JP2010525809A

JP2010525809A - 新鮮な蜂蜜又はミツバチの蜂蜜産生管から単離された新規細菌

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Publication number: JP2010525809A
Application number: JP2010506128A
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Inventors: オロフソン、トビアス; バスケス、アレハンドラ
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Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2010-07-29
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Abstract

本発明は、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された、新たな単離された乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株及びビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に関する。これらの細菌株は、食品製品及び飲料製品、餌製品並びに医療用製品などの多くの製品においてそれらを有用なものにする、独自の特性を有している。

Description

本発明は、新たな単離された乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株及びビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に関する。本発明はさらに、これらの株を含む組成物及び製品に関する。

古代より医学において用いられてきた神秘的な食品である蜂蜜は、紀元前２０００年のエジプト人が既に報告している、ヒトの創傷に対する治癒効果で、何世紀もの間人々を惑わせてきた。

蜂蜜は、ミツバチのセイヨウミツバチ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）などのハチにより産生される。ハチが植物から集める花蜜は、主にスクロースからなる甘い液体である。ハチが巣に帰るときまでに、スクロースの大半は、グルコース及びフルクトースに変換される。蜂蜜はさらに、タンパク質、ビタミン及びミネラルを含む。

現在、モル浸透圧濃度及び酸性度に加えて、蜂蜜の治療特性は、ペルオキシダーゼオキシダーゼの作用としての過酸化水素含量（Ｗｈｉｔｅら、１９６３ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ７３、５７〜７０）、その種々のフラボノイド及びフェノール酸含量による花蜜の起源（Ｔａｏｒｍｉｎａら、２００１．ＩｎｔＪＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６９（３）、２１７〜２２５；Ｗａｈｄａｎ，Ｈ．Ａ．１９９８．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ２６（１）、２６〜３１）、並びに未同定の成分（Ｍｏｌａｎ，Ｐ．Ｃ．２００１．ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｏｕｎｄｓ（オンライン）；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｏｕｎｄｓ．ｃｏｍ／２００１／ｎｏｖｅｍｂｅｒ／Ｍｏｌａｎ／ｈｏｎｅｙ−ａｓ−ｔｏｐｉｃａｌ−ａｇｅｎｔ．ｈｔｍｌから入手可能）によって、説明される。過去３０年間に実施された科学的な試み（Ｌｕｓｂｙ，Ｐ．Ｅ．ら、２００５ＡｒｃｈＭｅｄＲｅｓ３６（５）、４６４〜４６７；Ｍｏｌａｎ，Ｐ．Ｃ．２００６．ＩｎｔＪＬｏｗＥｘｔｒｅｍＷｏｕｎｄｓ５（１）、４０〜５４ＩｎｔＪＬｏｗＥｘｔｒｅｍＷｏｕｎｄｓ５（２）、１２２；Ｍｕｎｄｏ，Ｍ．Ａ．ら、２００４ＩｎｔＪＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１、９７（１）、１〜８）にもかかわらず、蜂蜜の作用様式の多くに関する神秘は、今なお解決されていない。

蜂蜜が有する抗菌特性は、蜂蜜を、創傷の包帯における使用に適したものにしており、感染症の予防、壊死組織のデブリードマン、悪臭を放つ創傷の脱臭及び瘢痕形成の最小化を助ける。蜂蜜を含む創傷及び皮膚のケア製品は、ＷＯ２００４０００３３９及びＷＯ０３０４７６４２によって公知である。

今日の医療実務において、抗生物質は感染症を治療するために最も一般的に使用されている。しかし、抗生物質の大規模な使用により、抗生物質耐性病原性細菌が大きな問題になっている。食品産業では、食品の保存寿命を延長し、有害な病原性微生物の増殖を防止するために、防腐剤が大規模に使用されている。しかし、人々は、食品中の添加物の副作用（例えばアレルギー）に気が付きつつあり、より天然の食品についての要求が高まっている。これらの事実が、伝統医薬における興味、並びに古来の智慧に基づく新たな治療上の解決法及び防腐処理及び添加物を見出そうとする衝動を導いてきた。

本発明の目的は、蜂蜜由来の有益な特性を提供する、医療用製品、食品製品、及び餌製品を得ることである。

さらなる目的は、蜂蜜を合成により製造することである。

別の目的は、抗菌活性を有する新規細菌株を得ることである。

発明の要旨
これらの目的は、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された、新たな単離された乳酸菌属株及びビフィズス菌属株、並びにこれらの株を含む組成物及び製品、及び蜂蜜を製造する方法を提供することによって、本発明に従ってここで成就された。細菌株の単離のための方法がさらに提供される。

このように、本発明者らは、蜂蜜の製造に密接に関与する細菌株を見出した。これらの細菌株は、医療用製品、食品製品、飲料製品及び餌製品などの多くの製品においてそれらを有用なものにする、独自の特性を有する。単離された細菌株は、低温及び酸性環境中で迅速に増殖し、高度に濃縮された糖溶液中で増殖できる。これらの細菌株は、他の生物、特に食品を腐敗させる、ヒトにとって病原性の生物（例えば、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種）及びミツバチにとって病原性の生物（例えばパエニバチルス・ラルバエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｒｖａｅ））と、効率的に闘うことができる。独自の蜂蜜関連の起源を有するので、これらの細菌株は、蜂蜜含有製品において使用するのに充分適している。これらの製品は、独自の健康促進特性を有する。

今日まで、新鮮な蜂蜜又はハチの蜂蜜産生管から単離された細菌株は存在しなかった。ハチの蜂蜜産生管は、蜂蜜産生ハチ（例えばミツバチ属（Ａｐｉｓ）種）の体幹、口、食道及び蜜胃を伴う。したがって、腸又は消化管は、ハチの蜂蜜産生管の一部ではない。新鮮な蜂蜜は、１８重量％を上回る、好ましくは２０重量％を上回る水分含量を有する蜂蜜である。１８重量％を下回る水分含量を有する蜂蜜は、熟成蜂蜜、即ち、通常消費される蜂蜜である。

ラクトバチルス・クンケエイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）は、ハチに関する文献中に現れてきた。１つの報告は、社会性スズメバチのウェスプラ・ゲルマニカ（Ｖｅｓｐｕｌａｇｅｒｍａｎｉｃａ）幼虫の腸の微生物生態学の試験に関するものであり（Ｒｅｅｓｏｎ，Ａ．Ｆ．ら、２００３ＩｎｓｅｃｔＭｏｌＢｉｏｌ１２（１）、８５−９１）、第２の報告は、孤立性ハチのオスミア・ビコルニス（Ｏｓｍｉａｂｉｃｏｒｎｉｓ）幼虫の消化管細菌叢中の単一クローンに関するものである（Ｍｏｈｒ，Ｋ．Ｉ．及びＴｅｂｂｅ，Ｃ．Ｃ．２００６．ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ８（２）、２５８〜２７２）。これら２種の生物は蜂蜜産生管を欠き、蜂蜜を産生せず、したがってミツバチではない。

ハチの疾患は、感染症及び寄生虫状態であり、農業経済の甚大な損失に関連する。アメリカ腐蛆病（ＡＦＢ）を引き起こすパエニバチルス・ラルバエは、多くの国で感染したコロニーの破壊をもたらしている、ミツバチにとって最も危険な病原体の１つとみなされている（Ｇｅｎｅｒｓｃｈ，Ｅ．ら、２００５．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ７１（１１）、７５５１〜７５５５）。ＪＰ２２２２６５４は、ミツバチの免疫機能を増強するための餌における、ミツバチの消化管由来の乳酸菌属の種の使用を示唆している。これらの細菌種は、ミツバチの消化管から単離され、したがって、蜂蜜様の環境には適応していない。

ＪＰ２２２２６５４は、ミツバチの消化管から単離されたラクトバチルス・ビフィダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｉｆｉｄｕｓ）を開示している。この文献はさらに、ミツバチの消化管の刺激のための、この細菌並びにラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌａｃｔｉｓ）（即ち、アニマリス（ａｎｉｍａｌｉｓ））、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含むハチ用の餌を開示している。

本発明の第１の態様は、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された乳酸菌属又はビフィズス菌属の単離された細菌株に関する。

本発明の第２の態様は、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された乳酸菌属又はビフィズス菌属の単離された細菌株を含む組成物に関し、この組成物は医薬組成物であり得る。

第３の態様は、上記に概説した医薬組成物を含む医療用製品に関する。

本発明の第４の態様は、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された、乳酸菌属又はビフィズス菌属の単離された細菌株を含む、食品製品又は餌製品に関する。

本発明の第５の態様は、感染症又は胃腸管疾患を予防及び／又は治療するための医療用製品、食品製品、飲料製品又は医薬組成物を調製するための、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された、乳酸菌属又はビフィズス菌属の単離された細菌株の使用に関する。

本発明の第６の態様は、乳酸菌属株Ｂｉｕｔ２（ＬＭＧＰ−２４０９４）、乳酸菌属株Ｈｍａ２（ＬＭＧＰ−２４０９３）、乳酸菌属株Ｈｍａ８（ＬＭＧＰ−２４０９２）、乳酸菌属株Ｂｍａ５（ＬＭＧＰ−２４０９０）、乳酸菌属株Ｈｏｎ２（ＬＭＧＰ−２４０９１）（前記株は、２００７年４月３日にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されている）、ビフィズス菌属株Ｂｉｎ７（ＬＭＧＰ−２３９８６）、ビフィズス菌属株Ｈｍａ３（ＬＭＧＰ−２３９８３）、ビフィズス菌属株Ｂｉｎ２（ＬＭＧＰ−２３９８４）、ビフィズス菌属株Ｂｍａ６（ＬＭＧＰ−２３９８５）及びラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２（ＬＭＧＰ−２３９８７）（前記株は、２００７年１月１５日にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されている）並びにＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されたＨｍａ１１からなる群より選択される細菌株に関する。

第７の態様は、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された、乳酸菌属又はビフィズス菌属の細菌株を少なくとも１つ、糖供給源に添加するステップを含む、蜂蜜を産生するための方法に関する。

本発明の第８の態様は、本発明に従う細菌株を単離するための方法に関し、この方法は、ａ）１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜をサンプリングするステップ、又はハチから蜂蜜産生管を分離し、無菌培地中で管を振盪するステップ；ｂ）適切な培地上でａ）からのサンプルを細菌培養するステップ；ｃ）適切な培地上でｂ）で得られた細菌株（単数又は複数）を純粋培養及び単離するステップを含む。

本発明のさらなる利点及び目的は、とりわけ添付の図面を参照して、より詳細に記載される。

本発明に従う細菌株を含む系統樹を示す図である。類型株ラクトバチルス・クンケエイ（サンプル１）及びラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２（サンプル２）のＲＡＰＤパターンを示す図である。６５％のスクロース及び３５％の水を含む６５％糖溶液中での、種々の株の糖耐性を示す図である。１９％のフルクトース、１９％のグルコース、３７％のスクロース及び２５％の水を含む７０％糖溶液中での、種々の株の糖耐性を示す図である。

定義
本出願及び本発明に関しては、以下の定義が適用される。

用語「蜂蜜」とは、種々のハチの蜂蜜産生管において花の花蜜から産生された甘い粘性の液体を意味する。

用語「バクテリオシン」は、細菌が産生する抗菌物質に関する。バクテリオシンは、密接に関連する微生物に対して殺菌的作用を示す、生物学的に活性なタンパク質又はタンパク質複合体（タンパク質凝集物、リポ糖タンパク質、糖タンパク質など）である。乳酸細菌が産生するいくつかのバクテリオシンは、食品を腐敗させる、食品媒介性の病原性微生物に対して活性である。

用語「糖供給源」とは、甘い可溶性二糖又は小さいオリゴ糖の炭水化物を一般に意味する。糖供給源の例は、蜂蜜、糖、グルコース、フルクトース、スクロース及びマルトースである。

用語「ＣＦＵ」とは、コロニー形成単位を意味する。

用語「乳酸細菌、ＬＡＢ」は、乳酸菌属、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びビフィズス菌属に属する細菌などの、乳酸を産生する細菌に関する。

用語「プロバイオティック微生物」とは、一過性又は内在性の細菌叢の少なくとも一部を形成し、それにより、宿主生物に対して有益な予防効果及び／又は治療効果を示す微生物をいう。

用語「分子マーカー」は、ある細菌株又は関連する細菌株を同定するために使用できる、ヌクレオチド配列の鎖を意味する意図である。分子マーカーは、ハイブリダイゼーションアッセイ並びにＰＣＲなどの増幅アッセイにおいて使用できる。

用語「賦形剤」とは、製品又は組成物に添加される任意の非活性成分を意味する。

本明細書において、特に断らない限り、１つの（「ａ」又は「ａｎ」）は「１又はそれ以上」を意味する。

ミツバチ特異的細菌株
本発明は、少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から又は１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から単離された乳酸菌属又はビフィズス菌属の単離された細菌株に関する。単離された細菌株は少なくとも１つの株を伴い、したがって、１つ又はそれ以上の細菌株を伴い得る。ハチの蜂蜜産生管はさらに、体幹、口、食道及び蜜胃からなると定義でき、したがって、腸も消化管も排除される。このハチは好ましくは、蜂蜜産生ハチであるミツバチ属の種、好ましくはセイヨウミツバチ由来である。用語「新鮮な蜂蜜」は、ミツバチが巣に帰るまでに花蜜を集めてから３日以下の新しい蜂蜜として定義してよい。さらに「新鮮な蜂蜜」は、好ましくは約２０重量％を上回る水分含量を有していてよく、いまだ蝋で封じられていない蜂巣の個室中に存在し得る。天然蜂蜜の産生のための原料である、ハチが収集した花蜜の水分含量は、最大９３重量％であり得る。通常、花蜜中の水分含量は、約３０〜５０重量％であり得る。対照的に、熟成蜂蜜は約１８重量％を下回る水分含量となったものである。

この株は好ましくは、６５重量％の糖溶液中で少なくとも８日間、好ましくは７０重量％の糖溶液中で８日間、生存する能力を有し、この能力は、多くの産業適用で非常に重要である。本発明に従う細菌株は、食品を腐敗させる病原性微生物（例えば、ブドウ球菌属の種、リステリア属の種、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びパエニバチルス・ラルバエ）の増殖を阻害する能力を有し得る。

本発明に従う細菌株は好ましくは、乳酸菌属株Ｂｉｕｔ２（ＬＭＧＰ−２４０９４）、乳酸菌属株Ｈｍａ２（ＬＭＧＰ−２４０９３）、乳酸菌属株Ｈｍａ８（ＬＭＧＰ−２４０９２）、乳酸菌属株Ｂｍａ５（ＬＭＧＰ−２４０９０）、乳酸菌属株Ｈｏｎ２（ＬＭＧＰ−２４０９１）（前記株は、２００７年４月３日にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔＧｅｎｔ，Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ３５、Ｂ−０９９９Ｇｅｎｔ，ＢＥＬＧＩＵＭ）に寄託されている）、ビフィズス菌属株Ｂｉｎ７（ＬＭＧＰ−２３９８６）、ビフィズス菌属株Ｈｍａ３（ＬＭＧＰ−２３９８３）、ビフィズス菌属株Ｂｉｎ２（ＬＭＧＰ−２３９８４）、ビフィズス菌属株Ｂｍａ６（ＬＭＧＰ−２３９８５）及びラクトバチルス・クンケエイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）Ｆｈｏｎ２（ＬＭＧＰ−２３９８７）（前記株は、２００７年１月１５日にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されている）並びに本願出願前にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されたＨｍａ１１からなる群より選択され得る。

本発明に従う組成物は、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された、乳酸菌属又はビフィズス菌属の単離された細菌株を含む。この組成物は、少なくとも１つの細菌株又はいくつかの細菌株の混合物を含む。この組成物は、糖供給源、好ましくは蜂蜜、糖、フルクトース、スクロース、デキストリン、マルトース又はグルコースからなる群より選択される糖供給源をさらに含んでもよい。この組成物は、胃腸管疾患を予防し得る食品製品（例えば、本発明に従う株を使用して合成により産生された蜂蜜）又はこの株を含む食品製品（飲料製品など）であり得る。この食品又は飲料は、プロバイオティック、プレバイオティック又は共生の組成物又は製品として使用できる。この組成物はさらに、ハチ用餌製品などの餌製品であり得る。

この組成物は、医薬上許容される担体及び／又は希釈剤を含む、感染症又は胃腸管疾患を予防及び／治療し得る医薬組成物であり得る。この医薬組成物は、懸濁物、ゲル、クリーム、粉末又はカプセルの形態であり得る。

本発明に従う医薬製品は、１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された、乳酸菌属又はビフィズス菌属の単離された細菌株を含み、感染症又は胃腸管疾患を予防及び／又は治療し得、包帯、絆創膏又はスプレーの形態であり得る。

本発明に従う組成物を製造するための方法は、本発明に従う細菌株を少なくとも１つ、糖供給源に添加するステップを含む。この糖供給源は好ましくは、蜂蜜、糖、フルクトース、スクロース、デキストリン、マルトース又はグルコースからなる群より選択し得る。このような方法は合成蜂蜜の製造であり得、この方法では、前記少なくとも１つの株が、糖供給源の少なくとも一部を発酵することが可能である。

これら上述の組成物及び製品は、生きた細菌、凍結乾燥された細菌又は死滅した細菌を含んでもよい。さらに、これらは、細菌が産生する代謝産物及び／又はバクテリオシンを含んでもよい。凍結乾燥された細菌株を含む製品は、水の添加によって活性化できる。

本発明に従う細菌株を単離するための方法は、ａ）１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜をサンプリングするステップ、又はハチから蜂蜜産生管を分離し、無菌培地中で管を振盪するステップ；ｂ）適切な培地上でａ）からのサンプルを細菌培養するステップ；ｃ）適切な培地上でｂ）で得られた細菌株（単数又は複数）を純粋培養及び単離するステップ、を含む。この蜂蜜産生管は好ましくは、腸又は消化管による汚染を回避するために、食道の後且つ前胃の前で分離される。この方法はさらに、ｄ）食品を腐敗させる病原性微生物を阻害する前記株（単数又は複数）の能力を評価するステップを含んでもよい。

培養のための培地は、蜂蜜ベースの寒天、ＴｒｙｐｔｏｎｅＳｏｙＢｒｏｔｈ寒天（ＴＳＢ）（例えば、Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄのもの）、トマトジュース寒天（ＴＪ）（例えばＯｘｏｉｄのもの）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含む全目的培地（ＡＰＴ）（例えば、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙのもの）及びＲｏｇｏｓａ寒天（例えばＭｅｒｃｋのもの）から選択され得る。

本発明に従う好ましい細菌株を表１中に開示する。これらの細菌株は、乳酸菌属種及びビフィズス菌属種の分類学的名称に適合する、カタラーゼ陰性でグラム陽性の非胞子形成性乳酸産生桿菌である。これらはまた迅速に増殖し、強力な病原体阻害特性を有する。さらに、本発明に従う細菌株は、ヒトに対して無害である。

表１：単離された細菌株

表１に列挙した細菌株は、ブダペスト条約の下で、国際寄託に従って、ＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託された。これらの株の１６ＳｒＲＮＡ配列を他の乳酸細菌株と比較した系統学的分析により、単離された株が乳酸菌属及びビフィズス菌属に属することが確認された。実施例中でさらに具体的に記載するように、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のほぼ完全な配列が決定されており、これらの配列を使用して、データベースＲｉｂｏｓｏｍａｌＤａｔａｂａｓｅＰｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）（Ｃｏｌｅ，Ｊ．Ｒ．ら、２００５．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１、３３）中で１６ＳｒＲＮＡ配列類似性について検索した。このデータベースは、それらの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子による細菌の同定のために使用される。全ての生物間で高度に保存されている１６ＳｒＲＮＡ配列の比較は、生物間の系統学的関連性を評価するために使用できる。

図１は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中の約１４００の位置の距離行列分析に基づいた系統樹を開示している。この系統樹は、近接接合法を使用して構築したものであり、進化距離は、ＰＡＵＰのＬｏｇＤｅｔ／Ｐａｒａｌｉｎｅａｒ法を使用して概算した。略号：（Ｂ．）ビフィズス菌属、（Ｌ．）乳酸菌属、（Ｐ．）ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、（Ｐａｒａｌ．）パララクトバチルス属（Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）。類型株番号：ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）ＪＣＭ１１１５、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＤＳＭ２００７５、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＡＴＣＣ３３８２０、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）ＡＴＣＣ３３３２３、ラクトバチルス・バースモルデンシス（Ｌ．ｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ）ＫＵ−３、ラクトバチルス・カリゼンシス（Ｌ．ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ）ＤＳＭ１６０４３、パララクトバチルス・セランゴレンシス（Ｐａｒａｌ．ｓｅｌａｎｇｏｒｅｎｓｉｓ）ＬＭＧ１７７１０、ペディオコッカス・パルバラス（Ｐ．ｐａｒｖｕｌｕｓ）ＪＣＭ５８８９、ペディオコッカス・イノピナタス（Ｐ．ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ）ＤＳＭ２０２８５、ラクトバチルス・キタサトニス（Ｌ．ｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ）ＪＣＭ１０３９、ラクトバチルス・ハムステリ（Ｌ．ｈａｍｓｔｅｒｉ）ＤＳＭ５６６１、ラクトバチルス・アミロリティクス（Ｌ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＤＳＭ１６６４、ラクトバチルス・クンケエイ（Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ）ＹＨ−１５、ビフィドバクテリウム・サーマシドフィルム亜種ポルシナム（Ｂ．ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍｓｕｂｓｐ．ｐｏｒｃｉｎｕｍ）Ｐ３−１４、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（Ｂ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ２５９１０、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ（Ｂ．ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ）ＡＴＣＣ２５９１１、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＳＭ２００７９、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＪＣＭ１１３６、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＪＣＭ１１４９、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＪＣＭ１１３４、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４９３１、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ２００１６、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＤＳＭ１０１４０、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）ＡＴＣＣ１５７００、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＡＴＣＣ１５６９７。

乳酸菌株Ｂｉｕｔ２、Ｈｍａ２、Ｈｍａ８及びＢｍａ５は、系統樹により示されるとおり、乳酸菌属内の新たな種である。これらの細菌株は、乳酸菌属内の他の類縁体とはクラスターを構成しない。このクラスターは、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の系統学的群内に割り当てられる。乳酸菌属Ｈｏｎ２は、乳酸菌属内の新たな種と第２のクラスターを構成する。しかし、このクラスターは、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）−ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）の系統学的群と、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の系統学的群との間に、割り当てられる。ラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、以前に記載されたラクトバチルス・クンケエイ類型株と同一であり、ラクトバチルス・カゼイ−ペディオコッカス属の系統学的群内に位置づけられる。しかし、微生物の全ＤＮＡを比較すると（図２を参照のこと）、これら２つの生物が互いに対応しないことは明らかである。

ビフィズス菌属Ｂｉｎ２、Ｈｍａ３及びＢｉｎ７は、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）に関連し、この種内の株として又はビフィズス菌属内の新たな種として割り当てることができよう。ビフィズス菌属Ｂｍａ６は、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ）に密接に関連している。

Ｈｍａ１１もまた、乳酸菌属内の新たな種である。

表１中の細菌株は、ミツバチ特異的であると同定されており、ミツバチの蜂蜜産生管中又は新鮮な蜂蜜中で見出された。これらの株は、蜂蜜産生の間にハチの蜂蜜産生管から蜂蜜に移る。ビフィズス菌属株Ｂｉｎ２、乳酸菌属株Ｈｏｎ２及びラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２もまた、新鮮な蜂蜜中に見出されている。蜂蜜中の水分含量が約１８％より下に低下した場合、非胞子形成性の細菌は生存せず、したがって、細菌の単離は不可能となる。蜂蜜は、３〜７日後、死んだ細菌並びにバクテリオシン及び代謝産物などの細菌成分を含む。

本発明に従う細菌株は、約２０〜３５℃の間（例えば、約２１〜３２℃の間）の、比較的低い温度範囲で最適に増殖し、この温度は、ミツバチが花蜜を集める時の蜜胃中の温度である。さらに、多くの他の乳酸細菌とは対照的に、これらの細菌株は迅速に増殖する。これらの細菌株はまた、酸性環境（例えば、ｐＨ２〜５の間）に耐性であり、このｐＨは、天然に存在する蜂蜜のｐＨである。

単離されたラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２は、通性嫌気性菌であり、弱くカタラーゼ陽性であり、グルコースからガスを産生し、グルコースの存在下でクエン酸塩又はリンゴ酸塩を利用し、フルクトースからマンニトールを産生する。さらに、たいていの場合、アルギニンからアンモニアを産生せず、硝酸塩を還元することもない。さらに、フルクトース、グルコース、スクロース及びラフィノースを発酵する。

本発明に従う細菌株は、ＡＰＴ寒天、Ｒｏｇｏｓａ寒天及びＴｒｙｐｔｉｃｓｏｙｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）寒天の１又は複数を添加する可能性を伴って、トマトジュース寒天などの培地上で増殖することが可能である（実施例を参照のこと）。これらのタイプの培地の適用は、細菌株の増殖のために非常に重要である。細菌株の増殖は、蜂蜜ベースの寒天プレート上でも達成できる。

表１中に列挙した細菌株は、ジアセチル、過酸化水素及び有機酸（例えば、乳酸及び酢酸）を産生する株である。これらの分子は全て、蜂蜜中に存在することが示されており、したがって、蜂蜜の抗菌特性、味及び品質に寄与し得る。これらの阻害剤は、細菌株が産生するバクテリオシン及び他の抗菌物質と共に、他の種の細菌及び酵母に対する広いスペクトルのタンパク質アンタゴニストの産生を示唆する。これらの細菌株は、蜂蜜中に一般に見出されるサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母の非常に強力な阻害剤である。酵母に対する蜂蜜の極度の感受性に起因して、蜂蜜の水分含量が約１８％を上回る場合、蜂蜜１グラム当たり胞子を１つだけ有していても、発酵を行えると予測される。記載された細菌株による蜂蜜の防腐はしたがって、蜂蜜の長期保存に重要である。表１中に列挙した細菌株の防腐能力は、多くの防腐適用（蜂蜜の防腐だけでなく、食品及び飲料一般の防腐も）においてそれらを有用なものにする。細菌性の阻害は、食品を腐敗させる食品媒介性の病原性微生物などの多くの細菌（クロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、大腸菌及びシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｏｃｕａ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、パニエバチルス・ラルバエが含まれる）に対して有効である。

本発明はまた、表１中に提示された細菌株の単離された純粋培養物に関する。このような純粋培養物は、寒天プレート上のコロニーとして、液体細胞懸濁物として、又は凍結された、スプレー乾燥された、若しくは凍結乾燥された調製物として、提供され得る。この培養物は、任意の適用（例えば、食品製品若しくは飲料製品、餌製品又は医療用製品）において、単独で使用しても組み合わせて使用してもよい。さらに、この培養物は、代謝産物、抗菌化合物及び／若しくはバクテリオシンを含み得及びこれらを産生するために使用され得、これらは、種々の製品又は組成物（例えば上で例示したもの）において使用できる。

さらに、本発明に従う製品又は組成物は、表１中に列挙した細菌の、２つ以上の異なる株を含んでもよい。この株の少なくとも２つ又はそれ以上を組み合わせることによって、細菌の効果は相乗的な様式で利用され、その結果より多くの種の病原体と闘うことになるであろう。さらに、多数の異なるバクテリオシンが産生されるので、製品の有効性は増強されるであろう。結果として、蜜胃及び新鮮な蜂蜜中の天然に存在する混合物などの、細菌株のより天然に存在する混合物が得られるであろう。

この製品は糖供給源を含み得、この糖供給源は、蜂蜜、糖、フルクトース、スクロース、デキストリン、マルトース又はグルコースを含む群より選択される。蜂蜜と組み合わせて本発明に従う細菌株を含む製品を製造することによって、これらの細菌株は、蜂蜜と相乗的な様式でそれらの機能を果たすであろう。したがって、本発明に従う細菌株の添加と、蜂蜜の効果を組み合わせることが所望され得る。

食品製品又は飲料製品
本発明の製品又は組成物は、本発明に従う株を少なくとも１つ含み、適切な食品又は飲料の成分又は栄養素を使用することによって、食品製品又は飲料製品の形態で調製できる。この食品又は飲料は、プロバイオティック、プレバイオティック又は共生の組成物又は製品として使用できる。

本発明に従う細菌株の１つ又は複数の添加によって、新規且つ改善された製品が得られる。これらの製品は、生きた、凍結乾燥した、又は死滅した細菌を含んでもよい。さらにこの製品は、細菌が産生する代謝産物及び／又はバクテリオシンを含んでもよい。凍結乾燥された細菌株を含む製品は、水の添加によって活性化できる。

本発明に従う細菌株を使用することによって、高度に天然の製品が産生できる。本発明の細菌株の少なくとも２つ又はそれ以上を組み合わせることによって、細菌の効果は相乗的な様式で利用できる。この様式で、蜂蜜中などの、より天然に存在する細菌株の混合物を得ることができる。細菌株の混合物の使用はまた、種々の望ましくない病原体を打ち負かす機会を増大させる。

製品は、蜂蜜又は例えば糖、フルクトース、スクロース、マルトース及びグルコースを含む群より選択される糖供給源を含んでもよい。少なくとも１つの本発明に従う細菌株を蜂蜜などの糖供給源と組み合わせて含む製品又は組成物を製造することによって、これらの細菌株は、糖供給源と相乗的な様式でそれらの機能を果たすであろう。蜂蜜の効果を本発明に従う細菌株の添加と組み合わせることが所望される。１つの実施形態によれば、蜂蜜及び細菌を含む飲料（例えば蜂蜜水飲料）が調製できる。この蜂蜜水飲料は、水、蜂蜜、本発明に従う細菌株及びフルーツジュース（例えば、レモンジュース、ライムジュース、オレンジジュース又はリンゴジュース）を混合することによって、調製できる。飲料中の細菌株の濃度は、製品１ｇ当たり約１０^１〜１０^１４ＣＦＵ（例えば、製品１ｇ当たり１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２又は１０^１３ＣＦＵ）であり得る。細菌株のこの濃度はまた、蜂蜜を添加せずに飲料製品中で使用できる。製品１ｇ当たり約１０^５ＣＦＵの濃度は、新鮮な蜂蜜中の細菌株の天然に存在する濃度を模倣する製品において使用され得る。蜂蜜水飲料はまた、ほとんど又は全く水分含量のない、凍結乾燥した細菌株及び上記ジュースを含む、濃縮物の形態で調製してもよい。

蜂蜜食品製品はさらに、他の食品製品の製造のための成分として使用してもよい。

本発明の目的は、消化管細菌叢を増大、補充及びバランスをとる目的のために、任意の消費者にとってより容易にアクセス可能であり、頻繁且つ通常の、細菌株を含む食品又は飲料を使用することであり、これは、毎日の健康状態及びスポーツ活動に関して利点をもたらすであろう。

別の実施形態によれば、細菌株の混合物を含む機能性の食品又は飲料が提供され、これらは、生きた又は生存形態で、並びにまたそれらのバクテリオシン及び／又は代謝産物が消化管に到達することができ、細菌叢に定着し、影響を与え又は増殖し、それによってヒトの健康状態にとって重要な有益な作用を果たす。消化管に到達する細菌株はまた非生存状態であってもよく、ひいては、それらが産生したバクテリオシン及び／又は代謝産物を介して有益な作用を果たす。この食品又は飲料は、胃腸管疾患の予防及び／又は治療のために使用され得る。

飲料の例は、乳製品、ジュース製品、ワイン、酢、スウェディッシュグログ（ＳｗｅｄｉｓｈＧｌｏｇｇ）、ビール、ソーダ、レモネード及びサイダー製品である。１つ又は複数の本発明に従う細菌株及び蜂蜜の添加を含む飲料は、風邪又は喉の不快感に対しての、運動選手、ストレスのかかった人の回復としての、又は免疫抑制入院患者の回復のための、蜂蜜水の形態であってもよい。飲料は、新鮮な蜂蜜中のような、所望の天然の効果を与えるミネラル及び他の物質を有するその特別な構成によって特徴付けられ得る。

本発明に従う細菌株を添加した飲料又は食品は、細菌株の保存効果から利益を得るであろう。酵母発酵は強く阻害されるであろう。さらに、これらの細菌株は、酵母発酵を終わらせるためにワイン生産において使用できる。この細菌は、製品中で、健康にとって利益となる天然起源の細菌として維持されるであろう。

この食品又は飲料はまた、例として、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤、フェノール、線維、オリゴ糖、フルクトオリゴ糖又はイヌリンなどの添加剤を含んでもよい。

食品製品の例は、肉製品、乳製品、果物製品、魚製品、パン製品又は野菜製品である。食品製品は、蜂蜜などの糖供給源を含んでもよい。この食品製品は、本発明に従う細菌を添加した新鮮な蜂蜜又は成熟蜂蜜であり得る。この蜂蜜食品製品は、本発明に従う細菌株又は本発明に従う細菌株の混合物を、蜂蜜又は他の製品に添加することによって調製できる。細菌株の濃度は、製品１ｇ当たり約１０^１〜１０^１４ＣＦＵ（例えば、製品１ｇ当たり１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２又は１０^１３ＣＦＵ）の濃度を達成するために、適切に選択できる。

本発明に従う細菌株はまた、食品及び飲料の発酵のための出発培養物としても使用できる。食品及び飲料の例は、パン、バターミルク、カカオ、バニラ、コーヒー、チーズ、グリーンチーズ、キュウリ、餌添加物、発酵魚製品、発酵乳、オリーブ油、ザウアークラウト、ソーセージ、ヨーグルト、ワイン、ビール、サイダー及び蜂蜜である。

医療用製品
本発明に従う細菌株は、病原性微生物の増殖を阻害するので、感染症を予防又は治療するのに有益である。これらの株及びそれらを含む製品は、軟膏、クリーム、スプレー、ゲル及び液体溶液などの形態で、ヒト又は動物の皮膚に移され得る。これらの細菌株は、感染症を予防又は阻害する所望の結果を達成するために、製品の種々の部分中に有効量の細菌株を含む、包帯、皮膚パッチ、ゲル又は絆創膏などの製品中にも含まれ得る。これらの製品は、創傷、ひりひりした痛み、熱傷、瘢痕、褥瘡、糖尿病性病変、挫瘡、湿疹、皮膚炎、癌、カタル、発疹、酵母感染症、毒素性ショック症候群、真菌感染症、ウイルス感染症及び潰瘍の治療のために使用され得る。

この製品は、細菌、ウイルス、酵母又は真菌の感染症の治療において使用され得る。目的のウイルス感染症は、口唇ヘルペスを含むヘルペスウイルス感染症であり得る。本発明に従う細菌株が闘う細菌感染症は、ブドウ球菌属の種、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種、シュードモナス属の種、リステリア属の種及び大腸菌を含む群より選択される種による感染症であり得る。

この医療用製品は、糖供給源（例えば、蜂蜜又は合成蜂蜜）と組み合わせて本発明に従う細菌株を含んでもよい。この製品はひいては、これら細菌株の効果と組み合わせて、蜂蜜の既知の効果から利益を得るであろう。この製品は、変動する重量％の、クリーム化した若しくは結晶化した蜂蜜、スプレー乾燥した、凍結乾燥した、風乾した蜂蜜及び／又は液体蜂蜜を含み得る。この蜂蜜は、新鮮な蜂蜜でも成熟蜂蜜でもよい。

この医療用製品は、本発明に従う細菌株が産生する代謝産物及び／又はバクテリオシンを含んでもよい。この製品は、生存細菌が全く存在しない無菌製品を達成するために、公知の様式でさらに無菌化してもよい。この製品は、細菌株が既に産生したバクテリオシン及び／又は代謝産物から利益を得るであろう。

活性成分（即ち、生きた又は死んだ細菌株並びにバクテリオシン及び／又は代謝産物）は、最終製品の約０．１重量％〜約１００重量％、例えば１重量％〜７０重量％、例えば５重量％〜５０重量％を構成し得る。典型的な製品は、１０^１〜１０^１４ＣＦＵ（例えば、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２又は１０^１３ＣＦＵ）の生存又は死滅細菌の濃度を、１グラムの投薬製剤中に含むであろう。

この医療用製品は、本発明の細菌株の少なくとも１又は複数或いは本発明に従う細菌株の１又は複数から産生されるバクテリオシンを含んでもよい。細菌株の混合物又は異なる細菌株由来のバクテリオシンは、病原体阻害効率に関して有益であり得る。

この医療用製品はまた、チューインガム中にこれらの細菌株を含んでもよい。この製品は、例えば歯肉炎及び歯垢の治療において使用できる。チューインガム製品の成分は、蜂蜜、蜜蝋、ゴム及び当該分野で公知の他の成分の１又は複数であり得る。

この医療用製品中の任意の成分には、抗生物質、殺菌剤及び他の抗菌剤などの医薬、ビタミン、緩衝剤、着色剤、ミネラル、調味料、香料、ゲル化剤又は他の化学化合物（例えば、抗酸化剤又はカルシウム）が含まれる。

この医療用製品は、フィルム、織布包帯、多層シート包帯、パッチ、ストラップ、ロープ構成又はラップの形態の基材材料を含み得る。基材材料の選択肢としては、寒天ゲルフィルム、アルギン酸塩包帯、ハイドロコロイド、発泡包帯などが含まれる。さらに、この製品は、医薬上又は生理学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤と共に、本発明に従う細菌株を含んでもよい。乾燥製剤のための担体は、トレハロース、マルトデキストリン、米粉、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、イノシトールなどであり得る。液体又はゲルベースの担体は、水、塩溶液、アルコールなどであり得る。医療用製品は、ひいては、吸収剤などに細菌株を適用することによって形成してもよい。

この医療用製品は、本発明に従う細菌と共に医薬上許容される担体を使用した医薬製品の形態であってもよい。医薬上許容される担体の例としては、種々の希釈剤及び賦形剤（例えば、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤及び当該分野で公知の他の担体）が含まれる。投薬は、丸剤、錠剤、粉末、溶液、懸濁物、エマルジョン又は顆粒の形態であり得る。錠剤は、標準的なコーティング材料でコーティングしてもよい。医薬製品中の細菌株の量は、製品の１投薬当たり約１０^５〜１０^１４ＣＦＵ（例えば１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２又は１０^１３ＣＦＵ）から選択され得る。この医療用製品は、胃腸管疾患の予防及び／又は治療のために使用され得る。

餌製品
本発明に従う細菌株は、ハチ及びハチ幼虫のための餌製品において有益であり得る。これらの製品は、ハチ又はハチの幼虫内の微生物細菌叢を強化又は再樹立するために使用されるプロバイオティック餌の形態であってもよい。使用される細菌株は、ハチの蜂蜜産生管中の天然に存在する細菌株である。したがって、本発明に従う細菌株は、蜂蜜産生管の微小環境内の任意の天然に存在する細菌株を打ち負かさないであろう。類似の製品中の、蜂蜜産生管に起源しない他の有益な細菌株の使用は、否定的な様式でミツバチの天然の細菌叢を変更する可能性がある。したがって、このタイプの本発明に従う餌製品は特に興味深いものとなろう。

この餌製品は、表１中に列挙した細菌株の１つ又はいくつかを含んでもよい。細菌株の混合物は、治療効率に関して有益であり得る。

細菌株の濃度は、製品１ｇ当たり約１０^１〜１０^１４ＣＦＵ（例えば、製品１ｇ当たり１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２又は１０^１３ＣＦＵ）の濃度を達成するために、適切に選択できる。

この餌製品は、病原性の細菌、ウイルス、真菌又はダニから、ミツバチ又はミツバチの幼虫を保護するために使用され得る。致死的な感染症を一般に導く、上記製品が闘うべき生物は、パエニバチルス・ラルバエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｒｖａｅ）、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、アスコスフェラ・アピス（Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａａｐｉｓ）、ミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、羽変形病ウイルス又はノゼマ・アピス（Ｎｏｓｅｍａａｐｉｓ）である。

細菌株又は細菌株混合物は、粉末、溶液又は固体として、ミツバチ又はミツバチの幼虫に投与され得る。粉末は、凍結乾燥された、スプレー乾燥された、又は風乾された形態であり得る。粉末は、取り扱い、輸送、保存が簡単であり、より延長された賞味期限を有する。この粉末又は溶液は、ミツバチ又は幼虫上に、振りかけてもスプレーしてもよい。有効な投与は、ミツバチの巣に粉末又は溶液を直接スプレー又は振りかけることによっても達成できる。

この餌製品はまた、糖供給源を含んでもよい。この糖供給源は、蜂蜜、糖、スクロース、グルコース、フルクトース、デキストリン、マルトース又は他の形態の糖であり得る。この糖供給源は、エネルギー源としてミツバチ又はミツバチの幼虫により使用され得る。糖溶液中で蜂蜜を使用することによって、いくつかの利点が得られる。第１に、ハチは、単純なスクロース含有溶液よりも蜂蜜含有溶液を使用したがる。第２に、蜂蜜は、さらなる有益な成分（例えば、ミネラル、ビタミン及びタンパク質）を含む。

本発明に従う細菌株を使用する場合、それらを含むミツバチ餌は、バクテリオシン及び代謝産物の細菌及び酵母阻害特性から利益を得るであろう。結果として、この糖溶液は、糖溶液の通常の場合のようには、発酵しないであろう。

この餌製品はまた、花粉、ダイズ、ハチパン又は合成ハチパン（秋、冬及び春の間、ミツバチ及びミツバチの幼虫にとって重要な食料源）を含んでもよい。この餌製品はまた、他の添加剤（例えば、ビタミン、ミネラル、脂肪、炭水化物及びタンパク質）を含んでもよい。

これらの細菌株の投与は、ミツバチ社会が弱く且つ休眠中である秋又は冬において、特に重要である。これらの細菌株は、その社会に存在する蜂蜜又は糖の防腐剤としても機能するであろう。花蜜が入手できない秋、冬及び早春の期間において、ハチ及びハチの幼虫は、細菌、ウイルス、真菌及び寄生生物の感染症に対して特に脆弱である。本発明に従う細菌株をミツバチ及びミツバチの幼虫に投与することによって、細菌は、それらの元の天然環境であるミツバチの蜂蜜産生管に到達したときに、生存可能な状態になるであろう。それにより、ハチ及び幼虫は、ミツバチ及び幼虫の病原体に対するより有効な保護を獲得した状態になっているであろう。

以下の実施例は、本発明を任意の様式、形状又は形態で、明確に又は暗黙に説明することを意図しているが、限定することは意図しない。

（例１）
ハチの巣の回収
約１２，０００匹のハチを有する小さいハチの巣を、スウェーデン南部のＳｋａｎｅの北西部に位置する自然保護区Ｋｕｌｌａｂｅｒｇの野生のラズベリーの花畑に輸送した。その期間の間、隣接区域には開花していた花は他に存在せず、ハチの巣には、実験開始の時点では蜂蜜が入っていなかった。２週目に、サンプリングを、ハチの巣周囲の新鮮なラズベリーの花、出て行く働きバチ及び入ってくる働きバチ、並びにハチの巣からのラズベリー花の新鮮な蜂蜜に対して実施した。これらのサンプルに加えて、回収したラズベリーの蜂蜜を保存し、２ヶ月の保存後に分析した。これらのサンプルを、全ての細菌の目的のため及びＬＡＢの選択のために、４種の異なるタイプのインキュベーション培地中で培養した。細菌の正体を、クローニング及び純粋培養の両方の技術を使用して、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の分析によって明らかにした。

（例２）
ミツバチからの細菌の単離
２０個のラズベリーの花、１０匹の入ってくる働きバチ及び１０匹の出て行く働きバチ、並びに１０匹の養育バチを取り、５ｍｌの無菌生理食塩水（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０及び０．１％ｗ／ｖのペプトン）を含む異なる無菌１０ｍｌチューブ中に仕分けした。さらに、０．５ｍｌの新鮮な蜂蜜、５匹のミツバチ幼虫（２〜５日齢）、５つのミツバチ頭部、５つのミツバチ蜜胃及び１つのミツバチ後腸を、０．９ｍｌの生理食塩水を含む１．５ｍｌの無菌マイクロチューブ中に個別に収集した。ミツバチの口及び体幹の分析を、無菌の外科用メス及びピンセットを用いて体から頭部を分離して実施した。これらの頭部を無菌希釈培地中で振盪し、その後細菌培養を行った。花蜜で満たされたミツバチの胃を、無菌の外科用メス及びピンセットを用いて食道の後且つ前胃の前で切り出すことによって、ミツバチの胃の分析を実施し、消化管のどの部分もサンプルを汚染しないことを保証した。これらのチューブを振盪し、直ぐに実験室に輸送した。直接的な１６ＳｒＲＮＡ遺伝子分析のために、０．５ｍｌの懸濁物を含むチューブを−２０℃で凍結し、保存した。

表１中に列挙した細菌株を、健康なミツバチから生存状態で単離した。本発明に従う細菌を最も多数生じた花の花蜜供給源は、ラズベリーの花であることが見出された。細菌株の消化管サンプルは、本発明に従う株が存在しないことを実証した。

（例３）
蜜胃由来の細菌の培養
例２に記載したサンプルから、無菌生理食塩水による希釈系列を作成し、０．１ｍｌの体積を異なる増殖培地上に広げた。増殖及び純粋培養物を、ＴｒｙｐｔｏｎｅＳｏｙＢｒｏｔｈ寒天（ＴＳＢ）（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、トマトジュース寒天（ＴＪ）（Ｏｘｏｉｄ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含む全目的培地（ＡＰＴ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＲｏｇｏｓａ寒天（Ｍｅｒｃｋ）を用いた異なる希釈から、異なる培地（表２を参照のこと）上で得た。これらの培地は製造業者の指示に従って製造した。使用した単離培地の組み合わせが、細菌の増殖にとって非常に重要であることが示された。全ての単離体は、Ｂｍａ５（Ｒｏｇｏｓａ上で限定的に増殖した）及びＦｈｏｎ２（Ｒｏｇｏｓａ上でほとんど増殖しなかった）以外は、Ｒｏｇｏｓａ上で非常に良好に増殖した。対照的に、Ｆｈｏｎ２（ラクトバチルス・クンケエイ）は、ビフィズス菌属に属する株（Ｂｉｎ２、Ｂｉｎ７、Ｂｍａ６及びＨｍａ３）と共に、トマトジュース寒天上で非常に良好に増殖した。他の乳酸菌属種（Ｂｉｕｔ２、Ｈｏｎ２、Ｈｍａ２、Ｈｍａ８、Ｈｍａ１１及びＢｍａ５）は、トマトジュース寒天上で限定的に増殖した。これらの単離体を、３７℃で２〜３日間、好気的及び嫌気的の両方で培養した。１０〜３０個のコロニーを、各々が３０〜３００個のコロニーを含む、使用した全ての培地からランダムにピックアップし、純粋（単離体）にするために再培養した。

表２：特異的培地上での細菌の増殖

（例４）
クローニング及びＰＣＲ増幅
純化した単離体由来の１コロニーを、０．１ｍｌの無菌水及びガラスビーズ（０．１０６ｍｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＵＳＡ）と共に、０．２Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｔｒｉｐｓ（Ａｂｇｅｎｅ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）中に配置した。細胞を、ＭＳ１Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ（ＩＫＡＷｏｒｋｓ，ＩＮＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）中で４５分間振盪することによって分解した。Ｇａｌａｘｙミニ遠心機（ＶＷＲ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）中で２０２００×ｇで５分間の遠心分離後、１μｌの上清を、以下のＰＣＲ反応で使用した。

増幅は、細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の保存された領域にアニールするように設計されたプライマーを用いて実行した。フォワードプライマーＥＮＶ１（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＩＩＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡに対して位置８〜２７に対応し、リバースプライマーＥＮＶ２（５’−ＣＧＧＩＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）は、位置１５１１〜１４９２に対応した（Ｂｒｏｓｉｕｓら、１９７８）。ＰＣＲ反応は、５０μｌの総容量中に、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．３）、２００μｍｏｌ１^−１の各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０ｐｍｏｌの各プライマー及び１〜１０μｌのテンプレートを含んだ。増幅は以下のとおりに、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した：（９５℃で１５秒間、４８℃で３０秒間及び７２℃で９０秒間）×３０サイクル、その後７２℃で１０分間の伸長ステップ。ＰＣＲ産物を、配列決定のために−２０℃で保存した。

ＥＺ１ＤＮＡＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）用の手順に従って、１９０μｌのＢｕｆｆｅｒＧ２及び１０μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをペレットに添加し、ＭＳ１Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒで２分間混合した。これらのサンプルを５６℃の水浴（ＪｕｌａｂｏＳＷ１、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、ペレットが溶解するまでインキュベートした。１５分毎に、プロセスを加速するためにサンプルを１分間混合した。ガラスビーズ（０．１０６ｍｍ）を添加し、細胞をＭＳ１Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ中で４５分間振盪することによって分解させた。Ｇａｌａｘｙミニ遠心機での２０２００×ｇで５分間の遠心分離後、０．１ｍｌの上清を、Ｑｉａｇｅｎの組織カードを使用して、ＢｉｏＲｏｂｏｔＥＺＩバージョン１．３のＥＺ１ＤＮＡＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（ＱｉａｇｅｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）用の手順に従って、さらに処理した。プロセスの最後に、ＤＮＡを２００μｌの無菌水中に溶出した。

ＰＣＲ増幅を、ＰＣＲが導入するバイアスを最小化するために、各サンプルについて４つの複製で実施した。増幅を、５０℃のアニーリング温度を用いる以外は、単離体についてと同じ方法で実施した。各ＤＮＡ調製物からの４つのＰＣＲ産物を一緒にプールし、１．５％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル（ＴｙｐｅＩＩＩ、ＨｉｇｈＥＥＯ、Ｓｉｇｍａ、ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）上で泳動することによってチェックした。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光で可視化した。

プールしたＰＣＲ産物を、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲＤＮＡ及びＧｅｌＢａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）で精製した。精製した産物を、製造業者の指示に従って、ＴＯＰＯＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中にライゲーションし、コンピテントｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中に形質転換した。コロニーを、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ）及びＸ−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＬＢ寒天上で青／白スクリーニングした。２４個の白色コロニーを、各サンプルからランダムに選択し、再培養した。

クローニングされたＤＮＡを回収するために、ベクターの開始点及び終点でアニーリングするように設計されたユニバーサルプライマーＭ１３フォワード（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）及びＭ１３リバース（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）を用いて増幅を実施した。ＰＣＲ反応は、５０μｌの総容量中に、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．３）、２００μｍｏｌ１^−１の各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０ｐｍｏｌの各プライマー及び１〜１０μｌのテンプレートを含んだ。増幅は、９４℃で１０分間の１回の変性ステップ、その後（９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間）×２８サイクル、その後７２℃で１０分間の伸長ステップを使用して、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。ＰＣＲ産物を、配列決定のために−２０℃で保存した。

（例５）
１６ＳｒＲＮＡの配列決定及び系統学的分析
単離された細菌に由来するＰＣＲ産物は、ユニバーサルプライマーＥＮＶ１及びＥＮＶ２を用いて、配列決定会社（ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈＡＢ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が配列決定した。これらの部分的１６ＳｒＲＮＡ配列を、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からアクセス可能な、ＡｄｖａｎｃｅｄＢＬＡＳＴ類似性検索オプション（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２５，３３８９−３４０２）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＰｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）に対して検索した。比較のために、配列は、ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ）からアクセス可能な別のソフトウェアＲｉｂｏｓｏｍａｌＤａｔａｂａｓｅＰｒｏｊｅｃｔＩＩに対しても検索した。これらの部分配列は、ほぼ１４００塩基対（５０〜１５００ｂｐの範囲）であった。

図１中の系統樹は、以下のコンピュータソフトウェアプログラムを使用して得た：アラインメントのためにＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン１．８１）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９７．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２４，４８７６−４８８２）、編集のためにＢｉｏＥｄｉｔ（バージョン６．０．７）（Ｈａｌｌ，Ｔ．、ＢｉｏＥｄｉｔＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔＥｄｉｔｏｒ，ＩｓｉｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）、及び系統樹の計算のためにＰＡＵＰ（バージョン４．０β）（Ｄ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄが書いたもの）。この樹は、進化距離概算ＬｏｇＤｅｔ／Ｐａｒａｌｉｎｅａｒモデルを用い、ＰＡＵＰにおいて近接接合法（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．及びＮｅｉ，Ｍ．１９８７．ＭｏｌＢｉｏｌＥｖｏｌ４，４０６−４２５）を使用して構築したものである。

（例６）
発酵パターン
ＡＰＩ５０ＣＨＬ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘＳＡ、Ｆｒａｎｃｅ）システムを使用して、それらの炭水化物発酵パターンによって細菌株を暫定的に同定した（表３を参照のこと）。トマトジュース寒天上での培養物を回収し、キットが提供した懸濁培地中に再懸濁した。製造業者の指示に従って、ＡＰＩストリップを接種し、分析した（４８時間後及び８２時間後）。

表３：発酵パターン

^＊＝ＣＨＬ培地に、無菌水中に懸濁した５％Ｗ／Ｖのカザミノ酸を補充し、無菌濾過した。

（例７）
ラクトバチルス・クンケエイ類型株及びラクトバチルス・クンケエイ株Ｆｈｏｎ２の発酵パターン及びＤＮＡフィンガープリンティング
ＡＰＩ５０ＣＨＬ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘＳＡ、Ｆｒａｎｃｅ）システムを使用して、それらの炭水化物発酵パターンによって、株Ｆｈｏｎ２及び類型株ラクトバチルス・クンケエイ類型株ＹＨ−１５を比較した。トマトジュース寒天上での培養物を回収し、キットが提供した懸濁培地中に再懸濁した。製造業者の指示に従って、ＡＰＩストリップを接種し、分析した（４８時間後及び８２時間後）。結果は、ラクトバチルス・クンケエイ類型株ＹＨ−１５は、Ｆｈｏｎ２が発酵できないＤ−ラフィノースを発酵でき、Ｆｈｏｎ２は、ラクトバチルス・クンケエイ類型株ＹＨ−１５が発酵できないＤ−トレハロース、グルコン酸カリウム及び５−ケトグルコン酸カリウムを発酵できる点で、異なっていた。ラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２を含む本発明に従う細菌株は、ラクトバチルス・クンケエイ類型株とは異なることが証明された。

ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析を使用して、ラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２を、ラクトバチルス・クンケエイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）類型株から識別した。実験室手順を、プライマー１２５４（５’−ＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’）を使用して、ＪａｎｓｓｏｎＤＳら、２００４．ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３，２９３−３００に従って実施した。プライマー１２５４を用いて得られたＲＡＰＤパターンの結果を図２に示す。ラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２を含む本発明に従う細菌株のＲＡＰＤパターンが、ラクトバチルス・クンケエイ類型株とは異なることが証明された。同一の細菌株は、細菌染色体組成に関して、アガロースゲル上で同一のパターンを示すはずである。図２中に番号１で示されたラクトバチルス・クンケエイ類型株は、９つのＤＮＡバンドを示し、番号２で示されたラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２は６つのＤＮＡバンドを示す。これらの株は、全ＤＮＡゲノムの組成が異なることを意味する、異なるバンド数及びまた異なるバンドパターンを有する。

上記のように、ラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２は、図１中の系統樹に示されるラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２と類型株との間の高い１６ＳｒＲＮＡ類似性にもかかわらず、新規ラクトバチルス・クンケエイ株である。

（例８）
ハチの巣の感染症
ハチの巣の１つに、幼虫病原体パエニバチルス・ラルバエを感染させた。この病原体による感染症は、通常であれば、致死的なアメリカ腐蛆病（ＡＦＢ）の発症を導くであろう。感染後、ハチの巣を、ラズベリーの花及びリンデンツリー（その花蜜は本発明に従う細菌にとってプレバイオティックとして作用する）の畑のそばに置いた。この時点で、パエニバチルス・ラルバエの数はその記録された幼虫１匹当たり８０億の最大ＣＦＵから減少し始め、ＡＦＢを発症することなく３週間後に消滅した。この結果は、他の花蜜よりもフルクトースをより多く含むラズベリー及びリンデンの花からの花蜜を与えた場合に、本発明に従う細菌株が一緒になってこの病原体と闘うことができることを、非常に明確に示した。

（例９）
ハチ及びハチの幼虫用のプロバイオティック餌（秋）
秋用のミツバチ餌製品（ハチ冬季休眠）を構成する凍結乾燥した本発明に従う細菌及び糖供給源を、１９％のフルクトース、１９％のグルコース、３７％のスクロース及び２５％の水を含む糖溶液とこの細菌を混合することによって調製した。使用した製品の総量は、ミツバチの社会１つ当たり１６ｋｇであり、この製品は製品１ｇ当たり１０^５ＣＦＵの細菌を含んだ。これらの成分を混合し、ハチ社会の上のビン中で、ハチ社会に与えた。ハチはこの溶液を摂取し、蝋で密封してそれらの蜂蜜の巣の小部屋中に保存した。

第２の適用において、凍結乾燥した細菌を１ｋｇの蜂蜜と混合し、製品１グラム当たり１０^７の細菌ＣＦＵ濃度にした。１ｋｇの蜂蜜を、１３ｋｇのスクロース及び１４ｋｇの水と混合した。この製品は、約５０％の花蜜などの糖含量及び蜜胃中の細菌ＣＦＵと類似の細菌ＣＦＵを有する。この糖溶液を、１日間静置し、その後ハチに投与した。この方法で、凍結乾燥された細菌は目覚めて増幅を開始し、使用前に有益な代謝産物及びバクテリオシンを産生する機会を持った。この糖溶液は、細菌を添加していない糖溶液を使用した通常の場合のようには、酵母発酵されなかった。糖溶液中に蜂蜜を使用することによって、いくつかの利点が得られた。第１に、ハチは、単純なスクロースよりもこの糖溶液を使用したがった。第２に、蜂蜜は、さらなる有益な成分（例えば、ミネラル、ビタミン及びタンパク質）を含む。

（例１０）
防腐研究
４×１０^７のＣＦＵラクトバチルス・クンケエイ株Ｆｈｏｎ２を、２００ｍｌの水、５ｍｌのレモンジュース及び１７ｍｌの蜂蜜と混合した。この蜂蜜水を、３週間冷蔵庫中に置いた。３週間後、この水は、発酵の味も細菌の味もせず、新鮮な味がした。ラクトバチルス・クンケエイの量を倍加したところ、酵母は検出できなかった。

（例１１）
糖耐性研究
本発明に従う細菌株並びに市販の製品株ラクトバチルス・アシドフィルスＤＳＭ２００７９、ラクトバチルス・カゼイＪＣＭ１１３４、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ２００１６、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクチス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＤＳＭ１０１４０及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＤＳＭ２００８１を、別個のバイアル中で、６５％のスクロース及び３５％の水を含む糖溶液と混合した。最終糖濃度は６５％であった。これらのバイアルを２２℃でインキュベートし、生存カウントを実施した。これらの結果により、本発明に従う細菌株が、市販の製品株（これらは全て８日後に死滅した）よりも、かなり糖耐性が高かった（８日後、１ｍｌ当たり１０^２ｃｆｕと１０^５ｃｆｕとの間のｃｆｕ数で、全てがなお生存していた）ことが実証された（図３を参照のこと）。

第２の試験を、１９％のフルクトース、１９％のグルコース、３７％のスクロース及び２５％の水を含む異なる糖溶液を用いた点以外は、最初の試験を繰り返すことによって実施した。この溶液中の糖濃度は７０％であり、これは、細菌にとっては非常に高い糖濃度である。また、これらの結果により、本発明に従う細菌株が、市販の製品株（これらは全て８日後に死滅した）よりも、かなり糖耐性が高かった（８日後、１ｍｌ当たり１０^３ｃｆｕと１０^６ｃｆｕとの間のｃｆｕ数で、全てがなお生存していた）ことが実証された（図４を参照のこと）。

（例１２）
病原体微生物及び食品を腐敗させる微生物の阻害研究
本発明に従う細菌株を、食品及び蜂蜜を腐敗させる酵母である出芽酵母、食品を腐敗させる細菌であるシュードモナス・フルオレッセンス及びクロストリジウム・チロブチリカム、ラクトバチルス・サケイ、バチルス・セレウス、リステリア・イノキュア並びにヒト病原体である大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス及び黄色ブドウ球菌（ここで、たとえこの種が病原体でなくても、属としてのシュードモナス属も示される（この場合、シュードモナス・フルオレッセンスなど））、並びにミツバチ病原体パエニバチルス・ラルバエに対してスクリーニングした。本発明に従う細菌株を、０．５％のＬ−システインを含むＭＲＳ培地上で嫌気的に３５℃で３日間培養し（２％のフルクトースを含むＭＲＳ培地上で培養したＦｈｏｎ２を除く）、継続した増殖を、０．５％のＬ−システインを含むＭＲＳ寒天プレート（トマトジュース寒天プレート上で培養したＦｈｏｎ２を除く）の中心で嫌気的に３５℃で１日間、別々に得た。表４中の試験株を、４２℃の温度で、表４に従って液体培地上で培養し、次いで０．８％の寒天を含む新たな培地と混合した。この培地と細菌とを混合し、本発明に従う細菌株を培養したプレート上に注いだ。次いで、これらのプレートを３５℃で３日間インキュベートし、阻止帯について分析した。阻止帯の直径はｃｍで測定した。

表４：病原体微生物及び食品を腐敗させる微生物の阻害

^＊．．．ｃｍは、試験細菌を本発明に従う細菌株の上で培養したときの、本発明に従う細菌株の周囲の阻止帯を示す。

これらの結果は、食品を腐敗させる細菌又は病原性細菌の阻害を明確に実証し、最も頻繁には、２．０ｃｍの帯は、それらの細菌が本発明に従う細菌株の周囲のこの球状の帯中で死ぬか又は増殖できないことを意味する。ラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２及びラクトバチルス・クンケエイ類型株を、ハチ病原体であるパエニバチルス・ラルバエの阻害について試験したところ、ラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２のみがこの病原体を阻害した（表４）が、ラクトバチルス・クンケエイ類型株（表４中には示さず）はパエニバチルス・ラルバエを全く阻害しなかった。これらの結果は再度、ラクトバチルス・クンケエイＦｈｏｎ２が新規ラクトバチルス・クンケエイ株であることを示す。

（例１３）
投与試験
本発明に従う細菌株を、感染症も消化管疾患も有さない種々の年齢の１０人の健康な個体に経口投与した。投与前に１週間の休薬期間を与え、このときにはプロバイオティック製品を摂取しなかった。投与を１０日間毎日実施した。摂取した飲料は、１株当たり約１０^９ＣＦＵと等価な濃度を有する新鮮な培養物から調製した細菌、２０ｍｌのカラスムギミルクを含んだ。志願者は、投与直前、１０日間の投与後及び最後の投与の７日後に採取した糞便サンプルを提供した。１グラムの糞便を連続希釈し、Ｒｏｇｏｓａ寒天上にプレートした。糞便サンプル由来の６個のコロニーをランダムにピックアップし、６つを外観に従って選択した。単離体の同定はＲＡＰＤにより達成した。

（例１４）
合成蜂蜜
合成蜂蜜を、アミノ酸、ビタミン、ミネラル及び水と共に、天然の花蜜と同様の種々の最終濃度（７％と８０％との間）で、糖、フルクトース、グルコーススクロース、マルトース及びメレジトース（例えば、サトウダイコン、サトウキビ又は高果糖コーンシロップ由来）を含む糖溶液に、種々の量の表１中の株を添加することによって製造した。細菌が、この製品を３日間３５℃で発酵した。水分含量は、プロセスの間に、天然蜂蜜と同様、１８％より下に低下した。

（例１５）
合成ハチパン
合成ハチパンを、例１４のとおりに製造した表１中の株を含む合成蜂蜜、花の花粉又はダイズ粉を混合し、ミツバチが蜂蜜及び花粉から製造した天然のハチパンと類似のハチパンを固めることによって、製造した。

（例１６）
創傷管理のための合成蜂蜜
医療用製品の下に記載された、創傷などに適用する表１中の株を含む合成蜂蜜を、例１４のとおりに製造した。この合成蜂蜜は、滅菌して、又は生存細菌と共に使用できる。

Claims

１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜から又は少なくとも１種のハチの蜂蜜産生管から単離された、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の単離された細菌株。
ハチの蜂蜜産生管が、体幹、口、食道及び蜜胃からなる、請求項１に記載の細菌株。
ハチの蜂蜜産生管が腸も消化管も含まない、請求項１又は２に記載の細菌株。
新鮮な蜂蜜が２０重量％を上回る水分含量を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の細菌株。
６５重量％の糖溶液中で少なくとも８日間、好ましくは７０重量％の糖溶液中で８日間、生存する能力を有する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の細菌株。
食品を腐敗させる病原性微生物の増殖を阻害する能力を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の細菌株。
ミツバチが、ミツバチ属（Ａｐｉｓ）種、好ましくはセイヨウミツバチ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）から選択される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の細菌株。
乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｂｉｕｔ２（ＬＭＧＰ−２４０９４）、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｈｍａ２（ＬＭＧＰ−２４０９３）、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｈｍａ８（ＬＭＧＰ−２４０９２）、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｂｍａ５（ＬＭＧＰ−２４０９０）、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｈｏｎ２（ＬＭＧＰ−２４０９１）（前記株は、２００７年４月３日にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されている）、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｂｉｎ７（ＬＭＧＰ−２３９８６）、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｈｍａ３（ＬＭＧＰ−２３９８３）、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｂｉｎ２（ＬＭＧＰ−２３９８４）、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｂｍａ６（ＬＭＧＰ−２３９８５）及びラクトバチルス・クンケエイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）Ｆｈｏｎ２（ＬＭＧＰ−２３９８７）（前記株は、２００７年１月１５日にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されている）並びにＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されたＨｍａ１１からなる群より選択される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の細菌株。
請求項１から８までのいずれか一項に記載の細菌株を含む、組成物。
蜂蜜、糖、フルクトース、スクロース、デキストリン、マルトース又はグルコースからなる群より好ましくは選択される糖供給源を含む、請求項９に記載の組成物。
請求項１から８までのいずれか一項に記載の細菌株並びに医薬上許容される担体及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物。
懸濁物、ゲル、クリーム、粉末又はカプセルである、請求項１１に記載の医薬組成物。
包帯、絆創膏又はスプレーの形態である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物を含む、医薬製品。
請求項１から８までのいずれか一項に記載の細菌株を含む、食品製品又は餌製品。
ハチの餌製品である、請求項１４に記載の食品製品又は餌製品。
請求項１から８までのいずれか一項に記載の細菌株を少なくとも１つ、糖供給源に添加するステップを含む、蜂蜜を産生するための方法。
感染症又は胃腸管疾患を予防及び／又は治療するための医療用製品、食品製品、飲料製品又は医薬組成物を調製するための、請求項１から８までのいずれか一項に記載の細菌株の使用。
ａ）１８重量％を上回る水分含量を有する新鮮な蜂蜜をサンプリングするステップ
又は
ハチから蜂蜜産生管を分離し、無菌培地中で管を振盪するステップ；
ｂ）適切な培地上でａ）からのサンプルを細菌培養するステップ；
ｃ）適切な培地上でｂ）で得られた細菌株（単数又は複数）を純粋培養及び単離するステップ、
を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の細菌株を単離するための方法。
ｄ）食品を腐敗させる病原性微生物を阻害する前記株（単数又は複数）の能力を評価するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
蜂蜜産生管が、腸又は消化管による汚染を回避するために、食道の後且つ前胃の前で分離される、請求項１８又は１９に記載の方法。
乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｂｉｕｔ２（ＬＭＧＰ−２４０９４）、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｈｍａ２（ＬＭＧＰ−２４０９３）、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｈｍａ８（ＬＭＧＰ−２４０９２）、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｂｍａ５（ＬＭＧＰ−２４０９０）、乳酸菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株Ｈｏｎ２（ＬＭＧＰ−２４０９１）（前記株は、２００７年４月３日にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されている）、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｂｉｎ７（ＬＭＧＰ−２３９８６）、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｈｍａ３（ＬＭＧＰ−２３９８３）、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｂｉｎ２（ＬＭＧＰ−２３９８４）、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｂｍａ６（ＬＭＧＰ−２３９８５）及びラクトバチルス・クンケエイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）Ｆｈｏｎ２（ＬＭＧＰ−２３９８７）（前記株は、２００７年１月１５日にＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されている）並びにＢＣＣＭ／ＬＭＧＢａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｉｎＢｅｌｇｉｕｍに寄託されたＨｍａ１１からなる群より選択される、細菌株。