożenia, a po usunięciu podłoża hodowlanego otrzymane koncentraty, zliofilizowano i używano do sporządzania preparatów probiotycznych dla pszczół.

P r z y k ł a d 2. Preparaty na bazie nowo wyizolowanych szczepów bakterii probiotycznych według wynalazku

Wyizolowane i oznaczone według przykładu 1, poszczególne hodowle szczepów bakterii, L. kunkeei, takie jak: CH1, CH2, CH3, Z1, Z3, Z5, III1, VI1, VI3, VI4, VI6, VII4 oraz szczepy F. fructosus, V5, i VIII1, rozlewano pojedynczo do fiolek i liofilizowano, doprowadzając do liczby bakterii od 1x10³ do 1x1011/ml.

Tak przygotowane fiolki stanowiły gotowe składniki do mieszania w czystej postaci z pokarmem pszczelim w postaci syropu cukrowego, ciasta pszczelego i innych, lub w postaci mieszanin wybranych szczepów, przy czym wymienione preparaty, korzystnie, dla zwiększenia trwałości preparatu w przypadku jego masowej produkcji, wzbogacano o znane substancje osłaniające i utrwalające. Dla przeprowadzania dalszych badań opisanych w kolejnych przykładach, sporządzono preparat według wynalazku, pod nazwą preparat 1, zawierający szczep CH1 L. kunkeei o łącznej zawartości 1x1011 bakterii w 1 ml preparatu.

Kolejny preparat probiotyczny, pod nazwą preparat 2, sporządzono ze szczepu CH1 L. kunkeei w liczbie 1x10³ bakterii w 1 ml preparatu; do bakterii dodano osłaniacz o następującym składzie: laktoza 10 g/l; laktoalbumina 10 g/l; glutaminian potasu 10 g/l; NaCl 3,4 g/l; KCl 0,2 g/l; Na2HPO4 27,87 g/l; KH2PO4 19,52 g/l i żelatyna 5 g/l.

Następny preparat pod nazwą preparat 3, sporządzono ze szczepu VIII1 F. fructosus w łącznej liczbie 1x10⁴ bakterii w 1 ml preparatu, do których dodano osłaniacz o następującym składzie: sacharoza 10 g/l; surowicza albumina wołowa (BSA) 5 g/l; laktoalbumina 5 g/l; glutaminian potasu 10 g/l; glicerol 1,7 g/l; laktuloza 0,1 g/l; NaCl 1,7 g/l ; KCl 0,1 g/l; Na2HPO4 27,87 g/l; KH2PO4 19,52 g/l i żelatyna 5 g/l.

Kolejny preparat pod nazwą preparat 4, sporządzono ze szczepów L. kunkeei: CH1, CH2, CH3, Z1, Z3, Z5, III1, Vl1, VI3, VI4, VI6 oraz VII4, w łącznej liczbie 1x10⁵ bakterii w 1 ml preparatu. Następny preparat pod nazwą preparat 5, sporządzono ze szczepów L. kunkeei: Z3, Z5, III1 i VIII1 w łącznej liczbie 1x10⁶ bakterii w 1 ml preparatu, do których dodano osłaniacz zawierający w swoim składzie: trehalozę 10 g/l; odtłuszczone mleko w proszku 4 g/l; dekstran 3 g/l; laktoalbuminę 3 g/I; glutaminian potasu 10 g/l; glicerol 1,7 g/l; NaCl 1,7 g/l; KC1 0,2 g/l; Na2HPO4 27,87 g/l; KH2PO4 19,52 g/l i żelatynę 5 g/l. Inny preparat pod nazwą preparat 6, sporządzono ze szczepów L. kunkeei VI3 i VI6 o łącznej liczbie 1x10⁷ bakterii w 1 ml preparatu. Inny preparat, pod nazwą preparat 7, sporządzono ze szczepów F. fructosus V5 i VIII1 w łącznej liczbie 1x10⁸ bakterii w 1 ml preparatu, a kolejny, pod nazwą preparat 8, sporządzono ze szczepów L. kunkeei: CH1, CH2, CH3, Z1, Z3, Z5, III1, Vl1, VI3, VI4, VI6, VII4 oraz szczepów F. fructosus V5 i VIII1, w łącznej liczbie 1x10⁹ bakterii w 1 ml preparatu, do których dodano osłaniacz zawierający w swoim składzie: trehalozę 10 g/l; glikol polietylenowy (PEG) 5 g/l; laktoalbuminę 5 g/l; polisorbaty 10 g/l; NaCl 3,4 g/l; KCl 0,2 g/l; Na2HPO4 27,87 g/l; KH2PO4 19,52 g/l oraz żelatynę 5 g/l.

PL 233 794 B1

P r z y k ł a d 3. Badanie tolerancji przewodu pokarmowego pszczół na preparaty probiotyczne według wynalazku

Do eksperymentu przygotowano po 6 klatek, w których umieszczono po 40 zdrowych pszczół, dla każdego z badanych preparatów otrzymanych w punkcie 2 oraz 6 klatek, w których również umieszczono po 40 zdrowych pszczół, traktowanych jako grupa kontrolna eksperymentu. Z poszczególnych klatek wybrano po 5 zdrowych pszczół, wypreparowano ich jelita, zważono i przeniesiono do jałowych probówek. Treść jelit wysiano na podłoża mikrobiologiczne MRS, które inkubowano w atmosferze 5% CO2, w ciągu 72 godz. i temp. 30°C. Następnie policzono kolonie bakteryjne w odniesieniu do 1 mg zawartości jelita.

Grupę kontrolną, karmiono czystym 35% syropem cukrowym zaś w pozostałych grupach eksperymentalnych pszczoły dokarmiano przez 7 dni różnymi pokarmami pszczelimi z dodatkiem preparatów ze szczepami bakteryjnymi, otrzymanymi w przykładzie 2. Preparaty oznaczone jako 1 i 5, dodawano do 35% syropu cukrowego, preparaty 2 i 3 do ciasta pszczelego, a preparaty 4, 6 i 8 do cukru inwertowanego, zaś preparat 7 do melasy.

Po 7 dniowym okresie karmienia, ponownie wybrano po 5 pszczół z każdej klatki, wypreparowano ich jelita, zważono i analogicznie jak poprzednio, określono liczbę bakterii w odniesieniu na 1 mg zawartości jelita.

Po 14-dniowym okresie kwarantanny wybrano po 5 pszczół z każdej klatki, wypreparowano ich jelita, zważono i określono liczbę bakterii w odniesieniu na 1 mg zawartości jelita.

Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Średnio, zawartość bakterii w jelitach pszczół zarówno z rodzaju Lactobacillus, jak i Fructobacillus, w trakcie karmienia preparatami według wynalazku uległa w naturalny sposób powiększeniu, jednakże po 14-dniowym okresie kwarantanny, wróciła do poziomu, jaki oznaczono przed rozpoczęciem eksperymentu. To dowodzi, że karmienie pszczół preparatami według wynalazku jest w pełni tolerowane przez przewód pokarmowy pszczół.

P r z y k ł a d 4. Wpływ preparatów według wynalazku na patogeny z rodzaju Nosema

a) zwalczanie nosemozy

Dla każdego z preparatów określonych w przykładzie 2, oraz dla grupy kontrolnej, przygotowano po 6 standardowych klatek, w których umieszczono po 40 zdrowych pszczół. Pszczoły sztucznie zakażono Nosema spp. i następnie karmiono przez 6 dni pokarmami z domieszką preparatów probiotycznych określonych w przykładzie 2.

Kontrolę stanowiły pszczoły zakażone, karmione czystym 35% syropem cukrowym.

b) zapobieganie nosemozie

Dla każdego z preparatów określonych w przykładzie 2, oraz dla grupy kontrolnej przygotowano po 6 standardowych klatek, w których umieszczono po 40 zdrowych pszczół, które karmiono przez 6 dni pokarmami z domieszką preparatów probiotycznych określonych w przykładzie 2. Następnie pszczoły sztucznie zakażono Nosema spp. Kontrolę stanowiły pszczoły zakażone, karmione czystym 35% syropem cukrowym.

Preparaty nr 1 i 5 dodawano do 35% syropu cukrowego, preparaty 2 i 3 dodawane były do ciasta miodowo-cukrowego, zaś preparaty 4, 6 i 8 do cukru inwertowanego, a preparat 7 do melasy.

W końcowej fazie, z 10 pszczół stanowiących kontrolę oraz karmionych poszczególnymi preparatami probiotycznymi, wykonywano standardowe rozciery w dwóch powtórzeniach, dla sporządzenia preparatów mikroskopowych. Zarodniki liczono w komorze Burkera obserwowanej w mikroskopie optycznym Olympus BX61 i porównywano z preparatem kontrolnym, sporządzonym z rozcieru pszczół zakażonych, karmionych czystym pokarmem. Podczas gdy w grupie pszczół kontrolnych, zakażenie rozwinęło się w zakresie 7,2 mln - 10,1 mln zarodników Nosema spp./pszczołę, to w przypadku pszczół karmionych preparatami, liczba zarodników zmalała do granic do 0,1-0,2 mln zarodników/pszczołę.

Na uwagę zasługuje również fakt, że dodatek osłaniacza do preparatu probiotycznego, polepszający żywotność bakterii po liofilizacji, w pewnym stopniu wpływa korzystnie na zredukowanie liczby zarodników Nosema spp.. Wpływ preparatów według wynalazku na zwalczanie patogenów z rodzaju Nosema, w postaci spadku liczby ich chorobotwórczych zarodników w stosunku do kontroli, przedstawiono graficznie na rysunku jako fig. 1.

Dla wykazania zwiększenia odporności pszczół dokarmianych preparatami probiotycznymi według wynalazku i wydłużenia okresu ich przeżycia, na koniec eksperymentu liczono liczbę pszczół żywych w poszczególnych klatkach.

PL 233 794 B1

W hodowlach kontrolnych, w których pszczołom zakażonym zarodnikami Nosema spp, podawano jedynie czysty syrop cukrowy, przeżywało średnio 10 z 40 sztuk pszczół, natomiast w hodowlach karmionych preparatami określonymi w przykładzie 2, jako preparat 1-27 pszczół, preparat 2-2,3 pszczoły; preparat 3-16 pszczół; preparat 4-23 pszczoły; preparatu 5-26 pszczół; preparatu 6-16 pszczół, preparat 7-23 pszczoły, a w przypadku preparatu 8-24 pszczoły.

Wraz ze wzrostem liczby zakażonych pszczół żywych, malała ich śmiertelność, co zobrazowano w sposób graficzny na rysunku, jako fig. 2.

P r z y k ł a d 5. Bójcze działanie preparatów według wynalazku na bakterie Paenibacillus larvae, Escherichia coli, Raoultella Ornithinolytica i Klebisiella pneumoniae

Na znanych i dedykowanych podłożach stałych prowadzono 24-godzinną, wgłębną hodowlę szczepów L. kunkeei CH1, CH2, CH3, Z1, Z3, Z5, III1, Vl1, VI3, VI4, VI6, VII4 oraz F. fructosus V5, VIII1, po czym z każdej hodowli wycięto krążki, umieszczając je pojedynczo w otworkach na płytkach z posianymi wgłębnie, na znanych i dedykowanych podłożach stałych, szczepami Paenibacillus larvae, Escherichia coli, Raoultella ornithinolytica i Klebsiella pneumoniae. Hodowle bakteryjne inkubowano przez 24 h w temperaturze 35°C, po czym zmierzono strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów jako odległość od brzegu krążka do końca strefy zahamowania wzrostu.

Wyniki wielkości stref zahamowania wzrostu poszczególnych bakterii chorobotwórczych wskutek bójczego oddziaływania preparatów zawierających szczepy bakterii według wynalazku, wyrażone w mm, zamieszczono na rysunku jako tabela 2.

Wśród zamieszczonych wyników pomiarów, największą strefą zahamowania wzrostu poszczególnych bakterii, w stosunku do zerowej wartości strefy dla kontroli (płytki z bakteriami, na które nie działano preparatami według wynalazku), wyróżniają się bakterie Paenibacillus larvae, będące jednym z głównych patogenów chorobotwórczych pszczół miodnych - zgnilca amerykańskiego.

P r z y k ł a d 6. Badanie toksyczności preparatów według wynalazku na organizmy pszczół

Do eksperymentu przygotowano po 6 klatek, w których umieszczono po 40 zdrowych pszczół, dla każdego z badanych preparatów otrzymanych w punkcie 2 oraz 6 klatek, w których również umieszczono po 40 zdrowych pszczół, traktowanych jako grupa kontrolna eksperymentu. Grupę kontrolną, stanowiły pszczoły karmione czystym 35% syropem cukrowym, zaś pozostałe pszczoły dokarmiano pokarmami pszczelimi z dodatkiem preparatów określonych w przykładzie 2. Preparaty 1 i 5 dodawane były do 35% syropu cukrowego, preparatu 2 i 3 do ciasta pszczelego, zaś preparaty 4, 6 i 8 do c ukru inwertowanego, a preparat 7 do melasy. Po 21 dniach policzono i porównano liczbę martwych pszczół w poszczególnych klatkach hodowlanych z kontrolą. Liczba martwych pszczół w kontroli wynosiła 193 sztuki, zaś w klatkach gdzie pszczoły dokarmiano preparatami według wynalazku kształtowała się od 115 do 169 sztuk.

Liczby obrazujące przeżywalność pszczół w poszczególnych klatkach, przedstawiono na rysunku (fig. 2) oraz w postaci tabeli 3.

Mając na względzie naturalną śmiertelność pszczół, należy stwierdzić, iż preparaty według wynalazku to substancje nietoksyczne, przedłużające czas życia pszczół i w pełni bezpieczne jako dodatki do pszczelich pokarmów.

PL 233 794 Β1

Wykaz sekwencji

Starter 27F o sekwencji:

(5’- GAGTTTGATCCTGGCTCA -3’)

Starter 1507B. o sekwencji:

(5 ’ -TACCTTGTTACG ACTTC ACCCCAG-3 ’)

Zastrzeżenia patentowe

Claims (6)

1. Szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus kunkeei oraz z gatunku Fructobacillus fructosus, wyizolowane z przewodu pokarmowego pszczół miodnych, takie jak: Lactobacillus kunkeei CH1, Lactobacillus kunkeei CH2, Lactobacillus kunkeei CH3, Lactobacillus kunkeei Z1, Lactobacillus kunkeei Z3, Lactobacillus kunkeei Z5, Lactobacillus kunkeei 1111, Lactobacillus kunkeei VII, Lactobacillus kunkeei VI3, Lactobacillus kunkeei VI4, Lactobacillus kunkeei VI6, Lactobacillus kunkeei VII4 oraz Fructobacillus fructosus V5 i Fructobacillus fructosus VIII1, zdeponowane w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda, Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu, pod numerami: Lactobacillus kunkeei CH1 -B/00125; Lactobacillus kunkeei - CH2 B/00126; Lactobacillus kunkeei CH3 - B/00127; Lactobacillus kunkeei Z1 - B/00128; Lactobacillus kunkeei Z3 - B/00129; Lactobacillus kunkeei Z5 - B/00130; Lactobacillus kunkeei 1111 - B/00131; Lactobacillus kunkeei V11 - B/00132; Lactobacillus kunkeei VI3 - B/00133; Lactobacillus kunkeei VI4 - B/00134; Lactobacillus kunkeei VI6 - B/00135; Lactobacillus kunkeei VII4 - B/00136; Fructobacillus fructosus VI111 - B/00137 oraz Fructobacillus fructosus V5 - B/00138.

2. Szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus kunkeei oraz z gatunku Fructobacillus fructosus, jak opisano w zastrz. 1, do zastosowania w zwalczaniu i zapobieganiu chorób pszczół miodnych, a także we wzmocnieniu ich odporności i kondycji zdrowotnej.

3. Preparaty probiotyczne na bazie nowo wyizolowanych szczepów bakterii, zdefiniowanych w zastrz. 1, znamienne tym, że zawierają jeden z tych szczepów Lactobacillus kunkeei lub Fructobacillus fructosus, bądź dowolne ich mieszaniny.

4. Preparaty probiotyczne według zastrz. 3, znamienne tym, że mają postać liofilizatu.

5. Preparaty probiotyczne według zastrz. 3 i 4, znamienne tym, że zawierają substancje utrwalające i osłaniacze.

6. Preparaty probiotyczne według zastrz. 3, znamienne tym, że w 1 ml preparatu, zawarte jest od 1x10³ do 1x10¹¹ bakterii.