TWI441657B - 新穎戊糖乳酸菌及其用途 - Google Patents

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新穎戊糖乳酸菌及其用途
本發明係關於一種戊糖乳酸菌BCRC 910389及其用途。
正常人口腔內存在著許多細菌、黴菌、甚至病毒，而其中又以細菌的數量為最大：每毫升唾液中有1億個細菌，整個口腔中的細菌種類超過600種，然而這些細菌並非全都是致病菌，其中也包括部份的益生菌。正常狀況下這些細菌彼此維持菌落的相對平衡而不會致病，但如果身體免疫力或抵抗力變差、口腔環境改變、服用藥物或有全身性疾病等情況下，就會使致病菌過度生長而造成口腔疾病，輕則導致口臭、滋生牙菌斑、牙齦發炎等，重則引發齲齒、牙周病，甚至是細菌侵入血管內大量繁殖而造成菌血症。
齲齒為口腔病源菌所造成，而轉糖鏈球菌(S.mutans)為主要造成齲齒的細菌之一。已知下列方式可預防或治療齲齒，例如施用避免細菌附著至牙齒表面的抗附著劑，以減少牙菌斑的形成避免細菌侵蝕牙質(中華民國，申請號094144377)；使用抗菌劑以抑制細菌孳生(US 5,368,845；WO 92/14475)；或是目前所廣泛使用的氟化物，利用其 能降低琺瑯質對酸性物質的溶解度以預防齲齒。然而抗生素會有嘔吐和下痢等副作用，因此如能開發出以天然方法治療或預防齲齒的物質，則更有益於全民的健康。
本發明提供一種對人類安全、可抑制特定的口腔病原菌之天然抗菌物質。已知益生菌可廣泛抑制感染人類之革蘭氏陰性和陽性菌生長，其可能抑制機制為產酸和其他代謝產物。其中乳酸菌係廣泛使用各種發酵食品的製造，而某些乳酸菌株本身具有整腸效果或可抑制病源菌等優異的生理活性，除使用於發酵食品的製造外，也可應用於醫療保健及健康促進等產品。
本發明分別從人類唾液、嬰兒糞便篩選分離乳酸菌，並從生物資源保存及研究中心購買標準菌株。利用洋菜菌落抑制法(agar spot test)和試管抑制體外試驗評估乳酸菌抑制標準轉糖鏈球菌株的抗菌活性，另評估乳酸菌液經加熱(100℃或121℃，15分鐘)、酵素處理或稀釋處理後對其抗菌活性影響。將有抑菌能力乳酸菌以API 50CHL進行菌株鑑定，獲得具有抑制轉糖鏈球菌生長能力的菌株，該菌株經加熱 後的抑菌效果最顯著，24小時內可將轉糖鏈球菌菌數降至0cfu/ml，此特性有利於添加至加工食品或口香糖製成抗齲齒產品。
本發明提供一種乳酸菌株，其中該乳酸菌株為戊糖乳酸桿菌(Lactobacillus pentosus)菌株，寄存於新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910389。
本發明另提供一種組合物，其係包含前述BCRC910389戊糖乳酸桿菌菌株或其加熱產物，其中該乳酸菌株為活菌菌株或失活菌株。該組合物係以一醫藥組合物、營養補充品、保健食品、醫療食品或其組份之形式存在。
本發明又提供一種以包含前述BCRC910389戊糖乳酸桿菌菌株之組合物用於抑制口腔細菌生長之用途，前述口腔細菌包含轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)。本發明之組合物也用於生產治療齲齒之產物，其中該產物包含醫藥品、營養品及保健品。
為便於貴審查委員能進一步了解有關本發明為上述目的，特徵所採用的技術手段及其功效，茲列舉較佳實施例並配合圖示說明如下。
實施例1 實驗材料
本發明使用之轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)共3株，分別為購自生物資源保存及研究中心分離人類齲齒來源標準菌BCRC 15254、15255和15257，以評估乳酸菌對於不同轉糖鏈球菌的口腔細菌是否皆具有抑制能力。本發明使用之乳酸菌包括分離自人類唾液之標準菌株BCRC 11080、12188、12194和12574，以及自行篩選自口腔和嬰兒糞便之乳酸菌菌株。
實施例2 乳酸菌篩選
使用Dentocult® LB dip-slide(Orion Diagnostica,Espoo,Finland)方法篩選唾液中的乳酸桿菌。取1ml唾液加入至選擇性dip-slide，經10% CO2、37℃環境下培養三天，以產品提供之密度圖與玻片比較以計算乳酸桿菌數。結果 表示為：低(≦103CFU/ml)、中(104CFU/ml)、高(105CFU/ml)和非常高(>106CFU/ml)的乳酸桿菌數。從Dentocult® LB dip-slide上不同型態菌落(每種型態至少挑2-3菌落)挑出後，接種至MRS培養液，培養在10% CO2、37℃環境下24-48小時。再經由MRS培養基劃線培養，以挑出純菌落(Kõll-Klais et al.,2005)。
實施例3 以抑菌圈評估乳酸菌抑制轉糖鏈球菌活性之效果
將72株選自BCRC之乳酸菌，以及10株從糞便或唾液中篩選之乳酸菌進行洋菜菌落抑菌試驗(表1)。
實驗方法修改自Morency(2001)，將乳酸菌活化兩次後，稀釋塗抹於MRS agar(1.5%)，隔夜培養於厭氧缸內。至乳酸菌菌落形成後，於菌落上層覆蓋含病源菌(Streptococcus mutans)(600奈米，OD 0.1-0.25)的培養基Brain Heart Infusion agar；BHIA(0.7%)(100μl/5ml)，厭氧培養20小時，後量測抑菌圈結果。
其中19株乳酸菌抑菌圈明顯(LA05,LCR01,Bbr-1,EFA02,EFA03,ECA01,ED01,LDB02,LGA03,LAH01,EFI01,LBR06,LFA01,LH01,LAG03,EFA01,LAG01,Bb12和BCRC 12574)，而抑菌直徑與乳酸菌菌落大小成正比關係。
從實驗結果顯示，篩選自口腔的乳酸菌其菌落明顯小於其它來源的乳酸菌。因此，口腔來源乳酸菌抑菌直徑較小。如圖一為篩選自口腔之乳酸菌菌株13-1，其所形成的菌落 很小，但抑制圈明顯，直徑約2.5mm。藉由洋菜菌落抑菌試驗挑選出有明顯抑制圈的乳酸菌，並進一步將這些乳酸菌與轉糖鏈球菌共培養以測試其抑菌能力。
實施例4 乳酸菌抑制轉糖鏈球菌之評估
實驗參考Nikawa et al.(2004)之方法。將轉糖鏈球菌和乳酸菌加入無菌離心管混合進行抑制實驗(控制組為轉糖鏈球菌加至相同含量的PBS內)，取100μl加入10ml BHI培養液中，振盪混合10秒鐘，經37℃振盪培養90分鐘後，經1000×g離心，以PBS清洗兩次，經系列稀釋後塗佈於Mitis-Salivarius(MS)(額外添加崔西桿菌素和蔗糖)培養基上(37℃,48小時)，後計算轉糖鏈球菌菌數。
表2為利用分光光度計進行乳酸菌其上清液或菌液與轉糖鏈球菌(S.mutans BCRC15257)共培養抑制試驗之600奈米吸光值變化。
結果發現從口腔篩選之乳酸菌菌株13-1其上清液或菌液與S.mutans BCRC 15257同時培養時，吸光值(OD值)變化隨著時間增加而遞減，表示13-1具有抑制S.mutans BCRC 15257生長能力。三株從口腔篩選之乳酸菌菌株 13-2,13-3,13-4及標準菌株Lactobacillus crispatus BCRC 14618(LCR01)、Lactobacillus fermentum BCRC 12194之菌液與S.mutans BCRC 15257共培養時，吸光值也隨著培養時間增加而下降；乳酸菌菌株13-4,12188,12194,12574,LA05,Bb12和Bbr-1之上清液與S.mutans BCRC 15257共培養24小時內，吸光值則變化不大。另四株從口腔篩選之乳酸菌菌株11、12-1、12-2與40-2之上清液或菌液與S.mutans BCRC 15257共培養時，吸光值變化則隨時間增加而上升，推測這四株乳酸菌無抑制S.mutans BCRC 15257之生長能力。
表3為三株口腔來源標準菌株Enterococcus faecium BCRC 11080,Lactobacillus fermentum BCRC 12194與Lactobacillus salivarius subsp.salicinius BCRC 12574，四株糞便來源菌株Lactobacillus acidophilus LA05,Lactobacillus crispatus LCR01,Bifidobacterium breve Bbr-1,Bifidobacterium bifidum Bb12及七株自行從口腔篩選之乳酸菌菌株13-1,13-2,13-3,13-4,11,12-1,12-2分別與轉糖鏈球菌(S.mutans BCRC15257)進行試管共培 養試驗。
結果顯示乳酸菌株11,12-1,12-2,13-2,13-3,BCRC 11080, BCRC 12194,BCRC 12574,LA05,Bbr-1及Bb12分別與Streptococcus mutans共培養24小時後，S.mutans菌數增加1個對數值，無抑制S.mutans生長之作用。而乳酸菌菌株13-1,13-4及LCR01與S.mutans共培養6小時後，即有效減少S.mutans菌數2~3個對數值，並於共培養24小時內，可抑制S.mutans菌數繼續增加。由此可知表3的結果與表2以分光光度計測定乳酸菌其上清液或菌液與S.mutans共培養抑制試驗之吸光值變化結果相符。
實施例5 乳酸菌液經加熱、分解酵素處理之抑菌效果
進一步再將具有抑菌作用之乳酸菌13-1,13-4與LCR01上清液(分別為pH 4.1,4.3和3.9)做各種不同處理，如上清液調至中性(pH 7.2)、熱破碎(100℃,15分鐘)、添加澱粉酶(amylase)作用等。
該實驗參考Franz et al.(1996),Gopal et al.(2001)和Todoriki et al.(2001)之方法。將乳酸菌液經100℃加熱15分鐘、分解酵素或稀釋後探討抑菌活性。分解酵素包括乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)或澱粉酶(1mg/ml)作 用後，再進行上述抑菌圈抑菌試驗，以評估是否影響乳酸菌液的抑菌能力。
結果顯示將乳酸菌菌株13-1與13-4之上清液稀釋至4倍或調至中性(pH 7.2)時即無抑菌效果(圖2及3)。如將三株乳酸菌(13-1,13-4與LCR01)之上清液加入澱粉酶作用後，其抑菌效果不受影響(圖4)。
另外，三株乳酸菌上清液經熱破碎處理後，抑制轉糖鏈球菌(S.mutans BCRC15257)生長之效果最為顯著，三株乳酸菌經熱破碎之上清液於24小時內可將菌數降至0log，抑菌效果比未加熱處理前顯著。若將熱破碎後之上清液調至中性，則喪失抑菌效果，推測上清液經加熱處理後，有更小的抑菌胜肽釋出，且抑菌成分可能在酸性環境下結構穩定。此三株乳酸菌對於S.mutans BCRC 15254與S.mutans BCRC 152545亦有同樣的抑菌效果(圖5及6)。而這三株乳酸菌中，又以Lactobacillus crispatus LCR01之抑菌效果最佳。
進一步分析不同菌數濃度之S.mutans(分別為108,107與 106CFU/ml)與三株乳酸菌(13-1,13-4與LCR01)上清液共培養之影響。發現乳酸菌上清液與不同菌數濃度之S.mutans BCRC 15257共培養24小時後，Lactobacillus crispatus LCR01抑菌能力最強；其經過24小時後，與對照組(S.mutans BCRC 15257培養於BHI 24小時)相差約3~4個對數值(圖7)。因此，由三株乳酸菌於體外試管試驗中證實具有顯著抑制S.mutans生長之作用，尤其是上清液經加熱處理後效果更顯著。
實施例6 乳酸菌之生化鑑定
將從唾液分離出的乳酸菌13-4進行菌種鑑定。以顯微鏡觀察該菌株以洋菜培養基培養後之菌落形態，結果如圖八，該菌株為桿菌，不具觸媒、氧化酶及運動性，不產生內孢子，於好氧及厭氧環境下均會生長。並以公知方法評估本菌株之生理學性質，發現該菌株為革蘭氏陽性桿菌。
以公知方法分析該菌株16S rDNA之部分鹼基序列(SEQ ID NO：1)，和基準株之16S rDNA相比，該菌株可能為Lactobacillus pentosus、Lactobacillus subsp.plantarum、 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum、Lactobacillus plantarum subsp.argentoratensis和Lactobacillus paraplantarum，序列相似度達99%以上。
使用細菌鑑定工具API 50 CHL套組評估該菌株對於各種碳水化合物之分解性，操作步驟如下：
(1)套組之接菌，以無菌棉棒在培養24至36小時之目標菌的平板培養基上塗抹取菌。
(2)將塗有菌體之棉棒放入含有2ml PBS緩衝液之玻璃小瓶中，調製成菌體懸浮液，以玻璃吸管吸取此菌液滴入含有5ml PBS緩衝液之玻璃小瓶中，調製成混濁度為McFarland 2之懸濁液，並記取所製備之滴數(n)。
(3)打開含有10ml API 50 CHL培養液之玻璃管，吸取原先製備成2ml菌體懸浮液，滴入2n滴之菌液於API 50 CHL培養液中，調製成試驗用菌液。
(4)用無菌吸管注入約100μl之試驗用菌液至每個測試條之孔洞中，須避免氣泡產生，並覆蓋一層礦物油，置於37℃培養，於24及48小時進行判讀。
(5)結果鑑定：以API LAB software系統鑑定受試菌株之 種別。
實驗結果如表4，該分離菌株具有甘油發酵能力，在49測驗項目中有46項測試結果和Lactobacillus pentosus基準株相符，綜合序列分析結果，該分離菌株為Lactobacillus pentosus。
但與基準株比較，該分離菌株和基準株對D-木糖，D-松三糖及D-棉子糖之分解性不同。
藉由以上結果，顯示本發明13-4之菌株係屬於戊糖乳酸桿菌之新穎乳酸菌株。
本發明之乳酸菌株13-4係於2008年5月14號寄存於中華民國食品工業發展研究所，並通過存活試驗，寄存編號為BCRC 910389。
圖一顯示由Agar spot抑菌試驗，可看出13-1品系的乳酸菌對轉糖鏈球菌BCRC 15257的生長有抑制的效果。
圖二顯示13-1品系乳酸菌對於轉糖鏈球菌BCRC 15257的生長抑制情形。
圖三顯示13-4品系乳酸菌對於轉糖鏈球菌BCRC 15257的生長抑制情形。
圖四顯示各種處理下13-1、13-4及LCR01三種品系乳酸菌對於轉糖鏈球菌BCRC 15257的生長抑制情形。
圖五顯示各種處理下13-1、13-4及LCR01三種品系乳酸菌對於轉糖鏈球菌BCRC 15255的生長抑制情形。
圖六顯示各種處理下13-1、13-4及LCR01三種品系乳酸菌對於轉糖鏈球菌BCRC 15254的生長抑制情形。
圖七顯示13-1、13-4及LCR01三種品系乳酸菌對於不同濃度(106、107或108CFU/ml)轉糖鏈球菌BCRC 15257抗菌能力之比較。
<110> 弘光科技大學
<120> 新穎戊糖乳酸菌及其用途
<130> 1164-HK-TW
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 501
<212> DNA
<213> Lactobacillus pentosus
<400> 1

Claims (7)

  1. 一種用於生產治療齲齒之產物的乳酸菌株，其中該乳酸菌株為戊糖乳酸桿菌(Lactobacillus pentosus)BCRC910389菌株。
  2. 一種組合物，其係包含申請專利範圍第1項之乳酸菌株或其加熱產物。
  3. 根據申請專利範圍第2項之組合物，其中該乳酸菌株為活菌菌株或失活菌株，該失活菌株係透過加熱或分解酵素處理之菌株。
  4. 根據申請專利範圍第2項之組合物，其係以一醫藥組合物、營養補充品、保健食品、醫療食品或其組份之形式存在。
  5. 根據申請專利範圍第1項之乳酸菌株，其抑制口腔細菌生長。
  6. 根據申請專利範圍第5項之乳酸菌株，其中該口腔細菌包含轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)。
  7. 根據申請專利範圍第1項之乳酸菌株，其中該產物包含醫藥品、營養補充品及保健食品。
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