KR101605737B1

KR101605737B1 - 내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드 dsr8985 균주 및 이를 이용한 김치의 제조 방법

Info

Publication number: KR101605737B1
Application number: KR1020130164510A
Authority: KR
Inventors: 안두현; 최혜영; 류병희; 최정호
Original assignee: 대상에프앤에프 주식회사
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2016-03-24
Also published as: KR20150075994A

Abstract

본 발명은 내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P) 및 이를 이용한 김치의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖고, 탄산가스 및 만니톨 생성능이 우수하다. 이에, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 김치를 제조할 수 있으며, 이를 특정 온도 및 특정 시간 동안 숙성한 다음 저온에서 저장함으로써, 유통 과정에서 안정적으로 품질을 유지하고, 김치 맛에 큰 영향을 미치는 젓산, 만니톨 및 탄산가스를 함유하여 관능성이 개선된 김치를 소비자에게 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)는 김치 제조를 위한 발효 스타터(starter) 균주로 사용할 수 있다.

Description

내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주 및 이를 이용한 김치의 제조 방법{Leuconostoc mesenteroides DSR8985 Strain Having Excellent Acid Resistance and Low Production Ability of Lactic Acid and Method for Preparing of Kimchi Using the Same}

본 발명은 내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주(KCCM11504P) 및 이를 이용한 김치의 제조 방법에 관한 것이다.

김치는 주원료인 절임 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 파 및 무 등을 혼합한 후, 제품의 보존성과 숙성도를 확보하기 위하여 저온에서 발효시킨 식품으로서, 우리나라 고유의 대표적인 전통발효식품이다.

상품화되고 있는 김치의 경우, 일정한 품질의 김치를 제공할 수 없고, 장기 유통 과정에서 맛이 변질되거나, 과숙성 또는 산패되어 먹을 수 없게 되는 등 상품으로써 가치가 극감하는 저장성이 낮은 문제가 있었다.

이에, 김치의 저장성을 연장시키기 위한 다양한 방법이 시도되었으며, 김치에서 유래되는 유산균을 분리한 후, 김치 제조시 스타터(starter)로 첨가함으로써 김치의 맛과 발효를 조절하려는 연구들이 많이 진행되고 있다. 즉, 차아염소산나트륨과 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가하여 산패가 억제되고 보존성이 연장된 김치를 제조하는 방법(대한민국 공개특허 제1989-0006153호)이 개시된 바 있고, 류코노스톡 파라메센테로이드와 류코노스톡 메센테로이드 균주를 혼합 첨가함으로써 맛과 산패가 지연된 김치의 제조방법(대한민국 등록특허 제0181009호)등이 개시된 바 있다. 그러나 상기 방법들은 숙성을 지연시켜 저장성을 향상시키는 방법으로서 숙성이 진행되는 김치를 제공하므로 일정한 숙성 상태의 김치를 제공할 수 없다.

또한 일반적으로 숙성이 되지 않은 상태에서 저장할 경우 저장성은 향상되나 관능이 매우 낮으며, 과다 숙성된 김치를 저장할 경우 저장성 및 관능이 모두 낮은 문제점이 있었다.

한편, 김치의 상업적 생산이 본격화되면서 김치발효에 관여하는 미생물을 효과적으로 제어하여 풍미를 향상시키고 가식기간을 연장시키려는 연구가 진행되고 있으며, 방사선 조사, 열처리, 고압처리와 같은 물리적 방법을 적용한 결과, 발효 초기 미생물의 생육저해를 통한 발효 지연효과가 보고되었다. 그러나 물리적 처리에 의한 품질 저하와 영양 손실의 가능성이 크고, 설비투자에 따른 생산비용 증가가 발생할 수 있다.

그리고, 자몽종자 추출물 등의 천연추출물들, 소르빈산(sorbic acid) 등의 식품보존료와 유기산 및 염 혼합물 등을 첨가한 시도가 진행되었다. 그러나 그 효과가 미미하거나 첨가물 자체가 가지고 있는 강한 맛과 향에 의해 김치 고유의 풍미가 저하되는 것으로 나타났다. 또한, 식품공전에 제시된 김치규격에는 식품보존료의 사용이 허용되지 않기 때문에 상업적 적용은 불가한 것으로 판단된다.

이를 해결하고자 종균(starter)을 이용하여 김치발효를 제어하려는 연구가 다수 진행되었다. 종균을 적용한 초기 연구에서는 김치발효 미생물의 천이 및 역할에 대한 충분한 지식이 확보되지 못해 김치에서 우점으로 검출되는 미생물을 적용하였다. 이들 연구에서는 종균 첨가에 의한 높은 초기 균수의 달성으로 숙성기간의 단축과 품질 균일화에 대한 가능성을 확인할 수 있었지만, 상업적 김치생산과 관련된 가식기간 연장은 해결되지 못했다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 김치의 가식 기간 및 맛 품질이 향상된 김치를 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 김치로부터 내산성 및 저 산생성능을 가지는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)를 새로이 분리 및 동정하는데 성공하였으며, 이 균주를 발효 스타터(starter)로 이용하여 김치를 제조 및 장기 저장한 결과, 장기 저장 후에도 적정산도를 유지하여 가식 기간을 연장시키고, 만니톨 및 탄산 가스를 생성하여 탄산미와 부드러운 신맛을 가져 관능성이 개선되며, 저장 기간 동안 우점율 증가로 안정적인 품질을 유지할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 탄산가스 및 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 본 발명의 균주(KCCM11504P)를 이용한 김치를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 본 발명의 김치의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 탄산가스 및 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)를 제공한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)는 유산균으로서 김치에서 분리하였으며, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다. 본 발명의 미생물의 동정은 미생물의 형태학적 특성 및 16S rRNA의 염기서열 분석을 통한 계통학적 특성을 기초로 하여 이루어졌다.

미생물의 분리 및 동정

본 발명의 신규 유산균은 통상적인 김치의 제조방법으로 제조된 김치들을 유산균 분리 시료를 이용하였다. 상기 김치 시료를 희석하고, MRS 아가 및 PES 아가 플레이트에 접종한 다음 배양하여 생성된 각각의 콜로니를 각각 분리된 아가 플레이트에 획선 접종한 후 배양하여 유산균 콜로니를 분리하였다. 그 다음, 김치에서 분리한 유산균 중 내산성 균주를 분리하기 위해서, 상기 분리된 각 유산균 콜로니를 젖산(lactic acid)으로 pH 3.2로 조정한 MRS 브로스에 각각 접종하고 배양하면서 생육 유무를 관찰하여 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다. 그리고, 내산성 균주 중 저산생성 균주를 분리하기 위해서 상기 분리한 균주를 CaCO₃이 첨가된 MRS 아가에 접종하여 배양하여 기존 제품에 적용하고 있는 균주와 비교하여 작은 크기의 투명환(clear zone)을 나타내는 균주를 선발하였다. 그리고, 분리된 균주는 다시 MRS 브로스에 접종하여 배양 후, 기존 제품에 적용하고 있는 균주보다 높은 pH, 낮은 산도를 나타내는 균주를 선발하였다.

상기 분리된 내산성 및 저 산생성 균주의 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과, 류코노스톡 메센테로이드와 99% 동일성을 가짐을 확인하였고, 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985로 명명하였으며, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2013년 12월 19일자로 기탁하였다(KCCM11504P)(도 2).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)는 pH 3.0-5.0에서 내산성을 갖는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P) 또는 이의 배양액을 포함하는 김치를 제공한다.

본 발명의 균주 또는 이의 배양액은 김치 제조를 위한 발효 스타터(starter)로 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)는 상기 균주의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균 또는 건조균을 포함하고, 상기 배양액은 상기 균주를 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함한다. 또한, 상기 배양액은 이를 건조(예: 동결 건조)한 후 분말화한 것도 포함한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)를 첨가하여 제조된 김치는 제조 후 저장 1개월 이후부터 숙성 김치의 적정 산도인 0.4%에 도달하였으며, 저장 4개월까지 적정 산도 범위 내인 0.6%의 산도를 유지하며 안정된 숙성도를 나타내었으며(도 3), 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주(KCCM11504P)는 김치에 첨가될 경우 김치에서 우점종(dominant species)으로서 발효를 주도한다(도 4 및 5). 김치 내 만니톨 함량이 높아서 김치가 숙성된 후 신맛이 약하고 탄산감, 깔끔한 맛 및 시원한 맛은 개선되어 전반적인 관능평가가 우수한 것으로 나타났다(표 2). 따라서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)를 첨가하여 제조된 김치는 산도 증가속도가 완만하여 김치의 적정 숙성도(산도 0.4-0.8％)를 오랫동안 유지할 수 있다. 또한 탄산감, 깔끔한 맛 및 시원한 맛은 개선되고 신 맛은 감소하여 종합적인 맛에 있어 개선되어 그 맛을 오래 보존할 수 있는 특징이 있다.

한편, 김치 발효에 의해 생성되는 만니톨은 김치 원료에 유래되는 과당이 만니톨 디하이드로게네이즈(Mannitol dehydrogenase)에 의해 김치 숙성 적기 이후에 생성되는 것으로서 김치에 상쾌하고 부드러운 단맛을 부여하는 반면, 김치가 과도하게 시어지는 현상을 억제하고 김치의 신 냄새와 신맛을 감소시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Hawer W.D., Ahn H.S. Report of Korea Food Research Institute, S9-3, Kang S.C., Yun J.W., Ro T.W., Korean J. Biotechnol. Bioeng., 11(2), 1996).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 김치의 제조 방법을 제공한다: (a) 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P) 및 이의 배양액을 첨가하는 단계; 및 (b) 김치를 수득하는 단계.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 김치를 제조하는 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

이하, 김치를 제조하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 균주 또는 이의 배양액의 첨가 및 (b) 김치의 수득

우선, 본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P) 및 이의 배양액을 첨가하고 김치를 수득하는 단계를 거친다.

김치의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 예컨대, 소금으로 절인 배추에 고춧 가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕과 같은 일반적인 김치 양념들을 혼합한 후, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P) 또는 이의 배양액을 첨가하여 김치를 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P) 자체를 직접 김치에 첨가할 수도 있고, 상기 균의 배양액을 첨가할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 김치 제조시 사용되는 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주(KCCM11504P)의 배양액은 (a) 상기 균주를 영양배지(펩톤, 효모 추출물, 글루코스/증류수)에 접종하고 20-30℃에서 18-28시간 동안 1차 전배양하는 단계; (b) 상기 1차 전배양액을 멸균된 배추즙에 0.5-2.0％(v/v) 접종하고 20-30℃에서 18-28시간 동안 2차 전배양하는 단계; 및 (c) 상기 2차 전배양액을 멸균된 배추즙에 0.5-2.0％(v/v) 접종하고 20-30℃에서 18-28시간 동안 본 배양하는 단계:를 포함하는 방법으로 제조된다. 또한 상기 배추즙은 다음과 같은 방법으로 제조되는 것이 바람직하다: (ⅰ) 절임배추를 분쇄 및 착즙하고 염농도를 2.0-3.0％(보다 바람직하게는 2.8％)로 조정하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)의 결과물에 포도당을 1.0-3.0％(w/v)(바람직하게는 1.0％(w/v)) 첨가하고 멸균하는 단계.

상기 김치에서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)의 배양액은 김치 총 중량에 대하여 0.1-5 중량%로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5-3 중량%로 포함되며, 보다 더 바람직하게는 0.7-1.5 중량%로 포함된다.

상기 균주의 배양액이 김치 총 중량에 대하여 0.1 중량% 미만인 경우에는 균주에 의한 효과가 미미하고, 5중량％를 초과하는 경우에는 김치의 풍미가 저하되고 김치가 과숙성되는 문제점이 발생할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (b) 이후에, (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 김치를 15 내지 20℃에서 15 - 20시간 동안 숙성시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 숙성된 김치를 -2 내지 3℃에서 저장하는 단계를 추가적으로 포함한다.

(c) 김치의 숙성

그 다음, 본 발명은 상기 (b) 단계에서 제조된 김치를 15 내지 20℃에서 15 - 20시간 동안 숙성하는 단계를 포함한다.

류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주(KCCM11504P) 또는 이의 배양액을 이용하여 제조된 김치를 적정 숙도를 유지하면서 장기 저장하기 위하여는 숙성 온도 및 숙성 시간을 최적화하여야 한다.

숙성 온도가 15℃ 미만인 경우는 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주(KCCM11504P)가 활성화되기 어렵고, 숙성 온도가 20℃를 초과한 경우에는 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주 외의 다른 유산균들도 활성화되어 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주의 우점율이 저하된다. 또한, 숙성 시간이 15시간 미만인 경우 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주가 활성화되지 못하고, 20시간 이상은 첨가된 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주의 초기 증식이 지나치게 되어 적정 숙도로 장기 저장이 어렵게 된다.

(d) 숙성된 김치의 저장

마지막으로, 본 발명의 방법은 상기 (c) 단계에서 숙성된 김치를 -2 내지 3℃에서 저장하는 단계를 거친다.

숙성된 김치를 -2℃ 미만에서 저장하면 적장 산도에 도달하는 저장 기간이 길어지고, 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주(KCCM11504P)의 우점율 급감으로 상기 균에 의한 숙성이 이루어지지 않는 문제점이 있으며, 3℃ 초과 온도에서 저장하게 되면 저장 후 산도가 빠르게 증가하여 적정 산도를 초과하는 단점이 있다.

본 발명의 방법에 의해 숙성된 김치 내 만니톨 함량은 숙성 전 0.48%에서 4개월 숙성 후 1.23%로서, 약 2.56배 증가하였다.

이러한 방법으로 김치를 장기간 저장 후에도 적정 산도를 유지할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 김치, 또는 이의 제조 방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 균주는 내산성이 우수하고 저 산생성능을 갖고, 탄산가스 및 만니톨 생성능이 우수하다.

(c) 이에, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 김치를 제조할 수 있으며, 이를 특정 온도 및 특정 시간 동안 숙성한 다음 저온에서 저장함으로써, 유통 과정에서 안정적으로 품질을 유지하고, 김치 맛에 큰 영향을 미치는 젓산, 만니톨 및 탄산가스를 함유하여 관능성이 개선된 김치를 소비자에게 제공할 수 있다.

(d) 따라서, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)는 김치 제조를 위한 발효 스타터(starter) 균주로 사용할 수 있다.

도 1은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)의 형태학적 특징으로 보여주는 사진이다.
도 2는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)의 계통도를 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 김치를 대상으로 산도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 김치를 대상으로 유산균의 수를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 김치를 대상으로 우점율의 변화를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예

실시예 1: 김치로부터 내산성, 저산생성을 갖는 균주의 분리

1-1) 김치로부터 유산균의 분리

통상적인 김치의 제조방법으로 제조된 여러 종류의 김치들을 유산균 분리 김치 시료로 사용하였다. 상기 김치 시료를 채취하여, 0.85% 식염수로 10 배 희석하고, 이를 0.1 ㎖씩 MRS[MRS 아가, 디프코(Difco.); 박토펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈80 1 g, 구연산 2 g, 제2인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g, 아가 15 g/증류수 1 L], PES 아가(페닐에틸 알콜 수크로즈 아가; 트립톤 5 g, 효모추출물 0.5 g, 수크로즈 20 g, 황산 암모늄 2 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘 0.244 g, 페닐에틸 알콜 2.5 ml, 아가 15g/증류수 1 L) 플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 37℃의 항온 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 각각 분리된 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 37℃에서 1일 동안 배양하여 유산균 콜로니를 분리하였다.

1-2) 김치에서 분리한 유산균 중 내산성 균주 분리

상기 실시예 1-1 에서 분리된 각 유산균 콜로니를 젖산(lactic acid)으로 pH 3.2로 조정한 MRS 브로스(MRS 브로스, 디프코(Difco.); 박토펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈80 1 g, 구연산 암모늄 2 g, 제2인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g/증류수 1 L) 5 ml에 각각 접종한 후 25℃에서 72시간 배양하면서 생육 유무를 관찰하여 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다

1-3) 내산성 균주 중 저산생성 균주 분리

상기 실시예 1-2에서 분리한 균주를 멸균된 이쑤시개를 이용해 CaCO₃ 0.8%가 첨가된 MRS 아가에 접종하여 25℃ 항온배양기에서 72시간 동안 배양하였고, 기존 제품에 적용하고 있는 균주와 비교하여 작은 크기의 투명환(clear zone)을 나타내는 균주를 선발하였다. 분리된 균주는 다시 MRS 브로스 5 ml에 접종하여 25℃, 72시간 배양 후, pH, 산도를 측정하여, 기존 제품에 적용하고 있는 균주보다 높은 pH, 낮은 산도를 나타내는 균주를 선발하였다.

실시예 2: 분리된 균주의 탄산가스 및 만니톨 생성능 확인

2-1) 탄산가스 생성능 확인

듀람관(durham tube)이 들어있는 시험관에 10 ml의 MRS 브로스를 넣고, 상기 실시예 1-3에서 분리된 균주를 접종하여 25℃, 72시간 배양 후 듀란관에 생긴 기체의 양을 비교하여 기존 제품에 적용하고 있는 균주보다 많은 양의 기체를 생성한 균주를 선발하였다.

2-2) 만니톨 생성능 확인

만니톨 분석은 HPLC를 통해 확인하였다. 배양액의 전처리는 1 g의 배양액을 정밀히 달아 30% 에탄올 50 ml을 첨가하여 10분간 진탕하여 추출하였다. 이 추출액을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 30% 에탄올로 희석하여 50 ml로 한 액을 시험용액으로 하였다. 이 액 1 ml를 취하여 감압농축한 후 5 ml p-니트로벤조일 클로라이드(nitrobenzoyl chloride)을 가한 다음 50℃에서 90분간 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 메탄올 5-6 방울을 떨어뜨린 후 질소 농축한 다음 5 ml 클로로포름으로 녹였다. 이 액을 n-핵산으로 활성화시킨 Sep-pak 카트리지에 통과시킨 후 10% 초산에틸/핵산을 흘려보낸 다음 25 ml 10% 초산에틸/헥산 용액으로 용출시켰다. 용출액을 질소 농축한 후 10 ml 아세토나이트릴을 가한 다음 0.455 mm 멤브레인 필터로 여과하여 액체크로마토그래피에 주입하였다.

HPLC장비는 Agilent 1200 series(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였고, 컬럼은 Imtakt Unison US-C18 (Agilent Technologies, 4.6 x 250 mm, 5 mm)을 사용하였으며, 검출기는 DAD(Diodearray detector)이었고, 검출파장은 260 nm 이었다. 컬럼온도는 40℃ 였으며, 샘플 주입량은 10 ml 주입하였다. 이동상 A는 아세토나이트릴, 이동상 B는 정제된 물이었으며 비율은 77:23(A:B), 유속은 1.0 ml/min으로 흘려주었다.

실시예 3: 분리 균주 동정

상기에서 분리된 내산성 균주의 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과, 류코노스톡 메센테로이드와 99% 동일성을 가짐을 확인할 수 있었다. 본 발명에서는 류코노스톡 메센테로이드와 99% 동일성을 갖는 균주를 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2013년 12월 19일자로 기탁하였다(KCCM11504P).

본 균주와 유전학적으로 비슷한 균들 간의 계통발생학적 위치를 Phydit 프로그램을 이용해 도 2와 같이 나타내었다. 같은 속의 균주와는 물론이고, 같은 종의 표준 균주와도 계통발생학적으로 다름을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 분리된 균주 적용 김치 제조

4-1) 배양액 제조

절임 배추를 브랜더로 분쇄, 착즙 후 재제염을 사용하여 염도가 2.8%가 되도록 조정하였다. 여기에 포도당을 1.0%(w/v) 첨가한 후, 멸균하여 배추즙을 제조하였다. 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주(KCCM11504P)를 영양배지(펩톤 5 g, 효모 추출물 2.5 g, 글루코즈 5 g/증류수 1L) 5 ml에 접종하여 25℃에서 24시간 1차 전배양을 하였다. 이후, 상기 1차 전배양액을 멸균된 배추즙에 1.0% 접종하여 25℃에서 24시간 동안 2차 전배양을 하였다. 상기 2차 전배양액을 다시 멸균된 배추즙에 1.0% 접종하여 25℃에서 18시간 동안 본 배양 하였다.

4-2) 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주를 첨가한 김치의 제조

배추를 각각 소금으로 절여 배추의 염도가 2.3%가 되도록 한 후 절여진 배추(82.5 중량%)에 고춧가루(2.5 중량%), 마늘(2 중량%), 생강(0.5 중량%), 대파(2 중량%), 무채(9 중량%)의 일반적인 김치 양념을 혼합한 후 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주 배양액을 전체 김치 중량에 대해 1 중량%를 가하여 김치를 제조하였다.

4-3) 대조군 김치 제조

1) 표준균주 첨가군

류코노스톡 메센테로이드 KCCM11325 균주를 첨가한 김치의 제조는 상기 실시예 3-2과 동일한 방법으로 배추와 김치 양념을 혼합 후, 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11325 균주 배양액을 전체 김치 중량에 대해 1 중량%를 가하여 김치를 제조하였다.

2) 균주 미첨가 김치의 제조

상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 배추와 김치 양념을 혼합하여 김치를 제조하였다.

실험예 1: 분리 균주가 적용된 김치의 특성 확인

1-1) 산도분석

상기 실시예 4에서 제조된 김치를 17℃에서 18시간 숙성한 후 -2℃에서 4개월간 저장하며 산도를 측정하였다. 산도는 각각 김치 100 g을 마쇄 후 거즈로 여과하여 김치액을 제조하였다. 이후, 상기 각각의 김치액을 0.1N NaOH을 사용하여 pH 8.1이 되도록 중화적정한 후, 소비된 NaOH량을 젖산 함량(%)으로 환산하여 나타내었다.

실험 결과, 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985를 첨가하여 제조한 김치는 제조 후 저장 1개월 이후부터 숙성 김치의 적정 산도인 0.4%에 도달하였으며 저장 4개월까지 적정 산도 범위 내인 0.6%의 산도를 유지하며 안정된 숙성도를 나타내었다. 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11325를 첨가하여 제조한 김치는 초기 산도가 낮았으나 저온 저장 중 숙성이 촉진되어 저장 2개월 이후부터 적정 산도 범위를 벗어나 과숙성 되었고 이후 숙성이 계속 진행되었다. 유산균을 첨가하지 않은 김치의 경우 저장 1개월까지 숙성이 진행되지 않다가 이후 산 생성량이 급증하여 저장 3개월 이후 적정 산도를 벗어나며 과숙성 되었다(도 3).

따라서, 적정 산도를 유지하며 김치를 장기 저장하는 본 발명에 적합한 균주가 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주(KCCM11504P)임을 확인할 수 있었다.

1-2) 우점률 분석

상기 실시예 4에서 제조된 종균 첨가 김치(류코노스톡 메센테로이드 DSR8985, 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11325)를 17℃에서 18시간 숙성한 후 -2℃에서 4 개월간 저장하며 우점률을 분석하였다. 각각 김치를 0.85% 식염수로 10배 희석하였고, 유산균 수를 측정하기 위하여 김치 희석액 0.1 ml 씩을 MRS 아가(락토바실리(Lactobacilli) MRS agar; 펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 10 g, 덱스트로즈 20 g, 솔비탄 모놀레이드 복합체 1 g, 구연산 암모늄 2 g, 초산 나트륨 5 g, 황산마그네슘 0.1 g, 황산망간 0.05 g, 인산 칼륨 2 g) 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 상기 김치 희석액이 도말된 각 아가 플레이트를 30℃의 항온배양기에서 2일 동안 배양한 후 생성된 집락의 수를 각각의 균수로 계수하였다. 우점종을 확인하기 위해 류코노스톡 균 측정은 김치 희석액 0.1 ml 씩을 PES 아가(페닐에틸 알콜 수크로즈 아가; 트립톤 5 g, 효모추출물 0.5 g, 수크로즈 20 g, 황산암모늄 2 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘 0.244 g, 페닐에틸알콜 2.5 ml, 아가 15 g/증류수 1L)플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 상기 김치 희석액이 도말된 아가 플레이트를 25℃의 항온배양기에서 2일 동안 배양한 후, 생성된 집락의 수를 각각의 균수로 계수하였다. 우점율은 PES 아가에서 종균으로 사용한 균주의 집락의 수를 총 유산균 집락수로 나눈 값을 백분율로 표시한 것이다.

그 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11325 균주를 첨가한 김치의 경우 유산균 수가 적고 그 변화가 안정적이지 못하며 제조 직후 첨가된 균주가 김치에서 우점종으로 발효를 주도하였으나, 저장 1개월 후부터 우점율이 급감하여 저장 4개월 후에는 20% 미만으로 나타났다. 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985를 첨가하여 제조한 김치는 유산균 수가 높고 그 변화가 안정적으로 나타났다. 또한, 저장 4개월까지 50% 이상의 우점율을 나타내며 발효를 주도하였다.

따라서, 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985를 첨가하여 제조한 김치의 경우 장기간 저장하는 동안 류코노스톡 메센테로이드 DSR8985 균주가 안정적으로 우점함을 확인할 수 있었다.

1-3) 만니톨 분석

상기 실시예 4에서 제조한 김치의 만니톨을 측정하였다. 김치시료의 전처리는 김치를 마쇄하여 착즙한 액 1 g을 정밀히 달아 30% 에탄올 50 ml을 첨가하여 10분간 진탕하여 추출하였다. 이 추출액을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 30% 에탄올로 희석하여 50 ml로 한 액을 시험용액으로 하였다. 이 액 1 ml을 취하여 감압농축한 후 5 ml p-니트로벤조일 클로라이드(nitrobenzoyl chloride)을 가한 다음 50℃에서 90분간 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 메탄올 5-6방울을 떨어뜨린 후 질소 농축한 다음 5 ml 클로로포름으로 녹였다. 이 액을 n-핵산으로 활성화시킨 Sep-pak 카트리지에 통과시킨 후 10% 초산에틸/핵산을 흘려보낸 다음 25 ml 10% 초산에틸/헥산 용액으로 용출시켰다. 용출액을 질소농축한 후 10 ml 아세토나이트릴을 가한 다음 0.455 mm 멤브레인 필터로 여과하여 액체크로마토그래피에 주입하였다. 만니톨 분석은 HPLC를 통해 확인하였다. HPLC 장비는 Agilent 1200 series(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였고, 컬럼은 Imtakt Unison US-C18(Agilent Technologies, 4.6 x 250 mm, 5 mm)을 사용하였으며, 검출기는 DAD(Diodearray detector)이었고, 검출 파장은 260 nm이었다. 컬럼온도는 40℃였으며, 샘플주입량은 10 ml 주입하였다. 이동상 A는 아세토나이트릴, 이동상 B는 정제된 물이었으며 비율은 77:23(A:B), 유속은 1.0 ml/min으로 흘려주었다. 그 결과, 본 발명에 의해 제조된 김치의 당알콜량은 저장기간 4개월을 기준으로 가장 많은 량의 만니톨이 확인되었고, 그 다음으로 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11325 균주를 첨가하여 제조한 김치, 균주 미첨가 김치의 순으로 나타났다(표 1).

구분		DSR8985	KCCM11325	미첨가
만니톨 함량(%)	숙성전	0.48	0.49	0.48
만니톨 함량(%)	4개월차	1.23	1.02	0.85

1-3) 관능평가

상기 실시예 4에서 제조한 김치에 대해 50명을 대상으로 관능 검사를 수행하였다. 테스트 결과는 5점을 만점으로 기호도 척도법에 의해 실시하였다. 유의성 검증은 t-test에 의해 실시하였다(표 2).

저온 4개월 평가	기호도	탄산감	깔끔한 맛	시원한 맛	신맛 정도
본발명	4.64	3.86	4.18	4.43	3.45
KCCM11325	4.16	3.49	3.84	4.01	3.72
미첨가	3.01	3.04	3.44	3.59	4.15

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11504P

20131219

Claims

내산성이 우수하고 저 젖산 생성능을 가지며, 탄산가스 및 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P).
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 pH 3.0-5.0에서 내산성을 갖는 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P).
상기 제 1 항 또는 제 2 항의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P) 또는 이의 배양액을 포함하는 김치.
다음의 단계를 포함하는 김치의 제조 방법:
(a) 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P) 및 이의 배양액을 첨가하는 단계; 및
(b) 김치를 수득하는 단계.
제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR8985 균주(KCCM11504P)의 배양액은 김치 총 중량에 대해 0.1 - 5 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (b) 이후에, (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 김치를 15 내지 20℃에서 15 - 20시간 동안 숙성시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 숙성된 김치를 -2 내지 3℃에서 저장하는 단계;를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.