KR20220009290A

KR20220009290A - 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법

Info

Publication number: KR20220009290A
Application number: KR1020200087814A
Authority: KR
Inventors: 이강욱; 김근수; 권도영; 김상구; 이상윤
Original assignee: 주식회사 풀무원
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2020-07-15
Publication date: 2022-01-24
Also published as: KR102616843B1; KR20230019483A

Abstract

본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 스타터 조성물, 상기 발효 스타터 조성물을 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 김치에 관한 것이다. 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 또는 이의 배양물을 이용하여 김치를 제조하는 경우 가스발생량이 낮아 유통 중에 가스발생량이 저감되어 가스발생으로 인한 포장 파손 등의 문제점을 예방할 수 있고, 산내성이 강하고 김치의 맛 품질 향상에 도움이 되는 만니톨 생성능이 우수하한 바, 기존 김치에 비해 맛이 개선되고 유통품질이 안정화된 김치를 제조하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법 {Leuconostoc mesenteroides PBio03 and methods for preparing kimchi using the same}

본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 스타터 조성물, 상기 발효 스타터 조성물을 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 김치에 관한 것이다.

김치는 주원료인 절임 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 파 및 무 등의 다양한 원료를 혼합한 후, 유산균을 이용하여 저온에서 발효시킨 우리나라 고유의 대표적인 전통발효식품이다. 특히 김치는 1990년대 이후, 경제성장, 사회구조 변화와 함께 가정이 아닌 산업적 김치의 생산량이 급격하게 증가하였다. 특히 김치는 김치의 발효를 주도하고 김치 특유의 맛을 내는 유산균들에 의해 발효가 진행되며, 이러한 유산균은 원재료로부터 유래한 자연발생 균주들이기 때문에 원재료의 종류, 원산지, 계절, 발효 조건 등에 따라 품질 자체가 매우 달라지게 되어 상품김치의 품질, 맛 등을 일정하게 유지하기가 어렵다. 따라서 품질이 일관되며, 맛이 유통기한 내 유지되는 김치의 개발을 필요로 하고 있으며, 이를 위하여 김치 스타터를 이용한 김치 제조가 한가지 방법이다. 따라서 김치 스타터로서 사용 가능한 우수한 특성을 지닌 유산균주를 찾고 제품에 적용하는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다.

김치에서 시원하고 깊은 맛을 내는 대표적인 유산균은 김치 발효 초기에 우점을 차지하고 있는 Leuconostoc mesenteroides (류코노스톡 메센테로이데스)이며, 발효 산물로서 만니톨, 이산화탄소, 젖산, 에탄올 및 기타 휘발성 대사 산물을 생산하여 김치의 풍미에 관여한다. 그러나 김치의 발효 중기에 이르면 pH 감소로 인하여 산성 환경에 상대적으로 약한 Leuconostoc mesenteroides의 수가 급격하게 감소되지만, 반면, 산성 환경에서 상대적으로 생육이 원할하게 가능한 Lactobacillus plantarum(락토바실러스 플란타룸)유산균이 증식하여 우점을 차지하게 되며, 젖산을 다량으로 생성함에 따라 김치 초기의 시원하고 깊은 맛이 사라지게 된다. 따라서 내산성이 강한 Leuconostoc mesenteroides 균주를 초기에 스타터로 사용하여 초기의 생육을 발효 전 기간동안 우점율을 유지시켜 김치의 신맛을 내는 Lactobacillus plantarum의 생육을 억제하여 김치의 품질과 맛을 유지시키는 것이 바람직하다.

또한 만니톨(mannitol)은 백색 결정 분말로 버섯 등의 과일 혹은 다시마와 같은 해조류 등에 광범위하게 존재하는 당알코올로서 항산화, 보습제 등의 기능이 있어 식품의 유통기한을 연장하는데 도움을 주어서 식품이나 의약품 등의 제조에 많이 사용되고 있다. 그리고, 만니톨은 감미도가 설탕의 약 0.5배지만 오히려 열량은 설탕의 열량(약 4.2kcal/g)의 1/3 정도 수준(약 1.6kcal/g)으로 대체 감미료로 많이 사용되고 있다. 특히, 김치의 발효 과정에서는 이러한 Leuconostoc속 유산균에 의하여 과당으로부터 젖산균이 함유하는 mannitol dehydrogenase 효소에 의해 일정 발효 이후에 생성되는 만니톨이 존재하며, 이는 시원하고 부드러운 단맛이 있으므로 김치에서 청량감을 주고 신맛을 억제하여 김치가 과도하게 시어지는 현상을 억제하기 때문에 김치의 맛을 향상시키는데 도움이 된다고 알려져 있다. 따라서 동일한 Leuconostoc속 유산균이라 하더라도 상대적으로 만니톨 생성량이 높은 유산균주를 선별하고 상품화하는 것이 도움될 수 있다.

기존의 상품화된 김치는 유통 과정에서 가스(주로 이산화탄소)가 발생하여 용기의 팽창, 파손 및 누액 등의 문제가 발생하고, 과숙성으로 인한 강한 신맛으로 맛 품질이 떨어지는 문제점이 있었다. 이러한 문제는 다양한 포장기술을 통하여 제어하고자 많은 노력이 있었으나, 실제로 상품화, 상용화에 있어서는 비용적인 문제 등으로 근본적인 해결책이 되기에는 어려움이 있다.

한국공개특허공보 10-2018-0008341호 한국등록특허공보 10-1660847호

이에 본 발명자들은 김치 제조에 있어 가스 발생을 줄이고 김치의 품질을 오래 유지할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 특정 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 이용하여 김치를 제조하는 경우, 가스 발생은 줄이고 김치 발효 초기의 품질을 오래 유지할수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 김치에 스타터로 이용하여 김치의 품질을 오랜 기간 유지할 수 있으며, 가스 발생량이 적은 신규한 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주(KCCM12726P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 스타터(fermentation starter) 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발효 스타터 조성물을 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 김치 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 김치를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주(KCCM12726P)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 스타터(fermentation starter) 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발효 스타터 조성물을 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 김치 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 김치를 제공한다.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주(KCCM12726P)를 제공한다.

본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03(Leuconostoc mesenteroides PBio03; 수탁번호 KCCM12726P) 균주는 전통발효식품 유래의 류코노스톡 메센테로이데스 신규 균주이다. 비록 본 발명에서 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주를 김치에서 분리, 동정하기는 하였으나, 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예를 통해 김치로부터 분리한 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과. PBio03 류코노스톡 메센테로이데스와 99% 동일함을 확인할 수 있었다. 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주는 한국미생물보존센터에 2020년 5월 22일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCCM12726P).

상기 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주는 만니톨의 생산을 촉진시킬 수 있는 다양한 배지에서 발효시킬 수 있는데. 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주의 생육에 적합하고 만니톨을 생성할 수 있는 배지면 특별히 제한되지 않는다.

또한 회분식 배양, 반회분식 배양, 연속식 배양, 유가식 배양 등의 방법으로 배양 될 수 있다. 배지 중에 포함되는 동화성 탄소원으로는 당 및 이들의 중합체, 폴리알콜 등을 사용할 수 있으며, 동화성 질소원으로는 무기질소 화합물, 동물, 식물 및 미생물 기원의 물질 등을 사용할 수 있다. 구체적으로, 탄소원은 과당, 포도당, 갈락토스, 만니톨, 말토스, 글리세린, 덱스트린, 전분 등의 단독 또는 혼합물을 예로 들 수 있고, 질소원으로서는 효모추출물, 고기추출물, 대두분, 펩톤, 콘·스티프·리카, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 요소 등의 단독 또는 혼합물을 예로 들 수 있다. 또한, 배지는 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주의 생육이나 만니톨의 생성을 촉진하는 유기물, 무기물, 비타민류 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 발효 중에 발포가 현저하게 나타낼 때는 소포제를 적절히 첨가할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태로서, 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 스타터(fermentation starter) 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “배양물”은 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주를 배지에 접종하여 배양한 결과물을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 배양물은 본 발명의 균주를 배지에서 배양한 배양물 자체(즉, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주, 배지 또는 균주의 대사생산물을 포함할 수 있음). 상기 배양물을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(예컨대, 원심분리한 상등액) 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 배양액은 이를 건조(예컨대, 동결 건조)한 후 분말화 한 것을 포함할 수 있다.

본 출원의 배지는 공지의 유산균용 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출언의 배지의 탄소원 및 질소원을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 탄소원은 수크로즈, 글루코스 및 과당으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소원일 수 있고, 상기 질소원은 효모추출물, 펩톤, 쇠고기 추출물, 맥아추출물, 옥수수 침지액, 구연산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질소원일 수 있다. 본 출원의 배지는 티윈80, 구연산나트륨, 인산칼륨, 초산나트륨, 황산망간, 황산마그네슘 및 증류수로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 “스타터(starter)”란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말한다. 본 발명에 있어서, 스타터란 발효식품의 맛을 일정하게 조절하고 우수한 관능미를 가질 수 있을 뿐만 아니라 발효식품 내 만니톨이 고함량으로 함유되도록 제공하는 미생물, 즉 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주를 필수적으로 포함하는 제제를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 발효 스타터는 액상 제제, 분말 제제 등으로 제형화할 수 있으며, 예를 들면 분말 제제로 사용할 수 있다. 분말 제제는 배양된 균주를 원심분리 등의 방법으로 수집하여 동결 건조시켜 수득할 수 있다. 스타터 균주를 발효식품에 첨가하는 경우, 균 배양액에서 분리한 젖은 형태의 균체를 첨가하는 것이 일반적이지만 액상 제형은 보관이 어렵고 유통 중 품질 유지가 어려워 이를 상품으로 유통시키기 어려운 단점이 있다. 반면에, 분말 제제는 공급, 품질 유지 및 사용이 용이하다는 장점이 있다. 상기 스타터는 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 뿐만 아니라, 콩가루, 탈지유(skim milk), 아미노산류, 당류, 당알코올류, 전분 등 통상적으로 스타터에 첨가되는 성분들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 발효 스타터 조성물은 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주(KCCM12726P)를 10⁶ cfu/g 이상 포함할 수 있으며, 바람직하게는 10⁶ cfu/g 내지 10¹²cfu/g, 10⁶ cfu/g 내지 10¹¹cfu/g, 10⁶ cfu/g 내지 10¹⁰cfu/g, 10⁶ cfu/g 내지 10⁹cfu/g, 10⁶ cfu/g 내지 10⁸ cfu/g, 10⁶ cfu/g 내지 10⁷ cfu/g 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태로서, 본 발명의 발효 스타터 조성물을 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 김치 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, “김치”라 함은 통상의 김치의 주재료에 양념을 첨가하여 제조되는 당해 분야에서 일반적으로 알려진 것을 통칭하는 것이다. 상기 김치의 주재료와 양념은 제조하고자 하는 김치의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 김치의 주재료는 배추, 무, 갓 또는 열무 등일 수 있고, 양념은 파, 마늘, 생강, 액젓, 설탕, 소금, 고춧가루 등과 같은 재료를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 주재료에 양념이 더해져 제조되는 김치는 배추김치, 갓김치, 무김치, 깍두기 등일 수 있으나, 상기와 같이 김치의 종류를 한정하는 것은 아니다. 즉, 본 발명에 따른 김치의 제조방법은 당해 분야에서 통상적으로 알려진 방법에 의해 제조되는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 양태로서, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 김치를 제공한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주는 가스발생량이 낮아 상기 균주 또는 이의 배양물을 발효 스타터로 이용하여 김치를 제조하는 경우, 유통 중에 가스발생량이 저감되어 가스발생으로 인한 포장 파손 등의 문제점을 예방함으로써 유통품질을 안정화할 수 있는 효과가 있다. 또한, 산내성이 강하고 만니톨 생성능이 우수하여 김치의 맛 품질 향상에 효과가 있다.

도 1은 분리된 유산균의 가스 생성 비교 실험을 나타낸 것이다.
도 2는 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주를 이용한 김치 발효 기간 중의 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주를 이용한 김치 발효 기간 중의 TA 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 신규 김치 종균을 적용한 김치의 당류 및 만니톨 함량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 김치 발효 및 저장기간 동안의 lactic acid bacteria 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 김치 발효 및 저장기간 동안의 Yeast 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 김치 발효 및 저장기간 동안의 Coliform bacteria 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 김치로부터 유산균의 분리

김치 스타터 선별을 위하여 대구 및 진주 지역의 재래시장으로부터 다양한 김치를 구입하였고, 숙성 초기 단계의 김치를 대상으로 이로부터 약 250여종의 유산균을 분리하였다. 김치 유산균의 분리는 구입한 김치시료를 0.85% 식염수로 단계 희석하였고, 각 희석액 0.1ml을 MRS agar (MRS; Becton, Dickinson and Company, USA) 평판 배지에 도말하였다. 도말된 배지는 30℃의 항온배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 생성된 각각의 단일 콜로니를 분리하여 본 시험에 사용하였다.

실시예 2 : 유산균 1차 선별 - 가스 및 산생성 적음

약 250여 종의 분리된 유산균은 MRS 액체 배지에서 전배양한 후, 각 유산균 전배양액의 흡광도가 OD600에서 1.0일 때, 새로운 MRS 배지에 1%(v/v)접종한 후, 25도에서 24시간 배양하였다. 새로 접종한 MRS 액체 배지 내에는 가스 채집을 위한 듀람관이 첨가되어 있어 해당 유산균이 생육하면서 가스(CO2)가 생성될 때 듀람관 내에 채집되며, 듀람관 내의 가스 채집 정도에 따른 기포의 높이로 가스 생성 정도를 확인하였다. 또한 배양액의 pH 측정을 통하여 유산균별 산 생성 정도를 파악하였다(일반적으로 유산균은 생육하면서 lactic acid, citric acid 등을 생성하여 pH가 감소된다.). 듀람관 내의 기포 생성 높이가 10mm 이내의 균주를 가스가 적게 생성되는 유산균으로 판단하였고, 동일한 배양조건에서 배양액의 pH가 4.4보다 높은 균주를 상대적으로 산생성 정도가 적다고 판단, 총 250여종 중 24종을 하기 [표 1]과 같이 1차 선별하였다(남은 220종 이상은 기포 생성정도가 모두 10mm를 초과하였다). 1차 선별된 유산균주는 16S rRNA gene sequencing(염기서열 분석)을 통하여 동정하였다.

[표 1]

실시예 3 : 유산균 2차 선별 - 산내성 우수

1차 선별된 24종의 유산균에 대한 산내성 측정을 실시하였다. 각각의 유산균을 MRS 액체 배지 10ml에 접종하여 전배양한 후, OD값 1.5일 때, 각 배양액 1ml씩 1.8ml e-tube에 분주한 후, 원심분리(12,000rpm, 10분)를 통하여 각각의 균체를 회수하였다. 회수된 각각의 균체는 pH 2.0, 3.0, 4.0로 보정된 MRS 액체 배지 1ml(인공위액)을 첨가하여 균체를 현탁한 후, 35도에서 2시간 방치하였다. 2시간 방치된 각각의 배양액을 단계 희석하여 균수를 확인하였다. 대조구로는 pH가 6.5인 MRS 액체 배지를 사용하였다. 각 유산균들의 pH 조건에 따른 생존율은 다음과 같이 측정하였다.

유산균 생존율(%) = pH 2.0, 3.0 or 4.0 조건의 MRS 액체배지에서 2시간 처리한 균수/pH6.5 조건의 MRS 액체배지에서 2시간 처리한 균수ⅹ100

24종의 유산균에 대하여 위의 산내성 측정을 통하여 하기 [표 2]와 같이 7종의 산내성이 상대적으로 높은 유산균을 2차 선별하였고, 특히 신규 균주인 PBio03 균주는 pH 3 조건에서 72.4%, pH 4.0에서 90.4%의 높은 생존율을 보여주어, 다른 Leuconostoc속 및 Weissella속 유산균에 비교하여 높은 생존율을 보여주었다.

[표 2]

실시예 4 : 유산균 3차 선별 - 만니톨 생성능

2차 선별된 7종의 유산균을 대상으로 김치의 관능에 영향을 미치는 만니톨 생성능을 통하여 3차 선별하였다. 유산균 배양액 (OD600=1.5)을 5ml을 원심분리(12,000 rpm, 10 min)하고 배양 상등액을 0.22 μm membrane filter로 여과하여 분석에 사용하였다. 만니톨 분석은 HPLC(1100 series, Agilent Co., Santa Clara, CA, USA)기기를 이용하여 분석하였으며, 사용한 컬럼은 Asahipak NH2P-50 4E(Column size 4.6 mm I.D.×250 mm, Shodex, Tokyo, Japan) 이다. 분석에 사용한 이동상은 acetonitrile과 water(75/25, v/v)를 1.5 ml/min의 유속으로 흘려 주었으며, 시료의 1회 주입량은 10 μl이며, RI detector(1260 series, Agilent Co., Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 검출하였다. 모든 분석은 3회 이상 반복 측정하였으며, mannitol chromatogram의 면적에서 개별 함량을 산출하였고 그 결과를 하기 [표 3]에 나타냈다.

선별된 신규 균주는 100당 2.5g을 확인되었으며, 상대적으로 가장 높은 만니톨 생성능을 보여주었다.

(출처, WK32 : 한국등록특허공보 10-1836365호 , KM20 : 한국공개특허공보 10-2003-0077100호)

최종 선별된 신규 균주는 Leuconostoc mesenteroides PBio03 균주로 명명하였다. 또한 특허 출원을 위하여 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2020년 5월 22일자로 기탁하였고, 해당 균주에 대한 기탁 번호는 KCCM12726P이다.

[표 3]

실시예 5 : 선별 균주의 생육 특성 조사

선별된 신규 균주 PBio03에 대한 생육 특성을 조사하였다. 다양한 온도, pH, NaCl 농도에 따라 생육 여부를 확인하였다. 모든 생육 측정은 MRS 액체 배지 10ml을 사용하였으며, pH 및 NaCl 농도의 경우, 각 액체 배지를 해당 조건에 맞게 제조하여 실험에 사용하였다. 온도 조건의 경우, 동일한 MRS 액체 배지에 1%(v/v) 접종한 후, 5, 10, 15, 20, 30, 40도 조건에서 96시간까지 배양하였으며, pH 및 NaCl 농도별 생육의 경우, 각 조건에 맞게 제조된 배지에 1%(v/v) 접종한 후, 30도에서 96시간까지 배양하며, 생육 여부를 확인하였으며 그 결과를 하기 [표 4]에 나타냈다.

선별된 PBio03 균주는 5도 조건에서도 생육이 가능하였으며, pH 3.0에서도 생육이 가능한 내산성 균주임을 확인하였다. 또한 NaCl 농도 7%에서도 생육이 가능하여 일반적인 김치의 NaCl 농도 15-2.0%에서도 충분히 왕성한 생육이 가능함을 확인하였다.

[표 4]

실시예 6 : PBio03 균주를 이용한 김치의 특성 분석

6 - 1 : PBio03 균주를 이용한 김치의 제조 및 발효 특성 조사

선별된 PBio03 균주에 대한 김치 스타터로서의 사용 가능성을 검증하기 위하여 김치를 제조, 저장 기간 28일까지의 김치 품질 분석을 진행하였다. 해당 28일은 국내 일반적인 시판 판매 김치 제품들의 유통기한이 약 30일임을 감안한 기간이다.

김치의 제조를 위하여 김치의 주원료인 배추를 9-13%(w/v)의 염수에 24시간 절인 후, 침지된 배추를 흐르는 수돗물에 3회 세척하였다. 김치 제조에 사용된 양념은 파, 고추, 마늘, 생강, 양파, 파, 젓갈 및 설탕을 55: 9.5: 7.5: 1: 7.5: 7.5: 9.5: 9.5: 2.5의 비율로 혼합하여 준비하였다. 절인 배추와 양념은 약 7:3의 비율로 혼합하였고, 김치에 첨가되는 스타터 유산균은 양념과 혼합하여 배추를 제조하였다. 사용되는 스타터 유산균은 MRS 액체 배지에 24시간 배양한 후, 원심분리(8,000rpm, 10분)를 통하여 균체를 회수하고, 멸균수를 2회 세척한 후, 최종 멸균수에 녹여 첨가하였다. 스타터 유산균은 제조된 김치 g당 10^7 cfu/g이 되게 첨가하였다. 제조된 김치는 포장하여 냉장 5도 조건하에서 28일간 저장하며 1주일에 1회, 총 5회 분석하였다.

이화학 분석을 위한 김치 샘플은 블렌더(Shinil electric mixer SMX-JC15MR, Yongin, Korea)를 사용하여 분쇄한 후, 12,000rpm에서 20분 동안 원심 분리기(Microcentrifuge 1730R; LABOGENE)를 사용하여 원심 분리하고 난 후, 상등액을 이용하여 pH, 산도, 당류 및 만니톨 분석을 실시하였다. pH는 pH 측정기(Orion STAR A211, Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였고, TA 분석을 위해 여과 액을 0.1N NaOH로 pH 8.3으로 적정 하였다. 만니톨 분석은 역시 상등액을 이용하여 Asahipak NH2P-50 4E 칼럼(4.6 mm ID × 250 mm)을 사용한 고성능 액체크로마토그래피(HPLC, 1100 시리즈, Agilent Co., CA, CA, USA)로 분석을 실시하였다. 만니톨 분석과 함께 만니톨 생성과 관련된 당인 과당, 자당에 대한 분석도 실시하였다.

하기 [표 5]에서 보듯이 제조 직후 김치 시료의 초기 pH 값은 5.51 ~ 5.61이며, 모든 김치 시료는 발효 및 저장 기간 28일 동안 pH가 점차 감소하였다. 이는 발효 중 유산균에 의하여 생성된 젖산 및 아세트산을 생성되었기 때문이다. 스타터를 첨가하지 않은 김치의 pH는 7 일에 5.08 ± 0.03였으며, 이는 김치 샘플 중에서 가장 높았고, 스타터를 첨가한 김치 샘플들은 김치 A보다 낮은 pH 값을 나타냈다. 신규 종균 PBio03을 첨가한 김치는 4.96으로 다른 유산균 스타터를 첨가한 김치의 pH 4.67, 4.90와 비교하여 상대적으로 높게 확인되었다(도 2 참조).

[표 5]

또한 하기 [표 6]에서 보듯이 초기 김치 샘플의 TA 값은 0.23 ~ 0.28로 확인되었고, 발효 및 저장 기간에 따라 점차 증가하였고, pH 값의 변화와 유사하게 7 일에서 14 일 사이에 현저한 증가하였다. 신규 종균 첨가한 김치에서 0.71 ± 0.02%로 다른 유산균 스타터 첨가 김치(0.72-0.76)와 비교하여 TA값이 상대적으로 낮게 확인되었다(도 3 참조).

[표 6]

김치 샘플의 만니톨 함량은 28 일 저장 김치 시료를 대상을 분석하였으며, 신규 종균 PBio03 첨가 김치C에서 1,423 ± 19.1 mg/100g으로 가장 높은 만니톨 함량을 나타내었으며, 스타터를 첨가하지 않은 김치는 1,027 ± 12.2 mg/100g이 가장 낮은 만니톨 함량을 나타내었다. 김치 C(PBio03스타터사용 김치)의 만니톨 함량은 각각 비스타터 김치 (A) 및 김치 B(혼합 LAB 스타터, 기존 풀무원 사용 스타터)보다 138.5 % 및 107.2% 높았다. 또한 추가적으로 시중에서 판매되는 김치 제품(경쟁사 제품)의 만니톨을 분석했다. 그 결과, 경쟁사(C사, D사)의 만니톨 함량은 각각 28 일에 1,250mg/100g 및 960mg/100g으로 확인되었다(도 4 참조).

분석에 검출된 주요 당류는 포도당 및 과당을 포함하며, 이는 김치 발효 동안 유산균 대사를 위한 탄소 공급원으로서 여러 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 저장 0 일차에 김치 샘플에서 과당 및 포도당 함량은 각각 1497-1548 mg/100g 및 1505-1534 mg/100g이었다. 그러나 과당과 포도당은 젖산균의 성장과 만니톨 생성에 사용되어 점차 감소하는 경향을 보였다. 저장 28 일차의 김치 샘플에서 과당 및 포도당 함량은 각각 170-264 mg/100g 및 555-778 mg/100 g으로 0일차와 비교하면 상당부분 감소된 것을 확인 가능하다.

6 - 2 : PBio03 균주를 이용한 김치의 미생물 분석 및 관능 검사

미생물 분석을 위한 김치 샘플을 0.85 % NaCl 용액(식염수)와 혼합하고 2분 동안 균질화시켰다(BagMixer 400, Interscience). 균질화된 샘플을 9 mL 식염수(3MTM Diluent, USA)로 단계별로 희석하고, 희석된 샘플을 플레이트 카운트 아가배지 (PCA, BD, USA)에 뿌려 일반세균수를 측정하였으며, 페트리 필름(3M Health Care)을 이용하여 대장균군수, MRS 평판 배지를 이용하여 총유산균, 디 클로란 로즈 벵갈 클로람페니콜 아가 배지(DRBC, BD) 이용하여 총 효모 수를 측정하였다. 일반세균은 35도, 유산균은 30도, 효모는 25도에서 각각 배양하여 균수를 계수하였다. 또한 유산균총의 분석을 위하여 각각의 MRS 평판 배지로부터 30 개의 단일 콜로니를 랜덤으로 선택하고 PCR에 의해 증폭된 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의해 동정하여 상대적인 유산균 우점율을 조사하였다(도 5, 도 6 및 도 7 참조).

김치 샘플 제조 직후의 총유산균수는 하기 [표 7]과 같이 비스타터 김치는 10⁵ cfu/g 수준이며, 스타터 첨가구에서는 10⁶ cfu/g으로 상대적으로 높은 수준이며, 이는 김치 발효 및 저장 기간동안 첨가 스타터가 우점에 유리하도록 하기 위하여 김치 g당 10⁶ cfu/g 수준이 되게 첨가하였기 때문이다. 또한 28일 경과 후에는 총유산균수는 10⁸-10⁹ cfu/g 수준으로 증가하였다.

[표 7]

PCA 배지를 사용하여 측정한 일반세균수의 경우, 총유산균수 수준과 유사하였는데 이는 김치 발효에 있어서 유산균이 가장 풍부한 미생물임을 나타내는 결과이다.

효모의 경우 하기 [표 8]과 같이, 김치 발효 초기부터 10³에서 10⁴cfu/g 수준이 유지되는 것을 확인하였다.

[표 8]

특히 대장균군의 경우 하기 [표 9]와 같이, 초기 10²cfu/g 수준이 검출되었으나 발효가 진행됨에 따라 pH가 감소하고 자연스럽게 대장균군은 14일 이후 불검출되었다.

[표 9]

유산균 우점율 조사에서는 신규 종균 PBio03을 첨가한 김치C에서 스타터로 첨가한 속과 동일한 Leuconostoc속 유산균이 저장 3주차에 각각 73.4%를 차지하였다. 이는 다른 스타터를 첨가한 김치 B, 김치D, 그리고 스타터를 첨가하지 않은 김치A의 3주차 Leuconostoc속 우점율인 43.4%, 70% 그리고 36.7%보다 상대적으로 높은 수치임을 확인할 수 있다. 또한 저장 4주차에도 PBio03 첨가 김치의 Leuconostoc속 유산균 우점율을 53.3%로 높은 수준임을 확인할 수 있었다(표 10 참조). (저장 4주차 김치 A, B, C = 26.7%, 43.3%, 56.6%). 이는 PBio03 유산균이 상대적으로 산내성이 강하여 김치 발효 중기 이후 pH가 낮음에도 불구하고 상대적으로 잘 생존하여 우점율이 강한 것으로 판단되며, 이는 상업 김치에서 발효기간내 품질을 상대적으로 일관되게 유지하는데 도움을 줄 것으로 판단된다.

[표 10]

김치 샘플의 관능 검사는 저장 시간 7일에 전문화된 인원으로 진행되었으며, 해당 인원은 5 명(남성:여성=2:3)이고 평균 연령은 35.3 세이다. 맛, 색, 풍미, 식감 및 전반적인 만족도 등 5점 척도로 평가하였다. 전반적인 만족도에서는 PBio03을 첨가한 김치 C와 혼합 균주를 첨가한 김치 B에서 스타터를 첨가하지 않은 김치A와 비교하여 상대적으로 높게 확인되었다(표 11 참조).

[표 11]

이상 살펴본 바와 같이 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주 또는 이의 배양물을 이용하여 김치를 제조하는 경우 가스발생량이 낮아 유통 중에 가스발생량이 저감되어 가스발생으로 인한 포장 파손 등의 문제점을 예방할 수 있고, 산내성이 강하고 김치의 맛 품질 향상에 도움이 되는 만니톨 생성능이 우수한 바, 기존 김치에 비해 맛이 개선되고 유통품질이 안정화된 김치를 제조하는데 유용하게 이용될 수 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12726P

20200522

Claims

류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주(KCCM12726P).
제 1항에 있어서, 상기 균주는 pH 3.0에서 내산성을 갖고, NaCl 7%에서 내염성을 갖는 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주(KCCM12726P).
제 1항에 있어서, 상기 균주는 발효시킨 김치 내 균주 우점율이 70% 이상인 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주(KCCM12726P).
제 1항에 있어서, 상기 균주는 만니톨 생성능이 2.5g/100g 이상인 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) PBio03 균주(KCCM12726P).
류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주(KCCM12726P) 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 스타터(fermentation starter) 조성물.
제1항에 있어서, 상기 발효 스타터 조성물은 상기 류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주(KCCM12726P)를 10⁶ cfu/g 이상 포함하는, 발효 스타터 조성물.
김치 제조방법에 있어서,
류코노스톡 메센테로이데스 PBio03 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 스타터 조성물을 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
제 7항의 방법에 의해 제조된 김치.