WO2022079929A1 - 乳酸菌及びその取得方法並びに乳酸菌含有飲食品 - Google Patents

乳酸菌及びその取得方法並びに乳酸菌含有飲食品 Download PDF

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朋彰 ▲高▼屋
洋平 石山
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel lactic acid bacterium, a method for obtaining the lactic acid bacterium, and a lactic acid bacterium-containing food or drink containing the lactic acid bacterium.
  • the optimum growth pH range of general lactic acid bacteria is pH 6 to 7
  • the growth limit value in the acidic region is pH 4
  • the growth limit value in the alkaline region is pH 8.
  • some lactic acid bacteria have excellent acid resistance and can grow even in a harsh environment (around pH 3) where it is difficult for general lactic acid bacteria to grow (for example, Patent Documents 1 and 2).
  • the applicant has, for example, a liquid obtained by mixing and pressing a plant and sugar, a beverage based on this liquid, or an acid value and sucrose concentration of jam, fruit sauce, etc. It is considered that it is possible to easily ferment materials that are difficult to ferment with general lactic acid bacteria, and it is possible to provide new fermented foods and fermented beverages. We proceeded with research on lactic acid bacteria that can grow in fermented foods, and finally succeeded in obtaining lactic acid bacteria that can grow well in the harsh environment of low pH and high fermentation concentration.
  • An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium capable of growing well in a low pH and high sucrose environment.
  • lactic acid bacterium characterized by being a species belonging to the genus Lactobacillus (Lactobacillus sp.) Deposited under NITE BP-03116 (identification indication: WR16-4).
  • the lactic acid bacterium is related to a lactic acid bacterium characterized by having a base sequence of the 16SrDNA region shown in SEQ ID NO: 1.
  • the lactic acid bacterium according to claim 1 is related to the lactic acid bacterium characterized by being obtained from a fermented plant extract.
  • the lactic acid bacterium according to claim 2 which is characterized by being obtained from a fermented plant extract.
  • the plant fermented extract relates to a lactic acid bacterium characterized by being a radish fermented extract.
  • the plant fermented extract is related to a lactic acid bacterium characterized by being a radish fermented extract.
  • the radish fermented extract is related to a lactic acid bacterium characterized by being a mixture of radish, white sugar and a bacterial solution and fermented.
  • the radish fermented extract is related to a lactic acid bacterium characterized by being a mixture of radish, white sugar and a bacterial solution and fermented.
  • the lactic acid bacterium is characterized in that the bacterial solution is composed of yeast.
  • the lactic acid bacterium is characterized in that the bacterial solution is composed of yeast.
  • lactic acid bacterium in the lactic acid bacterium according to any one of claims 1 to 10, it grows in a low pH environment of pH 3.5 to 5.5 and also grows in a high concentration sucrose environment having a sucrose concentration of 30 to 60 wt%. It is related to lactic acid bacteria characterized by.
  • the lactic acid bacterium grows in a low pH environment of pH 3.5 to 5.5, and the fructose concentration and the glucose concentration are each 10 to 30 wt% high in fructose / glucose. It is related to lactic acid bacteria characterized by growing even in a concentration environment.
  • the lactic acid bacterium in the lactic acid bacterium according to any one of claims 1 to 10, it proliferates in a low pH environment of pH 3.5 to 5.5 and also in a high concentration sucrose environment having a sucrose concentration of 30 to 60 wt%. Further, the lactic acid bacterium is characterized by growing in a low pH environment of pH 3.5 to 5.5 and also in a high fructose / glucose concentration environment having a fructose concentration and a glucose concentration of 10 to 30 wt%, respectively. Is.
  • a plant fermented extract is added to a sterilized liquid medium to obtain a culture solution, and then this culture solution is accumulated and cultured to obtain an accumulated culture solution, and then this accumulated culture medium is mixed with a sterilized separation medium.
  • a method for obtaining a lactic acid bacterium which comprises preparing a plate medium and then catching the colonies appearing in the plate medium to obtain a lactic acid bacterium capable of growing in a low pH environment and a high concentration sucrose environment. It is related to.
  • the method relating to the method for obtaining lactic acid bacteria is characterized in that the bacterial solution is composed of yeast.
  • the liquid medium is a mixed fermented extract obtained by using either or both of a fermented vegetable extract and a fermented fruit extract, and wild grass.
  • the present invention relates to a method for obtaining lactic acid bacteria, which is characterized by adding an antibiotic to a mixture of a mixed solution of vegetables and white sugar obtained by mixing the simmered solution of white sugar and white sugar.
  • the antibiotic is cycloheximide, which relates to a method for obtaining lactic acid bacteria.
  • the present invention relates to a lactic acid bacterium-containing food or drink characterized by containing the lactic acid bacterium according to any one of claims 1 to 10.
  • It also relates to a lactic acid bacterium-containing food or drink characterized by containing the lactic acid bacterium according to claim 11.
  • It also relates to a lactic acid bacterium-containing food or drink characterized by containing the lactic acid bacterium according to claim 12.
  • It also relates to a lactic acid bacterium-containing food or drink characterized by containing the lactic acid bacterium according to claim 13.
  • the lactic acid bacterium-containing food or drink relates to a lactic acid bacterium-containing food or drink characterized by being a fermented food or drink.
  • the lactic acid bacterium-containing food or drink relates to a lactic acid bacterium-containing food or drink characterized by being a fermented food or drink.
  • the lactic acid bacterium-containing food or drink relates to a lactic acid bacterium-containing food or drink characterized by being a fermented food or drink.
  • the lactic acid bacterium-containing food or drink relates to a lactic acid bacterium-containing food or drink characterized by being a fermented food or drink.
  • the lactic acid bacterium of the present invention grows (proliferates) predominantly in a low pH and high sucrose environment, for example, a liquid obtained by mixing and pressing a plant and sugar, a beverage based on this liquid, jam, or fruit.
  • Materials such as sauces, which have high acidity and sucrose concentration and are difficult to ferment with general lactic acid bacteria, can be easily fermented, and new fermented foods and beverages can be provided.
  • Lactis NBRC12007 in this Example It is a graph which shows the sucrose resistance test result of Leuconostoc mesenteroides subsp. Dextranicum NBRC100495 T in this Example. It is a graph which shows the sucrose resistance test result of the WR16-4 strain in this Example. It is a table which shows the composition of the MRS medium in the sucrose resistance test of this Example. It is a table which shows the composition of the MRS medium in the fructose-glucose resistance test of this Example. It is a graph which shows the fructose-glucose resistance test result of the WR16-4 strain in this Example. It is a data list which shows the homology search result in the gene database (NCBI) of this invention.
  • NCBI gene database
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a species belonging to the genus Lactobacillus (Lactobacillus sp.), And has been deposited under the accession number: NITE BP-03116 (identification display: WR16-4).
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a new type of lactic acid bacterium (a species belonging to the genus Lactobacillus) that has never existed before.
  • the lactic acid bacterium of the present invention has a characteristic that it is difficult to grow at pH 6 to 7, which is the optimum growth environment for general lactic acid bacteria, and grows well under an environment at a lower pH (for example, pH 3.5 to 5.5). Have.
  • the lactic acid bacterium of the present invention has a characteristic that it grows well even in a low pH (for example, pH 5 or less) and high sucrose (for example, 30 wt% or more) environment, which is difficult for general lactic acid bacteria to grow.
  • a low pH for example, pH 5 or less
  • high sucrose for example, 30 wt% or more
  • the lactic acid bacterium of the present invention has a characteristic of predominantly growing in a low pH and high sucrose environment. Therefore, for example, a liquid obtained by mixing and pressing a plant and sugar or a beverage based on this liquid.
  • materials such as jam and fruit sauce, which have high acid values and sucrose concentrations and are difficult to ferment with general lactic acid bacteria, can be easily fermented.
  • the lactic acid bacterium of this example has the base sequence of the 16SrDNA region shown in SEQ ID NO: 1 and belongs to the genus Lactobacillus deposited under the accession number: NITE BP-03116 (identification indication: WR16-4). sp.) Lactobacillus.
  • the lactic acid bacterium of this example has a short rod-like cell morphology and is white in the state of a colony, and produces extracellular polysaccharide (viscous substance).
  • WR16-4 strain lactic acid bacterium of this example
  • FIG. 12 is a list of data showing high homology with the sample-derived sequence in this homology search. As shown in FIG. 12, even the one having the highest homology with this WR16-4 strain was about 93%. In general, if there is no species with a homology value of 98.7% or more, it is judged to be a new species, so it can be said that this WR16-4 strain is a new (new species) lactic acid bacterium.
  • the WR16-4 strain uses a fermented plant extract, specifically, a fermented radish extract as a separation source.
  • the fermented radish extract which is the source of separation, is made by mixing and fermenting radish, white sugar and fungal solution. Specifically, the cut radish and the same amount of white sugar as this radish are mixed and fermented. After fermenting yeast, the liquid obtained by pressing is further fermented and aged.
  • the plant used as the separation source may be vegetables other than radish.
  • Enrichment culture is performed by repeating the process of 2 above several times (8 times in this example) to obtain an enriched culture solution.
  • the WR16-4 strain can be obtained by catching the colonies that appear on the above flat plate.
  • the above liquid medium is a mixed fermented extract obtained by using either or both of a vegetable fermented extract and a fruit fermented extract, and a wild grass / upper white sugar obtained by mixing a boiled solution of wild grass and white sugar.
  • a mixture of sucrose mixed solution with antibiotics added specifically, wild grass obtained by mixing the above mixed fermented extract and fine sucrose in a boiling solution of a plurality of wild plants at a ratio of 1: 1.
  • the separation medium is a mixture of medium A and medium B shown in the table below that have been wet-sterilized.
  • a lactic acid bacterium to be compared with the WR16-4 strain it is a species belonging to a widely known genus among lactic acid bacteria, and the optimum growth pH range is pH 6 to 7, similar to general lactic acid bacteria.
  • the MRS medium shown in FIG. 9 was adjusted by 2-fold concentration. At this time, by adding a 4N sodium hydroxide solution or 4N hydrochloric acid, the pH of the WR16-4 strain was adjusted to 4.5, and that of the comparison target was adjusted to 6.5.
  • the WR16-4 strain uses 2 wt% sucrose-containing MRS medium (pH 4.5), and the comparison target uses 2 wt% glucose-containing MRS medium (pH 6.5) at 30 ° C. for 24-48 hours under anaerobic conditions. gone.
  • the MRS medium shown in FIG. 9 was adjusted by 2-fold concentration. At this time, the pH was adjusted to 3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5 by adding a 4N sodium hydroxide solution or 4N hydrochloric acid.
  • Turbidity was measured over time using a microplate reader.
  • Figures 1 to 3 show the turbidity measurement results of lactic acid bacteria for comparison (Lactobacillus acidophilus JCM 1132 T (Fig. 1), Lactococcus lactis subsp. Lactis NBRC12007 (Fig. 2), Leuconostoc mesenteroides subsp. Dextranicum NBRC100495 T (Fig. 3)). It is a graph which shows, and FIG. 4 is a graph which shows the turbidity measurement result of the WR16-4 strain.
  • the lactic acid bacterium for comparison grows well in an acidic region having a pH of 5 to 6.5, which is close to neutral.
  • the WR16-4 strain grows in a region on the more acidic side than the region in which these lactic acid bacteria grow well, specifically, in a low pH region of pH 3.5 to 5, and the pH is higher than this. It was confirmed that lactic acid bacteria hardly grow in the region close to neutrality.
  • sucrose resistance test The sucrose resistance test of each pre-cultured lactic acid bacterium was performed as follows.
  • sucrose concentration was 5 wt%, 10 wt%, 20 wt%, 30 wt%, 40 wt%, 50 wt%, 60 wt%, and 70 wt%, respectively.
  • 4N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 4.5.
  • Turbidity was measured over time using a microplate reader.
  • Figures 5 to 8 show the turbidity measurement results of lactic acid bacteria for comparison (Lactobacillus acidophilus JCM 1132 T (Fig. 5), Lactococcus lactis subsp. Lactis NBRC12007 (Fig. 6), Leuconostoc mesenteroides subsp. Dextranicum NBRC100495 T (Fig. 7)). It is a graph which shows, and FIG. 8 is a graph which shows the turbidity measurement result of the WR16-4 strain.
  • sucrose resistance test under the acidic condition of the initial pH 4.5, as shown in the turbidity measurement results of each lactic acid bacterium, the lactic acid bacterium for comparison was confirmed to grow at a sucrose concentration of 20 wt% or less. Its growth state (proliferation rate) was low, and it was almost impossible to grow in a high sucrose environment of 30 wt% or more, whereas the WR16-4 strain showed a good growth state up to a sucrose concentration of about 40 wt%, 60 wt%. It was confirmed that it grows even in a high sucrose environment.
  • Sucrose is a disaccharide in which the monosaccharides fructose and glucose are bound, and since it was confirmed that the WR16-4 strain can grow in a high sucrose environment as described above, fructose and glucose are in a monosaccharide state, respectively. Considering that it may be possible to grow in the same manner as in the case of sucrose even in the environment of high concentration of fructose / glucose existing in the above, the fructose / glucose resistance test was carried out as follows in the same manner as the above-mentioned sucrose resistance test.
  • Turbidity was measured over time using a microplate reader.
  • FIG. 11 shows the results of the above turbidity measurement in the fructose / glucose resistance test under the acidic condition of the initial pH 4.5.
  • the WR16-4 strain has a low growth rate when either fructose or glucose is contained alone (although it is in a low growth state), but both fructose and glucose are contained. When it is contained, the growth rate becomes high (high growth state) as in the case where sucrose is contained, and from this result, it is confirmed that the WR16-4 strain has not only sucrose resistance but also fructose / glucose resistance. Was done.
  • sucrose is a disaccharide in which fructose and glucose are bound as described above
  • the WR16-4 strain contains, for example, 30 wt% each of fructose and glucose as in the case of sucrose (the total sugar concentration is 30 wt%). 60 wt%) It is considered that it can grow sufficiently even in a high sugar concentration environment.
  • the WR16-4 strain can be used for foods and drinks containing lactic acid bacteria, specifically, fermented foods and drinks.
  • the WR16-4 strain is a lactic acid bacterium having a characteristic of predominantly growing in a low pH and high sucrose environment. Therefore, for example, a liquid obtained by mixing a plant and sugar and pressing the liquid or this liquid can be used. Materials (acidic and high sugar concentration extracts) that are difficult to ferment with general lactic acid bacteria due to high acidity and sucrose concentration such as based beverages or jams and fruit sauces can be easily fermented. Organic acids can be contained in the extract, and effects such as acidity (reduction of sweetness and addition of refreshingness) and antiseptic (no preservative as an additive are required) can be obtained.
  • the WR16-4 strain is a lactic acid bacterium having a characteristic of predominantly growing at a low pH and in a high fructose / glucose environment, sugars containing both fructose and glucose (isomerized sugar, glucose) in addition to the above. It can also be used for foods and drinks using (such as a mixture of purified sugars of fructose).
  • Fermentation liquid A is added to the infusion liquid of wild grass with white sugar added, and fermented and aged to obtain fermented liquid B.
  • the fermented liquid A and the fermented liquid B become an acidic and high sugar concentration extract.
  • the fermented liquid A and the fermented liquid B are produced as beverages, and by fermenting with the WR16-4 strain, an acidity is imparted and an antiseptic effect can be obtained without adding a preservative. It will be possible to provide unprecedented beverages.
  • the WR16-4 strain has a characteristic that it hardly grows in an environment of pH 6 to 7, which is the optimum pH environment of general lactic acid bacteria. Therefore, for example, the sucrose concentration is high and the pH is high.
  • the WR16-4 strain does not grow until the optimum pH is reached. Therefore, it does not inhibit the growth of other microorganisms. Therefore, it is useful when utilizing complex fermentation by a plurality of types of microorganisms.
  • the WR16-4 strain can stop fermentation non-heatedly by adjusting the pH of the material to near neutral, and it is also useful for fermented products that cannot be heated.
  • the present invention is not limited to the present embodiment, and the specific configuration of each constituent requirement can be appropriately designed.

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Abstract

低ｐＨ且つ高スクロース環境下で良好に生育する乳酸菌を提供する。受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４）で寄託されているラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）である乳酸菌。

Description

乳酸菌及びその取得方法並びに乳酸菌含有飲食品
　本発明は、新規な乳酸菌及びその取得方法並びに前記乳酸菌を含有する乳酸菌含有飲食品に関するものである。
　一般的な乳酸菌の最適生育ｐＨ領域はｐＨ６～７であり、酸性領域での生育限界値はｐＨ４、アルカリ性領域での生育限界値はｐＨ８と言われている。しかしながら、乳酸菌の中には優れた耐酸性を有し、一般的な乳酸菌では生育が難しい苛酷な環境下（ｐＨ３前後）でも生育可能なものもある（例えば特許文献１，２）。
　また、味噌や醤油などの塩分濃度が高い環境下でも生育が可能な優れた耐塩性を有する乳酸菌もある（例えば特許文献３，４）。
　このように乳酸菌の中には過酷な環境下でも生育可能なものが多く存在するが、低ｐＨ（高酸性）且つ高スクロース濃度という苛酷な環境下で良好に生育することができる乳酸菌の存在については本出願人の知る限りこれまで報告されていない。
　そこで、本出願人は、このような乳酸菌の存在により、例えば、植物と糖を混合し圧搾して得られる液やこの液を基にした飲料、或いはジャム、フルーツソースなどの酸性値及びスクロース濃度が高く、一般的な乳酸菌では発酵が難しい素材を容易に発酵させることができ、新たな発酵食品や発酵飲料の提供が可能となると考え、上述のような低ｐＨ環境且つ高スクロース環境下で良好に生育することができる乳酸菌について研究を進め、ついに低ｐＨ且つ高スクロース濃度という苛酷な環境下で良好に生育することができる乳酸菌の取得に成功した。
特開２００９－２２５７９２号公報 ＷＯ２０１３／００１８６２号公報 特開２００７－２３６３４４号公報 特開２０１８－４２５５７号公報
　本発明は、低ｐＨ且つ高スクロース環境下で良好に生育することができる乳酸菌を提供することを目的とする。
　添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。
　受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４）で寄託されているラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）であることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項１記載の乳酸菌において、前記乳酸菌は配列番号１に示される１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を有することを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項１記載の乳酸菌において、植物発酵エキスから取得されたものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項２記載の乳酸菌において、植物発酵エキスから取得されたものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項３記載の乳酸菌において、前記植物発酵エキスは大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項４記載の乳酸菌において、前記植物発酵エキスは大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項５記載の乳酸菌において、前記大根発酵エキスは大根、上白糖及び菌液を混合し発酵させたものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項６記載の乳酸菌において、前記大根発酵エキスは大根、上白糖及び菌液を混合し発酵させたものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項７記載の乳酸菌において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項８記載の乳酸菌において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項１～１０いずれか１項に記載の乳酸菌において、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つスクロース濃度３０～６０ｗｔ％の高濃度スクロース環境下でも増殖することを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項１～１０いずれか１項に記載の乳酸菌において、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つフルクトース濃度及びグルコース濃度が夫々１０～３０ｗｔ％のフルクトース・グルコース高濃度環境下でも増殖することを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、請求項１～１０いずれか１項に記載の乳酸菌において、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つスクロース濃度３０～６０ｗｔ％の高濃度スクロース環境下でも増殖し、さらに、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つフルクトース濃度及びグルコース濃度が夫々１０～３０ｗｔ％のフルクトース・グルコース高濃度環境下でも増殖することを特徴とする乳酸菌に係るものである。
　また、滅菌した液体培地に植物発酵エキスを加えて培養液を得、続いて、この培養液を集積培養して集積培養液を得、続いて、この集積培養液を滅菌した分離用培地と混釈して平板培地を作成し、続いて、この平板培地に出現したコロニーを釣菌して低ｐＨ環境且つ高濃度スクロース環境下で増殖可能な乳酸菌を取得することを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。
　また、請求項１４記載の乳酸菌の取得方法において、前記植物発酵エキスは、大根と上白糖と菌液とを混合し発酵させた大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。
　また、請求項１５記載の乳酸菌の取得方法において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。
　また、請求項１４～１６いずれか１項に記載の乳酸菌の取得方法において、前記液体培地は、野菜発酵エキス及び果物発酵エキスのいずれか一方若しくは双方を用いて得られた混合発酵エキスと、野草の煮出液と上白糖とを混合して得られた野菜・上白糖混合液とを混合したものに抗生物質を添加したものであることを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。
　また、請求項１７記載の乳酸菌の取得方法において、前記抗生物質はシクロヘキシミドであることを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。
　また、請求項１～１０いずれか１項に記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。
　また、請求項１１記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。
　また、請求項１２記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。
　また、請求項１３記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。
　また、請求項１９記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。
　また、請求項２０記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。
　また、請求項２１記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。
　また、請求項２２記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。
　本発明の乳酸菌は、低ｐＨ且つ高スクロース環境下で優位に生育（増殖）するから、例えば、植物と糖を混合し圧搾して得られる液やこの液を基にした飲料、或いはジャム、フルーツソースなどの酸性値及びスクロース濃度が高く、一般的な乳酸菌では発酵が難しい素材を容易に発酵させることができ、新たな発酵食品や発酵飲料の提供が可能となる。
本実施例におけるLactobacillus acidophilus JCM 1132TのｐＨ耐性試験結果を示すグラフである。 本実施例におけるLactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007のｐＨ耐性試験結果を示すグラフである。 本実施例におけるLeuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495TのｐＨ耐性試験結果を示すグラフである。 本実施例におけるＷＲ１６－４株のｐＨ耐性試験結果を示すグラフである。 本実施例におけるLactobacillus acidophilus JCM 1132Tのスクロース耐性試験結果を示すグラフである。 本実施例におけるLactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007のスクロース耐性試験結果を示すグラフである。 本実施例におけるLeuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495Tのスクロース耐性試験結果を示すグラフである。 本実施例におけるＷＲ１６－４株のスクロース耐性試験結果を示すグラフである。 本実施例のスクロース耐性試験におけるＭＲＳ培地の組成を示す表である。 本実施例のフルクトース・グルコース耐性試験におけるＭＲＳ培地の組成を示す表である。 本実施例におけるＷＲ１６－４株のフルクトース・グルコース耐性試験結果を示すグラフである。 本発明の遺伝子データベース（ＮＣＢＩ）における相同性検索結果を示すデータ一覧表である。
　好適と考える本発明の実施形態を、図面に基づいて本発明の作用を示して簡単に説明する。
　本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）であり、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４）で寄託されている。
　本発明の乳酸菌から得られた配列データ（１６ＳｒＤＮＡ配列）をもとにＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の遺伝子データベースにて相同性検索を行った結果、前記配列と相同性が最も高かったもので９３％であり（図１２参照）、この結果から本発明の乳酸菌は従来にない新種の乳酸菌（ラクトバチルス属に属する種）と言える。
　本発明の乳酸菌は、一般的な乳酸菌の最適生育環境とされるｐＨ６～７では生育し難く、これよりも低いｐＨ（例えばｐＨ３．５～５．５）の環境下で良好に生育する特徴を有する。
　さらに、本発明の乳酸菌は、一般的な乳酸菌では生育し難い低ｐＨ（例えばｐＨ５以下）で且つ高スクロース（例えば３０ｗｔ％以上）環境下でも良好に生育する特徴を有する。
　このように、本発明の乳酸菌は、低ｐＨで且つ高スクロース環境下で優位に増殖する特徴を有するから、例えば、植物と糖を混合し圧搾して得られる液やこの液を基にした飲料、或いはジャム、フルーツソースなどの酸性値及びスクロース濃度が高く、一般的な乳酸菌では発酵が難しい素材を容易に発酵させることができるものとなる。
　本発明の具体的な実施例について図面に基づいて説明する。
　本実施例の乳酸菌は、配列番号１に示す１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を有し、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４）で寄託されているラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）の乳酸菌である。
　本実施例の乳酸菌は、細胞形態が短桿状であり、また、コロニーの状態では白色をしていて、菌体外多糖（粘性物質）を生産する。
　以下、本実施例の乳酸菌（以下、ＷＲ１６－４株という。）について詳述する。
　＜ＷＲ１６－４株の菌種について＞
　ＷＲ１６－４株の１６ＳｒＤＮＡデータをもとに微生物同定検査を行い、ＷＲ１６－４株の菌種について調査した。なお、微生物同定検査は株式会社ファスマックに依頼した。
　微生物同定検査の結果、最も高い相同値を示した菌種は、Lactobacillus kefiri(ATCC=35441)であった（相同値９３．１４％）。
　＜ＷＲ１６－４株の新規性について＞
　ＷＲ１６－４株の１６ＳｒＤＮＡデータをもとにＮＣＢＩの遺伝子データベースにて相同性検索を行い、ＷＲ１６－４株の新規性について調査した。
　図１２はこの相同性検索においてサンプル由来配列と高い相同性を示したデータの一覧表である。この図１２に示すように、このＷＲ１６－４株と相同性が最も高かったものでも９３％程度であった。一般的に、相同値が９８．７％以上の種がない場合は、新種と判断されることから、このＷＲ１６－４株は新規（新種）の乳酸菌であると言える。
　＜ＷＲ１６－４株の分離源＞
　ＷＲ１６－４株は植物発酵エキス、具体的には、大根発酵エキスを分離源とするものである。
　分離源となる大根発酵エキスは、大根、上白糖及び菌液を混合し発酵させたものであり、具体的には、裁断した大根と、この大根と同量の上白糖とを混合し、これに酵母菌を発酵させた後、圧搾して得られた液分をさらに発酵、熟成させたものである。なお、分離源となる植物は大根以外の野菜でも良い。
　＜ＷＲ１６－４株の分離方法＞
　ＷＲ１６－４株は、上記大根発酵エキスから分離する際、一般的な乳酸菌の分離方法では分離できず、本出願人が見出した以下の分離方法により分離することができる。
　(1) 湿式滅菌（１２１℃，１５分）した液体培地１０ｍｌに上記の大根発酵エキス８０μｌを加え、２５℃で６日間保温し培養液を得る。
　(2) 得られた培養液８０μｌを上記の液体培地１０ｍｌに加え、再び２５℃で３～４日間保温し培養液を得る。
　(3) 上記２の処理を数回（本実施例では８回）繰り返す集積培養を行い、集積培養液を得る。
　(4) 得られた集積培養液１ｍｌを湿式滅菌（１２１℃，１５分）した分離用培地１５ｍｌと混釈した後、冷却固化して平板を作成する。
　(5) この平板を２５℃で１０日間保温する。
　(6) 上記平板に出現したコロニーを釣菌することで、ＷＲ１６－４株が得られる。
　なお、上記液体培地は、野菜発酵エキス及び果物発酵エキスのいずれか一方若しくは双方を用いて得られた混合発酵エキスと、野草の煮出液と上白糖とを混合して得られた野草・上白糖混合液とを混合したものに抗生物質を添加したもの、具体的には、上記の混合発酵エキスと、複数の野草類の煮出液に上白糖を１：１で混合して得た野草・上白糖混合液と、１ｇ／Ｌシクロヘキシミド溶液を、１０：９０：１で混合した混合液である。
　また、上記分離用培地は、下表に示す培地Ａ及び培地Ｂを湿式滅菌し混合したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記分離方法により取得したＷＲ１６－４株の特性を確認するため、一般的な乳酸菌を用い、これらとの比較によるｐＨ耐性試験及びスクロース耐性試験を行った。
　具体的には、ＷＲ１６－４株の比較対象の乳酸菌として、乳酸菌の中では広く知られている属に属する種であり、一般的な乳酸菌と同様、最適生育ｐＨ領域をｐＨ６～７とする、ラクトバチルス（Lactobacillus）属のLactobacillus acidophilus JCM 1132T、ラクトコッカス（Lactococcus）属のLactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007、ロイコノストック（Leuconostoc）属のLeuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495Tの３種の乳酸菌を用いた。
　＜各乳酸菌の前培養＞
　上記２種の耐性試験を行うにあたり、各乳酸菌に対して以下のような前培養を行った。
　(1) 図９に示すＭＲＳ培地を２倍濃縮で調整した。この際、４Ｎ水酸化ナトリウム溶液又は４Ｎ塩酸を添加することにより、ＷＲ１６－４株用のものはｐＨ４．５に、比較対象用のものはｐＨ６．５に調整した。
　(2) ４ｗｔ％スクロース溶液又は４ｗｔ％グルコース溶液を調整した。
　(3) 上記(1)，(2)について、それぞれオートクレーブを用いた湿熱滅菌（１２１℃，２０分）を行った。
　(4) 湿熱滅菌した(1)及び(2)の溶液を冷却した後、クリーンベンチ内で１：１（ｖ／ｖ）となるように混合し、２ｗｔ％スクロース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ４．５）又は２ｗｔ％グルコース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ６．５）を調整した。
　(5) ＷＲ１６－４株は２ｗｔ％スクロース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ４．５）、比較対象用は２ｗｔ％グルコース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ６．５）を用いて、３０℃で２４～４８時間の嫌気条件で行った。
　＜ｐＨ耐性試験＞
　前培養した各乳酸菌のｐＨ耐性試験を以下のようにして行った。
　(1) 図９に示すＭＲＳ培地を２倍濃縮で調整した。この際、４Ｎ水酸化ナトリウム溶液又は４Ｎ塩酸を添加することにより、ｐＨ３，３．５，４，４．５，５，５．５，６，６．５に調整した。
　(2) ４ｗｔ％スクロース溶液を調整した。
　(3) 上記(1)，(2)について、それぞれオートクレーブを用いた湿熱滅菌（１２１℃，２０分）を行った。
　(4) 湿熱滅菌した(1)及び(2)の溶液を冷却した後、クリーンベンチ内で１：１（ｖ／ｖ）となるように混合し、２ｗｔ％スクロース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ３～６．５）を調整した。
　(5) 前培養した各乳酸菌株を遠心分離（１５，０００×ｇ，１０分）して上清を取り除いた後、(3)で調整した培地に初期濃度がＡ６６０ｎｍ≒０．０５～０．１０となるように再懸濁した。
　(6) ９６穴マイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように、各３ｗｅｌｌずつ分注した後（ｎ＝３）、３０℃、嫌気条件で培養した。
　(7) マイクロプレートリーダーを用いて経時的に濁度測定を行った。
　図１～３は比較対象用（Lactobacillus acidophilus JCM 1132T（図１）、Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007（図２）、Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495T（図３））の乳酸菌の濁度測定結果を示すグラフであり、図４はＷＲ１６－４株の濁度測定結果を示すグラフである。
　上記２ｗｔ％スクロースを炭素源としたｐＨ耐性試験においては、各乳酸菌の濁度測定結果に示されるように、比較対象用の乳酸菌はｐＨ５～６．５の中性に近い酸性領域で生育が良好であったのに対し、ＷＲ１６－４株はこれらの乳酸菌が良好に生育する領域よりもより酸性側の領域、具体的には、ｐＨ３．５～５の低ｐＨ領域で生育し、これよりｐＨが高い中性に近い領域ではほとんど生育しないことが確認された。
　＜スクロース耐性試験＞
　前培養した各乳酸菌のスクロース耐性試験を以下のようにして行った。
　(1) スクロースを添加した図９に示すＭＲＳ培地を、スクロース濃度が５ｗｔ％，１０ｗｔ％，２０ｗｔ％，３０ｗｔ％，４０ｗｔ％，５０ｗｔ％，６０ｗｔ％，７０ｗｔ％となるように調整した後、それぞれに対して４Ｎ塩酸を添加しｐＨ４．５となるように調整した。
　(2) 上記(1)について、それぞれオートクレーブを用いた湿熱滅菌（１２１℃，２０分）を行った。
　(3) 前培養した各乳酸菌株を遠心分離（１５，０００×ｇ，１０分）して上清を取り除いた後、(2)で調整した培地に初期濃度がＡ６６０ｎｍ≒０．０５～０．１０となるように再懸濁した。
　(4) ９６穴マイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように、各３ｗｅｌｌずつ分注した後（ｎ＝３）、３０℃、嫌気条件で培養した。
　(5) マイクロプレートリーダーを用いて経時的に濁度測定を行った。
　図５～８は比較対象用（Lactobacillus acidophilus JCM 1132T（図５）、Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007（図６）、Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495T（図７））の乳酸菌の濁度測定結果を示すグラフであり、図８はＷＲ１６－４株の濁度測定結果を示すグラフである。
　上記初期ｐＨ４．５の酸性条件下でのスクロース耐性試験においては、各乳酸菌の濁度測定結果に示されるように、比較対象用の乳酸菌はスクロース濃度が２０ｗｔ％以下での生育が確認されたもののその生育状態（増殖率）は低く、３０ｗｔ％以上の高スクロース環境ではほぼ生育できない結果であったのに対し、ＷＲ１６－４株はスクロース濃度４０ｗｔ％程度までは良好な生育状態を示し、６０ｗｔ％の高スクロース環境でも生育することが確認された。
　＜フルクトース・グルコース耐性試験＞
　スクロースは、単糖のフルクトースとグルコースとが結合した二糖類であり、ＷＲ１６－４株は上記のように高スクロース環境で生育可能なことが確認されたことから、フルクトース及びグルコースが夫々単糖状態で存在するフルクトース・グルコース高濃度環境下でも、スクロースの場合と同様に生育可能であるのではないかと考え、上記スクロース耐性試験と同様に、フルクトース・グルコース耐性試験を以下のようにして行った。
　(1) スクロース、フルクトース、グルコースの糖を夫々単独で添加した図１０に示すＭＲＳ培地を、夫々糖濃度が２０ｗｔ％となるように調整した後、それぞれに対して４Ｎ塩酸を添加しｐＨ４．５となるように調整した。
　(2) 別途、フルクトース及びグルコースを添加した図１０に示すＭＲＳ培地を、フルクトース、グルコース夫々の糖濃度が１０ｗｔ％（合計で２０ｗｔ％）となるように調整した後、それぞれに対して４Ｎ塩酸を添加しｐＨ４．５となるように調整した。
　(3) 上記(1)，(2)について、それぞれオートクレーブを用いた湿熱滅菌（１２１℃，２０分）を行った。
　(4) 前培養したＷＲ１６－４株を遠心分離（１５，０００×ｇ，１０分）して上清を取り除いた後、調整した培地に初期濃度がＡ６６０ｎｍ≒０．０５～０．１０となるように再懸濁した。
　(5) ９６穴マイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように、各３ｗｅｌｌずつ分注した後（ｎ＝３）、３０℃、嫌気条件で培養した。
　(6) マイクロプレートリーダーを用いて経時的に濁度測定を行った。
　この初期ｐＨ４．５の酸性条件下でのフルクトース・グルコース耐性試験における上記濁度測定の結果を図１１に示す。
　この図１１に示されるように、ＷＲ１６－４株は、フルクトース、グルコースのいずれかが単独で含まれている場合は増殖率が低いが（低生育状態であるが）、フルクトース、グルコースの両方が含まれる場合は、スクロースを含む場合と同様、増殖率が高くなり（高生育状態になり）、この結果から、ＷＲ１６－４株は、スクロース耐性だけでなく、フルクトース・グルコース耐性も有することが確認された。
　また、前述したようにスクロースはフルクトースとグルコースが結合した二糖類であることから、ＷＲ１６－４株は、スクロースの場合と同様、例えば、フルクトースとグルコースを夫々３０ｗｔ％ずつ含む（糖濃度の合計が６０ｗｔ％）高糖濃度環境でも十分生育可能と考える。
　＜ＷＲ１６－４株の用途＞
　ＷＲ１６－４株は乳酸菌含有飲食品、具体的には、発酵飲食品に用いることができる。
　ＷＲ１６－４株は、上述したように、低ｐＨで且つ高スクロース環境下で優位に増殖する特徴を有する乳酸菌であるから、例えば、植物と糖を混合し圧搾して得られる液やこの液を基にした飲料、或いはジャム、フルーツソースなどの酸性値及びスクロース濃度が高く、一般的な乳酸菌では発酵が難しい素材（酸性且つ高糖濃度抽出液）を容易に発酵させることができ、これにより前記抽出液に有機酸を含有させることができ、酸味の付与（甘さの軽減やさわやかさの付与）や防腐（添加物としての保存料が不要になる）などの効果が得られる。
　また、ＷＲ１６－４株は、低ｐＨで且つ高フルクトース・グルコース環境下でも優位に増殖する特徴を有する乳酸菌であるから、上記の他に、フルクトースとグルコースの両方を含む糖（異性化糖、ブドウ糖及び果糖の夫々の精製糖を混合したものなど）を用いた飲食品にも用いることができる。
　また、上記酸性且つ高糖濃度抽出液の取得方法の一例を以下に示す。なお、抽出液の取得方法はこれに限定されるものではない。
　(1) 裁断した野菜や果物と上白糖とを同比率で混合し、菌液を加えて発酵させる。
　(2) 発酵後、圧搾して液分を回収し、この回収液をさらに発酵・熟成させて発酵液Ａを得る。
　(3) 野草の煮出し液に上白糖を加えたものに発酵液Ａを加え、発酵・熟成させて発酵液Ｂを得る。
　この発酵液Ａや発酵液Ｂが酸性且つ高糖濃度抽出液となる。なお、この発酵液Ａ及び発酵液Ｂは飲料として製造されるものであり、ＷＲ１６－４株によって発酵させることで、酸味を付与すると共に、保存料を添加することなく防腐効果が得られ、これまでにない飲料の提供が可能となる。
　また、ＷＲ１６－４株は、上記試験結果に示すように、一般的な乳酸菌の最適ｐＨ環境であるｐＨ６～７の環境下でほとんど生育しない特性を有するから、例えば、スクロース濃度が高くてｐＨが中性付近の素材を、ＷＲ１６－４株と他の微生物（例えば一般的な乳酸菌や酵母など）で発酵させようとする場合、ＷＲ１６－４株は至適ｐＨに到達するまでの間は生育しないので、他の微生物の生育を阻害しない。よって、複数種の微生物による複合的な発酵を利用する場合に有用となる。
　また、上記特性から、ＷＲ１６－４株は、素材のｐＨを中性付近に調整することで発酵を非加熱的に停止させることができ、加熱できない発酵製品への利用も有用となる。
　なお、本発明は、本実施例に限られるものではなく、各構成要件の具体的構成は適宜設計し得るものである。
　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１１６
[規則26に基づく補充 10.05.2021]　
Figure WO-DOC-FIGURE-ro134

Claims (26)

  1. 　受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４）で寄託されているラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）であることを特徴とする乳酸菌。
  2. 　請求項１記載の乳酸菌において、前記乳酸菌は配列番号１に示される１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を有することを特徴とする乳酸菌。
  3. 　請求項１記載の乳酸菌において、植物発酵エキスから取得されたものであることを特徴とする乳酸菌。
  4. 　請求項２記載の乳酸菌において、植物発酵エキスから取得されたものであることを特徴とする乳酸菌。
  5. 　請求項３記載の乳酸菌において、前記植物発酵エキスは大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌。
  6. 　請求項４記載の乳酸菌において、前記植物発酵エキスは大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌。
  7. 　請求項５記載の乳酸菌において、前記大根発酵エキスは大根、上白糖及び菌液を混合し発酵させたものであることを特徴とする乳酸菌。
  8. 　請求項６記載の乳酸菌において、前記大根発酵エキスは大根、上白糖及び菌液を混合し発酵させたものであることを特徴とする乳酸菌。
  9. 　請求項７記載の乳酸菌において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌。
  10. 　請求項８記載の乳酸菌において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌。
  11. 　請求項１～１０いずれか１項に記載の乳酸菌において、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つスクロース濃度３０～６０ｗｔ％の高濃度スクロース環境下でも増殖することを特徴とする乳酸菌。
  12. 　請求項１～１０いずれか１項に記載の乳酸菌において、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つフルクトース濃度及びグルコース濃度が夫々１０～３０ｗｔ％のフルクトース・グルコース高濃度環境下でも増殖することを特徴とする乳酸菌。
  13. 　請求項１～１０いずれか１項に記載の乳酸菌において、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つスクロース濃度３０～６０ｗｔ％の高濃度スクロース環境下でも増殖し、さらに、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つフルクトース濃度及びグルコース濃度が夫々１０～３０ｗｔ％のフルクトース・グルコース高濃度環境下でも増殖することを特徴とする乳酸菌。
  14. 　滅菌した液体培地に植物発酵エキスを加えて培養液を得、続いて、この培養液を集積培養して集積培養液を得、続いて、この集積培養液を滅菌した分離用培地と混釈して平板培地を作成し、続いて、この平板培地に出現したコロニーを釣菌して低ｐＨ環境且つ高濃度スクロース環境下で増殖可能な乳酸菌を取得することを特徴とする乳酸菌の取得方法。
  15. 　請求項１４記載の乳酸菌の取得方法において、前記植物発酵エキスは、大根と上白糖と菌液とを混合し発酵させた大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌の取得方法。
  16. 　請求項１５記載の乳酸菌の取得方法において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌の取得方法。
  17. 　請求項１４～１６いずれか１項に記載の乳酸菌の取得方法において、前記液体培地は、野菜発酵エキス及び果物発酵エキスのいずれか一方若しくは双方を用いて得られた混合発酵エキスと、野草の煮出液と上白糖とを混合して得られた野菜・上白糖混合液とを混合したものに抗生物質を添加したものであることを特徴とする乳酸菌の取得方法。
  18. 　請求項１７記載の乳酸菌の取得方法において、前記抗生物質はシクロヘキシミドであることを特徴とする乳酸菌の取得方法。
  19. 　請求項１～１０いずれか１項に記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品。
  20. 　請求項１１記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品。
  21. 　請求項１２記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品。
  22. 　請求項１３記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品。
  23. 　請求項１９記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品。
  24. 　請求項２０記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品。
  25. 　請求項２１記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品。
  26. 　請求項２２記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品。
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